KR101590268B1 - 효소를 이용한 글리세롤 아세테이트의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글리세롤 아세테이트의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤로부터 글리세롤 아세테이트를 합성함에 있어서 최적의 반응 조건을 제공하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 효소를 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 아세테이트를 생산하는 방법은 기존의 화학적 방법에 비해 온건한 조건에서 생산이 가능하다. 또한 산 혹은 염기 촉매를 이용한 기존의 방식을 대체함으로써 환경 보존에 기여할 수 있다. 본 발명은 또한 일련의 반응 조건 최적화를 통해 최적의 반응 조건을 확립함으로써 생산량 및 비용의 최적화를 달성할 수 있다.

Description

효소를 이용한 글리세롤 아세테이트의 제조 방법 {Method for enzymatic synthesis of glycerol acetate}
본 발명은 글리세롤 아세테이트의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤로부터 글리세롤 아세테이트를 합성함에 있어서 최적의 반응 조건을 제공하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법에 관한 것이다
전 세계적으로 화석 연료에 대한 수요가 증가하고 있으나, 공급은 이에 미치지 못하는 실정이다. 이로 인한 화석 연료의 가격 상승이 불가피하며, 대표적으로 이용되는 화석 연료인 석유의 경우 생산지의 정세에 따른 유가의 변동 폭이 큰 점으로 인해 많은 사회적 문제를 발생시키고 있다. 화석 연료의 가격 상승은 비단 차량의 연료 가격 상승만이 아닌, 화학 공정을 통해 생산되는 많은 물질들의 공정 가격의 상승을 가져옴으로써 그 문제가 심각하다고 할 수 있다. 이러한 화석 연료의 문제점으로 인해, 대체 연료의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.
바이오디젤은 재생 가능한 자원으로부터 생성되며, 화석 연료에 비해 적은 양의 환경오염 물질을 배출하고 화석 연료 대비 90%의 에너지를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있다. 현재 바이오디젤의 생산에 대한 연구는 식용 작물을 이용한 연구에서 시작하여 목질계 바이오매스를 이용한 생산을 거쳐 미세조류를 이용한 바이오디젤의 생산으로 확장되는 등 그 관심이 매우 높은 대체 연료이다. 현재 가장 널리 쓰이는 바이오디젤 생산 방법은 동물성 기름 혹은 식물성 기름을 이용한 방법이며, 이들의 에스테르화 반응을 통해 바이오디젤이 생성된다. 이 때 전체 바이오디젤 생산량의 10%에 해당하는 글리세롤이 부산물로 생성된다 (도1). 바이오디젤의 생산이 점차 증가함에 따라 부산물인 글리세롤의 생산량 또한 증가하고 있으며, 이로 인해 글리세롤의 가치가 점차 하락하고 있다. 따라서 글리세롤의 고부가가치화는 대체에너지 개발 공정에서 필수적인 요소로 고려된다.
글리세롤은 수산화기를 작용기로 가진 트리올의 형태를 갖는다. 글리세롤의 고부가가치화를 위해 산화, 에테르화, 에스테르화, 케탈화 등을 통해 유도체를 생산하며, 생산된 글리세롤의 유도체는 식품, 화장품, 화학 등 다양한 산업에서 적용되고 있다. 이들 유도체 중 에스테르화 반응을 통해 생성되는 글리세롤 에스터가 가장 큰 관심을 받고 있다. 글리세롤 아세테이트는 글리세롤 에스터의 한 종류로, 현재 산 또는 염기 촉매를 통한 글리세롤의 아세틸화를 통해 생산되고 있다. 글리세롤 아세테이트는 글리세롤 모노아세테이트, 글리세롤 디아세테이트, 글리세롤 트리아세테이트의 세 가지 형태로 존재하며 세 형태 모두 용매, 식품 첨가제, 화장품 첨가제 등으로 이용되고 있다.
