KR101597110B1

KR101597110B1 - 항체-링커-약물 결합체, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR101597110B1
Application number: KR1020140000818A
Authority: KR
Inventors: 박영준; 정진교; 최영미; 이민섭; 최준헌; 이진서; 조은주; 송현남; 박성준; 이종협; 이상엽; 이인숙; 김준우; 홍승서; 김연정; 김경석
Original assignee: (주)셀트리온
Priority date: 2013-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2016-02-25
Also published as: KR20140088841A

Abstract

본 발명은 항체의 라이신 잔기에 직접 결합할 수 있는 효소-분해형 펩타이드 링커를 통해 항체와 세포독성 약물이 접합된 항체-링커-약물 결합체, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.

Description

항체-링커-약물 결합체, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 항암제 조성물 {Antibody-Linker-Drug Conjugates, Process for Preparing the Same and Anti-cancer Agents Comprising the Same}

본 발명은 우수한 항암 활성을 가지는 항체-링커-약물 결합체, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항체의 라이신 잔기에 직접 결합할 수 있는 효소-분해형 펩타이드 링커를 통해 항체와 세포독성 약물이 접합된 항체-링커-약물 결합체, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

항체는 특이적 항원에 결합하는 면역학적 단백질로서, 다수의 모노클로날 항체가 현재 항암제로서 개발 중이거나, 암의 치료에 사용되고 있다. 그러나, 거의 모든 항체는 암세포의 증식을 억제하여 암의 진행을 막아 주기는 하지만 암의 치료에는 아주 제한적이다[Sharkey et al., Adv. Drug Del. Rev., 2008, 1407-1420]. 이러한 한계점을 극복하기 위한 대안으로써 항체에 약물을 접합한 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate: ADC)가 새로운 형태의 항체 치료제로서 개발되고 있다[Chari, Acc. Chem. Res., 41(2008), 98-107].

ADC는 세포독성 약물 또는 독소를 이들을 표적 종양세포의 내부에 선택적으로 전달할 수 있는(internalization) 모노클로날 항체(monoclonal antibody: mAb)에 결합(conjugation)시킨 것을 의미한다. 환자에게 투여되면, ADC는 이것의 항체 부분을 통해 표적 세포에 결합하여 세포 내로 전달되며, 이에 따라서 세포독성 약물 또는 독소는 ADC로부터 분리되어 그 자체의 효능을 나타내게 된다[Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070, October 15, 1999].

ADC의 제조를 위해 항체와 세포독성 약물을 효과적으로 접합하기 위해서는 적당한 형태의 링커(linker)를 이용하는 방법이 보편적이다. 이때 사용되는 링커의 대표적인 예로는 히드라존, 디설파이드, 펩타이드 링커 등이 있다. ADC가 효과적으로 작용하기 위해서는 기본적으로 ADC의 세 가지 구성요소인 mAb, 링커 및 세포독성 약물 모두 일정 수준 이상의 기능을 발휘해야 한다[Chari, Acc. Chem. Res., 41(2008), 98-107].

미국특허 제6,214,345호에는 특정한 리소좀 내에 존재하는 단백질 분해효소인 카텝신(cathepsin)에 의하여 분해되는 효소-분해형(enzyme cleavable) 펩타이드 링커를 이용해 독소루비신, 탁솔 등 세포독성 약물을 항체에 결합시킨 ADC가 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제7,964,566호에는 같은 효소-분해형 펩타이드 링커를 사용하여 MeVal-Val-Dil-Dap-Norephedrine(MMAE) 및 MeVal-Val-Dil-Dap-Phe(MMAF)와 같은 세포독성 약물을 항체에 결합시킨 ADC가 보고되어 있다.

종래의 효소-분해형 펩타이드 링커를 이용한 ADC의 제조방법에 따르면, 링커를 항체에 접합하는 방법으로 항체와 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT)와 같은 환원제를 반응시켜 항체에 존재하는 디설파이드 결합으로부터 항체 내 티올기를 생성한 후, 생성된 티올기와 링커를 접합하는 기술을 사용한다. 그러나 환원제를 사용하여 항체의 분자내 디설파이드 결합을 끊는 방식은 필연적으로 항체 구조 자체의 변형이 동반되고, 이로 인해 항체의 항원에 대한 친화력에 나쁜 영향을 줄 수 있다. 또한 환원 반응 시 항체의 부분적인 분해를 동반하여 최종 ADC의 정제를 어렵게 하는 요인이 되기도 한다. 아울러 반응 중에 항체가 쉽게 집합체를 형성(aggregation)하여 최종 ADC의 수율이 낮아지는 문제점도 있다.

또한, 항체의 분자내 디설파이드 결합을 환원시켜 티올기를 생성하는 대신에, 2-이미노티오란(Traut's reagent)와 같은 티올기 생성 시약과 항체의 라이신 잔기의 아미노기를 반응시켜 티올기를 생성할 수도 있는 것으로 알려져 있으나, 이 경우에는 항체에 결합된 티올기 생성 시약의 개수가 0 에서 수 개까지 다양한 분포를 보이고, 생성된 티올기와 링커를 접합시킬 때 같은 항체 내에 링커가 결합된 티올기와 링커가 결합되지 않은 티올기가 혼재하게 되는 결과가 초래된다. 따라서 제조된 ADC는 링커가 결합되지 않은 불필요한 티올기의 존재, 티올기 생성 시약으로부터 비롯된 잔기 등으로 인해 ADC의 성능, 특히 생체 내에서 약물동력학이 좋지 않은 문제점을 가지고 있다.

본 발명자들은 상기한 바와 같은 목적하지 않은 항체의 구조적 변형 없이 세포독성 약물이 항체에 접합된 ADC를 개발하고자 예의 연구 검토한 결과, 항체의 라이신 잔기에 직접 결합할 수 있는 효소-분해형 펩타이드 링커를 사용하여 종래의 펩타이드 링커의 문제점을 극복할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 한 목적은 항체의 라이신 잔기에 직접 결합할 수 있는 효소-분해형 펩타이드 링커를 통해 항체와 세포독성 약물이 접합된 항체-링커-약물 결합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체-링커-약물 결합체를 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체-링커-약물 결합체를 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:

[화학식 I]

상기 식에서,

Ab는 항체이고,

X는 C₁-C₈의 알킬기 또는 C₃-C₆의 시클로알킬기이며,

R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,

Ar은 아릴기이며,

Z는 질소 또는 산소이고,

R₅는 Z가 질소일 때 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고, Z가 산소일 때 존재하지 않으며,

R₆는 수소, 히드록시, C₁-C₄의 알콕시기 또는 옥소(=O)이고,

n은 1 내지 5이다.

본 명세서에서 C₁-C₈의 알킬기는 탄소수 1 내지 8개로 구성된 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-옥틸 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 C₃-C₆의 시클로알킬기는 탄소수 3 내지 6개로 구성된 고리형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 C₁-C₄의 알킬기는 탄소수 1 내지 4개로 구성된 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 C₁-C₄의 알콕시기는 탄소수 1 내지 4개로 구성된 직쇄형 또는 분지형 알콕시기를 의미하며, 메톡시, 에톡시, n-프로판옥시 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 아릴기는 아로메틱기와 헤테로아로메틱기 및 그들의 부분적으로 환원된 유도체를 모두 포함한다. 상기 아로메틱기는 5 내지 15각형으로 이루어진 단순 또는 융합 고리형이며, 헤테로아로메틱기는 산소, 황 또는 질소를 하나 이상 포함하는 아로메틱기를 의미한다. 대표적인 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸, 피리디닐(pyridinyl), 푸라닐(furanyl), 티오페닐(thiophenyl), 인돌릴(indolyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 테트라히드로나프틸 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 C₁-C₈의 알킬기, C₃-C₆의 시클로알킬기, C₁-C₄의 알킬기, C₁-C₄의 알콕시기, 및 아릴기는 한 개 또는 그 이상의 수소가 C₁-C₄의 알킬기, C₂-C₄의 알케닐기, C₂-C₄의 알키닐기, C₃-C₁₀의 시클로알킬기, C₁-C₄의 할로알킬기, C₁-C₄의 알콕시기, C₁-C₄의 티오알콕시기, 아릴기, 아실기, 히드록시, 티오(thio), 할로겐, 아미노, 알콕시카르보닐, 카복시, 카바모일, 시아노, 니트로 등으로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 항체는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고도 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.

