KR101605123B1 - 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체 함유 배과피농축액 및 상기 배과피농축액을 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배 과피로부터 유용화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체 함유 배과피농축액 및 그 배과피농축액으로부터 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체를 정제할 수 있는 정제방법에 관한 것이다.

Description

트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체 함유 배과피농축액 및 상기 배과피농축액을 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체 정제방법{Concentrated pear peel extract including triterpenoids and its caffeoyl derivatives, and isolation method for triterpenoids and its caffeoyl derivatives from the same}

본 발명은 배 과피로부터 유용화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체 함유 배과피농축액 및 그 배과피농축액으로부터 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일 유도체를 정제할 수 있는 정제방법에 관한 것이다.

배는 장미과(Rosaceae) 배나무속(Pyrus)에 속하는 교목성 낙엽과수로서 약 30여 종이 분포하고 있으나 세계적으로 재배되는 기본종은 한국과 일본에서 주로 재배되는 일본배(P. pyrifolia N.), 중국에서 재배되는 중국배(P. ussuriensis M.), 그리고 유럽과 미국에서 재배되는 서양배(P. communis L.)의 세 가지로 대별된다[농촌진흥청, 표준영농교본-13(개정판), 배재배, 2000].

또한 배는 전국적으로 소비되고 있는 4대 과실 중의 하나로 기호도가 높아 대부분 생과로 소비되고 있다. 그리고 한국과 중국을 포함한 아시아에서는 예로부터 배 과실을 이뇨, 변비, 감기 등을 다루는 전통적 민간요법의 소재로도 이용하여 왔다(Cui, T 등 J. Agric. Food Chem. 53, 3882-3887, 2005).

이와 같은 배경을 바탕으로 최근 배 함유 유용성분에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그 과정을 통해 hydroxycinnamoylmalic acids 및 그 methyl esters (J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 10124-10128), flavonoid를 포함한 다양한 페놀성 화합물(Food Sci. Biotechnol. 20(6): 1539-1545 (2011); Food Sci. Biotechnol. 22(3): 803-810 (2013)), β-sitosterol과 그 배당체(KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 45, No. 5, pp. 1~8 (2013))의 존재가 밝혀져 왔다. 그에 더하여 배의 과피 및 배 미성숙과에 다량 함유된 주요성분들의 고순도 정제법이 확립되기도 하였다(Food Sci. Biotechnol. 20(3): 801-807 (2011); Food Sci. Biotechnol. 22(6): 1-7 (2013) DOI 10.1007/s10068-013-0249-8).

이와 같은 일련의 연구를 통해 지금까지 배에 유용 생리활성 화합물이 함유되어있지 않을 것이라는 인식과는 달리 배에도 유용 성분이 다종ㆍ다량 함유되어있음이 체계적으로 밝혀지게 되었다. 또 최근에 중국배(Pyrus bretschneideri Rehd.)로부터 9β,19α-dihydroxy ursolic acid와 α-amyrin의 2종의 triterpenoid 유도체들이 anti-inflamatory 및 anti-microbial 활성 화합물로 단리된 바 있다(Food and Chemical Toxicology 50, 3673-3679, 2012).

한편, triterpenoid계 화합물은 항산화, 항균 및 면역력 향상 효과 등이 있음이 이미 잘 알려져 있다(J. Agric. Food Chem. 58, 8983-8987, 2010; J. Agric. Food Chem. 60, 8737-8744, 2012; Food Chem. Toxicol. 50, 3673-3679, 2012). 또한 카페오일 유도체도 항산화, 항균 및 면역력 향상 효과 등이 있음이 알려져 있다.

따라서, 트리터페노이드계 화합물 또는 카페오일유도체가 함유된 천연물을 확인하고, 그 천연물로부터 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체를 포함한 유용물질의 대량정제가 가능한 기술이 개발될 필요가 있다.

본 발명자들은 다수의 연구 결과 배 과피에 트리터페노이드계 화합물은 물론 그 카페오일유도체가 함유된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 배 과피에 항산화, 항균 및 면역력 향상 효과 등이 있는 유용물질로 작용할 수 있는 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체가 함유된 것을 확인하고 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체 정제시 사용될 수 있는 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체가 상당량 함유된 배과피농축물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 배과피농축물로부터 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체를 간편하게 분리할 수 있는 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐기물로 버려지는 배과피를 재활용하여 식품 및 의약품 첨가제 등으로 사용될 수 있는 고부가가치의 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체를 정제할 수 있는 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 먼저, 본 발명은 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde), 루페올(lupeol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 3-O-시스-카페오일 베툴린산(3-O-cis-caffeoyl betulinic acid), 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산(3-O-trans-caffeoyl betulinic acid), 카페오일 올레아놀산(caffeoyl oleanolic acid), 및 베툴린산(betulinic acid)을 포함하는 배과피농축물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 배과피농축물은 신선 배과피를 용매로 추출하여 얻어진 추출물을 농축한 것이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 배과피농축물은 상기 신선 배과피 15000중량부 당 상기 베툴린 알데하이드 0.00339중량부 이상, 상기 루페올 0.00340중량부 이상, 상기 베타-시토스테롤0.00270중량부 이상, 상기 3-O-시스-카페오일 베툴린산 0.00164중량부 이상, 상기 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산 0.530중량부 이상, 상기 카페오일 올레아놀산0.00285중량부이상, 및 상기 베툴린산 0.00184중량부 이상 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 용매는 메탄올이다.

