KR101605963B1

KR101605963B1 - 마이크로니들 및 이를 포함하는 일산화질소 검출용 센서

Info

Publication number: KR101605963B1
Application number: KR1020140122889A
Authority: KR
Inventors: 한세광; 금도희; 정호상; 김혜민; 신명환
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2016-03-24
Also published as: US20160174885A1

Abstract

본 발명은 마이크로니들, 상기 마이크로니들을 포함하는 일산화질소 검출용 센서, 상기 마이크로니들을 포함하는 의료장치 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 마이크로니들은 전기화학적 원리로 일산화질소의 존재 유무를 검출할 수 있다. 또한, 실시간으로 일산화질소의 농도 변화를 감지할 수 있다. 이러한 일산화질소 검출 효과를 이용하여, 암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 종양의 크기와 성장 정도를 예측할 수 있다.

Description

마이크로니들 및 이를 포함하는 일산화질소 검출용 센서{micro-needle and sensor for detecting nitrogen monooxide comprising the same}

본 발명은 마이크로 니들 및 이를 포함하는 일산화질소 검출용 센서에 관한 것이다.

일반적으로 마이크로니들(microneedle)은 생체 내 약물, 백신 등의 활성 물질의 전달, 체내 분석물질의 검출 및 생검(biopsy)에 사용된다. 마이크로니들을 이용하는 방법으로는 마이크로니들이 부착된 롤러(roller) 등의 마이크로니들 장치(device)를 사용하여 피부에 일정 개수 이상의 구멍을 형성한 후 약물을 덧바르는 형태, 마이크로니들 표면에 활성성분(유효성분)을 코팅함으로써 피부 천공과 동시에 활성성분이 투여되도록 하는 형태, 고분자(생분해성 고분자 또는 수용성 고분자)를 이용한 마이크로니들로 주사 시 피부 내에서 분해 또는 용해됨으로써 마이크로니들에 포함된 활성물질을 확산시키는 형태 등이 일반적으로 이용되고 있다.

한편, 전이를 하는 특성을 가진 암은 조기 발견이 가장 중요하며 암을 사전에 예방하기 위하여서 가장 흔하고 쉬운 방법으로 내시경을 사용한다. 암을 보다 정확하게 진단하기 위한 다양한 종류의 내시경들이 많이 개발되고 있으며, 대표적으로 전자내시경, 캡슐내시경, 3D 내시경 등이 존재한다. 색소 염색방법을 이용하여 내시경으로부터 얻어지는 이미지로 암을 일차적으로 구분한 후, 그 부위의 조직을 채취하여 꺼낸 뒤 암의 악성 여부를 판별한다. 그러나, 현재의 이러한 방법은 정확한 악성종양 판별까지 조직검사가 필수적이며, 이를 통해 악성종양의 여부를 판별하기까지는 오랜 시간이 필요하고 가끔 내시경의 염색방법을 통해 얻는 이미지를 잘못 분석하여 오진이 발생할 수 있다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 마이크로니들을 이용하여, 짧은 시간 내에 비침습적인 방법으로 암을 진단할 수 있는 센서를 제공하고자 한다.

Microneedle electrodes toward an amperometric glucose sensing smart patch, Michael A et al., Advanced healthcare materials, 2013 Real-time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub-nanomolar sensitivity, Shan Jiang et al., Nature communications, 2013

본 발명은 마이크로니들, 상기 마이크로니들을 포함하는 일산화질소 검출용 센서, 상기 마이크로니들을 포함하는 의료장치 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 마이크로니들 베이스; 접착성 고분자층; 전도성 고분자층; 및 철이온을 포함하는 일산화질소 결합성 분자층이 순서대로 적층되어 있는 마이크로니들을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 마이크로니들 및 전극을 포함하는 일산화질소 검출용 센서를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 마이크로니들 및 전극을 포함하는 암 진단용 센서를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 마이크로니들, 상기 일산화질소 검출용 센서, 또는 상기 암 진단용 센서를 포함하는 내시경을 제공한다.

본 발명은 또한, 마이크로니들 베이스 및 접착성 고분자를 혼합하여 상기 마이크로니들 베이스에 접착성 고분자층을 형성하는 단계; 상기 접착성 고분자층 및 전도성 고분자 용액을 접촉시켜 용액 공정을 통하여 상기 접착성 고분자층에 전도성 고분자층을 형성하는 단계; 및 상기 전도성 고분자층 및 철이온을 포함하는 일산화질소 결합성 분자를 접촉시켜 상기 전도성 고분자층에 일산화질소 결합층을 형성하는 단계를 포함하는 마이크로니들의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 마이크로니들은 전기화학적 원리로 일산화질소의 존재 유무를 검출할 수 있다. 또한, 실시간으로 일산화질소의 농도 변화를 감지할 수 있다. 이러한 일산화질소 검출 효과를 이용하여, 암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 종양의 크기와 성장 정도를 예측할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 마이크로니들을 포함하는 센서의 단면도이다. 도면에서 부호 1은 마이크로니들 베이스 표면에 코팅된 피닷 채널이며, 2는 양 끝에 작업전극과 상대전극을 연결하기 위한 전극으로 금으로 이루어진 층이며, 3은 금층 아래 마이크로니들과 금을 접착해줄 수 있는 티타늄과 크로뮴층이다. 부호 4는 기준전극을 연결하기 위한 티타늄으로 이루어진 전극이며 5는 폴리카프로락톤으로 된 마이크로니들 패널이다. 부호 2, 3으로 구성된 전극의 한 끝이 작업전극, 반대쪽이 상대전극에 하나씩 연결이 되며 부호 4는 기준전극에 연결된다.
도 2a는 본 발명의 마이크로니들을 포함하는 센서가 적용되는 일 예를 보여준다. 부호 6은 마이크로니들의 한쪽 끝의 전극에 작업 전극을 연결하는 구리도선으로, 전극과 프루브 스테이션을 전기적으로 연결하기 위하여 마이크로니들 끝의 전극을 땜납한 것이다. 반대쪽 전극에도 동일하게 구리도선을 연결하여 상대전극을 연결시켜준다. 부호 7은 마이크로니들의 전극과 가장자리 부분을 덮고 있는 주황색 부분으로서 마이크로니들의 채널 외 부분을 고분자로 코팅하여 방수처리한 것을 보여준다. 부호 8은 기준 전극을 연결한 모습을 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 일 예로써, 마우스 피부에 본 발명의 마이크로니들을 포함하는 센서를 적용하는 모습을 보여준다.
도 2c는 본 발명의 일 예로써, 본 발명의 마이크로니들을 포함하는 센서를 내시경에 적용한 모습을 보여준다. 부호 9는 백색광을 촬영하는 내시경부분, 부호 10은 형광을 촬영하는 내시경 부분, 부호 11은 센서가 장착되는 내시경 부분이다.
도 3은 광학 현미경을 이용하여 단계별 코팅에 따른 마이크로니들 표면을 관찰한 결과를 보여준다(도 3a: 폴리카프로락톤으로 이루어진 마이크로니들 베이스를 제조하는 단계; 도 3b: 도파민 코팅 없이 피닷을 용액 가공하여 피닷을 코팅한 단계; 도 3c 폴리카프로락톤에 도파민을 코팅한 단계; 도 3d: 도파민을 코팅한 뒤 피닷을 용액 가공하여 피닷을 코팅한 단계).
도 4는 주사현미경을 이용하여 단계별 코팅에 따른 마이크로니들 표면을 관찰한 결과를 보여준다. 표면 코팅에 따라 마이크로니들의 측면도(왼쪽)와 마이크로니들 끝부분의 이미지(오른쪽)이다 (도 4a: 폴리카프로락톤으로 만들어진 초기 마이크로니들 베이스의 표면으로 표면이 깨끗함을 보여준다; 도 4b: 도파민 없이 피닷폴리머를 코팅한 경우 표면 코팅이 매끄럽지 못함을 보여준다; 도 4c: 도파민을 코팅한 뒤 피닷을 코팅한 표면으로, 표면 코팅이 잘 되었음을 보여준다).
도 5는 주사현미경에 부착된 X-ray 스펙트로미터 (energy dispersion X-ray, EDX)를 이용하여 마이크로니들 센서 채널의 표면에 존재하는 헤민분자의 철분을 확인한 그래프이다.
도 6은 광전자 분광기 (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)를 이용해 마이크로니들 채널에 존재하는 헤민분자의 철분의 함량을 정량적으로 확인한 그래프이다.
도 7은 마이크로니들의 기계적인 물성을 확인한 것으로, 도 7a는 마이크로니들의 압축에 따른 힘의 세기를 측정하여 파괴응력을 도출한 결과를 보여주고, 도 7b는 도 7a의 결과로부터 획득한 변형길이에 대한 압력 그래프를 보여준다.
도 8은 마이크로 니들을 적용한 마우스 피부를 관찰한 것으로, 도 8a는 마우스 피부의 측면도, 도 8b는 마우스 피부의 단면도, 도 8c 는 마우스의 피부를 크리오섹션한 측면도이다.
도 9는 단계별 코팅에 따른 마이크로 니들을 포함하는 센서의 표면을 순환전류법으로 관찰한 그래프이다.
도 10은 순환전류법 측정시 스캔 속도에 따른 전압 전류 그래프와 헤민기의 산화 환원 피크의 이동을 관찰한 그래프이다.
도 11은 전해질에 일산화질소를 농도별로 첨가하여 얻은 순환전류그래프이다.
도 12는 전기화학적인 방법으로 마이크로니들을 포함하는 센서 표면의 저항값을 측정한 결과를 보여준다.
도 13은 마이크로니들의 끝부분을 마우스의 피부에 적용하기 전 후의 표면을 위에서부터 50, 1000, 3000, 10000 배율별로 관찰한 주사현미경 이미지이다.
도 14는 검출테스트가 끝난 후에 사용한 마이크로니들의 순환전류 그래프이다.
도 15는 50회 연속적으로 측정한 마이크로니들의 순환전류 그래프이다.
도 16은 마이크로니들을 포함하는 센서의 세포 생존능력을 측정한 결과를 보여준다.
도 17은 마이크로니들을 포함하는 센서에 일산화질소가 함유된 수용액을 농도별로 흘려주어 전류값의 변화를 관측한 결과를 보여준다.
도 18은 센서의 검출에 영향을 줄 수 있는 여러가지 분자 및 다당류들(갈락토스, 글루코스, 철이온, 과산화수소, 라이소자임, 알부민)에 대한 마이크로니들의 전류 변화를 분석한 결과를 보여준다.
도 19는 다양한 물질들이 존재하는 세포배양 용액에 녹아 있는 일산화질소의 검출능력을 측정한 결과를 보여준다.
도 20은 일산화질소의 농도에 따른 540 파장에서의 흡광도를 그리스 시약을 이용하여 정량한 결과를 보여준다.
도 21a는 raw 246.7 마크로파지 세포에서, 리포다당류체의 처리 농도에 따라 세포에서 발생되는 일산화질소의 양을 측정한 그래프이다.
도 21b는 raw 246.7 마크로파지 세포에 리포다당류체 및 아미노구아니딘을 동시에 처리한 경우에 있어서 아미노구아니딘의 농도에 따른 일산화질소의 양을 측정한 그래프이다.
도 22는 일반세포와 리포다당류를 처리한 세포, 리포다당류에 아미노구아니딘까지 동시에 처리한 세포에서 나오는 일산화질소를 센서를 통해 측정한 결과를 보여준다.
도 23은 마이크로니들을 포함하는 센서로부터 측정된 전류변화값을 이용하여 세포에서 실질적으로 나오는 일산화질소의 양을 환산한 그래프이다.
도 24는 피부암에 걸린 마우스의 피부조직을 관찰한 것으로, 마우스 피부조직에 마이크로니들을 포함하는 센서를 적용하여 검출하는 모습을 보여준다.
도 25는 일반 마우스의 피부와 피부암에 걸린 마우스의 암세포 주변 피부에 마이크로니들을 삽입하여 얻은 전류값을 보여준다.
도 26는 일반 마우스의 피부와 피부암이 걸린 마우스의 피부에 마이크로니들을 번갈아가며 삽입하여 얻은 전류값을 보여준다.