본 발명의 한 실시형태로서, 항체는 암세포 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수하거나, 재조합 발현 기술과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 진뱅크 데이터베이스 또는 문헌으로부터 얻거나, 통상의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 얻을 수 있다. 암 치료에 이용가능한 항체의 예는 전이성 유방암의 치료를 위한 인간화된 항-HER2 항체인 허셉틴^®(제넨테크사의 트라스투주맙), 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 키메라 항-CD20 항체인 리툭산^®(제넨테크사의 리툭시맙), 두부 및 목의 암과 같은 상피성장인자 양성 암의 치료를 위한 키메라 항-EGFR 항체인 어비툭스^®(임클론 시스템즈사의 세툭시맙) 및 육종의 치료를 위한 인간화된 항-인테그린 αvβ3 항체인 비탁신^®(메드이뮨사)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항체-링커-약물 결합체에서 링커-약물은 항체의 라이신 잔기에 직접 결합된다. 따라서, 항체의 분자내 디설파이드 결합의 환원, 티올기 생성 시약으로 인한 잔기의 잔류 등 항체 단백질 구조의 불필요한 변형이 발생하지 않고, 항체의 비정상적인 파편이나 응집의 발생이 최소화되어 92% 이상의 정상 항체 구조 비율을 가진다.

본 발명의 항체-링커-약물 결합체는 바람직하게는,

Ab가 암세포 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체이고,

X는 C₁-C₈의 알킬기 또는 C₃-C₆의 시클로알킬기이며,

R₁, R₂ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,

R₃는 C₁-C₄의 알킬기이며,

Ar은 C₁-C₄의 알킬기, C₁-C₄의 알콕시기 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이고,

Z는 질소이며,

R₅는 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,

R₆는 수소, 히드록시 또는 C₁-C₄의 알콕시기이다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 항체-링커-약물 결합체는

Ab가 트라스투주맙(trastuzumab)이고,

X는 메틸, n-프로필, n-펜틸, n-옥틸 또는 시클로프로필이며,

R₁, R₂ 및 R₃는 메틸이고,

R₄는 수소 또는 메틸이며,

Ar은 메틸, 메톡시 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이고,

Z는 질소이며,

R₅는 수소 또는 메틸이고,

R₆는 수소, 히드록시 또는 메톡시이다.

본 명세서에서 약제학적으로 허용되는 염은 무독성 무기산염 및 유기산염 모두를 포함하며, 예를 들어 염산염, 황산염, 질산염, 인산염, 아세테이트산염, 벤젠설포네이트산염, 시트레이트산염 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체-링커-약물 결합체 중 대표적인 물질은 하기 그룹에서 선택될 수 있다.

상기 식에서, n은 1 내지 5이다.

한편으로, 본 발명은 상기 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법은

(i) 하기 화학식 II의 화합물과 하기 화학식 III의 돌라스타틴 10 유도체를 축합반응시켜 하기 화학식 IV의 화합물을 수득하는 단계;

(ii) 하기 화학식 IV의 화합물에 하기 화학식 V의 화합물을 첨가반응시켜 하기 화학식 VI의 화합물을 수득하는 단계;

(iii) 하기 화학식 VI의 화합물과 N-히드록시숙신이미드를 축합반응시켜 하기 화학식 VII의 화합물을 수득하는 단계; 및

(iv) 하기 화학식 VII의 화합물과 항체를 반응시키는 단계를 포함한다.

[화학식 II]

[화학식 III]

[화학식 IV]

[화학식 V]

[화학식 VI]

[화학식 VII]

상기 식에서,

X, R₁, R₂, R₃, R₄, Ar, Z, R₅ 및 R₆는 상기 화학식 I에서 정의한 바와 같다.

이하, 본 발명에 따른 상기 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체의 제조방법을 하기 반응식 I을 참조로 상세히 설명한다. 하기 반응식 I에 기재된 방법은 대표적으로 사용된 방법을 예시한 것일 뿐 단위조작의 순서, 반응시약, 반응조건 등은 경우에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.

[반응식 I]

상기 단계 (i)에서는 화학식 II의 화합물과 화학식 III의 돌라스타틴 10 유도체를 축합반응시켜 화학식 IV의 화합물을 수득한다.

상기 축합반응은 축합제의 존재 하에 수행될 수 있으며, 축합제로는 히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시아자벤조트리아졸(HOAt), 히드록시숙신이미드(HOSu) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

축합반응시 필요하다면, 피리딘, 디이소프로필에틸아민과 같은 유기 염기를 축합제와 함께 사용할 수 있다.

반응용매로는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸술폭시드(DMSO), N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 등을 사용할 수 있으며, 반응온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.

상기 단계 (ii)에서는 화학식 IV의 화합물에 화학식 V의 화합물을 첨가반응시켜 화학식 VI의 화합물을 수득한다.

반응용매로는 디메틸술폭시드(DMSO), 아세토니트릴(MeCN), 디메틸포름아미드(DMF) 등을 사용할 수 있으며, 반응온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.

상기 단계 (iii)에서는 화학식 VI의 화합물과 N-히드록시숙신이미드를 축합반응시켜 화학식 VI의 화합물의 카르복시산기를 활성화한다.

상기 축합반응은 축합제의 존재 하에 수행될 수 있으며, 축합제로는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

반응용매로는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 디클로로메탄(DCM) 등을 사용할 수 있으며, 반응온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.

상기 단계 (iv)에서는 화학식 VII의 화합물과 항체를 반응시켜 최종 생성물인 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체를 수득한다.

반응용매로는 pH 6.0 내지 8.0의 포스페이트 버퍼를 사용할 수 있으며, 세포독성 약물의 종류에 따라 화학식 VII의 화합물인 링커-세포독성 약물의 포스페이트 버퍼에서의 용해도가 달라지므로, 필요에 따라 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸아세트아미드(DMA), 아세토니트릴(MeCN), 1,4-디옥산 등의 유기용매를 혼합하여 사용할 수 있다. 이때 혼합용매 중 유기용매의 비율은 50부피% 이하인 것이 바람직하다.

상기 화학식 VII의 화합물은 항체를 기준으로 3 내지 25 당량 사용하는 것이 바람직하다. 이때 제조된 항체-링커-약물 결합체에서 1 분자의 항체에 결합된 약물의 수인 약물-항체 비(drug-antibody ratio: DAR)은 약 1 내지 5가 된다.

상기 화학식 II의 화합물은 효소-분해형(enzyme cleavable) 펩타이드 링커로 공지된 물질로, 미국특허 제6,214,345호에 기재된 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.

또한 상기 화학식 III의 돌라스타틴 10 유도체는 세포독성 약물로서, 본 출원인에 의해 2012년 9월 20일자 출원되어 계류중인 대한민국 특허출원 제10-2012-0104710호 또는 미국특허 제5,599,902호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 이에 상기 특허문헌을 전부 본 명세서에 참조로 포함시킨다.

예를 들어, 상기 화학식 III의 돌라스타틴 10 유도체는 하기 반응식 II에 나타낸 방법에 따라 제조될 수 있다.

[반응식 II]

본 발명의 항체-링커-약물 결합체는 우수한 항종양 활성을 나타낸다(시험예 3 및 시험예 4 참조).

따라서, 본 발명은 상기 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 항암제 조성물, 특히 유방암 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항암제 조성물은 경구적으로(예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로(예를 들면, 주사, 침착, 이식, 좌약) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내주사 또는 복강내주사일 수 있다. 본 발명에 따른 항암제 조성물은 투여 경로에 따라, 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래(fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 항암제 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제(disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.

본 발명에 따른 항암제 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약 0.01 내지 95 중량%로 포함한다.

본 발명의 항암제 조성물의 구체적인 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 체중, 성별, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 다를 수 있다. 바람직하게는, 경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg당 활성성분 0.01 내지 50 mg이 투여되고, 비경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg당 활성성분 0.01 내지 10 mg이 투여된다. 상기 총 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체는 링커-약물이 항체의 라이신 잔기에 직접 결합되어 항체 단백질 구조의 불필요한 변형이 발생하지 않으며, 생체내 안정성을 확보하면서 세포독성 약물의 효과적이고 선택적인 전달을 가능케 함으로써 1회 투여로 암, 특히 유방암을 효과적으로 치료할 수 있다. 아울러, 본 발명의 제조방법에 따르면, 항체-링커-약물 결합체를 고수율로 제조할 수 있다.