또한, 본 발명은 배과피농축물을 준비하는 단계; 상기 배과피농축물을 1차 용매분획하는 단계; 상기 1차 용매분획의 용매층을 완충액으로 2차 용매분획하는 단계; 상기 2차 용매분획의 용매층을 완충액으로 3차 용매분획하는 단계; 상기 3차 용매분획의 수용액층을 4차용매분획하는 단계; 상기 4차 용매분획의 용매층을 1차 정제하는 단계; 상기 1차 정제단계에서 얻어진 특정획분을 대상으로 2차 정제하는 단계; 및 상기 2차 정제단계에서 얻어진 특정획분을 대상으로 3차 정제하는 단계;를 포함하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 배과피농축물은 배과피와 알코올을 균질하게 섞은 후 흡입 여과하여 얻어진 여과액을 진공농축하여 얻어진다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 알코올은 메탄올이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 1차 용매분획단계는 상기 배과피농축물을 산성 완충용액으로 현탁액을 조제하는 단계와 상기 현탁액을 용매로 복수 회 용매분획하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 2차 용매분획단계는 약염기성 완충용액으로 복수 회 용매분획하는 단계가 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 3차 용매분획단계는 강염기성 완충용액으로 복수 회 용매분획하는 단계가 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 4차 용매분획단계는 상기 3차 용매분획에서 얻어진 수용액의 pH를 약산성으로 조절하는 단계와 상기 pH조절된 수용액층을 복수 회 용매분획하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 1차 정제단계는 충진제로 silica gel을 사용하고, n-hexane, 에틸아세테이트 및 알코올 중 하나 이상이 포함된 혼합용액을 용출용매로 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 이루어진다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 2차 정제단계는 충진제로 Sephadex LH-20을 사용하고, 알코올수용액을 용출용매로 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 이루어진다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 알코올수용액은 농도가 70 내지 95%인 메탄올수용액이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 3차 정제단계는 상기 2차 정제단계에서 얻어진 특정획분에 대해 ODS 칼럼 크로마토그래피 또는 분취용 고속액체크로마토그래피가 더 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 ODS 칼럼 크로마토그래피가 수행된 후 얻어진 획분을 대상으로 TLC 분석을 더 수행하여 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde), 루페올(lupeol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol)이 정제된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피는 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min, 254 nm 파장인 조건에서 수행되어 t _R 19.2 분에 용출된 피크분인 정제된 3-O-시스-카페오일 베툴린산(3-O-cis-caffeoyl betulinic acid)을 얻도록 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피는 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min, 254 nm 파장인 조건에서 수행되어 t _R 20.9 분에 용출된 피크분인 정제된 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산(3-O-trans-caffeoyl betulinic acid)을 얻도록 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피는 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min, 254 nm 파장인 조건에서 수행되어 t _R 24.4 분에 용출된 피크분인 정제된 카페오일 올레아놀산(caffeoyl oleanolic acid)을 얻도록 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피는 일정용매조성용출법에 의해 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피는 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min, 254 nm 파장인 조건에서 수행되어 t _R 32.8 분에 용출된 피크분인 정제된 베툴린산(betulinic acid)을 얻도록 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피는 농도가 낮은 용매로 시작하여 일정시간 후에 농도가 높은 용매가 되도록 구배용출법에 의해 용출시킨 후 농도가 높은 용매의 용출을 유지시켜 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 용매는 에틸아세테이트이다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명에 의하면 배 과피에 항산화, 항균 및 면역력 향상 효과 등이 있는 유용물질로 작용할 수 있는 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체가 함유된 것을 확인할 수 있으며, 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체가 상당량 함유된 배과피농축물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 배과피농축물로부터 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체를 간편하게 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 폐기물로 버려지는 배과피를 재활용하여 식품 및 의약품 첨가제 등으로 사용될 수 있는 고부가가치의 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체를 정제할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 배과피로부터 항산화 화합물들이 함유된 배과피농축물을 준비하고, 그 배과피농축물로부터 트리터페노이드계화합물( 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 7) 및 그 카페오일유도체(화합물 4 내지 화합물 6)를 단리, 정제하는 정제방법에 대한 흐름도이다.
도 2는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행하는 과정에서 배과피농축물의 에틸아세테이트 페놀성획분의 silica gel 컬럼 크로마토그래피 후 얻어진 획분 C-6을 대상으로 고속액체크로마토그래피를 수행하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 3은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행하는 과정에서 배과피농축물의 에틸아세테이트 페놀성획분의 silica gel 컬럼 크로마토그래피 후 얻어진 획분 C-5를 대상으로 고속액체크로마토그래피를 수행하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 4는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 6은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 1의 구조해석 결과 동정된 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 7은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 8은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 9는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 2의 구조해석 결과 동정된 루페올(lupeol)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 10은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 3의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 11은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-4획분에서 단리된 화합물 3의 구조해석 결과 동정된 베타-시토스테롤(β-sitosterol)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 12는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 4의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 13은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 4의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 14는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 4의 구조해석 결과 동정된 3-O-시스-카페오일 베툴린산(3-O-cis-caffeoyl betulinic acid)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 15는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 5의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 16은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 5의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 17은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 5의 구조해석 결과 동정된 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산(3-O-trans-caffeoyl betulinic acid)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 18은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 6의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 19는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 6의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 20은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-6획분에서 단리된 화합물 6의 구조해석 결과 동정된 카페오일 올레아놀산(caffeoyl oleanolic acid)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 21은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-5획분에서 단리된 화합물 7의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 22는 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-5획분에서 단리된 화합물 7의 ¹³C-NMR 스펙트라이다.
도 23은 도 1에 도시된 방법으로 정제를 수행한 결과 C-5획분에서 단리된 화합물 7의 구조해석 결과 동정된 베툴린산(betulinic acid)의 구조식을 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

먼저, 본 발명의 기술적 특징은 폐기물로 버려지는 배과피에 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체이 함유된 것을 확인한 것에 있다. 또한, 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체가 상당량 함유된 배과피농축물에 있다.

따라서, 본 발명은 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체 특히 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde), 루페올(lupeol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 3-O-시스-카페오일 베툴린산(3-O-cis-caffeoyl betulinic acid), 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산(3-O-trans-caffeoyl betulinic acid), 카페오일 올레아놀산(caffeoyl oleanolic acid), 및 베툴린산(betulinic acid)을 포함하는 배과피농축물을 제공한다.

본 발명에서 배과피농축물은 신선 배과피를 용매로 추출하여 얻어진 추출물을 농축한 것으로서, 신선 배과피 15000중량부 당 베툴린 알데하이드 0.00339중량부 이상 포함할 수 있다. 또한, 루페올은 0.00340중량부 이상 포함할 수 있고, 베타-시토스테롤은 0.00270중량부 이상 포함할 수 있으며, 3-O-시스-카페오일 베툴린산은 0.00164중량부 이상 포함할 수 있고, 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산은 0.530중량부 이상 포함할 수 있으며, 카페오일 올레아놀산은 0.00285중량부 이상 포함할 수 있고, 베툴린산은 0.00184중량부 이상 포함할 수 있다. 이 때 용매는 알코올일 수 있는데 예를 들어 메탄올일 수 있다.

또한, 본 발명의 기술적 특징은 배과피농축물로부터 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체를 단리, 정제하는 정제방법에 있다.

따라서, 본 발명의 트리터페노이드계 화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법은 배과피농축물을 준비하는 단계; 배과피농축물을 1차 용매분획하는 단계; 1차 용매분획의 용매층을 완충액으로 2차 용매분획하는 단계; 2차 용매분획의 용매층을 완충액으로 3차 용매분획하는 단계; 3차 용매분획의 수용액층을 4차용매분획하는 단계; 4차 용매분획의 용매층을 1차 정제하는 단계; 1차 정제단계에서 얻어진 특정획분을 대상으로 2차 정제하는 단계; 및 2차 정제단계에서 얻어진 특정획분을 대상으로 3차 정제하는 단계를 포함한다.

여기서, 배과피농축물은 배과피와 알코올을 균질하게 섞은 후 흡입 여과하여 얻어진 여과액을 진공농축하여 얻어지는데, 이 때 분리된 잔사에 대해서도 균질화와 여과를 수회 시행하여 얻어진 여과액을 더하여 진공농축하여 배과피농축물을 얻을 수도 있다. 배과피농축물 준비단계에서 사용되는 알코올은 예를 들어 메탄올일 수 있다.

1차 용매분획단계는 배과피농축물을 산성 완충용액으로 현탁액을 조제하는 단계와 현탁액을 용매로 복수 회 용매분획하는 단계를 포함하는데, 산성 완충용액은 완충작용을 할 수 있고 산성을 띠기만 하면 제한되지 않지만 예를 들어 pH 3.0의 0.2 M 글라이신이 사용될 수 있다. 또한 용매분획은 에틸아세테이트를 이용하여 수회 예를 들어 3회 수행될 수 있다.