글리세롤로부터 글리세롤 아세테이트를 생성하는 반응은 아세테이트기를 필요로 하며, 메틸 아세테이트가 아세테이트 제공자로 이용된다. 메틸 아세테이트와 글리세롤은 리파아제에 의해 촉진되는 전이에스테르화 반응을 통해 글리세롤 아세테이트를 생성한다. 각각 1 몰의 메틸 아세테이트와 글리세롤이 반응하여 글리세롤 아세테이트와 메탄올 1 몰 씩을 생성한다 (반응식 1 내지 3).
반응식1.
Figure 112014087768027-pat00001
반응식2.
Figure 112014087768027-pat00002
반응식3.
Figure 112014087768027-pat00003
글리세롤 아세테이트는 또한 효소를 이용하여 생성될 수 있으며, 리파아제가 전이에스테르화 반응을 위한 효소로 이용 가능하다. 효소를 통한 글리세롤 아세테이트 합성은 전이에스테르화 반응을 토대로 하며, 따라서 아세테이트기를 제공할 물질을 필요로 한다. 또한 효소 반응이므로, 반응에 이용되는 아세테이트 제공자는 효소의 안정성에 영향을 미치지 않고 비교적 낮은 온도에서도 반응할 수 있는 물질이 요구된다. 메틸 아세테이트는 기초적인 구조를 가진 아세테이트 제공자로, 리파아제의 안정성을 해치지 않는 물질로 밝혀진 바 있다. 리파아제를 이용한 바이오디젤 및 글리세롤 카보네이트 등의 합성 반응에 관한 연구는 활발히 진행되고 있으나, 글리세롤 아세테이트 합성 연구는 전무한 실정이다.
따라서 글리세롤의 고부가가치화를 수행할 수 있는 생물학적 글리세롤 아세테이트의 제조 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명은 리파아제 존재 하에서 글리세롤과 메틸 아세테이트의 반응을 통해 글리세롤 아세테이트를 합성하고, 다양한 반응 변수 (효소의 종류, 효소 농도, 반응 온도, 용매 등)의 영향에 대해 파악하여, 최적화된 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 무위치 선택성 리파아제의 존재 하에 글리세롤과 메틸 아세테이트를 반응시키는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다.
상기 무위치 선택성 리파아제는 고정화된 리파아제인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 리파아제가 0.5 내지 15.0 g/L 의 농도인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 리파아제의 농도는 2 내지 3g/L가 바람직하고, 약 2.5 g/L인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율이 1:5 내지 1:60 인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 몰 비율은 1:30 내지 1:60 이 바람직하고, 약 1:40 인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 반응이 20 내지 50℃ 에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 온도는 35 내지 45℃ 인 것이 바람직하고, 약 40℃인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 반응이 용매 하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 용매는 t-부탄올 (tert-Butanol), THF (Tetrahydrofuran), 아세토니트릴 (Acetonitrile), DMSO (Dimethylsulfoxide), 1,2-디클로로에탄 (1,2-Dichloroethane)으로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하는 것이 바람직하고, t-부탄올이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 반응이 크루드글리세롤을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 크루드글리세롤은 바이오디젤 생산의 부산물로 생성된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 친환경적으로 글리세롤 아세테이트를 제조할 수 있는 방법으로서, 바이오디젤 생산에 따른 부산물의 감소 뿐만 아니라 글리세롤 아세테이트의 고부가가치화를 달성할 수 있다.
본 발명에 의한 효소를 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 아세테이트를 생산하는 방법은 기존의 화학적 방법에 비해 온건한 조건에서 생산이 가능하다. 또한 산 혹은 염기 촉매를 이용한 기존의 방식을 대체함으로써 환경 보존에 기여할 수 있다. 본 발명은 또한 최적의 반응 조건을 확립하기 위해 일련의 반응 조건 최적화를 달성함으로써 생산량 및 비용의 최적화를 달성할 수 있다.
도1은 글리세롤이 생산되는 과정을 도식한 것이다.
도2는 효소의 농도에 따른 글리세롤 아세테이트의 전환율을 나타낸 결과이다.