본 발명의 마이크로니들은 마이크로니들 베이스, 접착성 고분자층, 전도성 고분자층 및 일산화질소 결합성 분자층으로 구성된다. 전도성 고분자층 및 일산화질소 결합성 분자층은 일산화질소를 검출하기 위한 것이고, 접착성 고분자층은 전도성 고분자층과 일산화질소 결합성 분자층을 안정하게 구성하기 위하여 필요하다.

본 명세서에서 마이크로니들 베이스는 마이크로니들의 기본 골격을 이루는 것으로 마이크로니들의 형상을 나타내는 것이다. 상기 마이크로니들 베이스에 추가의 코팅층들을 형성시킴으로써 본 발명의 마이크로니들이 완성된다. 마이크로니들 베이스는 구성 물질에 따라 통상의 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 생분해성 고분자로 이루어진 마이크로니들 베이스는 마이크로니들용 몰드에 생분해성 고분자를 넣어 열을 가하고, 굳힘으로써 형성될 수 있다. 알루미늄 옥사이드, 알루미늄 니켈, 니켈 옥사이드 또는 스테인리스 스틸 등으로 이루어진 마이크로니들 베이스는 에칭 방법을 이용하여, 스테인리스 스틸로 이루어진 마이크로니들 베이스의 경우에는 에칭 또는 금형 주조법에 의하여 마이크로니들을 형성할 수 있다.

한 구체예에서, 마이크로니들 베이스는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리비닐알코올(Polyvinylalcohol), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리락타이드(Polylactide), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene oxide), 폴리디옥사논(Polydioxanone), 폴리포스파젠(Polyphosphazene), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리아크릴레이트(Polyacrylate), 폴리아크릴아미드(Polyacrylamide), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리실록산(Polysiloxane), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone),폴리메틸메타아크릴레이트(Polymethylmethacrylate), 폴리에틸렌(polyeyhylene), 폴리아미드(Polyamide), 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxanes), 폴리에스터(polyester), 폴리오르토에스터(polyorthoester),폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchrolide),폴리메틸펜텐(polymethylpentene), 폴리니트로벤질(polynitrobenzyl),폴리아미노에스터(polyaminoester), 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트(Cellulose acetate butyrate), 셀룰로오스 트리아세테이트(Cellulose triacetate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 테플론(polytetrafluornehylene), 스테인리스 스틸(stainless steel), 실리콘(silicon), 실리콘옥사이드(silicon oxide), 알루미늄(aluminium), 알루미늄옥사이드(aluminium oxide), 니켈 옥사이드 및 SU-8(에폭시 기반의 네거티브형 포토레지스터)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 한 구체예에서, 마이크로니들 베이스는 생분해성 고분자로 이루어질 수 있으며, 생분해성 고분자는 소수성 고분자일 수 있다. 한 구체예에서, 마이크로니들의 베이스로 폴리카프로락톤(PCL) 을 사용할 수 있으며, 폴리카프로락톤은 생분해성 재료로서 생체안정성이 매우 높다. 또한, 폴리카프로락톤의 분자량을 조절하여 마이크로니들의 강도를 적절하게 조절할 수 있다. 한 구체예에서, 폴리카프로락톤의 분자량은, 이에 제한되는 것은 아니나, 4000 내지 10000kDa, 5000 내지 9000kDa, 6000 내지 85000kDa 또는 7000 내지 8300kDa일 수 있다.

상기 마이크로니들 베이스와 접착성 고분자를 혼합하여 상기 마이크로니들 베이스 상에 접착성 고분자층을 형성할 수 있다. 한 구체예에서, 접착성 고분자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 키토산(chitosan), 실크(silk), 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 고무(rubber) 또는 폴리도파민일 수 있다. 예를 들어, 접착성 고분자는 카테콜기를 포함할 수 있으며, 폴리도파민일 수 있다. 도파민은 접착성 성질을 가진 생체안정성이 높은 폴리머로서 폴리카프로락톤 마이크로니들의 소수성 표면에서 산화적 반응에 따른 자가 폴리머라이제이션을 일으켜 폴리카프로락톤으로 구성된 마이크로니들 베이스 표면에 도파민 폴리머가 성장되어 코팅된다. 이에 따라 마이크로니들의 표면이 친수성을 나타내게 되고 동시에 접착력이 매우 높은 표면으로 개질된다. 이러한 표면 개질은, 이후에 사용될 피닷의 코팅을 용이하게 하고 접착력이 좋아 마이크로니들의 안정성을 향상시킨다.

한 구체예에서 마이크로니들 베이스에 접착성 고분자층을 형성하기 전에, 마이크로니들 베이스를 UV 처리 또는 오존 플라즈마 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. UV 처리 또는 오존 플라즈마 처리는 당업계에서 공지된 표면 개질 방법이며, 이를 통하여 추가될 전도성 고분자층의 표면 코팅 능력을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, UV 처리는 UVO cleaner 장비를 이용하여 25분 내지 35분 또는 30분 동안 UV를 처리함으로써 이루어질 수 있고, 오존 플라즈마 처리는 Reactive ion etching, RIE 장비(SNTEK BSC5004)를 이용하여 5 X 10^-6 torr 이하의 진공에서 산소 분위기 하에 파워 100으로 50초 내지 70초 또는 60초 동안 오존 플라즈마를 처리함으로써 이루어질 수 있다.