이와 같이 1차 용매분획단계가 수행되면 수용액층과 용매층 즉 에틸아세테이트층을 얻을 수 있는데, 2차용매분획단계는 에틸아세테이트층을 대상으로 수행되는 것이다.

2차용매분획단계는 용매층을 대상으로 약염기성 완충용액을 이용하여 복수 회 용매분획하는 단계가 수행되는데, 약염기성 완충용액 또한 완충작용을 할 수 있고 pH가 7보다 크고 9보다 작은 염기성을 띠기만 하면 제한되지 않지만 예를 들어 pH 8.0의 0.2 M 인산나트륨 용액일 수 있다.

이와 같이 2차 용매분획단계가 수행되면 수용액층과 용매층 즉 에틸아세테이트층을 얻을 수 있는데, 3차용매분획단계 또한 용매층을 대상으로 수행된다.

3차용매분획단계는 용매층을 대상으로 강염기성 완충용액을 이용하여 복수 회 용매분획하는 단계가 수행되는데, 강염기성 완충용액 또한 완충작용을 할 수 있고 pH가 10보다 큰 염기성을 띠기만 하면 제한되지 않지만 예를 들어 pH 12.0의 0.2 M KCl과 0.2 M NaOH의 혼합용액일 수 있다.

이와 같이 3차 용매분획단계가 수행되면 수용액층과 용매층 즉 에틸아세테이트층을 얻을 수 있는데, 4차용매분획단계는 수용액층을 대상으로 수행된다.

4차 용매분획단계는 3차 용매분획의 수용액층의 pH를 약산성으로 조절하는 단계와 상기 pH조절된 수용액층을 복수 회 용매분획하는 단계를 포함한다. 이 때 수용액층의 pH를 약산성으로 조절하기 위하여 산을 가할 수 있는데 예를 들어 1.0 N HCl용액이 사용하여 pH를 6으로 조절할 수 있다. 용매분획은 에틸아세테이트를 이용하여 수회 예를 들어 3회 수행될 수 있다. 이와 같이 4차 용매분획단계가 수행되면 물층과 에틸아세테이트층 즉 에틸아세테이트 페놀성획분을 얻을 수 있다.

1차 정제단계는 4차 용매분획 분 중 용매층 즉 에틸아세테이트 페놀성획분을 대상으로 하여 충진제로 silica gel을 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 이루어지는데, n-hexane, 에틸아세테이트 및 알코올 중 하나 이상이 포함된 혼합용액을 용출용매로 사용할 수 있다. 예를 들어 n-hexane, 에틸아세테이트 및 알코올이 6:4:0, 4:6:0, 2:8:0, 0:10:0, 0:9:1, 0:8:2, 0:7:3, 0:6:4, 0:5:5, 0:0:10의 부피비로 혼합된 혼합용액이 사용될 수 있다. 이와 같이 충진제로 silica gel을 사용하는 컬럼크로마토그래피를 수행한 후 TLC분석에 의해 함유성분들의 존재경향이 유사한 획분들끼리 grouping하여 얻어진 획분 A~T를 대상으로 prep-HPLC를 이용하여 분석을 행하였다. 다른 획분에 비해 비교적 순도가 높은 화합물들이 존재하고 있음이 시사된 획분 C가 최적 획분임을 확인하였다.

2차 정제단계는 1차 정제단계에서 얻어진 특정획분 특히 획분 C를 대상으로 하여 충진제로 Sephadex LH-20을 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 이루어지는데, 알코올수용액을 용출용매로 사용할 수 있다. 예를 들어 알코올수용액으로서 농도가 70 내지 95%인 메탄올수용액이 사용될 수 있다. 이와 같이 충진제로 Sephadex LH-20을 사용하는 컬럼크로마토그래피가 수행되면 C-1부터 C-12까지 12개 획분을 얻을 수 있다. 모든 획분에 대해 분석한 후 도 1에 도시된 바와 같이 C-4, C-5, 및 C-6획분이 최적 획분임을 확인하였다.

3차 정제단계는 2차 정제단계에서 얻어진 특정획분 즉 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피에서 얻어진 용출획분 특히 C-4, C-5, C-6획분 중 어느 하나의 획분에 대해 ODS 칼럼 크로마토그래피 또는 분취용 고속액체크로마토그래피가 더 수행되는 것이다.

먼저, C-4 획분을 대상으로 ODS 칼럼 크로마토그래피를 수행한 후 얻어진 획분을 대상으로 TLC 분석을 더 수행하면 비교적 순도가 높다고 판단된 획분을 3그룹으로 얻을 수 있고, 각각의 그룹은 후술하는 바와 같이 화합물1 내지 화합물 3인 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde), 루페올(lupeol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol)이었다.

또한, C-6획분을 대상으로 분취용 고속액체크로마토그래피가 수행될 수 있는데, 예를 들어 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min 으로 분취를 실시하였고, 일정용매조성용출법을 이용하였으며, 254 nm 파장인 검출조건에서 수행하여 3개의 획분을 나누어 분취하여 3개의 카페오일유도체를 정제하였다. 즉, 도 2에 도시된 바와 같이 t _R 19.2 분에 용출된 피크분, t _R 20.9 분에 용출된 피크분 및 t _R 24.4 분에 용출된 피크분을 얻었는데, 각각의 피크분은 각각 화합물 4인 정제된 3-O-시스-카페오일 베툴린산(3-O-cis-caffeoyl betulinic acid), 화합물 5인 정제된 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산 및 화합물 6인 정제된 카페오일 올레아놀산(caffeoyl oleanolic acid)인 것으로 후술하는 바와 같이 밝혀졌다.

또한, C-5획분을 대상으로 분취용 고속액체크로마토그래피가 수행될 수 있는데, 예를 들어 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min 으로 분취를 실시하였고, 254 nm 파장인 검출조건에서 수행하였다. 이 때 용매조건은 농도가 낮은 용매로 시작하여 일정시간 후에 농도가 높은 용매가 되도록 구배용출법에 의해 용출시킨 후 농도가 높은 용매의 용출을 유지시켜 수행하는 것일 수 있다. 이 때 용매조건은 A용매로 시작하여 40분에 B용매가 되도록 하여 B용매를 20분간 유지시키는 gradient용출법을 이용하여 용출시킬 수 있는데, 예를 들어 A용매(H₂O/MeCN = 35:65)로 시작하여 30분에 B용매(H₂O/MeCN = 5:95)가 되도록 gradient 용출법에 의해 용출시킨 다음, B용매의 용출을 20분간 유지시키는 시스템일 수 있다. 이와 같이 고속액체크로마토그래피를 수행하면서 특히 t _R 32.3 분에 용출된 피크분을 단리할 수 있는데, 도 4에 도시된 바와 같이 t _R 32.8 분에 용출된 피크분이 정제된 베툴린산(betulinic acid)이다.

한편, 후술하는 실시예에서는 배의 외과피(껍질)만을 예시하였으나 내과피를 제외하는 것은 아니다.