도 1은 BT-474 세포에 대한 본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체 (I-1)의 시험관 내 세포생장 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 BT-474 세포에 대한 본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체 (I-3)의 시험관 내 세포생장 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 BT-474 세포에 대한 본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체 (I-4)와 (I-6)의 시험관 내 세포생장 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 BT-474 세포에 대한 본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체 (I-5)와 (I-7)의 시험관 내 세포생장 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 암 유발 동물모델에 본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체 (I-1)을 투여한 후 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 암 유발 동물모델에 본 발명에 따른 항체-링커-약물 결합체 ((I-1)을 투여하고 28일 경과 후의 종양 무게를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

제조예 1: 화학식 II의 화합물의 제조

제조예 1-1: 화합물 (II)의 제조

6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드(5.0 g, 8.7 mmol, Dubowchik et al., Bioconjugate Chem., 2002, 13 (4), pp 855-869)를 아르곤 기류 하에서 무수 디메틸포름아미드 60 mL에 녹인 후, N,N-디이소프로필에틸아민(3.0 mL, 17.4 mmol)을 가하고 0 ℃로 냉각하였다. 반응혼합물에 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트(7.94 g, 26.1 mmol)를 한번에 가하고 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(3.65 g, 57%)을 미색 고체로 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 0.83 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 1 H), 1.19 (m, 2 H), 1.34 - 1.76 (m, 7 H), 1.96 (m, 1 H), 2.15 (m, 2 H), 2.99 (m, 2 H), 3.37 (m, 2 H), 4.19 (t, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.39 (m, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 5.41 (s, 2 H), 5.97 (brt, J = 5.6 Hz, 1 H), 7.00 (s, 2H), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.57 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 8.09 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 8.31 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 10.05 (brs, 1 H)

제조예 2: 화학식 III의 화합물의 제조

제조예 2-1: 화합물 (III-1)의 제조

(2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(0.70 g, 2.2 mmol)을 아르곤 기류 하에서 무수 디메틸포름아미드 10 mL에 녹인 후, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염(0.47 g, 2.4 mmol)을 가하고 반응혼합물을 0 ℃로 냉각한 다음, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(0.97 g, 2.2 mmol)와 디이소프로필에틸아민(1.0 mL, 6.6 mmol)을 순차적으로 가하고, 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 (2S,4R)-t-부틸 2-((1R,2R)-3-(((2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)-4-메톡시피롤리딘-1-카르복실레이트(0.61 g, 56%)를 얻었다.

LC-MS m/z : 494.2 [M⁺]⁺, 516.3 [M+Na]⁺

상기 화합물(0.61 g, 1.23 mmol)을 디클로로메탄 10 mL에 녹이고 트리플루오로아세트산 7 mL를 적가한 후 20 - 25 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응용매를 감압 농축하여 제거하고, 톨루엔 5 mL를 2회 첨가하여 트리플루오로아세트산을 완전히 제거한 후 반응을 진행하였다.

반응 농축액(TFA염)과 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄산(0.53 g, 1.23 mmol)를 디메틸포름아미드 5 mL에 용해하고, 0 ℃에서 디에틸 시아노포스포네이트(DEPC) (0.20 mL, 1.35 mmol)와 트리에틸아민(1.56 mL, 11.09 mmol)을 가하고 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응용매를 제거하고 에틸아세테이트 20 mL에 용해시킨 후, 1 M 포타슘하이드로젠설파이트, 물, 포화 탄산수소나트륨 용액 및 소금물로 추출한 다음, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 화합물 (III-1)의 아미노기가 보호화된 화합물(0.25 g, 25%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 779.6[M+H]⁺

화합물 (III-1)의 아미노기가 보호화된 화합물(0.25 g, 0.31 mmol)을 메틸알코올 10 mL에 녹이고 10% 팔라듐 카본(15 mg)을 가한 후 수소 대기 하에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 메탄올로 수회 세척한 후, 감압 하에서 용매를 제거하여 백색 고체의 표제화합물(97 mg, 41%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 753[M⁺]⁺, 775[M+Na]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.72 (t, 3 H), 0.77 -1.02 (m, 17 H), 1.01 (d, 3 H), 1.15 (d, 3 H), 1.32 (m, 1 H), 1.78 (brd 2H), 1.85- 2.12 (m, 4 H), 2.18 (S, 6 H), 2.32-2.50 (m, 4H), 3.30 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.48(m, 1H), 4.00-4.15 (m, 4H), 4.32(m, 2H), 4.85 (m, 2H), 6.60 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.99-7.06 (m, 2H), 7.22-7.32 (m, 2H)

제조예 2-2: 화합물 (III-2)의 제조

(2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 대신에 (2R,3R)-3-((2S)-1-(t-부톡시카르보닐)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(92 mg, 0.32 mmol)을 사용하고, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염 대신에 (2R)-1-아지도-1-페닐프로판-2-아민 염산염(68 mg, 0.32 mmol)을 사용하여 제조예 2-1과 동일한 방법으로 표제화합물(44 mg, 50%)을 수득하였다.

MALDI-TOF MS m/z : 731.6 [M+H]⁺, 753.5 [M+Na]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.81 (t, 3 H), 0.88-1.07 (m, 17 H), 1.18 (d, 3 H), 1.21 (d, 3 H), 1.47 (m, 1 H), 1.74 (brd, 2H), 1.87- 2.17 (m, 3 H), 2.24 (S, 6 H), 2.25-2.47 (m, 4H), 3.04 (s, 3H), 3.28-3.34 (m,1H), 3.31 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.45(m, 1H), 3.79 (d, 1H), 3.82 (m, 1H), 4.05-4.12 (m, 4H), 4.24(m, 2H), 4.75 (m, 2H), 6.73 (s, 1H), 6.95 (d, 1H), 7.24-7.35 (m, 5H)

제조예 2-3: 화합물 (III-3)의 제조

(2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 대신에 (2R,3R)-3-((2S)-1-(t-부톡시카르보닐)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(0.80 g, 2.8 mmol)을 사용하고, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염(0.64 g, 2.8 mmol)을 사용하여 제조예 2-1과 동일한 방법으로 표제화합물(0.5 g, 79%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 749.47 [M+H]⁺, 771.44 [M+Na]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.82 (t, 3 H), 0.91-1.1 (m, 17 H), 1.16 (d, 3 H), 1.20 (d, 3 H), 1.35 (m, 1 H), 1.78 (brd, 2H), 1.87- 2.10 (m, 4H), 2.24 (S, 6 H), 2.28-2.48 (m, 4H), 3.03 (s, 3H), 3.28-3.34 (m,1H), 3.31 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.48(m, 1H), 3.82 (d, 1H), 4.03-4.10 (m, 4H), 4.22(m, 2H), 4.77 (m, 2H), 6.56 (d, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.99-7.07 (m, 2H), 7.23-7.35 (m, 2H)

제조예 2-4: 화합물 (III-4)의 제조

((2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 대신에 (2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-히드록시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(340 mg, 1.12 mmol)을 사용하고, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염(258 mg, 1.12 mmol)을 사용하여 제조예 2-1과 동일한 방법으로 표제화합물(350 mg, 71%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 765.46[M⁺]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.80 (t, 3 H), 0.90-1.09 (m, 17 H), 1.11 (d, 3 H), 1.25 (d, 3 H), 1.32 (m, 1 H), 1.78 (brd, 2H), 2.04- 2.09 (m, 3 H), 2.23 (S, 6 H), 2.35-2.50 (m, 4H), 3.03 (s, 3H), 3.32 (s, 3H), 3.38(m, 1H), 3.47 (s, 3H), 3.54-3.56 (m, 2H), 3.90 (m, 1H), 4.0-4.32 (m, 6H), 4.75 (m, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.76 (d, 1H), 6.99-7.04 (m, 2H), 7.32-7.35 (m, 2H)

제조예 2-5: 화합물 (III-5)의 제조

(2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 대신에 (2R,3R)-3-((2S)-1-(t-부톡시카르보닐)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(0.17 g, 0.58 mmol)을 사용하고, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염 대신에 (2R)-1-프탈이미도-1-(4-메톡시페닐)프로판-2-아민 염산염(0.2 g, 0.58 mmol)을 사용하여 제조예 2-1과 동일한 방법으로 화합물 (III-5)의 아미노기가 보호화된 화합물(0.34 g, 94%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 891.62[M]⁺