한 구체예에서, 전도성 고분자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리(1,4-페닐렌비닐렌)(poly(1,4-phenylenevinylene)), 폴리(1,4-페닐렌 설파이드)(poly(1,4-phenylene sulfide)), 폴리(플루오레닐렌에티닐렌)(poly(fluorenyleneethynylene)), 폴리아이소티아나프틴(polyisothianaphthene), 폴리티데닐렌 비닐(polythienylene vinylene), 폴리페닐린비닐(polyphenylene vinylene), 폴리페닐린설파이드(polyphenylene sulfide), 폴리헥실티오펜(polyhexylthiophene), 피닷(pedot), 또는 이들의 유도체일 수 있다. 피닷(Poly(3,4-ethylenedioxythiophene), PEDOT)은 파란색을 띠는 폴리머로서, 체내 무해하며 생체안정성이 좋으며 공정과정이 용이한 전도성 폴리머이다. 이러한 특성으로 인하여 피닷은 바이오센서, 반도체, 태양전지 등의 다양한 분야에서 센서의 채널 또는 전극의 용도로 이용된다. 피닷 폴리머의 체인은 파이 전자를 다량 가지고 있으며 다른 분자가 가진 파이 전자와 파이 파이 결합을 이루어 n 타입 또는 p 타입으로 도핑하면 피닷폴리머의 전도성에 영향을 미친다. 상기 피닷은 수용액 속에 계면활성제인 피에스에스와 섞인 용액상태로 존재하며 적정 범위의 분자량을 가진 폴리머를 사용하기 위하여 필터로 거른 뒤 친수성으로 바뀐 상기 도파민이 코팅된 마이크로 니들 위에 용액공정을 통하여 코팅한다.

한 구체예에서, 용액 공정은 접착성 고분자층이 형성된 마이크로니들 베이스를 전도성 고분자 용액에 침지하고, 건조하여 수행될 수 있다.

한 구체예에서, 철이온을 포함하는 일산화질소 결합성 분자는 중심에 파이전자를 가지는 포르피린링 또는 헤민분자일 수 있다. 헤모글로빈과 유사한 구조를 가진 헤민(Hemin) 분자는 중심에 3가 철이온이 있는 홀전자 오비탈 물질로서 체내에 있는 일산화질소를 빠르게 잡아내어 니트로화(nitrosylation)를 일으킨다. 헤민분자의 포르피린 링 중앙에 존재하는 여분의 파이 전자가 또 다른 파이전자과 결합하여 파이파이 결합을 이루며, 상기 피닷 폴리머 체인에 존재하는 수많은 여분의 파이전자와 결합하여 센서의 채널을 이룬다. 피닷 폴리머를 센서의 채널로 사용하게 되면 코팅하기 위하여 이용한 피닷피에스 1000 (Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Polystyrene sulfonate 1000, PEDOT: PSS 1000)의 본래적 성질인 친수성 경향성 때문에 공기 중에서 소량씩 분해가 일어나게 되게 되지만 소수성 분자인 헤민을 피닷층 위에 한층으로 코팅하게 되면 피닷 채널을 전체적으로 덮음으로써 채널의 손상을 막고 마이크로니들의 안정성이 증가한다.

상기 마이크로니들은 마이크로니들 패드 상에 형성될 수 있다. 마이크로니들 패드는 마이크로니들이 형성된 플레이트를 의미하고, 마이크로니들 패드에 전극을 증착함으로써, 마이크로니들에 센서의 기능을 부여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 마이크로니들은 마이크로니들 패드 상에 가로 세로 10개씩의 니들이 정사각형 형태로 존재하여 총 100 개의 니들이 형성될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 마이크로니들 및 전극을 포함하는 일산화질소 검출용 센서를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 마이크로니들이 형성된 마이크로니들 패드에 전극을 증착하는 것을 포함하는 일산화질소 검출용 센서의 제조방법을 제공한다.

한 구체예에서, 전극은 니켈, 크로뮴, 티타늄, 금, 은 및 백금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 니켈, 크로뮴, 티타늄 등은 금 또는 은 전극에 접착용 전극으로서 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 전극은 기준전극, 작업전극 및 상대전극을 포함할 수 있다

본 발명의 일산화질소 검출용 센서는 암세포 주변의 일산화질소의 양을 검출하여 암을 진단할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 마이크로니들 및 전극을 포함하는 암 진단용 센서를 제공한다.

식도암, 위암, 대장암 피부암 등 대부분의 암은 암세포의 전이와 자가세포소멸 과정을 위하여 유도 일산화질소 합성효소가 과다 발현되며 상기 유도 일산화질소 합성효소에 의해 암세포에서 일산화질소가 다량 분비된다. 암세포 주변 조직에는 항상 정상세포보다 1000배 이상의 일산화질소가 분비되어, 일산화질소의 농도가 마이크로 몰 수준의 높은 농도로 몇 일간 지속된다. 일산화질소는 아주 불안정한 상태의 라디칼 분자로서 체내에서 발생되면 혈관과 림프 그리고 조직 사이를 따라 빠르게 확산된다. 체내 환경에서 일산화질소가 혈액 속의 헤모글로빈과 만나게 되면 헤모글로빈의 철이온에 의해 일산화산소가 잡히게 되고, 소멸하게 된다.

즉, 암세포 주변에 존재하는 일산화질소의 양은 암을 진단할 수 있는 중요한 바이오마커이다. 본 발명의 마이크로니들을 포함하는 센서는 악성종양세포에서 다량 발생되는 바이오마커인 일산화질소의 양을 실시간으로 측정할 수 있어, 생물학적 유체 내에서, 비침습적인 방법으로 악성종양의 여부를 판별할 수 있다.

한 구체예에서, 암은 이에 제한되는 것은 아니나, 피부암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁암 또는 유방암일 수 있다.

도 1 및 도 2에 본 발명의 일 예에 따른 마이크로니들을 포함하는 일산화질소 검출용 센서를 나타내었다. 도 1은 본 발명의 마이크로니들 및 전극을 포함하는 일산화질소 검출용 센서를 보여준다. 도 2는 실제로 체외, 체내에 존재하는 일산화질소를 검출하기 위하여 구성된 센서의 예시적인 모습을 보여준다. 본 발명의 일산화질소 검출용 센서는 전기화학(electrochemical)적 센서로서, 마이크로 니들의 양끝과 바닥 부분에 티타늄, 크로뮴 및 금이 순차적으로 증착되어 총 3개의 전극을 형성하고, 각기 기준전극(reference electrode), 작업전극(working electrode), 상대전극(counter electrode)으로 기능하여 피닷과 헤민으로 된 채널에 흐르는 전류를 측정할 수 있다.

상기 피닷과 헤민분자의 파이파이 결합을 이룬 상태의 채널에 일산화질소가 헤민분자의 철분에 의해 잡히게 되면 피닷과 파이결합을 이루고 있는 헤민분자의 파이전자의 밀도가 바뀌게 되면서 피닷의 저항이 달라지게 된다.

보다 상세하게 헤민분자의 3가 철이온은 철이온의 4s 오비탈이 빈 상태이기 때문에 전자를 하나 받아서 안정해지고자 하는 성향이 있다. 그러므로 피닷의 폴리머 체인에 존재하는 다량의 파이전자와 결합을 하여 파이파이 결합을 이루면서 보다 안정한 상태를 이루게 된다. 헤민분자와의 파이파이 결합에 의하여 피닷 폴리머는 p 타입으로 도핑된 상태로 존재하며, 피닷 폴리머에 전도성을 제공하는 전자운반체는 체인을 따라 흐르는 정공(positive hole)이 된다. 이때 라디칼로 이루어진 일산화질소가 헤민분자에 다가오게 되면 헤민분자의 3가 철이온이 더 강한 결합을 이루게 되는 일산화질소의 전자를 받아들이게 되며 철이온의 전자밀도가 일부 일산화질소로부터 충전되어 분산되고, 그 전자밀도가 피닷의 폴리머 체인으로도 전달이 되어 피닷의 전자밀도가 높아지게 된다. 따라서 추가적인 전자 유입에 의해 p 타입으로 도핑되어 있던 피닷 폴리머 체인의 전자운반체인 정공이 전자와 결합하게 되고, 전자 운반체로서의 기능이 상쇄되면서 전자운반체의 밀도가 줄어들어 센서 채널의 저항이 증가하게 된다. 즉, 실시간으로 측정된 마이크로니들의 전류변화에 따른 저항의 감소 정도에 따라 일산화질소의 유무 및 양을 검출할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 마이크로니들의 높이는 300 내지 1000 마이크로미터, 400 내지 900 마이크로미터, 500 내지 800 마이크로미터, 550 내지 750 마이크로미터일 수 있다. 마이크로니들의 높이가 상기 범위일 때, 적용시 신경을 건드리지 않고, 피검자에게 고통을 주지 않으며, 충분히 피하층 내로 피부를 관통하여 피층으로 드러나는 종양 주변에 접근하기에 충분하다.