실시예 1. 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 함유 배과피농축물 준비

추황배(Pyrus pyrifolia Nakai cv. chuwhangbae)는 전남 나주에서 9월에 수확한 것을 사용하였다. 먼저, 배를 약 3 mm 두께로 과피(15 kg, 신선중량)를 분리한 다음, 얻어진 과피를 세절 후, MeOH 24.3 L와 함께 균질화(BM-2 Nissei boi-mixer, Nihonseiki Kaiseiki LTD., Japan)하고 흡입여과(No. 2, Whatman)하여 여과액과 잔사를 분리하였다. 이어, 회수한 잔사에 MeOH 10.5 L를 가하여 균질화와 여과를 재차 행한 후, 얻어진 여과액을 합해 진공농축하여 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체를 포함하는 배과피농축물(3708.67g)을 얻었다.

실시예 2. 배과피농축물로터 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제

도 1에 도시된 절차를 다음과 같이 수행하여 배과피로부터 실시예 1과 같이 배과피농축물을 얻고, 배과피농축물로부터 7종의 천연 트리터페노이드계화합물(화합물 1 내지 3, 화합물 7) 및 카페오일유도체(화합물 4 내지 6)를 수득하였다.

1. 배과피농축물을 1차 내지 4차 용매분획하는 단계

실시예 1에서 준비된 배과피농축물(3708.67 g)을 대상으로 다음과 같이 해리성을 이용한 용매분획을 3회에 걸쳐 실시하여 도 2에 도시된 바와 같이 3개의 H₂O층과 BuOH층, EtOAc 산성획분, EtOAc 중성획분, EtOAc 페놀성획분을 얻었다.

① 배과피농축물을 1차 용매분획하는 단계

배과피농축물(3708.67 g)을 pH 3.0의 buffer 용액(0.2M glycine-0.2M HCl)으로 현탁액(6 L)을 조제하여 에틸아세테이트(EtOAc) 6 L로 3회 용매분획하여 수용액층과 용매층을 분리하여 얻고, 용매층인 에틸아세테이트층(EtOAc층)을 선택하였다.

② 1차 용매분획의 용매층을 완충액으로 2차 용매분획하는 단계

선택된 EtOAc층은 pH 8.0의 buffer 용액(0.2 M Na₂HPO₄-0.2 M NaH₂PO₄, 6 L)과 함께 용매분획하여 수용액층과 용매층인 EtOAc층으로 분리하여 얻었다.

또한, 비교를 위해 1차 용매분획의 수용액층에 water-saturated nbutanol (BuOH, 6L)을 가하여 3회 반복 용매분획한 후 물층(H₂0층:2005.89g)과 BuOH층(157.52g)을 얻었다.

③ 2차 용매분획의 용매층을 3차 용매분획하는 단계

2차 용매분획에서 얻어진 EtOAc층을 pH 12.0의 buffer 용액(0.2 M KCl-0.2 M NaOH, 6 L)과 함께 용매분획하여 수용액층과 EtOAc 중성획분(44.84g)을 얻었다.

또한, 비교를 위해 2차 용매분획을 통해 얻어진 수용액층을 1.0 N HCl용액을 이용하여 pH 3.0으로 조정한 후, 6 L의 EtOAc로 3회 반복하여 용매분획함으로써 H₂O층(214.34g)과 EtOAc 산성획분(5.168g)을 얻었다.

④ 3차 용매분획의 수용액층을 4차 용매분획하는 단계

3차 용매분획에서 얻어진 수용액층을 1.0 N HCl용액으로 pH 6.0으로 조정한 후, 6 L의 EtOAc로 3회 반복 용매분획하여 H₂O층(109.02g)과 EtOAc 페놀성 획분(2.38g)을 얻었다.

2. 4차 용매분획의 용매층인 EtOAc 페놀성 획분을 정제하는 단계

① 1차 정제단계: silica gel 컬럼크로마토그래피

4차 용매분획의 용매층인 EtOAc 페놀성 획분을 silica gel (70-230 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)column chromatography를 행하여 정제하였다. 즉 EtOAc 페놀성 획분(2.38 g)을 silica gel이 충진된 column (2.8×38 cm)에 charge시켜 n-hexane/EtOAc/MeOH=6:4:0, 4:6:0, 2:8:0, 0:10:0, 0:9:1, 0:8:2, 0:7:3, 0:6:4, 0:5:5, 그리고 0:0:10 (v/v/v)의 용액을 이동상으로 하여 step-wise법을 이용하여 용출시키면서 200 mL씩 분획하였다. 분획한 획분들을 대상으로, TLC분석에 의해 함유성분들의 존재경향이 유사한 획분들끼리 grouping하여 획분 A~T를 얻었다. 얻어진 획분 A~T를 대상으로 prep-HPLC를 이용하여 정제를 행하였다. 다른 획분에 비해 비교적 순도가 높은 화합물들이 존재하고 있음이 시사된 획분 C가 2차 정제단계를 수행하기 위한 대상으로 선정되었다.

② 2차 정제단계: Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피

1차 정제단계에서 선택된 획분 C를 대상으로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 즉, Sephadex LH-20이 충진된 column (2.0×40 cm)에 획분 C 시료를 charge한 다음, MeOH/BuOH=50:50(v/v)을 용매계로 하여 분리된 획분 C-1 내지 C-12를 얻었다.

③ 3차 정제단계: ODS 칼럼 크로마토그래피 또는 분취용 고속액체크로마토그래피

a. ODS 칼럼 크로마토그래피

2차 정제단계에서 얻어진 획분 중 C-4 (102 mg)를 대상으로 ODS column chromatography를 행하여 재정제하였다. 이후 얻어진 각 획분들을 대상으로 TLC분석을 행하고, 그들 중 비교적 순도가 높다고 판단된 획분 60~63을 화합물 1 (3.39 mg)로, 81~90을 화합물 2 (3.40 mg)로, 101~104를 화합물 3 (2.70 mg)으로 각각 칭하였다.

b. 고속액체크로마토그래피

2차 정제단계에서 얻어진 획분 중 C-6(15 mg)을 대상으로 prep-HPLC를 이용하여 정제하였다. 컬럼은 ODS컬럼[Shim-pack Prep-ODS (H) KIT, 20 Ø × 250 mm]을 사용하였고, 유속 9.9 mL/min (LC-6AD, Shimadzu, Japan)의 조건에서 분취를 실시하였다. 용매조건은 85% MeCN을 이용하여 isocratic 용출법에 의하여 용출시켰으며, 254 nm (SPD-M20A, Shimadzu, Japan)의 파장에서 검출을 행하였다(도 2). 그 결과, 획분 C-6을 3개의 획분으로 나누어 분취하였으며, 그들 중 획분 C-6-1을 화합물 4 (t _R 19.2 min, 1.64 mg)로, 획분 C-6-2를 화합물 5 (t _R 20.9 min, 5.30 mg)로, 그리고 획분 C-6-3을 화합물 6 (t _R 24.4 min, 2.85 mg)으로 각각 칭하였다.

c. 고속액체크로마토그래피

2차 정제단계에서 얻어진 획분 중 C-5(29 mg)를 대상으로 prep-HPLC를 이용하여 정제를 행하였다. HPLC는 ODS컬럼[Shim-pack Prep-ODS (H) KIT, 20 Ø × 250 mm]을 사용하였고, A용매(H₂O/MeCN = 35:65)로 시작하여 30분에 B용매(H₂O/MeCN = 5:95)가 되도록 gradient 용출법에 의해 용출시킨 다음, B용매의 용출을 20분간 유지시키는 시스템을 사용하였다. 그리고 254 nm (SPD-M20A, Shimadzu, Japan)의 파장과 유속 9.9 mL/min (LC-6AD, Shimadzu, Japan)의 조건에서 분석을 실시하였다. 그 결과 획분 C-5를 1~6의 6개의 획분으로 분취하였으며, 그 중 비교적 순도가 높다고 판단된 C-5-4를 화합물 7 (t _R 32.8 min, 1.84 mg)로 칭하였다(도 3).