화합물 (III-5)의 아미노기가 보호화된 화합물(0.34 g, 0.38 mmol)을 에탄올 10mL에 용해시키고, 히드라진 수화물 1mL를 가한 후 16시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 하에서 용매를 제거하여 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 백색 고체의 표제화합물(0.11 g, 38%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 761.56[M⁺]⁺, 783.60[M+Na]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.80 (m, 3H), 0.88-1.07 (m, 18H), 1.19 (d, 3 H), 1.15(m, 1H), 1.22 (m, 1 H), 1.25(d, 3H), 1.70- 1.90 (m, 4H), 2.07(S, 6 H), 2.26(s, 3H), 2.28-2.48 (m, 4H), 3.06 (s, 3H), 3.32 (s, 3H), 3.38 (m, 1H), 3.43(s, 3H), 3.50(m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.80(s, 3H), 3.78(d, 1H), 3.90-4.25 (m, 4H), 4.54 (m, 2H), 6.89 (d, 2H), 7.35 (d, 2H)

제조예 2-6: 화합물 (III-6)의 제조

(2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 대신에 (2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-히드록시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(0.36 g, 1.17 mmol)을 사용하고, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염 대신에 (2R)-1-프탈이미도-1-(4-메톡시페닐)프로판-2-아민 염산염(0.41 g, 1.17 mmol)을 사용하여 제조예 2-1과 동일한 방법으로 화합물 (III-6)의 아미노기가 보호화된 화합물(0.59 g, 74%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 907.54[M]⁺

화합물 (III-6)의 아미노기가 보호화된 화합물(0.59 g, 0.65 mmol)을 이용하여 제조예 2-5와 동일한 방법으로 백색 고체의 표제화합물(0.19 g, 38%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 777.42[M⁺]⁺, 799.39[M+Na]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.79-0.859(m, 3H), 0.86-1.06(m, 17H), 1.13(d, 3H), 1.24-1.40(m, 6H), 1.62-1.84(m, 2H), 1.97-2.41(m, 3H), 2.20-2.32(m, 7H), 2.36-2.54(m, 4H), 3.06(s, 3H), 3.31(s, 3H), 3.46(t, 1H)3.50(s, 3H), 3.56(brs, 1H), 3.62(m, 1H), 3.67(m, 1H),3.72-3.77(m, 1H), 3.80(s, 3H), 3.97-4.28(m, 4H), 4.30(m, 1H), 4.68(m, 1H), 4.72-4.83(m, 1H), 6.89(d, 2H), 7.33(d, 2H)

제조예 2-7: 화합물 (III-7)의 제조

(2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 대신에 (2R,3R)-3-((2S,4R)-1-(t-부톡시카르보닐)-4-하이드록시피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(1.43 g, 4.7 mmol)을 사용하고, (2R)-1-아지도-1-(4-플루오로페닐)프로판-2-아민 염산염 대신에 2-프탈이미도-2-(p-톨릴)에틸아민 염산염(1.65 g, 5.2 mmol)을 사용하여 제조예 2-1과 동일한 방법으로 화합물 (III-7)의 아미노기가 보호화된 화합물 (2.35 g, 78%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 878[M+1]⁺

화합물 (III-7)의 아미노기가 보호화된 화합물(2.08 g, 2.37 mmol)을 이용하여 제조예 2-5와 동일한 방법으로 백색 고체의 표제화합물(1.7 g, 94%)을 수득하였다.

LC-MS m/z : 748[M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.79-0.84(m, 3H), 0.91-1.03(m, 19H), 1.24-1.29(m, 4H), 1.29-1.40(m, 1H), 1.90-2.14(m, 4H), 2.25(s, 6H), 2.32(s, 3H), 2.38-2.48(m, 3H),3.03(s, 3H), 3.14(brd, 1H), 3.24-3.30(m, 1H), 3.32(s, 3H),3.38-3.43(m, 1H), 3.48(s, 3H), 3.54-3.62(m, 3H), 4.04-4.18(m, 3H), 4.24-4.34(m, 2H), 4.77-4.90(m, 2H), 6.37(m, 1H), 7.14-7.28(m, 4H)

제조예 3: 화학식 IV의 화합물의 제조

제조예 3-1: 화합물 (IV-1)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1)(89 mg, 0.116 mmol)을 아르곤 기류 하에서 무수 디메틸포름아미드 8 mL에 녹인 후, 제조예 1-1에서 수득한 화합물 (II)(78 mg, 0.106 mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 0 ℃로 냉각한 후 HOBt (17 mg, 0.128 mmol)와 무수 피리딘 2.0 mL를 순차적으로 가하고, 상온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(106 mg, 73%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1377.8 [M⁺]⁺, 1400.8 [M+Na]⁺

제조예 3-2: 화합물 (IV-2)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1) 대신에 제조예 2-2에서 수득한 화합물 (III-2)(17 mg, 0.023 mmol)를 사용하여 제조예 3-1과 동일한 방법으로 표제화합물(26 mg, 93%)을 얻었다.

MALDI-TOF MS m/z : 1351.3 [M+Na]⁺, 1367.7 [M+K]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.81-0.91(m, 6H), 0.91-1.03(m, 21H), 1.63(d, 2H), 1.22(d, 1H), 1.28(m, 2H), 1.32(m, 1H), 1.50-1.63(m, 6H), 1.68(m, 2H), 1.82-1.90(m, 2H), 1.95(s, 3H), 1.98(m, 4H), 2.23-2.28(m, 3H), 2.34(brd, 1H), 2.40(s, 6H), 2.58-2.70(m, 1H),2.80-2.85(m, 1H), 2.91-2.98(m, 1H), 3.12(s, 3H), 3.15-3.27(m, 2H), 3.26-3.33(m, 8H, OCH₃), 3.34(d, 2H), 3.42-3.48(m, 5H, OCH₃),3.52(m, 1H), 3.7-3.96(m, 2H), 3.96-4.08(m, 2H), 4.15(d, 1H), 4.18(m, 1H), 4.44-4.54(m, 2H), 4.66(d, 1H), 4.54-5.10(m, 5H), 6.76(m, 1H), 7.02-7.12(m, 2H), 7.23-7.28(m, 2H), 7.30-7.38(m, 2H), 7.51-7.58(m, 2H)

제조예 3-3: 화합물 (IV-3)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1) 대신에 제조예 2-3에서 수득한 화합물 (III-3) (478 mg, 0.638 mmol)을 사용하여 제조예 3-1과 동일한 방법으로 표제화합물(347 mg, 40%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1347 [M⁺]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.76-0.90(m, 6H), 0.90-1.12(m, 18H), 1.16(m, 4H), 1.19(m, 3H), 1.28(m, 3H), 1.28(m, 3H), 1.40(m, 2H), 1.50-1.66(m, 9H), 1.66-1.80(m, 2H), 1.93(s, 3H), 2.0-2.14(m, 4H), 2.26(m, 3H),2.38(d, 6H), 2.44(m, 1H), 2.50-2.65(m, 1H), 2.77(m, 2H), 3.10-3.24(m, 6H), 3.25-3.36(m, 7H, OCH₃), 3.45(t, 3H), 3.58(m, 1H), 3.66(m, 1H), 3.82(m, 1H), 4.06(m, 1H), 4.14(m, 2H), 4.26(m, 1H), 4.36(m, 1H), 4.48(m, 2H), 4.63(m, 1H), 4.69(m, 3H),6.78(s, 2H), 6.97(m, 1H), 7.08(m, 1H), 7.25(m, 2H), 7.34(m, 2H), 7.54(m, 2H)

제조예 3-4: 화합물 (IV-4)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1) 대신에 제조예 2-4에서 수득한 화합물 (III-4)(0.39 g, 0.51 mmol)을 사용하여 제조예 3-1과 동일한 방법으로 표제화합물(453 mg, 65%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1364[M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.81-0.91(m, 6H), 0.91-1.03(m, 21H), 1.13(d, 2H), 1.22(d, 1H), 1.28(m, 2H), 1.32(m, 1H), 1.50-1.63(m, 6H), 1.68(m, 2H), 1.82-1.90(m, 2H), 1.95(s, 3H), 1.98(m, 4H), 2.23-2.28(m, 3H), 2.34(brd, 1H), 2.40(s, 6H), 2.58-2.70(m, 1H),2.80-2.85(m, 1H), 2.91-2.98(m, 1H), 3.12(s, 3H), 3.15-3.27(m, 2H), 3.27-3.33(m, 8H, OCH₃), 3.34(d, 2H), 3.42-3.48(m, 5H, OCH₃),3.52(m, 1H), 3.7-3.96(m, 2H), 3.96-4.08(m, 2H), 4.15(d, 1H), 4.18(m, 1H), 4.44-4.54(m, 2H), 4.66(d, 1H), 4.74-5.10(m, 5H), 6.76(m, 1H), 7.02-7.12(m, 2H), 7.23-7.28(m, 2H), 7.30-7.38(m, 2H), 7.51-7.58(m, 2H)

제조예 3-5: 화합물 (IV-5)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1) 대신에 제조예 2-5에서 수득한 화합물 (III-5)(110 mg, 0.144 mmol)를 사용하여 제조예 3-1과 동일한 방법으로 표제화합물(82 mg, 42%)을 얻었다.