본 발명의 일산화질소 검출용 센서의 제조에 있어서, 마이크로니들 패드에 전극을 증착한 후에, 마이크로니들 부분을 제외하고 방수 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 방수 처리는 실리콘계 고분자, 파릴린(parylene)계 고분자, 비전도성 플라스틱, 또는 소수성 고분자 등의 방수처리용 고분자로 코팅함으로써 수행될 수 있다. 일산화질소 검출을 위한 피닷 코팅 영역을 제외하고, 상기 방수 처리용 고분자로 코팅함으로써, 센서에 방수 처리를 할 수 있다. 방수 처리용 고분자로 마이크로니들 센서의 채널 외 부분을 덮어주면 채널 외의 전극 부분이 직접적으로 일산화질소가 있는 수용액 또는 피부와 닿지 않으므로 큰 노이즈를 줄일 수 있으며 오직 채널에서 센싱되는 일산화질소만을 감지하는 형태를 가지기 때문에 검출 효율을 향상시킬 수 있다.

실리콘 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 시닐론 (Sinylon), 폴리우레테인 (Polyurethane), 에폭시(Epoxy), 폴리디메틸실록세인 (Polydimethylsiloxane), 데카메틸 사이클로펜타실록세인 (Decamethyl cyclopentasiloxane) 등을 포함한다. 파릴린계 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 파릴린-A, 파릴린-B, 파릴린-C 고분자 등을 포함한다.

본 발명의 마이크로니들 또는 일산화질소 검출용 센서는 생체에 무해한 재료들을 사용함으로써, 생체에 안전하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 센서는 그대로 피부에 적용할 수도 있고, 암 진단용 내시경에 부착되어 사용될 수도 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 상기 마이크로니들 또는 상기 일산화질소 검출용 센서를 포함하는 내시경을 제공한다. 도 2c는 본 발명의 마이크로니들 또는 일산화질소 검출용 센서가 장착된 내시경의 모습을 보여준다.

본 발명의 마이크로니들은 0.5 cm² 이하의 소형 사이즈로 내시경과 함께 제작될 수 있다. 상기 일산화질소 검출용 센서는 암의 진단을 위하여 통상적으로 사용되는 내시경에 전기적으로 연결된 뒤 부착될 수 있다. 일산화질소 검출용 센서를 내시경에 부착하는 방법은 공지된 통상의 방법을 제한 없이 이용할 수 있다.

예를 들어, 상기 일산화질소 검출용 센서는 내시경의 종류에 따라 호스형 또는 캡슐형으로 체내에 적용될 수 있으며, 체내 삽입시에는 마이크로 니들의 채널부분이 보호막에 의해 감싸진 채로 들어가게 되며 특정 조직을 센싱하기 직전에 보호막을 녹인 뒤 니들을 조직에 찔러, 일산화질소의 양을 검출할 수 있다.

본 발명의 마이크로니들 또는 일산화질소 검출용 센서는 기존의 체내 종양을 내시경으로 진단할 때 필요했던 번거롭고 시간이 오래 걸리는 조직검사를 대신할 수 있다. 본 발명의 마이크로니들 또는 일산화질소 검출용 센서를 포함하는 내시경은 내시경을 통하여 생체 내 종양세포로 추정되는 위치를 확인하고, 확인된 조직 주변의 일산화질소의 농도를 수용액 상태에서 전류흐름의 변화로 실시간으로 측정하여 편리하고 저비용으로 악성종양을 판별할 수 있다. 즉, 색소법으로 종양으로 의심되는 위치를 확인한 뒤 조직을 채취하는 대신 마이크로니들을 삽입하여 체내에서 바로 종양이 악성인지 양성인지를 구분해 낼 수 있다. 또한 실시간으로 측정된 마이크로니들의 전류변화에 따른 저항의 감소 정도에 따라 종양의 크기와 성장 정도를 예측하여 빠르고 쉽게 종양의 예후를 예측할 수 있다. 다양한 종양에 적용이 가능하기 때문에 다양한 종류의 내시경에 장착되어 복합적으로 종양의 특성을 진단해 낼 수 있다.

한 구체예에서, 내시경은, 이에 제한되는 것은 아니나, 위 내시경, 기관지 내시경, 대장 내시경, 식도 내시경, 십이지장 내시경, 방광 내시경, 복강 내시경, 흉강 내시경 또는 심장 내시경 등을 포함한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 도파민- 피닷 - 헤민 분자 채널 제작

분자량 8000kDa의 폴리카프로락톤 구슬을 가로 세로 10개씩의 니들형을 가진 피디엠에스 몰드에 0.5 g 가량 채운 뒤, 진공 조건 하에서 180 ℃ 오븐에서 3시간 가량 녹였다. 오븐에서 꺼낸 뒤 상온에서 식힌 마이크로니들 베이스를 몰드로부터 분리시켰다. 2 mg

ml^-1 농도의 도파민 염산염 (dopamine hydrochloride)을 pH 8.5, 1.0mM 농도의 트리스 완충액 (TRIS buffer) 에 용해하였다. 그리고 나서, 폴리카프로락톤 마이크로니들 베이스를 상기 용액에 넣고 37 ℃에서 24 시간 동안 흔들어 마이크로니들 베이스의 표면을 도파민으로 코팅하였다. 피닷 채널을 만들기 위하여 피닷 피에스에스 1000이 혼합된 용액을 0.45 mm 필터로 필터링한 후, 상기 용액을 도파민이 코팅된 마이크로니들 베이스 위에 덮고, 37℃ 오븐에서 건조하여 용액공정을 수행하였다. 마이크로니들의 표면에 전체적으로 폴리메틸메타아크릴레이트 (poly(methyl methacrylate), PMMA)로 코팅을 한 뒤, 이빔 리소그래피를 이용해 마이크로니들의 채널 부분만 노출시켰다. 다음으로 1mg/ml 농도의 디엠에스오(dimethyl sulfoxide, DMSO) 유기 용매에 용해시킨 헤민분자를 피닷 채널 위에 올리고, 24시간 동안 침적시켰다. 디엠에스오와 이소프로판알코올 용액으로 각 3회씩 세척하여, 결합되지 않은 헤민 분자를 피닷 채널로부터 제거하여, 도파민-피닷-헤민분자 채널을 제작하였다.

제조예 2. 마이크로니들 센서 제작

세 개의 전극을 제작하기 위하여 마이크로니들에 티타늄, 팔라듐, 그리고 금을 순차적으로 증착시켰다. 마이크로니들의 표면에 AZ4620 포토레지스터를 스핀 코팅하고 65℃ 오븐에서 20분 동안 구운 뒤 전극이 증착될 직사각형 모양의 부위만을 선택적으로 에칭하였다. 다음으로 이빔 증착기를 이용하여 티타늄, 팔라듐, 금을 각각 10nm, 10nm, 50nm로 증착시켰다. 그리고 나서, 이소프로판 알코올과 증류수로 세척하여, 불필요한 포토리지스트를 모두 에칭시켰다. 마지막으로 검출을 위한 피닷 채널을 제외한 부분을 방수처리하기 위하여 마이크로 니들의 피닷으로 코팅된 채널부위 (5X5mm) 를 제외하고 피디엠에스로 코팅한 후, 60 ℃ 오븐에서 굳혀, 마이크로니들 센서(1X1cm)를 제작하였다. 제조된 마이크로니들 센서의 구성을 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1은 일산화질소 검출을 위한 마이크로니들 센서의 단면도로, 폴리카프로락톤으로 된 마이크로니들 베이스 상에 도파민과 피닷이 순서대로 코팅되어 있으며 마이크로니들의 양 끝에는 티타늄(Ti), 크로뮴(Cr), 금 (Au)이 증착되어 각기 상대전극과 작업전극으로 사용된다. 마이크로니들의 뒷면에는 기준전극을 연결하기 위한 티타늄과 은 (Ag)이 증착되어 기준전극으로 사용된다.

도 2a는 본 발명의 마이크로니들을 포함한 일산화질소 검출용 센서의 구성의 일 예를 보여준다. 도 1에 나타낸 바와 같은 마이크로니들의 각 전극에 구리도선을 연결한 뒤 피디엠에스를 코팅하여 마이크로니들의 채널 외 부분을 방수처리 하여, 수용액 중에 존재하는 일산화질소양을 측정할 수 있다.