실험예 1

실시예 2에서 silica gel 컬럼크로마토그래피를 통해 얻어진 A 내지 T획분 중 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체가 존재하는 획분을 확인하기 위해 다음과 같이 분석하였다.

항산화 활성의 평가를 위한 assay는 silica gel TLC plate에 평가 대상 획분을 spotting한 후에 적합한 전개용매로 전개를 행한 다음, 건조된 plate 위에 200 μM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ethanol 용액을 분무하여 DPPH 고유의 보라색이 탈색되어지는 정도에 따라 활성을 비교하는 방법을 이용하였는데, C획분이 가장 강한 항산화활성을 나타내었다.

실험예 2

실시예 2에서 단리된 화합물 1 내지 7의 정확한 구조 확인과 동정을 위하여 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR분석을 다음과 같이 수행하고, 그 결과를 도 4 내지 도 23에 나타내었다. 단리된 활성 화합물의 ¹H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance), ¹³C-NMR 및 2D-NMR 분석은 FT-NMR 기기(^unitINOVA 500, Varian, Walnut Creek, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.

1. 화합물 1의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물1의 ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃)분석결과는 도 4에 도시된 바와 같이 δ 3.19 (1H, dd, J = 11.5, 4.5 Hz, H-3), 2.87 (1H, m, H-19), 0.92 (3H, s, H-23), 0.76 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H-25), 0.98 (3H, s, H-26), 0.97 (3H, s, H-27), 9.68 (1H, s, H-28), 4.63 (1H, s, H-29a), 4.76 (1H, s, H-29b), 1.70 (3H, s, H-30)이며, ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃)의 분석결과는 도 5에 도시된 바와 같이 38.8 (C-1), 27.4 (C-2), 79.1 (C-3), 38.9 (C-4), 55.3 (C-5), 18.3 (C-6), 34.4 (C-7), 40.9 (C-8), 50.5 (C-9), 37.2 (C-10), 20.8 (C-11), 25.6 (C-12), 38.7 (C-13), 42.6 (C-14), 29.3 (C-15), 28.9 (C-16), 59.4 (C-17), 48.1 (C-18), 47.6 (C-19), 149.8 (C-20), 29.8 (C-21), 33.3 (C-22), 28.0 (C-23), 15.4 (C-24), 15.9 (C-25), 16.2 (C-26), 14.2 (C-27), 206.8 (C-28), 110.2 (C-29), 19.1 (C-30)이다.

도 4에 도시된 ¹H-NMR(500 MHz, CDCl₃) 분석결과로부터 관찰된 이중결합과 aldehyde기의 존재를 시사하는 3종의 sp ² carbon proton signal들[δ 4.63 (1H, s, H-29a), 4.76 (1H, s, H-29b) 및 9.68 (1H, s, H-28)], 및 sp ³ carbon proton signal들 중에 6종의 methyl기의 존재를 시사하는 signal들[δ 0.92 (3H, s, H-23), 0.76 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H-25), 0.98 (3H, s, H-26), 0.97 (3H, s, H-27), 1.70 (3H, s, H-30)]로부터, 화합물 1은 triterpenoid계의 화합물일 것으로 시사되었다.

또한 ¹³C-NMR spectrum (125 MHz, CDCl₃)으로부터 총 30개의 carbon signal이 관찰되었다. 그 중 3종의 sp ² carbon signal들[δ 110.2 (C-29), 149.8 (C-20), 206.8 (C-28)]에 있어 δ 206.8의 carbon signal은 1종의 aldehyde의 존재를 시사했으며,δ110.2와 149.8은 이중결합의 존재를 시사하였다. 또 1종의 oxygenated- methine carbon signal (δ 79.1, C-3)이 검출되어 1종의 hydroxyl기가 존재하는 것을 확인하였다. 이들의 결과로부터 화합물 1은 betulin aldehyde일 가능성이 강하게 시사되었다. 그래서 기존의 문헌과의 비교를 통하여 data가 일치함이 확인되어, 화합물 1을 도 6에 도시된 구조식을 갖는 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde)로 동정하였다. 본 화합물은 배에서는 처음으로 동정되었다.

2. 화합물 2의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물 2의 ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃)분석결과는 도 7에 도시된 바와 같이 δ 3.18 (1H, dd, J = 11.5, 5.0 Hz, H-3), 0.96 (3H, s, H-23), 0.76 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H-25), 1.02 (3H, s, H-26), 0.94 (3H, s, H-27), 0.78 (1H, s, H-28), 4.69 (1H, m, H-29a), 4.56 (1H, m, H-29b), 1.68 (3H, s, H-30)이며, ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃)의 분석결과는 도 8에 도시된 바와 같이 38.7 (C-1), 27.4 (C-2), 79.0 (C-3), 38.8 (C-4), 55.2 (C-5), 18.3 (C-6), 34.2 (C-7), 40.8 (C-8), 50.4 (C-9), 37.1 (C-10), 20.9 (C-11), 25.1 (C-12), 38.0 (C-13), 42.8 (C-14), 27.3 (C-15), 35.5 (C-16), 43.0 (C-17), 48.2 (C-18), 48.0 (C-19), 151.0 (C-20), 29.8 (C-21), 40.0 (C-22), 28.0 (C-23), 15.4 (C-24), 16.1 (C-25), 16.0 (C-26), 14.5 (C-27), 18.0 (C-28), 109.3 (C-29), 19.3 (C-30)이다.

도 7에 도시된 ¹H-NMR(500 MHz, CDCl₃)분석결과는 화합물 1의 spectrum과 매우 유사한 패턴을 보였다. 화합물 1은 6종의 methyl기를 포함하였고, 1종의 aldehyde기가 존재한 반면, 화합물 2의 ¹H-NMR spectrum으로부터 7종의 methyl기의 signal들[δ 0.96 (3H, s, H-23), 0.76 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H-25), 1.02 (3H, s, H-26), 0.94 (3H, s, H-27), 0.78 (H, s, H-28), 1.68 (3H, s, H-30)]이 관찰되었고 aldehyde기의 존재는 관찰되지 않았다. 그래서 화합물 2는 betulin aldehyde의 구조에 있어 aldehyde기가 methyl기로 치환된 화합물일 것으로 시사되었다.