도3은 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율에 따른 글리세롤 아세테이트의 전환율을 나타낸 결과이다.
도4는 온도에 따른 글리세롤 아세테이트의 전환율을 나타낸 결과이다.
도5는 용매에 따른 글리세롤 아세테이트의 전환율을 나타낸 결과이다.
도6은 크루드글리세롤 사용에 따른 글리세롤 아세테이트의 전환율을 순수글리세롤의 전환율과 비교하여 나타낸 결과이다.
이하, 필요에 따라 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 무위치 선택성 리파아제의 존재 하에 글리세롤과 메틸 아세테이트를 반응시키는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 글리세롤과 메틸 아세테이트의 전이에스테르화 반응은 높은 활성화 에너지를 가지나 메틸 아세테이트의 끓는점은 56.9℃로 낮기 때문에 고온의 반응 조건을 이용할 수 없다. 따라서 효소로 이용되는 리파아제의 존재는 필수적이다. 일반적으로 리파아제는 그 종류에 따른 위치 선택성을 가지며, 무위치 선택성 리파아제와 1,3-위치 선택성 리파아제의 두 가지 혹은 1,3-위치 특이성 리파아제를 포함한 세 가지로 나뉜다. 전이에스테르화 반응에서 리파아제의 위치 선택성은 반응에 큰 영향을 미치는 요소이다. 본 발명에 따른 전이에스테르화 반응에는 무위치 선택성 리파아제가 유리하게 작용한다.
리파아제는 위치 선택성에 의한 분류 외에 고정화 여부에 따라 고정화된 리파아제 및 고정화되지 않은 리파아제로 분류된다. 고정화되지 않은 효소는 고정화된 효소에 비해 유기용매 조건 및 고온 조건에서 낮은 활성을 나타내거나 혹은 활성을 나타내지 못하는 단점이 존재한다. 그러나 보다 낮은 가격으로 인해 널리 이용되고 있다. 본 발명에 따르면 상기 무위치 선택성 리파아제는 고정화된 리파아제인 것이 바람직하다.
상기 리파아제는 0.5 내지 15.0 g/L 의 농도인 것이 바람직하고 2.0 내지 3.0 g/L가 더욱 바람직하며, 약 2.5 g/L인 것이 가장 바람직하다. 상기 리파아제의 농도가 0.5g/L 미만이면 반응이 너무 느리게 이루어질 수 있고 15.0 g/L 초과하면 용액의 점도가 증가하여 반응액 혼합이 어렵거나 역반응이 일어날 수 있다. 효소는 기질과 결합하여 기질-효소 복합체를 형성한 후 결과물을 생성한다. 이를 설명하는 Michaelis-Menten 식에 따르면, 초기 효소 농도는 반응의 최대 정반응속도와 비례한다. 따라서 효소 농도가 높을수록 반응은 촉진된다. 그러나 효소의 농도는 반응액의 혼합 속도에 또한 영향을 미친다. 효소의 농도가 높을수록 용액의 점도가 증가하므로 반응액은 잘 혼합되지 않으며, 이는 효소의 작용을 억제한다. 또한 리파아제는 에스테르 결합의 분해를 이용하는 정반응뿐만 아니라 그 역반응도 수행한다. 반응계 내의 글리세롤 아세테이트가 늘어날수록 역반응에 이용될 수 있는 글리세롤 아세테이트의 양 또한 증가하므로, 과잉의 리파아제가 역반응을 수행하여 글리세롤 아세테이트 생성을 억제한다. 따라서 최적의 효소 농도를 탐색하는 것은 글리세롤 아세테이트 생성에 있어 매우 중요하다.