도 2b는 피부암이 유도된 마우스에 마이크로니들을 포함하는 센서를 삽입하는 모습의 일 예를 보여주는 것으로, 방수처리가 된 마이크로니들 부분의 채널 부위만 마우스 피부에 삽입 되도록 한다.

도 2c는 본 발명의 마이크로니들을 포함하는 센서를 내시경에 적용한 모습을 보여준다.

제조예 3. 일산화질소 제공 용액 제조

체외에서 일산화질소를 검출하기 위하여 디에틸 일산화염 (diethylamine NONOate sodium salt)을 10mM의 NaOH가 녹은 pH 7.4 10mM PBS 버퍼에 녹여 일산화질소 제공자로 사용하였다. 일산화염을 녹이기 전에, 10mM의 NaOH가 녹은 pH 7.4 10mM PBS 버퍼 용액을 질소로 2시간 동안 버블링 하여 산소를 모두 제거한 뒤, 센서에 일산화질소 검출 테스트를 하기 바로 직전에 일산화염을 녹여 일산화질소를 제공하였다.

제조예 4. 일산화질소를 방출하는 마크로파지 세포 처리

RAW 264.7 마크로파지 세포를 DMEM 세포배양 용액에서 하루 정도 성장시킨 뒤 첫 번째 그룹은 대조군으로 아무런 시약을 처리하지 않고, 두 번째 그룹은 일산화질소가 풍부한 그룹으로 일산화질소를 다량으로 유발시키기 위하여 리포다당류 (LPS)를 세포배양 용액에 0.5

ug/ml로 처리하고, 세 번째 그룹은 일산화질소의 양이 감소된 그룹으로, 리포다당류 0.5

ug/ml와 함께 100mM의 농도로 아미노구아니딘을 처리하였다.

제조예 5. 피부암 유도 마우스를 이용한 암세포 검출

피부암 마우스 모델을 만들기 위하여 SKH-1 마우스의 양쪽 등에 1X10⁷ 밀도의 B16F10 세포를 넣어주었다. 2주 후, 0.5cm³ 의 크기로 피부암세포가 충분히 성장하면 암세포 위의 피부를 에탄올로 깨끗이 닦고, 마이크로니들을 삽입하여 전류를 측정하였다.

실험예 1. 마이크로니들 센서 물성 테스트

1-1) 마이크로니들 센서의 표면 테스트

제조예 1에서 제조된 마이크로니들의 니들 끝 부분까지 전도성 피닷 채널이 잘 코팅이 되었는지 확인하기 위하여 광학현미경과 주사현미경으로 마이크로니들 센서의 표면을 관찰하였다. 그리고 피닷 채널 위에 코팅이 된 헤민분자를 관측하기 위하여 물질의 구성 원소와 상대적인 양을 분석할 수 있는 EDX 검출기를 이용하여 시료 표면과 전자 빔(beam)의 상호작용으로 방출되는 다양한 신호를 분석하고 characteristic X-ray를 검출하여 미세구조의 화학성분을 정성적으로 분석하여 헤민분자의 존재 유무를 확인하였다. 또한 마이크로니들 표면에 특성 X선을 입사하여 방출되는 광전자 에너지를 측정하여 시료 표면의 헤민분자가 가지고 있는 철분 조성과 화학적인 결합상태를 확인하기 위하여 XPS를 실시하였다.

1-2) 분석결과

그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 광학현미경 관찰 결과, 도 3a는 폴리카프로락톤으로 이루어진 마이크로니들 베이스를 보여준다. 도파민 코팅 없이 피닷을 용액가공하여 피닷만 코팅한 경우 완벽하지 못한 코팅이 됨을 알 수 있고(도 3b), 폴리카프로락톤에 도파민을 코팅하고(도 3c), 도파민을 코팅한 뒤 피닷을 용액가공하여 코팅한 경우(도 3d), 니들 끝 부분까지 잘 코팅되었음을 확인하였다.

주사현미경 관찰 결과, 폴리카프로락톤으로 만들어진 초기 마이크로니들(마이크로니들 베이스)은 표면이 깨끗하게 존재함을 확인하였다 (도 4a). 도파민 없이 피닷폴리머를 코팅한 마이크로니들과(도 4b)과 도파민을 코팅한 뒤 피닷을 코팅한 마이크로니들 (도4c)의 표면 모습 관찰 결과, 접착 기능을 하는 도파민을 코팅하여야 폴리카프로락톤 마이크로니들 베이스에서 피닷이 벗겨지지 않으며 마이크로니들의 끝 부분까지 피닷으로 코팅될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 광학현미경, 주사현미경 이미지로부터 도파민이 코팅된 마이크로 니들에 피닷 채널을 용액공정 하여야 마이크로니들로부터 피닷 채널이 분리되지 않으며 니들의 끝 부분까지 코팅이 잘 됨을 알 수 있었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, EDX 그래프로부터 spot size 4, 20keV의 에너지로 측정한 결과 매우 낮은 세기의 철분의 피크가 관측되었다. EDX 측정시 벌크한 재료라는 가정하에 구성원소들 간에 상대적인 양만을 비교하며, 0.1%이상 함유되어 있어야 피크를 얻을 수 있으므로 6.4eV근처의 위치에서 철분만의 고유한 피크가 나온 것으로부터 피닷 채널의 성분인 탄소, 산소, 황, 나트륨에 낮은 비율로 존재하지만 어느 정도의 충분한 양의 철분이 표면에 존재함을 알 수 있었다.

또한 도 6에 나타낸 바와 같이, XPS를 이용한 철분 분석 그래프로부터 마이크로니들 채널 위에 철분이 존재함을 확인하였다. 이는, 헤민기가 안정하게 피닷 위에 결합하였음을 의미한다. XPS에서 710eV근처의 에너지에서 피닷 분자와의 비공유결합을 의미하는 Fe2p의 피크가 관측되며 Fe2p₃ _/ ₂ 의 높은 값을 가지기 때문에 피닷 채널에 하나의 층으로 헤민분자가 유지됨을 알 수 있었다.

실험예 2. 마이크로니들의 기계적 성질

1-1) 마이크로니들의 강도 측정

마이크로니들의 기계적인 물성을 확인하기 위하여 강도측정, 파괴응력, 및 변형길이 (스트레인)에 따른 압력 (스트레스) 을 측정하였다. Instron eXpert 760 mechanical tester (ADMET)를 이용하여 0.5mm/min의 속도로 압축길이에 따른 힘의 변화그래프를 얻었고 이를 스트레인과 스트레스에 관한 그래프로 환산하여 압축상수를 얻었다. 또한 실질적으로 마우스의 피부에 삽입하여 피부에 생긴 구멍들을 광학현미경 (Optical microscope)으로 관측하였다.

1-2) 분석 결과

도 7a에 나타낸 바와 같이, 마이크로니들의 강도를 측정한 결과 압축길이에 따른 힘의 그래프로부터 니들 길이인 0.7mm위치에서 나타나는 파괴응력이 약 1.20 ± 0.11　N임을 알 수 있었다. 파괴응력이 1N 이상이라는 것은, 피부 안에서 결함없이 삽입될 수 있음을 의미한다.

또한 도 7b에 나타낸 바와 같이, 스트레스 스트레인 그래프로부터 초기에 일직선으로 나타나는 탄성구역이 얻어짐에 따라 압축응력이 약 162.5 ± 0.31 MPa 로서 기계적으로 강한 물성을 가짐을 확인하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 마이크로니들을 삽입한 마우스의 피부의 측면도(도 8a), 단면도(도 8b), 크리오섹션(도 8c) 분석을 통하여, 마이크로니들이 마우스 피부 상에 규칙적인 간격으로 균일하게 잘 찔렸음을 확인하였다.

실험예 3. 순환전류법을 이용한 마이크로니들 센서의 표면 성질

1-1) 순환전류법을 이용한 전압에 따른 전류 측정

센서의 표면 분석을 위하여 CHI 832 workstation (Shanghai Chenhua, China)을 이용하여, 도파민, 피닷, 헤민분자의 코팅 단계별로 순환전류를 측정하였다. 전해질로는 pH 7.4 PBS 버퍼 용액을 선택하였고, 스캔속도 50mV/s에서 수행하였다. 스캔속도에 따른 마이크로니들 센서의 순환전류 측정 그래프를 얻었다.

또한, PBS 버퍼 용액에 일산화질소를 농도별로 처리하고 순환전류를 측정하여 일산화질소의 산화환원 피크를 분석하였다.

마이크로니들 센서 표면의 저항을 측정하기 위하여 CHI 660 electrochemical workstation 를 이용하여 전기화학적 임피던스 스펙트럼 (electrochemical impedance spectroscopy, EIS)을 측정하였다. pH 7.4 PBS 버퍼 용액 내에서 0.1Hz에서 100KHz까지의 범위의 진동수에 따라 ac 5mV하에서 임피던스 스펙트럼을 측정하였다.