또한 도 8에 도시된 ¹³C-NMR spectrum (125 MHz, CDCl₃)으로부터도 ¹H-NMR 결과와 동일한 결과를 얻었다. 즉, 30종의 carbon peak가 관찰되었으며, 이들 중에 δ 78.9 (C-3)의 signal과 이중결합의 signal들[δ 151.0 (C-20) 및 109.3 (C-29)]이 관찰된 것으로부터 화합물 2는 lupeol일 가능성이 시사되었다. 그래서 보고된 문헌과의 비교를 통해서 data의 일치성이 확인되어, 화합물 2를 도 9에 도시된 구조식을 갖는 lupeol로 동정하였다. 본 화합물은 배에서는 처음으로 동정되었다.

3. 화합물 3의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물3의 ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃)분석결과는 δ 3.53 (1H, m, H-3), 5.36 (1H, br. d, J = 5.0 Hz, H-6), 0.68 (3H, s, H-18), 1.01 (3H, s, H-19), 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-21), 0.83 (3H, d, J = 7.3 Hz, H-26), 0.81 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-27), 0.85 (3H, m, H-29)이며, ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃)의 분석결과는 도 10에 도시된 바와 같이 37.2 (C-1), 31.6 (C-2), 71.8 (C-3), 42.2 (C-4), 140.7 (C-5), 121.7 (C-6), 31.8 (C-7), 31.8 (C-8), 50.0 (C-9), 36.4 (C-10), 21.0 (C-11), 39.7 (C-12), 42.2 (C-13), 56.8 (C-14), 24.2 (C-15), 28.2 (C-16), 56.1 (C-17), 11.8 (C-18), 19.3 (C-19), 36.1 (C-20), 18.7 (C-21), 33.8 (C-22), 25.9 (C-23), 45.7 (C-24), 29.0 (C-25), 19.8 (C-26), 18.9 (C-27), 23.0 (C-28), 11.9 (C-29)이다.

¹H-NMR(500 MHz, CDCl₃)분석결과로부터 1종의 sp ² carbon proton signal [δ 5.36 (1H, br. d, J = 5.0 Hz, H-6)]과 1종의 oxygenataed-methine proton signal [δ 3.53 (1H, m, H-3)]이 관찰되었다. 그리고 6종의 methyl기[δ 0.68 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, m, H-27), 0.83 (3H, m, H-26), 0.85 (3H, m, H-29), 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz), 1.01 (3H, s, H-19)]의 존재가 관찰되었다. 이 결과로부터 화합물 3은 sterol류인 sitosterol일 가능성이 시사되었다.

도 10에 도시된 화합물 3의 ¹³C-NMR spectrum(125 MHz, CDCl₃)으로부터 총 29종의 carbon signal들이 관찰되었고, δ 71.8 (C-3)의 존재로부터 1종의 hydroxyl기가 존재하는 화합물일 가능성이 시사되었다. ¹³C-NMR의 결과는 ¹H-NMR의 결과와 일치하여, 이 화합물 3은 β-sitosterol일 것으로 추측되었다. 그래서 기존의 data와 비교한 결과, 그들의 일치성이 확인되어 화합물 3을 도 11에 도시된 구조식을 갖는 β-sitosterol로 동정하였다. 본 화합물 또한 배에서는 처음으로 동정되었다.

4. 화합물 4의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물4의 ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD)분석결과는 도 12에 도시된 바와 같이 δ 7.28 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'), 7.00 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.80 (1H, d, J = 13.2 Hz, H-7'), 6.72 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 5.74(1H, d, J = 13.2 Hz, H-8'), 4.71 (1H, s, H-29a), 4.59 (1H, s, H-29b), 4.49 (1H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz, H-3), 1.70 (3H, s, H-30), 1.02 (3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-27), 0.89 (3H, s, H-26), 0.85 (3H, s, H-24), 0.78 (3H, s, H-25)이며, ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD)의 분석결과는 도 13에 도시된 바와 같이 39.8 (C-1), 24.8 (C-2), 82.4 (C-3), 39.1 (C-4), 57.1 (C-5), 19.4 (C-6), 35.6 (C-7), 42.1 (C-8), 52.0 (C-9), 38.3 (C-10), 22.3 (C-11), 27.0 (C-12), 39.8 (C-13), 43.7 (C-14), 30.9 (C-15), 33.5 (C-16), 57.7 (C-17), 50.6 (C-18), 48.4 (C-19), 152.2 (C-20), 31.8 (C-21), 38.4 (C-22), 28.7 (C-23), 16.8 (C-24), 17.1 (C-25), 16.9 (C-26), 15.3 (C-27), 180.3 (C-28), 110.3 (C-29), 19.7 (C-30), 117.6 (C-1'), 144.9 (C-2'), 148.2 (C-3'), 115.8 (C-4'), 124.7 (C-5'), 128.5 (C-6'), 145.9 (C-7'), 118.6 (C-8'), 168.6 (C-9')이다.

도 12에 도시된 화합물 4의 ¹H-NMR spectrum (600 MHz, CD₃OD)으로부터 3종의 sp ² carbon proton signal들[δ 6.72 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 7.00 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6'), 7.28 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2')]이 검출되어 3치환체 벤젠환의 존재가 시사되었고, 또 다른 2종의 sp ² carbon proton signal들[δ 5.74 (1H, d, J = 13.2 Hz, H-8'), 6.80 (1H, d, J = 13.2 Hz, H-7')]의 coupling constant 값(J = 13.2 Hz)으로부터 cis 형태의 olefinic double bond의 존재가 시사되어 화합물 4는 cis 형태의 caffeic acid를 부분구조로 이루어진 화합물임이 추측되었다. 그리고 6종의 methyl기의 signal들과 δ 4.59 (H-3)의 존재는 전형적인 triterpene의 골격으로서 본 화합물이 betulinic acid일 가능성이 강하게 시사되었다. 이를 종합해보면, 화합물 4는 betulinic acid와 caffeic acid가 ester 결합한 화합물로 추측되었다.

또한, 도 13에 도시된 ¹³C-NMR spectrum (125 MHz, CD₃OD)으로부터 총 30종의 carbon signal들이 관찰되었고, δ 180.3 (C-28)의 signal로부터 carboxyl기의 존재가 시사되었다. 또한 δ 82.4 (C-3)의 존재는 부분구조들 사이에 ester 결합이 있음을 시사하였다. 이상의 결과로부터 화합물 4는 3-O-cis-caffeoyl betulinic acid인 것으로 판단되어, 보고된 문헌과의 비교를 행한 결과, data의 일치성이 확인되어 화합물 4를 도 14에 도시된 구조식을 갖는 3-O-cis-caffeoyl betulinic acid 로 동정하였다. 본 화합물 또한 배에서는 처음으로 동정되었다.