본 발명은 또한 상기 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율이 1:5 내지 1:60 인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 몰 비율은 1:30 내지 1:60 이 바람직하고, 약 1:40 인 것이 가장 바람직하다. 상기 몰 비율이 1:5 미만이면 반응 수율이 낮아질 우려가 있고, 1:60 초과이면 반응이 저해될 수 있다. 글리세롤과 메틸 아세테이트는 1:1로 반응하여 글리세롤 모노아세테이트를 생성한다. 이는 메틸 아세테이트와의 반응을 통해 글리세롤 디아세테이트, 글리세롤 트리아세테이트으로 전환되며 각각 1:1로 반응한다. 글리세롤 아세테이트 생성에 이용되는 전이에스테르화 반응은 가역적인 반응이다. 따라서 높은 전환율을 위해서 역반응을 억제하여야 하며, 이를 위해 이들의 양론 계수보다 더 높은 메틸 아세테이트의 몰 비율이 요구된다. 양론 계수 이상의 메틸 아세테이트 공급은 르 샤틀리에의 원리 (Le Chatelier's principle)에 의해 정반응을 촉진시키고, 풍부한 아세테이트기 공급에 의한 유효충돌의 증가를 통해 전환율을 높인다. 그러나 최적의 메틸 아세테이트 비율을 넘어선 과잉 공급은 효소의 활성을 방해한다. 효소 속도론적 관점에서 이는 기질저해에 의한 것이며, 최적 농도 이상의 기질이 주어질 경우 기질의 양이 증가할수록 반응 속도는 감소한다.
본 발명은 또한 상기 반응이 20 내지 50℃ 에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 온도는 35 내지 45℃ 인 것이 바람직하고, 약 40℃인 것이 가장 바람직하다. 상기 온도가 20℃ 미만이면 반응이 너무 느리게 일어날 가능성이 있고, 50℃ 초과하면 효소의 변성 및 공정 비용의 증가 우려가 있다. 반응 온도는 전이에스테르화 반응에 있어 중요한 요소 중 하나로, 반응 온도가 증가함에 따라 분자의 운동 속도가 증가하여 유효 충돌 빈도를 증가시키므로 반응 속도 또한 증가한다. 그러나 효소는 단백질로 이루어진 그 특성으로 인해 고온의 조건에서 변성되어 활성을 잃는다.
본 발명은 또한 상기 반응이 용매 하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 용매는 t-부탄올 (tert-Butanol), THF (Tetrahydrofuran), 아세토니트릴 (Acetonitrile), DMSO (Dimethylsulfoxide), 1,2-디클로로에탄(1,2-Dichloroethane)으로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하는 것이 바람직하고, t-부탄올이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 반응이 크루드글리세롤을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법을 제공한다. 상기 크루드글리세롤은 바이오디젤 생산의 부산물로 생성된 것을 이용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 하기 실시예들에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 및 방법
1. 효소 및 시약
아세테이트기 제공자로 이용되는 메틸 아세테이트는 대정화금 (시흥, 대한민국)의 제품을 사용하였다. 글리세롤은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, 미국)에서 구입하였다. 효소 선택을 위해 Novozym 435 (Candida antarctica lipase B immobilized on a macroporous acrylic resin), Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei lipase immobilized on an anionic resin)을 Novo Nordisk Bioindustry (Bagsvrd, 덴마크)에서 구입하였다. Amano AK (Pseudomonas fluorescens lipase)를 Amano International Enzyme (Nagoya, 일본)에서 구입하여 이용하였다. 용매 선정에 이용되는 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran, THF)과 아세토니트릴은 Junsei Chemical (Tokyo, 일본)에서, 다이메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)와 1,2-디클로로에탄 (1,2-Dichloroethane)은 대정화금에서, 그리고 t-부탄올 (tert-butanol)은 시그마 알드리치 (Sigma-Aldrich)에서 각각 구입하여 이용하였다.
2. 전이에스테르화 반응
본 발명에서는 글리세롤 아세테이트 합성 효율을 향상시키기 위하여 순차적인 반응 인자 별 실험 설계를 구축하였다. 반응은 진탕배양기에서 수행되었으며, 각 실험 샘플은 50 ml 스크류캡 플라스크에 반응 부피를 10 ml로 설정하였다.