1-2) 분석결과

도 9에 나타낸 바와 같이, 순환전류측정에 따른 전압 전류 그래프로부터 폴리카프로락톤 마이크로니들과 도파민까지 코팅된 니들은 -2.0V 내지 1.0V의 전압의 범위에서 전류가 거의 흐르지 않음을 알 수 있었다. 반면에, 전도성 폴리머에서는 소량의 전류변화가 관찰되었다. 헤민기가 코팅된 니들의 경우는 전자를 잘 운반하는 헤민분자에 의해 전류 흐름이 증가하게 되고, 헤민기만의 고유한 산화 환원 피크를 관찰할 수 있었다. 헤민기만의 산화 환원 피크가 각 -0.4V와 -0.6V에서 관측되었다. 헤민기만의 산화 환원 피크는 3가 철이온에서 2가 철이온 상태로 가역적으로 바뀌었음을 의미한다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 스캔속도가 증가함에 따라 산화환원이 일어나는 피크의 전압 절대값이 증가하며 피크에서의 전류값 또한 증가하고, 전체적인 그래프의 전류값도 증가하였다. 이는 센서의 전기화학적인 특성이 잘 나타남을 의미한다. 도 10의 그래프에 삽입된 그래프는 스캔속도에 따른 산화 환원이 일어나는 전압을 도시한 그래프로서 산화되는 전압과 환원되는 전압 모두 1차 함수의 경향성을 가지는 것으로부터 전기화학적 센서의 표면이 전기화학적 성향을 잘 나타내고 있음을 의미한다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 일산화질소가 없는 환경에서는 헤민기의 산화환원 피크만 관찰되지만, 전해질에 일산화질소가 첨가되는 경우 -1.10V에서 일산화질소의 환원 피크도 관찰되었다. 또한 일산화질소의 농도가 높을수록 흐르는 전류의 값도 증가함을 알 수 있었다. 이는 피닷채널에 결합된 헤민분자가 선택적으로 일산화질소를 잡아내기 때문에 센서에 흐르는 전류의 양이 증가하는 것이다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 헤민기가 결합된 마이크로니들의 저항값이 450Ω, 피닷채널만 있는 마이크로니들의 저항값이 6000Ω 으로 헤민기까지 코팅이된 마이크로니들 센서의 표면 저항이 가장 작았다. 이는 헤민기가 EIS 측정시 전해질 속에서 전자운반을 하는데 큰 역할을 함을 의미한다.

실험예 4. 마이크로니들 안정성 테스트

1-1) 마이크로니들을 피부에 삽입하기 전 후의 피닷 채널의 표면 관찰

주사현미경을 통하여 마우스 피부에 삽입한 전후의 마이크로니들의 채널 표면을 관측하였다. 또한 마이크로니들센서를 5일간 디엠에스오 유기용매로 세척한 후, 실험예 3에서와 동일한 조건 하에서 순환전류측정을 하여 헤민분자의 산화환원 피크를 확인함을 통하여 헤민분자가 피닷채널에 잘 결합할 수 있는지 확인하였고, 상기와 같은 조건으로 순환전류측정을 50회 연속으로 하여 그래프의 변화를 살펴보았다.

1-2) 분석결과

피부에 삽입하기 전 후의 마이크로니들 표면의 상태를 주사현미경으로 관찰한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 표면의 큰 변화는 없었고 피닷 폴리머가 잘 결합되어 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 마이크로니들 삽입 전 후에 있어서 피닷 코팅층은 크게 손상되지 않았다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 순환전류 그래프에서도 유기용매로 5일간 세척한 후에도, 헤민기의 산화 환원 피크가 실험예 3에서와 동일한 위치에서 나타났으며, 도 15에 나타낸 바와 같이 50회 사이클을 거친 순환전류 그래프도 50회 때의 전류의 변화가 1회 때와 비교하여 약 2.7% 정도의 차이밖에 보이지 않음을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 마이크로니들 센서가 수용액 상에서 매우 안정한 상태임을 의미한다.

1-3) 피닷채널에 결합한 헤민분자 정량

마이크로니들에 부착된 헤민분자의 몰수를 계산하였다. 우선 디엠에스오에 녹은 헤민분자의 농도별로 UV 스펙트럼을 얻어 405nm에서의 흡광도 세기에 따라 헤민분자의 농도의 스탠다드를 얻었다. 다음으로 초기농도 1mg/ml, 0.1ml의 헤민분자 용액에 피닷채널이 코팅된 마이크로니들을 1일 동안 담근 후, 남은 용액 속에 있는 헤민분자의 농도를 UV 스펙트럼을 이용해 흡광도 세기를 측정하여, 헤민분자의 농도를 계산하였다.

1-4) 분석결과

UV 스펙트럼을 이용해 헤민분자의 농도를 다음의 수식을 따라 계산하였다.

이때

은 피닷채널 위에 결합한 표면적당의 헤민분자 농도이고,

은 피닷채널에 결합한 헤민분자의 총수, N _hemin0은 마이크로니들을 로딩하기 전 용액 속의 초기 헤민분자의 수, N _hemin1은 마이크로니들을 로딩한 후 남아있는 용액 속의 헤민분자의 수를 의미한다. N _hemin0 과 N _hemin1의 차는 마이크로니들에 결합한 헤민분자의 수를 나타낸다.

은 피닷채널의 면적으로 1 cm² 이며,

은 헤민기의 초기농도인 1mg/ml,

은 UV 스펙트럼으로 얻은 헤민분자의 농도이다. 위의 수식을 통해

이므로 헤민분자의 지름이 0.5nm인 것을 고려하면 상기 헤민분자의 농도는 피닷 채널 위에 모노레이어로 결합을 하고 있는 농도임을 알 수 있었다.

실험예 5. 마이크로니들 세포 독성 테스트

1-1) 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, MTT 테스트

마이크로니들의 코팅층 들의 세포 독성 정도를 측정하기 위하여 세포의 활성도를 측정하는 MTT 시약을 이용하였다. Raw 146.7 마크로파지 세포를 각각 폴리카프로락톤 마이크로니들, 도파민이 코팅된 마이크로니들, 피닷채널까지 코팅된 마이크로니들, 그리고 헤민기까지 코팅된 마이크로니들위에 동일한 수로 키우고, 1~2일 후 완전히 세포들이 부착된 후 0.2mm 필터로 걸러진 0.5 mg ml^-1농도의 MTT용액 150ml를 투여하였다. 37℃ 오븐에서 2시간 가량 가온하고, 니들 위의 용액을 모두 제거하였다. 그리고 나서 200ml의 디엠에스오를 넣어 보라색으로 색이 변한 세포들을 모두 녹인 뒤 540nm 파장대에서 ELISA 마이크로플레이트 리더 (Molecular devices, Versamax)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

1-2) 분석결과

도 16에 나타낸 바와 같이, 세포 생존능력 그래프를 보면 폴리카프로락톤과 도파민의 안정성이 각각 100%, 103.2% 정도로 거의 모두 생존하며, 피닷채널 위에서의 세포생존능력은 95.6%, 헤민분자까지 코팅된 마이크로니들 위에서의 세포생존능력은 102.3%으로 대부분의 세포가 마이크로니들위에서 잘 생존하는 것을 확인하였다. 이는 마이크로니들 센서는 세포 독성이 거의 없음을 의미한다.

실험예 6. 체외 일산화질소 검출 테스트

1-1) 실시간 체외 일산화질소 농도별 검출 테스트

도 2에 나타낸 바와 같이, 피디엠에스로 채널부분을 제외한 곳을 모두 덮은 마이크로니들을 이용하였다. 피디엠에스로 둘러싸인 채널은 피디엠에스 챔버에 2개의 구멍을 뚫은 후, 주사바늘에 각각 연결하여 한곳에서는 용액을 흘려 넣어주고 다른 곳에서는 용액이 빠져나가게 된다. 상기 제조예 3에 따라 1, 2, 4, 8, 16mM의 농도로 일산화질소용액을 만든 뒤 주사기를 이용해 마이크로니들의 채널부분으로 유입시켰다. 마이크로니들에 흐르는 전류의 측정은 챔버형으로 된 프루브 스테이션 (Lake shore probe station, Model TPP4)를 이용하여 용액의 증발을 최소화하고, 세 개의 프로브 탐침을 마이크로니들 센서의 세 전극과 연결한 뒤 작업전극과 상대전극에는 뒤 0.1V를 걸어주고 상대전극과 기준전극 사이에는 0.07V를 걸어 흐르는 전류값을 측정하였다. 상기 실험은 헤민기가 결합한 마이크로니들 센서와 헤민기를 연결하지 않고 피닷만 있는 마이크로니들 센서 두 가지를 동시에 진행하여 그래프를 얻었다.