LC-MS m/z: 1360 [M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.81-0.91(m, 6H), 0.92-1.05(m, 19H), 1.3-1.2(m,3H), 1.22(d, 1H), 1.28(m, 2H), 1.32(m, 1H), 1.50-1.63(m, 6H), 1.68(m, 2H), 1.82-1.90(m, 2H), 1.95(s, 3H), 1.98(m, 3H), 2.23-2.28(m, 3H), 2.37(d, 6H), 2.61(m, 1H),2.78(m, 1H), 3.12(s, 3H), 3.16-3.24(m, 2H), 3.26-3.32(m, 15H, OCH₃), 3.32-3.28(m, 5H, OCH₃),3.42-3.50(m, 1H), 3.74(d, 3H), 3.86(m, 1H), 3.96-4.08(m, 2H), 4.14(d, 1H), 4.18-4.10(m, 1H), 4.42-4.52(m, 2H), 4.64-5.10(m, 5H), 6.76(d, 2H), 6.87(m, 2H), 7.24(m, 4H), 7.55(m, 2H)

제조예 3-6: 화합물 (IV-6)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1) 대신에 제조예 2-6에서 수득한 화합물 (III-6)(179 mg, 0.23 mmol)를 사용하여 제조예 3-1과 동일한 방법으로 표제화합물(268 mg, 85%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1375 [M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 0.71-0.80(m, 5H), 0.80-0.98(m, 18H), 0.98-1.10(m, 4H), 1.18(m, 2H), 1.50(m, 6H), 1.55-1.75(m, 4H), 1.81-2.00(m, 8H), 2.05-2.30(m, 5H), 2.26(d, 6H), 2.40-2.61(m, 1H), 2.65-2.80(m, 2H), 2.90-3.08(m, 6H), 3.15(d, 3H), 3.30(d, 3H), 3.42(s, 2H), 3.67(s, 3H), 3.70(s, 3H), 3.15-3.43(m, 3H), 3.85-4.05(m, 4H), 4.18(brt, 2H), 4.38(m, 2H), 4.52(t, 1H), 4.56-4.80(m, 3H), 4.88(d, 1H), 5.01(m, 2H), 5.10(d, 1H), 6.00(m, 1H), 6.84-8.20(m, 10H), 10.0(d, 1H)

제조예 3-7: 화합물 (IV-7)의 제조

제조예 2-1에서 수득한 화합물 (III-1) 대신에 제조예 2-7에서 수득한 화합물 (III-7)(327 mg, 0.431 mmol)를 사용하여 제조예 3-1과 동일한 방법으로 표제화합물(440 mg, 75%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1346 [M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.81-1.02(m, 23H), 1.13-1.20(m, 3H), 1.25-1.32(m, 2H), 1.40(m, 1H), 1.50-1.63(m, 6H),1.72-1.78(m, 2H), 1.82-1.98(m, 3H), 1.96(s, 3H), 2.00-2.09(m, 4H), 2.15-2.30(m, 5H), 2.34-2.42(d, 6H),2.40-2.60(m, 3H), 2.75(m, 1H), 2.98(m, 1H), 3.05(m, 3H), 3.16-3.24(m, 2H), 3.26-3.35(m, 8H, OCH₃), 3.38-3.48(m, 6H, OCH₃), 3.52-3.60(m, 1H), 3.65-3.80(m, 1H), 3.90-4.16(m, 5H), 4.48(m, 1H), 4.63-5.10(m, 8H), 6.76(s, 2H), 7.09-7.28(m, 6H), 7.53(m, 2H)

제조예 4: 화학식 VI의 화합물의 제조

제조예 4-1: 화합물 (VI-1)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1)(58 mg, 0.042 mmol)에 메틸알코올 5 mL를 넣고 무수 디메틸포름아미드 1.5 mL를 가하여 용해시키고, 2-(1-(머캅토메틸)시클로프로판)아세트산(19 mg, 0.126 mmol)를 가하여 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(60 mg, 93%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1523.8 [M⁺]⁺, 1545.8 [M+Na]⁺

제조예 4-2: 화합물 (VI-2)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1) 대신에 제조예 3-2에서 수득한 화합물 (IV-2)(41 mg, 0.031 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물(39 mg, 85%)을 고체로 얻었다.

MALDI-TOF MS m/z : 1496.8 [M+Na]⁺

제조예 4-3: 화합물 (VI-3)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1) 대신에 제조예 3-3에서 수득한 화합물 (IV-3) (347mg, 0.257 mmol)을 사용하고, 2-(1-(머캅토메틸)사이클로프로판)아세트산 대신에 11-머캅토운데칸산(112 mg, 0.514 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물(266 mg, 66%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1567 [M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.76-0.90(m, 10H), 0.90-1.14(m, 20H), 1.17(m, 3H), 1.26(m, 4H), 1.29(brs, 20H), 1.37(m, 4H), 1.50-1.64(m, 14H), 1.68-1.78(m, 3H), 1.88(m, 2H), 1.94(s, 3H), 2.21-2.26(m, 6H), 2.99-2.48(m, 10H, N-CH₃*2), 2.70(m, 1H), 2.84(m, 1H), 3.07-3.19(m, 6H), 3.26-3.45(m, 6H), 3.45(m, 4H), 3.82(m, 1H), 4.15(m, 1H), 4.47(m, 2H), 4.64(m, 1H), 4.81(m, 1H), 4.98(m, 3H),6.96(t, 1H), 7.08(t, 1H), 7.25(d, 2H), 7.28-7.40(m, 2H), 7.53(d, 2H)

제조예 4-4: 화합물 (VI-4)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1) 대신에 제조예 3-4에서 수득한 화합물 (IV-4)(453 mg, 0.332 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물(60 mg, 93%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1510 [M+1]⁺,

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.46-0.68(m, 5H), 0.82-1.10(m, 27H), 1.17(d, 2H), 1.22(d, 1H), 1.30(m, 2H), 1.40(m, 1H), 1.50-1.63(m, 6H), 1.68-1.80(m, 2H), 1.82-1.90(m, 2H), 1.94(s, 3H), 2.00-2.15(m, 4H), 2.20-2.35(m, 5H), 2.42(s, 6H), 2.38-2.50(m, 2H), 2.81-2.89(m, 1H), 2.91-2.98(m, 2H), 3.08-3.40(m, 6H), 3.26-3.33(m, 10H, OCH₃), 3.43(d, 2H), 3.45-3.48(m, 5H, OCH₃), 3.52-3.64(m, 1H), 3.74-3.86(m, 1H), 3.906-4.10(m, 3H), 4.15(d, 1H), 4.24(m, 1H), 4.44-4.54(m, 2H), 4.66(d, 1H), 4.74-5.10(m, 5H), 7.09-7.12(m, 2H), 7.23-7.27(m, 2H), 7.33-7.37(m, 2H), 7.52-7.59(m, 2H)

제조예 4-5: 화합물 (VI-5)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1) 대신에 제조예 3-5에서 수득한 화합물 (IV-5)(82 mg, 0.063 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물(38 mg, 42%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1506 [M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.42-0.67(m, 4H), 0.81-1.08(m, 27H), 1.13-1.20(m, 4H), 1.29(m, 2H), 1.40(m, 1H), 1.50-1.68(m, 6H), 1.75(m, 2H), 1.82-1.90(m, 2H), 1.94(s, 3H), 2.01-2.18(m, 4H), 2.23-2.32(m, 3H), 2.42(s, 6H),2.35-2.50(m, 1H), 2.61(m, 1H), 2.79-3.00(m, 3H), 3.10-3.20(m, 5H), 3.28-3.40(m, 19H, 2*OCH₃), 3.43-3.48(m, 3H), 3.60(m, 1H), 3.74(d, 3H), 3.85-4.00(m, 3H), 4.14(d, 1H), 4.21-4.30(m, 1H), 4.48(m, 2H), 4.64-5.10(m, 5H), 6.86-7.60(m, 8H)

제조예 4-6: 화합물 (VI-6)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1) 대신에 제조예 3-6에서 수득한 화합물 (IV-6)(268 mg, 0.195 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물(132 mg, 46%)을 고체로 얻었다.