5. 화합물 5의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물5의 ¹H-NMR (500 MHz, pyridine-d ₅)분석결과는 도 15에 도시된 바와 같이 δ 8.05 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7'), 7.68 (1H, br. s, H-2'), 7.24 (1H, br. s, H-6'), 7.20 (1H, br. s, H-5'), 6.71 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8'), 4.97 (1H, s, H-29a), 4.87 (1H, m, H-3), 4.77 (1H, s, H-29b), 1.79 (3H, s, H-30), 1.09 (3H, s, H-27), 1.04 (3H, s, H-26), 0.94 (6H, s, H-23, 24), 0.78 (3H, s, H-25)이며, ¹³C-NMR (150 MHz, pyridine-d ₅)의 분석결과는 도 16에 도시된 바와 같이 38.6 (C-1), 24.3 (C-2), 80.4 (C-3), 38.3 (C-4), 55.7 (C-5), 18.5 (C-6), 34.6 (C-7), 41.1 (C-8), 50.7 (C-9), 37.3 (C-10), 21.2 (C-11), 26.0 (C-12), 38.6 (C-13), 42.9 (C-14), 30.3 (C-15), 32.8 (C-16), 56.6 (C-17), 49.7 (C-18), 47.8 (C-19), 151.3 (C-20), 31.2 (C-21), 37.6 (C-22), 28.1 (C-23), 16.3 (C-24), 16.9 (C-25), 16.3 (C-26), 14.9 (C-27), 178.9 (C-28), 110.0 (C-29), 19.5 (C-30), 115.9 (C-1'), 147.7 (C-2'), 150.5 (C-3'), 116.8 (C-4'), 122.1 (C-5'), 127.0 (C-6'), 145.7 (C-7'), 115.7 (C-8'), 167.4 (C-9')이다.

도 15에 도시된 화합물 5의 ¹H-NMR (600 MHz, pyridine-d ₅) spectrum은 화합물 4의 패턴과 매유 유사하였다. 다만, 화합물 4는 olefinic double bond가 cis 형태인 반면에, 화합물 5에서는 olefinic double bond의 존재를 시사하는 2종의 sp ² carbon proton signal들[δ 6.71 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8'), 8.05 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7')]의 coupling constant 값(J)이 16.2 Hz로 확인되어 이 olefinic double bond가 trans 형태로 존재함이 확인되었다. 이 결과로부터, 화합물 5는 trans 형태의 caffeoyl betulinic acid일 가능성이 시사되었다.

또한, 도 16에 도시된 화합물 5의 ¹³C-NMR spectrum (125 MHz, pyridine-d ₅)에서도 동일한 결과가 얻어졌다. 또한 ESI-MS (positive) spectrum에서는 pseudomolecular ion peak로 m/z 641 [M+Na]⁺이 관찰되어 이 화합물의 추정 구조의 분자량(618)과 일치하였다. 따라서, 화합물 5를 도 17에 도시된 구조식을 갖는 3-O-trans-caffeoyl betulinic acid로 동정하였다.

6. 화합물 6의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물 6의 ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD)분석결과는 도 18에 도시된 바와 같이 δ 2.86 (2H, dd, J = 13.8, 3.6 Hz, H-2), 4.57 (1H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz, H-3), 5.25 (1H, t, J = 3.3 Hz, H-12), 1.28 (3H, s, H-23), 0.91 (3H, s, H-24), 1.00 (3H, s, H-25), 0.97 (3H, s, H-26), 1.18 (3H, s, H-27), 0.94 (3H, s, H-29), 0.83 (3H, s, H-30), 7.03 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2'), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.94 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-6'), 7.52 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7'), 6.24 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8')이며, ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD)의 분석결과는 도 19에 도시된 바와 같이 39.5 (C-1), 24.8 (C-2), 82.4 (C-3), 39.1 (C-4), 57.0 (C-5), 19.5 (C-6), 34.1 (C-7), 40.7 (C-8), 48.8 (C-9), 38.3 (C-10), 24.7 (C-11), 123.6 (C-12), 145.4 (C-13), 43.1 (C-14), 29.0 (C-15), 24.2 (C-16), 47.8 (C-17), 43.0 (C-18), 47.4 (C-19), 31.8 (C-20), 35.1 (C-21), 34.0 (C-22), 28.8 (C-23), 17.5 (C-24), 16.1 (C-25), 17.8 (C-26), 26.6 (C-27), 182.2 (C-28), 33.7 (C-29), 24.1 (C-30), 127.8 (C-1'), 115.2 (C-2'), 146.9 (C-3'), 149.7 (C-4'), 116.7 (C-5'), 123.1 (C-6'), 146.8 (C-7'), 115.7 (C-8'), 169.3 (C-9')이다.

도 18에 도시된 화합물 6의 ¹H-NMR spectrum (600 MHz, CD₃OD)으로부터 δ 0.83 (3H, s, H-30), 0.91 (3H, s, H-24), 0.94 (3H, s, H-29), 0.97 (3H, s, H-26), 1.00 (3H, s, H-25), 1.18 (3H, s, H-27), 그리고 1.28 (3H, s, H-23)의 7종의 methyl기의 존재가 관찰되었다. 그리고 3종의 sp ² carbon proton signal들[δ 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.94 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-6'), 7.03 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2')]은 3치환체 벤젠환의 존재를 시사하였으며, 2종의 sp ² carbon proton signal들[δ 6.24 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8')과 7.52 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7')로부터 trans 형태의 caffeic acid의 존재가 시사되었고, δ 4.57 (1H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz, H-3)의 존재로부터 화합물 6은 caffeic acid와 oleanolic acid가 ester 결합되어져 있는 화합물로 추측되어졌다.

또한 도 19에 도시된 화합물 6의 ¹³C-NMR spectrum (125 MHz, CD₃OD)에서 총 30종의 carbon signal들이 관찰되었고, 2종의 carboxyl기[δ 182.02 (C-28) 및 169.3 (C-9')], 1종의 olefinic double bond [δ 123.6 (C-12), 145.4 (C-13)]의 존재가 관찰되었다. 이 결과들로부터 화합물 6은 caffeoyl oleanolic acid일 가능성이 시사되었고, ESI-MS spectrum (positive)으로부터 pseudomolecular ion peak로 m/z 641 [M+Na]⁺이 관찰되어 이 화합물의 추정 구조의 분자량(618)과 일치하였다. 또한 기존 문헌과의 data 일치성이 확인되어 화합물 6을 도 20에 도시된 구조식을 갖는 3-O-caffeoyl oleanolic acid로 동정하였다.

7. 화합물 7의 구조 확인 및 동정

단리된 화합물 7의 ¹H-NMR (600 MHz, pyridine-d ₅)분석결과는 도 21에 도시된 바와 같이 δ 3.47 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-3), 1.78 (1H, t, J = 11.4 Hz, H-18), 1.24 (3H, s, H-23), 1.00 (3H, s, H-24), 0.84 (3H, s, H-25), 1.07 (3H, s, H-26), 1.08 (3H, s, H-27), 4.97 (1H, s, H-29a), 4.79 (1H, s, H-29b), 1.81 (3H, s, H-30)이며, ¹³C-NMR (150 MHz, pyridine-d ₅)의 분석결과는 도 22에 도시된 바와 같이 39.6 (C-1), 28.7 (C-2), 78.5 (C-3), 39.9 (C-4), 56.3 (C-5), 19.1 (C-6), 35.2 (C-7), 41.5 (C-8), 51.3 (C-9), 37.9 (C-10), 21.5 (C-11), 26.5 (C-12), 39.0 (C-13), 43.2 (C-14), 30.6 (C-15), 33.2 (C-16), 57.0 (C-17), 50.1 (C-18), 48.1 (C-19), 151.7 (C-20), 31.6 (C-21), 37.9 (C-22), 29.0 (C-23), 16.7 (C-24), 16.7 (C-25), 16.7 (C-26), 15.2 (C-27), 179.3 (C-28), 110.3 (C-29), 19.8 (C-30)이다.