1-2) 분석결과

도 17에 나타낸 바와 같이 일산화질소가 없는 용액을 마이크로니들 센서의 채널 위에 올린 채 평형을 이룬 상태의 전류값은 49.9 mA이며 헤민기가 연결되지 않은 마이크로니들 센서(W/O hemin)는 1, 2, 4, 8, 16 mM의 농도로 각각 제조된 일산화질소용액을 흘려주어도 그 값을 계속 유지하였다. 반면에 헤민분자가 연결된 마이크로니들 센서(W/hemin)는 1, 2, 4, 8, 16 mM의 농도로 각각 제조된 일산화질소용액을 주입하면 일산화질소의 농도에 비례하여 49.98 평형 전류값을 시작으로 순차적으로 49.01, 47.61, 45.31, 41.62, 33.89 uA로 낮아지게 되며 0.97, 1.40, 2.30, 3.69, 7.73 uA 만큼 전류가 감소함을 알 수 있었다. 이는 여분의 전자를 가지고 있는 라디칼 형태의 일산화질소의 농도가 높을수록 마이크로니들에 결합되어 있는 헤민분자가 많은 전자를 받아들이게 되고, 이로 인하여 p-type으로 도핑이 되어있는 피닷 채널의 전자 운반체인 정공의 수가 줄어들어 전도성이 감소함을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 마이크로니들 센서가 선택적으로 일산화질소를 잘 검출함을 알 수 있다.

실험예 7. 마이크로니들 센서의 선택성 테스트

1-1) 마이크로니들의 체내 다양한 다당류 및 단백질들에 대한 반응 측정

마이크로니들을 실질적으로 체내에 적용시키기에 앞서 체내에 존재하는 다양한 종류의 다당류와 높은 전자밀도를 가진 단백질들에 의해 마이크로니들 채널의 전도성이 변화하는 여부를 살펴보았다. 마이크로니들 센서에 갈락토오스, 글루코스, 철 3가 이온, 과산화수소, 오발부민 단백질, 라이소자임, 보바인세럼알부민단백질이 약 1 uM의 농도로 녹아있는 용액을 순서대로 흘려주었고, 마지막으로 일산화질소 1, 2 uM을 순서대로 흘러주었다.

1-2) 분석 결과

도 18에 나타낸 바와 같이, 갈락토오스, 글루코스, 철 3가 이온, 과산화수소, 오발부민 단백질, 라이소자임, 보바인세럼알부민단백질에 의하여 마이크로니들 센서의 전도성 변화가 관찰되지 않았고 초기의 마이크로니들의 평형 전류인 50.3 uA가 계속 유지됨을 확인하였다. 그러나, 일산화질소 1, 2 uM를 흘려준 경우에는 초기의 전류값에서 각각 1.01, 1.97 uA 씩 전류가 감소하여, 마이크로 니들의 전도성이 감소함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 헤민이 결합된 마이크로니들 센서가 일산화질소 선택적으로 검출할 수 있음을 의미한다.

1-3) 세포배양용액 (Dulbecco? modified eagle medium, DMEM)에서의 일산화질소 실시간 검출 테스트

상기 실험예 6에서 수행한 일산화질소 실시간 검출 테스트와 동일한 방법으로 PBS 용액을 DMEM으로 교체하여 수많은 단백질, 아미노산, 비타민, 무기염류들을 포함하고 있는 세포배양 용액에서 일산화질소 실시간 검출 테스트를 수행하였다.

1-4) 분석결과

도 19에 나타난 바와 같이 약간 불안정한 전류 변화를 보이기는 하나 1, 2, 4, 8, 16 mM의 농도로 제조된 일산화질소용액을 흘려주면 상기 실험예 6의 결과와 유사하게 초기 마이크로니들의 평형상태에서 흐르는 전류의 값인 51.19 에서 49.47, 46.99, 41.04, 30.01, 15.13 uA로 감소하였다. 즉, 흘려준 일산화질소의 농도에 비례하여 각 단계별로 약 1.72, 2.48, 5.95, 11.03, 14.88 uA씩 전류가 감소함을 알 수 있었다.

실험예 8. 그리스 시약 테스트

1-1) 일산화질소 농도 환산

제조예 4의 마크로파지 세포의 세 개의 그룹에서 방출되는 일산화질소의 실질적인 양을 알아보기 위하여, 그리스 시약 테스트를 이용하여, 정량화된 디에틸 일산화염에서 방출되는 일산화질소의 농도에 따른 용액의 540nm 파장대에서의 흡광도를 얻었다. 디에틸 일산화염을 이용하여 방출되는 일산화질소의 양을 250 uM 부터 1/2씩 계속 희석하여 총 11개의 농도에 따른 흡광도를 측정하였다. 다양한 농도의 디에틸 일산화염의 용액 100 ul를 그리스 시약 100 ul와 혼합한 10분 후, 540nm 파장대에서의 흡광도 세기값으로 스탠다드를 얻었다.

1-2) 분석결과

도 20에 나타낸 바와 같이, 일산화염의 다양한 농도에 따른 흡광도를 얻었으며, 그로부터 y = 0.0119x + 0.0479 관계식을 얻었다. 하기 실험예 9에서 세포로부터 나오는 일산화질소의 양을 정량하기 위하여 상기 관계식을 이용하였다.

실험예 9. 세포의 일산화질소 검출 테스트

1-1) 마크로파지 세포에서 발생되는 일산화질소 실시간 검출

살아있는 상태의 RAW 264.7 마크로파지 세포의 물질대사 과정에서 최대 나노 몰랄 정도의 일산화질소가 발생된다. 이 마크로파지를 성장시키는 세포미디어에 리포다당류를 처리하게 되면 일산화질소를 세포에서 만들어 내는 효소 중 한가지인 유도 일산화질소 생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 분화를 증가시켜 평소의 1000배 이상의 높은 농도의 일산화질소를 만들어 낸다. 또한 리포 다당류와 함께 아미노구아니딘을 처리해주면 리포다당류를 억제하여 세포에서 방출되는 일산화질소의 양이 다시 줄어들게 된다.

도 2a와 같이 피디엠에스로 채널 외 부위가 잘 몰딩이 된 마이크로 니들 위에 약 만마리의 세포를 하루 정도 배양한 뒤 3개의 그룹으로 나누어 아무것도 처리하지 않은 그룹과 리포다당류를 0.5 ug/ml로 처리한 그룹과 0.5 ug/ml 리포다당류 및 아미노구아니딘 100mM을 처리한 그룹을 만들고, 37℃ 인큐베이터에서 30시간 동안 활성화하여, 36시간 동안 충분한 일산화질소를 방출시켰다. 그리고 나서 마이크로니들 센서에 연결된 구리도선을 프루브스테이션에 연결하여 상기 실험예 6에서 하였던 전류측정방법과 동일하게 시행하였다. 헤민분자가 결합되지 않은 마이크로니들에도 똑같이 실험을 수행하였다.

1-2) 세 그룹의 세포에서 발생하는 일산화질소의 양 정량

리포다당류(LPS)와 아미노구아니딘의 농도에 따른 마크로파지의 일산화질소 생성 정도를 분석하기 위하여 그리스시약 테스트를 진행하였다. 세포배양용 6웰 플레이트에 만개의 마크로파지를 하루 동안 배양한 후, 리포다당류를 각 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/ml로 처리하고, 하루 뒤 그리스테스트를 하여 UV 스펙트럼으로부터 나오는 흡광도를 도 20에서 얻은 흡광도에 따른 일산화질소 농도 관계식을 이용하여 환산하여 도 21a 에 나타내었다. 또한 리포다당류를 0.5 ug/ml 처리한 그룹에 각각 아미노구아니딘을 25, 50, 100, 200, 400mM 처리하고 하루 뒤 동일한 방법으로 그리스테스트를 한 뒤 각 마크로파지세포 그룹에서 발생된 일산화질소의 양을 환산하여 도 21b에 나타내었다.

1-3) 분석결과

그 결과, 도 21a에 도시된 바와 같이, 리포다당류의 처리에 따라 마크로파지 세포에서 일산화질소가 발생함을 알 수 있었다. LPS를 0.5 um/ml 처리한 경우 가장 효율적으로 일산화질소가 발생하였다. 도 21a에 도시된 바와 같이, 아미노 구아니딘을 함께 처리한 경우, 아미노 구아니딘에 의하여 LPS가 억제되어 일산화질소 발생이 억제됨을 알 수 있었다.