LC-MS m/z : 1521[M]⁺

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 0.48-0.50(m, 6H), 0.71-1.08(m, 27H), 1.16-1.22(m, 4H), 1.42-1.54(m, 9H), 1.60(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.94(s, 3H), 2.10-2.32(m, 8H), 2.32-2.46(m, 6H), 2.50(s, 6H), 2.78-3.10(m, 8H), 3.16(m, 2H), 3.21(m, 1H), 3.28-3.40(m, 6H, 메톡시기 6H), 3.62(s, 1H), 3.70(s, 2H), 3.86- 4.00(m, 5H), 4.19(t, 2H), 4.38(m, 2H), 4.52(t, 1H), 4.60(m, 1H), 4.76(m, 1H), 4.88(m, 1H), 5.00(m, 2H), 5.08(m, 1H), 5.42(brs, 2H), 5.98(m, 1H), 6.81(d, 1H), 7.17(d, 1H), 7.28(dd, 1H), 7.50-7.70(m, 3H), 7.82(d, 1H), 8.10(d, 1H), 10.0(d, 1H)

제조예 4-7: 화합물 (VI-7)의 제조

제조예 3-1에서 수득한 화합물 (IV-1) 대신에 제조예 3-7에서 수득한 화합물 (IV-7)(440 mg, 0.33 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물(296 mg, 60%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1492 [M+1]⁺

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 0.47-0.62(m, 5H), 0.81-1.02(m, 26H), 1.13-1.20(m, 3H), 1.25-1.32(m, 2H), 1.40(m, 1H), 1.50-1.68(m, 6H), 1.72-1.78(m, 2H), 1.82-1.98(m, 3H), 1.96(s, 3H), 2.00-2.09(m, 4H), 2.25-2.35(m, 5H), 2.38-2.48(m, 6H), 2.850-2.90(m, 3H), 3.05-3.20(m, 6H), 3.26-3.35(m, 9H, OCH₃), 3.40-3.48(m, 6H, OCH₃), 3.50-3.60(m, 2H), 3.65-3.80(m, 3H), 3.90-4.18(m, 5H), 4.48(m, 1H), 4.64(m, 1H), 4.70-5.10(m, 8H), 7.09-7.58(m, 8H)

제조예 5: 화학식 VII의 화합물의 제조

제조예 5-1: 화합물 (VII-1)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1)(60 mg, 0.039 mmol)을 아르곤 기류 하에서 무수 디메틸포름아미드 3 mL에 녹인 후, N-히드록시숙신이미드(18.1 mg, 0.157 mmol)를 가하였다. 반응혼합물을 0 ℃로 냉각한 후 EDC·HCl (30.2 mg, 0.157 mmol)을 가하고 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 에틸아세테이트 50 mL에 용해시켜 1M HCl 5 mL를 가하고 증류수 30 mL, 포화식염수 30 mL로 순차적으로 세척한 다음, 무수 황산나트륨으로 건조 후 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(37 mg, 57%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1620.8 [M⁺]⁺,1643.7 [M+Na]⁺

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.48 (m, 2H), 0.64 (m, 2H), 0.71 (m, 6H), 0.78 -0.88 (m, 17H), 0.92-0.97 (m, 4H), 1.02- 1.03 (d, 2H), 1.16 (m, 3H), 1.40-1.45 (m, 5H), 1.50-1.78 (m, 4H), 1.82-2.01 (m, 5H), 2.16 (S, 6H), 2.06- 2.28 (m, 3H), 2.39 (m, 1H), 2.47(S, 3H), 2.44-2.50 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.77 (S, 3H), 2.82-2.94 (m, 4H), 2.96-3.00 (m, 3H), 3.10-3.17 (m, 7H), 3.18-3.52 (m, 13H), 3.54-3.70 (m, 2H), 3.76(m, 1H), 3.84-3.99 (m, 3H), 4.00-4.16 (m, 2H), 4.33 (m, 1H), 4.49(t, 1H), 4.54-4.68 (m, 2H), 4.92 (m, 2H), 5.38(s, 2H), 5.95 (m, 1H), 7.00-7.06 (m, 2H), 7.22-7.27 (m, 3H), 7.50-7.55 (m, 2H), 7.70-7.78 (m, 1H), 7.98-8.06 (m, 1H), 9.95 (S, 1H)

제조예 5-2: 화합물 (VII-2)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1) 대신에 제조예 4-2에서 수득한 화합물 (VI-2)(39 mg, 0.026 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물(32 mg, 78%)을 얻었다.

MALDI-TOF MS m/z : 1595.8 [M+Na]⁺

제조예 5-3: 화합물 (VII-3)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1) 대신에 제조예 4-3에서 수득한 화합물 (VI-3)(266 mg, 0.170 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물(37 mg, 57%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1590 [M⁺]⁺

제조예 5-4: 화합물 (VII-4)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1) 대신에 제조예 4-4에서 수득한 화합물 (VI-4)(247 mg, 0.16 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물(197 mg, 77%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1607 [M]⁺

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 0.54(m, 1H), 0.65(m, 3H),0.70-0.78(m, 5H), 0.80-1.00(m, 18H), 1.00-1.08(m, 6H), 1.20(m, 3H), 1.47(m, 5H), 1.60(m, 2H), 1.94(m, 5H), 2.08-2.20(m, 3H), 2.25(d, 6H), 2.40(m, 1H), 2.60(s, 6H), 2.73-3.02(m, 13H), 2.84-3.42(m, 17H, 2*OCH₃),3.60(m, 1H), 3.70(m, 1H), 3.80-4.06(m, 3H), 4.20(t, 2H), 4.38(m, 2H), 4.53(t, 1H), 4.66(m, 2H), 4.78(m, 1H), 4.88-5.10(m, 3H), 5.42(s, 2H), 6.00(m, 1H), 7.07(m, 1H), 7.27-7.37(m, 3H), 7.50-7.58(m, 2H), 7.65-7.85(m, 1H), 8.10(m, 1H), 9.95(s, 1H)

제조예 5-5: 화합물 (VII-5)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1) 대신에 제조예 4-5에서 수득한 화합물 (VI-5)(38 mg, 0.025 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물(25 mg, 62%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1603 [M]⁺

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 0.48 (m, 1H), 0.62 (m, 2H), 0.65-0.78 (m, 6H), 0.71- 1.02 (m, 25 H), 1.16 (m, 2H), 1.30-1.52 (m, 5H), 1.53-1.82 (m, 5H), 1.83-2.12 (m, 5H), 2.14 (d, 6H), 2.54 (s, 3H), 2.58-3.02 (m, 14H), 3.10-3.16 (m, 6H), 3.18-3.20 (m, 7H), 3.28-3.70 (m, 11H), 3.72-3.86 (m, 1H), 3.90-4.04 (m, 1H), 4.03-4.29 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 4.42-4.78 (m, 3H), 4.82-4.98 (m, 2H), 5.06 (m, 1H), 5.39 (s, 2H), 5.96 (m, 1H), 6.78 (m, 1H), 7.03-7.26 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 7.79(d, 1H), 8.00 (d, 1H), 8.07(d, 1H), 9.95 (S, 1H)

제조예 5-6: 화합물 (VII-6)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1) 대신에 제조예 4-6에서 수득한 화합물 (VI-6)(132 mg, 0.09 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물(136 mg, 93%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1619 [M]⁺

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 0.54(m, 1H), 0.63-0.68(m, 3H), 0.70-0.80(m, 5H), 0.81-0.90(m, 17H), 1.00-1.1.08(m, 8H), 1.22(m, 3H), 1.40-1.54(m, 6H), 1.56-1.74(m, 3H), 1.80-2.00(m, 3H), 2.26-2.30(m, 7H), 2.51(m, 6H), 2.56(s, 1H), 2.64-3.04(m, 14H), 3.13-3.30(m, 6H), 3.36(m, 6H), 3.62(s, 1H), 3.69(s, 2H), 3.87-4.04(m, 4H), 4.19(t, 2H0, 4.37(m, 2H), 4.52(t, 1H), 4.62(m, 1H), 4.68(m, 1H), 4.76(m, 1H), 4.89(m, 1H), 4.979m, 2H), 5.08(d, 1H), 5.42(s, 2H), 5.98(m, 1H), 6.81(d, 1H), 7.17(d, 1H), 7.30(m, 1H), 7.60(m, 3H), 7.82(d, 1h), 8.10(m, 1H), 10.00(d, 1H),

제조예 5-7: 화합물 (VII-7)의 제조

제조예 4-1에서 수득한 화합물 (VI-1) 대신에 제조예 4-7에서 수득한 화합물 (VI-7)(296 mg, 0.198 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물(132 mg, 83%)을 얻었다.