도 21에 도시된 화합물 7의 ¹H-NMR (600 MHz, pyridine-d ₅) data는 δ 4.79 (1H, s, H-29a)와 δ 4.97 (1H, s, H-29b)로부터 1종의 2중 결합의 존재가 시사되었고, 또 6종의 methyl기들[δ 1.24 (3H, s, H-23), 1.00 (3H, s, H-24), 0.84 (3H, s, H-25), 1.07 (3H, s, H-26), 1.08 (3H, s, H-27), 1.81 (3H, s, H-30)]의 존재 또한 관찰되었다. 반면에 화합물 1에 있는 aldehyde기의 signal은 화합물 7의 spectrum으로부터 관찰되지 않았다. 이것은 betulinic aldehyde에서 aldehyde기가 다른 작용기로 치환된 화합물일 가능성을 시사하였다.

또한, 도 22에 도시된 화합물 7의 ¹³C-NMR spectrum (125 MHz, CDCl₃)으로부터 총 30종의 carbon signal들이 관찰되었고, 1종의 수산기와 결합된 carbon [δ 78.5 (C-3)], 1종의 이중결합[δ 110.3 (C-29)과 δ 151.7 (C-20)], 1종의 carboxyl기[δ 179.3 (C-28)]가 관찰되었다. 이 결과들로부터 화합물 7은 betulinic acid일 가능성이 시사되었다. 그래서 기존의 문헌과의 비교를 행한 결과, data의 일치성이 확인되어 화합물 7을 도 23에 도시된 구조식을 갖는 betulinic acid로 동정하였다.

상술된 실험결과들은 본 발명이 그동안 배에 함유되어 있다고 생각되지 않던, 트리터페노이드계화합물을 최초로 확인하였을 뿐만 아니라, 특히 배과피를 원료로 한 배과피농축물의 용매분획분 중 페놀성획분으로부터 7종의 항산화성 triterpenoid계 화합물 및 카페오일유도체에 대한 단리, 정제법의 확립하였음을 보여준다. 따라서, 본 발명을 통하여 triterpenoid계 화합물 및 카페오일유도체들의 식품 및 의약품 첨가제 등의 항산화제로서의 이용성을 제시할 수 있을 뿐만 아니라 폐과, 낙과, 저급품, 가공 후의 잔여물 및 솎음작업에 의해 발생되어 전량 버려지고 있는 유과(미성숙과) 등의 활용성을 높여 고부가가치를 창출할 수 있을 것이다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (23)

1. 신선 배과피를 용매로 추출하여 얻어진 추출물을 농축한 것으로서, 상기 신선 배과피 15000중량부 당 베툴린 알데하이드 0.00339중량부 이상, 루페올 0.00340중량부 이상, 베타-시토스테롤0.00270중량부 이상, 3-O-시스-카페오일 베툴린산 0.00164중량부 이상, 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산 0.530중량부 이상, 카페오일 올레아놀산0.00285중량부이상, 및 베툴린산 0.00184중량부 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 함유 배과피농축물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 함유 배과피농축물.
   
5. 배과피농축물을 준비하는 단계;
   상기 배과피농축물을 1차 용매분획하는 단계;
   상기 1차 용매분획의 용매층을 완충액으로 2차 용매분획하는 단계;
   상기 2차 용매분획의 용매층을 완충액으로 3차 용매분획하는 단계;
   상기 3차 용매분획의 수용액층을 4차용매분획하는 단계;
   상기 4차 용매분획의 용매층을 1차 정제하는 단계;
   상기 1차 정제단계에서 얻어진 특정획분을 대상으로 2차 정제하는 단계; 및
   상기 2차 정제단계에서 얻어진 특정획분을 대상으로 3차 정제하는 단계;를 포함하는데,
   상기 3차 정제단계는 상기 2차 정제단계에서 얻어진 특정획분에 대해 ODS 칼럼 크로마토그래피 또는 분취용 고속액체크로마토그래피가 더 수행되며,
   상기 ODS 칼럼 크로마토그래피가 수행된 후 얻어진 획분을 대상으로 TLC 분석을 더 수행하여 베툴린 알데하이드(betulin aldehyde), 루페올(lupeol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol)가 정제되고,
   상기 고속액체크로마토그래피는 옥타데실실란 컬럼이 연결된 시스템에서 유속 9.9 mL/min, 254 nm 파장인 조건으로 t_R 19.2 분에 용출된 피크분인 정제된 3-O-시스-카페오일 베툴린산(3-O-cis-caffeoyl betulinic acid)을 얻도록 수행되거나, t_R 20.9 분에 용출된 피크분인 정제된 3-O-트랜스-카페오일 베툴린산(3-O-trans-caffeoyl betulinic acid)을 얻도록 수행되거나, t_R 24.4 분에 용출된 피크분인 정제된 카페오일 올레아놀산(caffeoyl oleanolic acid)을 얻도록 수행되거나, t_R 32.8 분에 용출된 피크분인 정제된 베툴린산(betulinic acid)을 얻도록 수행되는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 배과피농축물은 배과피와 알코올을 균질하게 섞은 후 흡입 여과하여 얻어진 여과액을 진공농축하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 알코올은 메탄올인 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
   
8. 제 5 항에 있어서,
   상기 1차 용매분획단계는 상기 배과피농축물을 산성 완충용액으로 현탁액을 조제하는 단계와 상기 현탁액을 용매로 복수 회 용매분획하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
   
9. 제 5 항에 있어서,
   상기 2차 용매분획단계는 약염기성 완충용액으로 복수 회 용매분획하는 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
   
10. 제 5 항에 있어서,
    상기 3차 용매분획단계는 강염기성 완충용액으로 복수 회 용매분획하는 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
    
11. 제 5 항에 있어서,
    상기 4차 용매분획단계는 상기 3차 용매분획에서 얻어진 수용액의 pH를 약산성으로 조절하는 단계와 상기 pH조절된 수용액층을 복수 회 용매분획하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
    
12. 제 5 항에 있어서,
    상기 1차 정제단계는 충진제로 silica gel을 사용하고, n-hexane, 에틸아세테이트 및 알코올 중 하나 이상이 포함된 혼합용액을 용출용매로 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
    
13. 제 5 항에 있어서,
    상기 2차 정제단계는 충진제로 Sephadex LH-20을 사용하고, 알코올수용액을 용출용매로 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
    
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 알코올수용액은 농도가 70 내지 95%인 메탄올수용액인 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
    
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16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 제 5 항에 있어서,
    상기 고속액체크로마토그래피는 일정용매조성용출법 또는 농도가 낮은 용매로 시작하여 일정시간 후에 농도가 높은 용매가 되도록 구배용출법에 의해 용출시킨 후 농도가 높은 용매의 용출을 유지시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.
    
21. 삭제
22. 삭제
23. 제 5 항 내지 제 14 항, 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 배과피를 이용한 트리터페노이드계화합물 및 그 카페오일유도체 정제방법.

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