3. 효소 선택
리파아제인 Novozym 435, Lipozym RM IM, Amano AK의 세 효소를 선정하여 실험을 수행하였다. 초기 실험을 위하여 효소 농도를 5.0 g/L로 설정하고 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 1:5로 설정하였으며, THF를 용매로 이용하였다. 반응은 진탕배양기를 이용하여 30℃, 180 rpm으로 설정하여 12시간동안 수행하였다.
4. 효소 농도 선택
최적의 효소 농도를 도출하기 위하여 Novozym 435를 이용하였으며, 효소의 농도는 1.0 g/L, 2.5 g/L, 5.0 g/L, 10.0 g/L, 15.0 g/L의 다섯 조건에서의 반응을 수행하였다. 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 1:5로 설정하고 THF를 용매로 이용하였으며, 반응은 진탕배양기를 이용하여 30℃, 180 rpm으로 설정하여 12시간동안 수행하였다.
5. 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율 선택
반응물의 몰 비율에 따른 영향을 분석하기 위해 다양한 조건에서 실험을 수행하였다. 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:60으로 설정하여 수행하였으며, Novozym 435의 농도를 2.5 g/L로 설정하고 THF를 용매로 사용하였다. 반응은 진탕배양기를 이용하여 30℃, 180 rpm으로 설정하여 12시간동안 수행하였다.
6. 반응 온도 선택
반응 온도의 영향을 파악하기 위해 20℃, 30℃, 40℃, 50℃의 반응 온도를 설정하여 실험을 수행하였다. Novozym 435을 2.5 g/L의 농도로 설정하고 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 1:40으로 설정하였으며, THF를 용매로 사용하였다. 반응은 진탕배양기를 이용하여 180 rpm에서 12시간동안 반응을 수행하였다.
7. 용매 선택
각 용매의 친수성을 고려하여 DMSO, 아세토니트릴, THF, t-부탄올, 1,2-디클로로에탄의 총 다섯 가지의 용매를 이용하였다. 각 샘플에 Novozym 435를 2.5 g/L의 농도로 설정하고 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 1:40으로 설정하였다. 반응은 진탕배양기를 이용하여 40℃, 180 rpm으로 설정하여 12시간동안 수행하였다.
8. 크루드글리세롤 이용
실제 바이오디젤 부산물 고부가가치화 공정의 적용 가능성을 시험하기 위해 크루드글리세롤을 사용하였다. 크루드글리세롤은 단석산업에서 구입하였다. 크루드글리세롤 샘플에 Novozym 435를 2.5 g/L의 농도로 설정하고 크루드글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 1:40으로 설정하였다. 용매로 t-부탄올을 이용하였으며, 반응은 진탕배양기를 이용하여 40℃, 180rpm 조건에서 12시간동안 수행하였다.
9. 분석 방법
글리세롤 아세테이트 생성량 측정을 위하여 반응 용액에서 1 ml의 샘플을 주사기로 추출하여 1.5 ml 튜브에 준비하고, 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm에서 10 분간 효소 지지체 조각 등의 부유물을 침전시켰다. 이후 상등액을 희석 없이 필터 (Advantec DISMIC-13JP PTFE 0.20 m, Japan)로 필터링하여 분석용 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플은 Agilent 7890A 가스 크로마토그래피를 이용하여 분석하였으며, DB5-MS 모세관 컬럼 (5% phenyl methyl polysiloxane capillary, 30.0m×250㎛×250㎛)을 통해 분리하고 불꽃이온검출기 (Flame ionization detector, FID)를 통해 분석을 수행하였다. 질소를 운반 기체로 이용하였으며, 1㎕ 의 샘플을 주입하였다. 컬럼의 온도 설정은 초기 온도를 140℃로 설정하고 2 분간 유지 후 20℃/min의 속도로 240℃ 까지 가열하였다. 이후 최종 온도에서 2분간 유지한다. 주입구의 온도는 210℃로 설정하였으며, 검출기의 온도는 250℃로 설정하였다. 검출 결과는 Agilent ChemStation을 이용하여 분석하였다. 글리세롤 아세테이트의 전환율은 아래 식을 이용하여 계산하였다.