LC-MS m/z : 1589 [M]⁺

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 0.48 (m, 1H), 0.60 (m, 2H), 0.71 (m, 5H), 0.71- 0.88 (m, 17 H), 0.98 (d, 3H), 0.93- 1.08 (m, 3H), 1.16 (m, 3H), 1.37-1.45 (m, 5H), 1.50-1.86 (m, 4H), 1.91 (m, 3H), 2.0-2.42 (m, 11H), 2.68 (m, 1H), 2.77 (S, 3H), 2.82-3.02 (m, 5H), 3.10-3.19 (m, 6H), 3.21-3.30 (m, 7H), 3.36-3.50 (m, 16H), 3.54-3.72 (m, 3H), 3.80-4.00 (m, 4H), 4.15 (t, 1H), 4.33 (m, 1H), 4.49-4.71 (m, 3H), 4.86 (m, 2H), 5.04 (m, 1H), 5.39 (s, 2H), 5.96 (m, 1H), 7.03-7.21 (m, 5H), 7.55 (m, 2H), 7.79 (d, 1H), 8.06 (d, 1H) 9.95 (S, 1H)

실시예: 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체의 제조

실시예 1: 결합체 (I-1)의 제조

pH 7.5의 PBS (10 mM phosphate, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl 포함)로 교환 처리된 트라스투주맙 용액 5 mL (5.4 g/mL, 36 μM)에 추가적으로 pH 7.5의 PBS 2.5 ml와 pH 8.5의 0.05 M 소듐보레이트 버퍼 7.5 mL 를 가하고, 20% DMSO 3.75 mL에 용해된 제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) (4.4 mg, 0.003 mmol, 15 당량)를 가한 후, 25 ℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응혼합물을 0.45 ㎛ 여과기로 여과하고, 여액을 원심여과기(centrifugal filter, Amicon Ultra-15 30K)에 담아 유기용매와 미반응 물질이 제거될 때까지 pH 7.5의 PBS를 다시 가하여 2 - 3회 반복 농축하였다. 농축액을 pH 7.5의 PBS 중에 평형화시킨 Sephadex G-25 수지 충진 컬럼 (30 x 300 mm)을 사용하여 MPLC (280 nm, UV range 0.08, flow rate 10 mL/min)로 분리 정제하여 표제화합물 22.5 mg (1.73 mg/mL, 총 부피 13 mL, 83%)를 얻었다. 이때 얻어진 화합물의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.

실시예 2: 결합체 (I-2)의 제조

제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) 대신에 제조예 5-2에서 수득한 화합물 (VII-2) (5.6 mg, 0.004 mmol, 20 당량)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 25.6mg (2.05 mg/mL, 총 부피 12.5 mL, 95%)를 얻었다.

실시예 3: 결합체 (I-3)의 제조

제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) 대신에 제조예 5-3에서 수득한 화합물 (VII-3) (4.0 mg, 0.0024 mmol, 15 당량)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 23.8 mg (1.98 mg/mL, 총 부피 12 mL, 99%)를 얻었다.

실시예 4: 결합체 (I-4)의 제조

제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) 대신에 제조예 5-4에서 수득한 화합물 (VII-4) (4.0 mg, 0.0025 mmol, 15 당량)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 20.4 mg (1.86 mg/mL, 총 부피 11 mL, 82%)를 얻었다

실시예 5: 결합체 (I-5)의 제조

제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) 대신에 제조예 5-5에서 수득한 화합물 (VII-5) (3.8 mg, 0.0024 mmol, 15 당량)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 18.9 mg (1.72 mg/mL, 총 부피 11 mL, 79%)를 얻었다

실시예 6: 결합체 (I-6)의 제조

제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) 대신에 제조예 5-6에서 수득한 화합물 (VII-6) (4.0 mg, 0.0025 mmol, 15 당량)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 19.8 mg (1.8 mg/mL, 총 부피 11 mL, 80%)를 얻었다

실시예 7: 결합체 (I-7)의 제조

제조예 5-1에서 수득한 화합물 (VII-1) 대신에 제조예 5-7에서 수득한 화합물 (VII-7) (3.8 mg, 0.0024 mmol, 15 당량)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 13.0 mg (1.18 mg/mL, 총 부피 11 mL, 54%)를 얻었다

시험예 1: 단백질 질량분석법을 이용한 DAR 결정

실시예에서 제조된 항체-링커-약물 결합체 각각에 PNGase F 엔자임을 37 ℃에서 15±3시간 동안 처리하여 N-결합형 당을 제거하였다. 당이 제거된 항체-링커-약물 결합체를 Agilent 1200 HPLC와 Agilent 6530 Q-TOF 질량분석기(mass spectrometer)로 구성된 LC-ESI-MS를 이용하여 분석하였다. Agilent Zorbax 컬럼(300SB-C18, 2.1 mm x 75 mm, 5 ㎛)과 0.1% 포름산 수용액/ 0.1% 포름산 아세토니트릴 용액의 구배 용리(gradient elution)을 이용하여 항체-링커-약물 결합체를 분리하고, m/z(mass to charge) 데이터를 초당 1 스펙트라의 스캔속도로 900 내지 4000 m/z의 범위에서 획득한 후, 디콘볼루션(deconvolution)하여 분자량과 인테그레이션(integration)된 각 피크(D0, D1, D2 .. Dn)의 존재비(abundance) 정보를 이용하여 DAR을 계산하였다.

각 피크의 상대 존재비(relative abundance)는 하기 식을 이용하여 계산하였다. 각 피크의 존재비를 모든 피크의 존재비의 합으로 나누어 각 피크의 % 상대 존재비를 계산하였다.

항체-링커-약물 결합체의 DAR은 % 상대 존재비와 하기 식을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	결합체 (I-1)
	D0	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	Sum
Mass (Da)	145183.4	146693.5	148201.3	149712	151221.6	152733.2	154245	155747.8	157256	158782.5
Area	102	1424	3455	4709	5143	4244	3996	2766	1683	762	28284
%Area	0.4	5.0	12.2	16.6	18.2	15.0	14.1	9.8	6.0	2.7	100.0
DAR		4.52
	결합체 (I-4)
	D0	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	Sum
Mass (Da)	145180	146700	148195.7	149700.2	151191.8	152675.1	154214.2
Area	0	659	2225	3104	2632	1969	1031				11620
%Area	0	5.7	19.1	26.7	22.7	16.9	8.9				100.0
DAR		3.53
	결합체 (I-5)
	D0	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	Sum
Mass (Da)	145180	146682.2	148171.4	149661.6	151149.2	152635.6	154120.6	155616.1
Area	0	1192	4051	5884	5670	4260	2553	1374			24984
%Area	0	4.8	16.2	23.6	22.7	17.1	10.2	5.5			100.0
DAR		3.84
	결합체 (I-6)
	D0	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	Sum
Mass (Da)	145180	146696.3	148185.3	149697.7	151205.5	152699.3	154228.8	155742.3
Area	0	204	832	1650	1996	906	480	135			6203
%Area	0	3.3	13.4	26.6	32.2	14.6	7.7	2.2			100.0
DAR		3.73
	결합체 (I-7)
	D0	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	Sum
Mass (Da)	145180	146696.3	148150.3	149640.7	151168	152613.7	15087.2	15554.7	157093.4	158600
Area	0	204	1040	1925	2478	2635	1932	886	929	328	12333
%Area	0	1.7	8.2	15.6	20.1	21.4	15.7	7.2	7.5	2.7	100.0
DAR		4.81

시험예 2: SEC-HPLC 분석

크기 배제 크로마토그래피법(Size Exclusion Chromatography, SEC-HPLC)을 이용하여, 항체와 약물을 결합하는 과정에서 항체의 비정상적인 파편(fragment)이나 응집(aggregation)의 발생 유무를 평가하였다. 이런 비정상적인 단백질 구조는 본래 항체가 가지고 있는 항원 특이적인 결합능, 생체 내 약물동력학에 영향을 주기 때문에, 제조된 항체-링커-약물 결합체의 우수성을 간접적으로 확인할 수 있다.