도 22에 도시된 바와 같이 헤민분자가 없는 마이크로니들센서의 경우 초기의 마이크로니들 평형전류값을 계속 유지하고 마크로파지의 일산화질소를 검출하지 못하였다. 헤민분자가 결합된 마이크로니들센서의 경우 마크로파지세포에서 방출되는 일산화질소를 실시간으로 검출할 수 있었다. 시약이 처리되지 않은 그룹에서는 약 0.97, 리포다당류가 처리된 그룹에서는 4.93, 리포다당류와 아미노구아니딘이 같이 처리된 그룹에서는 1.03 uA 정도의 전류감소가 발생하였다. 이는 마크로파지에서 방출된 일산화질소에 의한 마이크로니들 채널의 전도성 감소로 볼 수 있다. 전류의 감소양으로부터 환산된 일산화질소 방출량은 각 0.97, 4.93, 1.03 uM로 계산되며 이는 상기 1-2에서 실시한 그리스시약 테스트를 통해 환산한 마크로파지에서 방출되는 일산화질소의 양인 0.96, 5.57, 0.68 uM과 아주 유사한 값임을 확인할 수 있었다 (도 23).

실험예 10. 체내 일산화질소 검출 테스트

1-1) 피부암이 유도된 마우스를 이용한 일산화질소 실시간 측정

헤민분자가 연결된 마이크로니들과 헤민분자가 연결되지 않은 마이크로니들을 피부암세포가 성장된 부위에 찔러 실시간 전류 변화를 측정하였다. 대조군으로는 피부암이 유도되지 않은 일반마우스를 이용하였다.

1-2) 분석결과

도 24는 피부암에 걸린 마우스의 피부조직을 관찰한 것으로, 마우스 피부조직에 마이크로니들을 포함하는 센서를 적용하여 검출하는 모습을 보여준다.

도 25에 나타낸 바와 같이 헤민분자가 연결된 마이크로니들 센서의 경우 피부암이 유도되지 않은 일반마우스의 피부에 삽입하였을 때 약 2.92 uA 정도의 전류감소가 나타났다. 그리고 다시 평형을 찾은 후 피부암이 있는 마우스의 피부에 삽입되었을 때 7.98 uA 전류감소를 보였다. 헤민분자 없이 피닷으로만 된 마이크로니들 센서의 경우 일반마우스와 피부암이 유도된 마우스에 삽입하였을 때 각 2.87 mA 와 2.57 mA 로 유사한 값의 전류감소를 보였다. 헤민분자가 없는 마이크로니들의 저항변화는 헤민분자가 결합한 마이크로니들을 일반마우스에 삽입하였을 때 발생하는 저항변화와 동일한 수준으로 일반마우스에 삽입하여 생기는 전류변화값은 오직 피부와의 접촉에 의한 저항 증가임을 알 수 있다. 즉, 일반마우스에 삽입한 경우에 발생한 전류감소 (t= 85 s)는 마이크로니들 채널의 피부삽입에 의한 접촉 저항 증가로 볼 수 있다. 그러므로 마이크로니들 센서를 피부암세포에 삽입하여 피부암 주위의 조직에 존재하는 일산화질소를 검출하여 변화한 알짜 전류 변화값은 피부 접촉에 의한 전류증가 값을 제외한 7.98 uA - 2.92 uA =5.06 uA 로 추정할 수 있었다.

일반마우스 피부와 피부암세포가 유도된 마우스의 피부에 반복적으로 헤민분자가 연결된 마이크로니들 센서를 삽입하여 전류의 감소를 측정한 결과를 도 26에 나타내었다. 마찬가지로 일반마우스에 삽입되었을 경우 발생하는 접촉에 의한 저항 증가보다 피부암이 유도된 마우스에 삽입한 경우 2배 이상의 전류 감소가 발생함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명의 마이크로니들 센서가 충분히 반복적으로 암세포 주변에 다량으로 방출되는 일산화질소를 실시간으로 검출할 수 있음을 의미한다.

Claims

마이크로니들 베이스; 접착성 고분자층; 전도성 고분자층; 및 철이온을 포함하는 일산화질소 결합성 분자층이 순서대로 적층되어 있는 마이크로니들.
제1항에 있어서,
마이크로니들 베이스는 폴리비닐알코올(Polyvinylalcohol), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리락타이드(Polylactide), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene oxide), 폴리디옥사논(Polydioxanone), 폴리포스파젠(Polyphosphazene), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리아크릴레이트(Polyacrylate), 폴리아크릴아미드(Polyacrylamide), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리실록산(Polysiloxane), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone),폴리메틸메타아크릴레이트(Polymethylmethacrylate), 폴리에틸렌(polyeyhylene), 폴리아미드(Polyamide), 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxanes), 폴리에스터(polyester), 폴리오르토에스터(polyorthoester),폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchrolide),폴리메틸펜텐(polymethylpentene), 폴리니트로벤질(polynitrobenzyl),폴리아미노에스터(polyaminoester) 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트(Cellulose acetate butyrate), 셀룰로오스 트리아세테이트(Cellulose triacetate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 테플론(polytetrafluornehylene), 스테인리스 스틸(stainless steel), 실리콘(silicon), 실리콘옥사이드(silicon oxide), 알루미늄(aluminium), 알루미늄옥사이드(aluminium oxide), 니켈 옥사이드 및 SU-8 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 이루어지는 것인 마이크로니들.
제1항에 있어서,
접착성 고분자는 키토산(chitosan), 실크(silk), 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 고무(rubber) 및 폴리도파민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 마이크로니들.
제1항에 있어서,
전도성 고분자는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리(1,4-페닐렌비닐렌)(poly(1,4-phenylenevinylene)), 폴리(1,4-페닐렌 설파이드)(poly(1,4-phenylene sulfide)), 폴리(플루오레닐렌에티닐렌)(poly(fluorenyleneethynylene)), 폴리아이소티아나프틴(polyisothianaphthene), 폴리티에닐렌 비닐(polythienylene vinylene), 폴리페닐린비닐(polyphenylene vinylene), 폴리페닐린설파이드(polyphenylene sulfide), 폴리헥실티오펜(polyhexylthiophene), 피닷(pedot) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 마이크로니들.
제1항에 있어서,
철이온을 포함하는 일산화질소 결합성 분자는 중심에 파이전자를 가지는 포르피린링 또는 헤민분자인 마이크로니들.
제1항의 마이크로니들 및 전극을 포함하는 일산화질소 검출용 센서.
제6항에 있어서, 전극은 니켈, 크로뮴, 티타늄, 금, 은 및 백금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 이루어지는 것인 일산화질소 검출용 센서.
제6항에 있어서, 전극은 기준전극, 작업전극 및 상대전극을 포함하는 일산화질소 검출용 센서.
제1항의 마이크로니들 및 전극을 포함하는 암 진단용 센서.
제9항에 있어서, 암은 피부암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁암 또는 유방암인 암 진단용 센서.
제1항의 마이크로니들, 제6항의 일산화질소 검출용 센서 또는 제9항의 암 진단용 센서를 포함하는 내시경.
제11항에 있어서, 내시경은 위 내시경, 기관지 내시경, 대장 내시경, 식도 내시경, 십이지장 내시경, 방광 내시경, 복강 내시경, 흉강 내시경 또는 심장 내시경인 내시경.
마이크로니들 베이스 및 접착성 고분자를 혼합하여 상기 마이크로니들 베이스에 접착성 고분자층을 형성하는 단계; 상기 접착성 고분자층 및 전도성 고분자 용액을 접촉시켜 용액 공정을 통하여 상기 접착성 고분자층에 전도성 고분자층을 형성하는 단계; 및 상기 전도성 고분자층 및 철이온을 포함하는 일산화질소 결합성 분자를 접촉시켜 상기 전도성 고분자층에 일산화질소 결합층을 형성하는 단계를 포함하는 마이크로니들의 제조방법.
제13항에 있어서, 마이크로니들 베이스에 접착성 고분자층을 형성하기 전에, 마이크로니들 베이스를 UV 처리 또는 오존 플라즈마 처리하는 것을 추가로 포함하는 마이크로니들의 제조방법.
제13항에 있어서, 용액 공정은 접착성 고분자층이 형성된 마이크로니들 베이스를 전도성 고분자 용액에 침지하고, 건조하여 수행되는 것인 마이크로니들의 제조방법.
제13항의 마이크로니들이 형성된 마이크로니들 패드에 전극을 증착하는 것을 포함하는 일산화질소 검출용 센서의 제조방법.
제16항에 있어서, 마이크로니들 부분을 제외하고 방수 처리하는 것을 추가로 포함하는 일산화질소 검출용 센서의 제조방법.
제17항에 있어서, 방수 처리는 실리콘계 고분자, 파릴린(Parylene)계 고분자, 비전도성 플라스틱 및 소수성 고분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 코팅함으로써 수행되는 것인 일산화질소 검출용 센서의 제조방법.