실시예에서 제조된 항체-링커-약물 결합체 각각에 대해 SEC-HPLC를 이용하여 정상 항체 구조 비율을 분석하여, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료	Main peak ¹⁾ (%)	HMW ²⁾ (%)	LMW ³⁾ (%)
결합전 항체	99.48	0.27	0.25
결합체 (I-1)	99.24	0.40	0.35
결합체 (I-2)	99.25	0.38	0.32
결합체 (I-3)	98.44	1.38	0.18
결합체 (I-4)	93.56	6.25	0.18
결합체 (I-5)	94.06	5.73	0.20
결합체 (I-6)	97.27	2.52	0.20
결합체 (I-7)	92.43	7.37	0.19
¹⁾Main peak: 정상적인 항체 크기에 해당하는 물질의 비율 ²⁾HMW (High molecular weight): 응집 현상으로 정상 항체보다 큰 크기의 물질의 비율 ³⁾LMW (Low molecular weight): 파편화 현상으로 정상 항체보다 작은 크기의 물질의 비율

실시예에서 제조된 항체-링커-약물 결합체들은 약물을 접합하기 이전의 항체(99.48%)와 비교하여, 92.43 내지 99.25% 범위의 정상 항체 구조 비율을 보였다.

시험예 3: 시험관내 세포독성 시험

항체-링커-약물 결합체의 항암 효능(potency)은 HER-2 과발현 유방암세포주(BT-474)를 이용하여, 세포생장 저해능(anti-proliferation activity)을 시험관내 실험법으로 평가하였다. 대조군으로는 항체-링커-약물 결합체의 제조에 사용된 트라스투주맙이 사용되었다. 트라스투주맙은 유방암세포에서 특이적으로 발현되는 HER-2 항원에 대한 모노클로날 항체이다.

96웰 마이크로 플레이트에서 웰 당 1 X 10⁴개의 BT-474 세포주를 준비하고, 대조군인 트라스투주맙과 실시예에서 제조된 항체-링커-약물 결합체를 각각 농도 별로 처리한 후, 5일 배양 후에 살아있는 세포 수를 발색시약(CCK-8)으로 처리한 후 흡광도를 측정하여 간접 확인하였다. 농도-효능 간의 관계식은 4차 곡선 함수로 구하고, EC₅₀(effective concentration of 50%, 반수영향농도)를 비교하여, 상대적인 효능을 평가하였다. 그 결과를 도 1 내지 도 4및 표 3에 나타내었다.

표 3에서 보듯이, 대조군인 트라스투주맙과 비교하여, 실시예에서 제조된 항체-링커-약물 결합체들은 7.7 배 내지 34.2 배의 낮은 EC₅₀값을 보였고, 이는 더 적은 양을 사용해도 동등한 효능을 보이며 부작용이 줄어드는 효과를 기대할 수 있음을 나타낸다.

또한, 도 1 내지 도 4에서 보듯이 실시예에서 제조된 항체-링커-약물 결합체들은 대조군인 트라스투주맙과 비교하여 4차 곡선 함수에서 더 낮은 흡광도까지 도달하는데, 이는 세포생장 저해능이 대조군인 트라스투주맙보다 더 뛰어남을 의미한다. 즉, 항체가 본래 가지는 종양세포 저해효능에 접합된 세포독성 약물의 기작에 의해 추가적으로 종양 세포가 감소했음을 나타낸다.

시료	EC ₅₀ (ng/ml)	상대효능 (배)
트라스투주맙	98.6	1
결합체(I-1)	2.88	34.2
트라스투주맙	110	1
결합체(I-3)	14.3	7.7
트라스투주맙	96.6	1
결합체(I-4)	5.18	18.6
트라스투주맙	92.3	1
결합체(I-5)	5.72	16.1
트라스투주맙	96.6	1
결합체(I-6)	7.09	13.6
트라스투주맙	92.3	1
결합체(I-7)	6.7	13.8

시험예 4: 동물모델 효능 시험

동물모델 효능 시험은 HER-2 과발현 유방암세포주(BT-474)를 이종이식(xenograft)한 누드마우스에 실시예 1에서 제조된 항체-링커-약물 결합체 (I-1)을 3종의 용량(0.05, 0.5, 5 mg/kg)으로 단회 정맥 투여한 후, 28일 동안의 종양의 부피와 최종 무게를 비교 평가하여 수행하였다. 음성대조군으로는 생리식염수(PBS)를, 양성대조군으로는 트라스투주맙(허셉틴)을 5 mg/kg로 투여하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6으로부터 트라스투주맙 (허셉틴)을 투여한 양성대조군은 음성대조군과 비교하여 유의적으로 종양이 감소하고, 항체-링커-약물 결합체 (I-1)이 투여된 군들은 양성대조군 보다 더 현저하게 종양이 감소하였음을 확인할 수 있었다.

Claims

하기 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
[화학식 I]

상기 식에서,
Ab는 항체이고,
X는 C₁-C₈의 알킬기 또는 C₃-C₆의 시클로알킬기이며,
R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,
Ar은 아릴기이며,
Z는 질소 또는 산소이고,
R₅는 Z가 질소일 때 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고, Z가 산소일 때 존재하지 않으며,
R₆는 수소, 히드록시, C₁-C₄의 알콕시기 또는 옥소(=O)이고,
n은 1 내지 5이다.
제1항에 있어서,
Ab가 암세포 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체이고,
X는 C₁-C₈의 알킬기 또는 C₃-C₆의 시클로알킬기이며,
R₁, R₂ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,
R₃는 C₁-C₄의 알킬기이며,
Ar은 C₁-C₄의 알킬기, C₁-C₄의 알콕시기 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이고,
Z는 질소이며,
R₅는 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,
R₆는 수소, 히드록시 또는 C₁-C₄의 알콕시기인 것을 특징으로 하는 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서,
Ab가 트라스투주맙(trastuzumab)이고,
X는 메틸, n-프로필, n-펜틸, n-옥틸 또는 시클로프로필이며,
R₁, R₂ 및 R₃는 메틸이고,
R₄는 수소 또는 메틸이며,
Ar은 메틸, 메톡시 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이고,
Z는 질소이며,
R₅는 수소 또는 메틸이고,
R₆는 수소, 히드록시 또는 메톡시인 것을 특징으로 하는 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서, 하기 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

상기 식에서, n은 1 내지 5이다.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커-약물이 항체의 라이신 잔기에 직접 결합된 것을 특징으로 하는 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 92% 이상의 정상 항체 구조 비율을 가지는 것을 특징으로 하는 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
(i) 하기 화학식 II의 화합물과 하기 화학식 III의 돌라스타틴 10 유도체를 축합반응시켜 하기 화학식 IV의 화합물을 수득하는 단계;
(ii) 하기 화학식 IV의 화합물에 하기 화학식 V의 화합물을 첨가반응시켜 하기 화학식 VI의 화합물을 수득하는 단계;
(iii) 하기 화학식 VI의 화합물과 N-히드록시숙신이미드를 축합반응시켜 하기 화학식 VII의 화합물을 수득하는 단계; 및
(iv) 하기 화학식 VII의 화합물과 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 I의 항체-링커-약물 결합체의 제조방법:
[화학식 II]

[화학식 III]

[화학식 IV]

[화학식 V]

[화학식 VI]

[화학식 VII]

[화학식 I]

상기 식에서,
Ab는 항체이고,
X는 C₁-C₈의 알킬기 또는 C₃-C₆의 시클로알킬기이며,
R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고,
Ar은 아릴기이며,
Z는 질소 또는 산소이고,
R₅는 Z가 질소일 때 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이고, Z가 산소일 때 존재하지 않으며,
R₆는 수소, 히드록시, C₁-C₄의 알콕시기 또는 옥소(=O)이고,
n은 1 내지 5이다.
제7항에 있어서, 단계 (i)의 축합반응이 히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시아자벤조트리아졸(HOAt) 및 히드록시숙신이미드(HOSu)로 구성된 군으로부터 선택된 축합제와 피리딘 및 디이소프로필에틸아민으로 구성된 군으로부터 선택된 유기 염기의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계 (iii)의 축합반응이 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)로 구성된 군으로부터 선택된 축합제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계 (iv)의 반응용매가 pH 6.0 내지 8.0의 포스페이트 버퍼인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계 (iv)의 반응용매가 pH 6.0 내지 8.0의 포스페이트 버퍼와 유기용매의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제11항에 있어서, 혼합용매 중 유기용매의 비율은 50부피% 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계 (iv)에서 화학식 VII의 화합물이 항체를 기준으로 3 내지 25 당량 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체-링커-약물 결합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 항암제 조성물.
제14항에 있어서, 항암제가 유방암 치료에 적용되는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.