Figure 112014087768027-pat00004

결과 및 평가
1. 효소 및 효소 농도 선택
효소는 무위치 선택성 리파아제 Novozym 435와 1,3-위치 선택성 리파아제 Lipozym RM IM이 반응에 사용되었다. 그 결과, Novozym 435를 이용한 반응의 전환율은 36.11%, Lipozym RM IM을 이용한 반응은 1.93%를 나타내었다. 따라서 전이에스테르화 반응에는 무위치 선택성 리파아제가 유리하게 작용했다.
또, 고정화 효소인 Novozym 435와의 비교를 위해 무위치 선택성 리파아제이며, 고정화되지 않은 Amano AK를 이용하였다. Amano AK를 이용한 반응의 전환율은 5.73%를 나타내었으며, 이는 Novozym 435를 이용할 때에 비해 15.87%에 불과했다 (표1). 이 결과는 유기 용매인 THF 및 메틸 아세테이트 하에서 고정화되지 않은 효소의 사용이 부적절함을 의미하며, 따라서 Novozym 435를 최적의 효소로 선정하고 순차적 실험에 이용하였다.
각 효소의 고정화 여부 및 위치 선택성에 따른 글리세롤 아세테이트의 전환율
효소 고정화 여부 위치 선택성 상대 전환율(%) 절대 전환율(%)
Novozym 435 O 무위치 선택성 100 36.11
Lipozyme RM IM O 1,3-위치 선택성 5.34 1.93
Amano AK X 무위치 선택성 15.87 5.73
최적의 효소 농도를 파악하기 위하여 1.0 g/L, 2.5 g/L, 5.0 g/L, 10.0 g/L, 15.0 g/L의 효소 농도를 이용하였다(도2). 2.5 g/L에서 반응의 전환율은 40.37%를 나타내었다. 2.5 g/L보다 낮은 1.0 g/L에서의 전환율은 34.71%로 나타났으며, 2.5 g/L보다 높은 5.0 g/L, 10.0 g/L, 15.0 g/L에서 각각 36.11%, 36.83%, 34.56%의 전환율을 나타내었다. 따라서 반응 부피가 10 ml로 설정된 본 연구의 샘플의 혼합을 저해하지 않는 최적의 효소 농도가 2.5 g/L임을 파악하였으며, 이를 기반으로 이후의 실험을 수행하였다.
2. 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율 선택
글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율을 각각 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:60으로 설정하여 실험을 수행하였다 (도3). 그 결과 1:5, 1:10, 1:20의 몰 비율에서 몰 비율이 증가함에 따라 각각 40.37%, 55.88%, 61.27%로 전환율이 상승하였으며, 1:40의 몰 비율에서 가장 높은 82.93%의 전환율을 나타내었다. 그러나 1:60의 몰 비율에서는 이보다 낮은 71.40%의 전환율을 나타내었다. 따라서, 상기 결과에 따르면 최적의 몰 비율은 1:40이므로, 이를 토대로 이후의 실험을 진행하였다.
3. 온도 선택
최적의 반응 온도를 탐색하기 위해 20℃, 30℃, 40℃, 50℃로 설정하여 실험을 수행하였다. 그 결과 각각의 조건에 대하여 75.41%, 82.93%, 87.28%, 87.64%의 전환율이 기록되었다 (도4). 본 연구에서 수행된 각 온도 조건에서, 효소는 온도가 증가함에 따라 변성되지 않고 꾸준히 활성을 높여 50℃에서 최대의 전환율을 나타내었다. 그러나 공정 비용의 측면에서 40℃ (87.28%)와 50℃ (87.64%)의 결과를 분석하면, 10℃의 온도 상승에 비해 0.36%의 전환율 상승은 단위 글리세롤 아세테이트 생산 당 공정 비용을 상승시키는 결과를 야기한다. 그러므로 40℃의 온도를 최적으로 설정하여 이후의 실험을 진행하였다.
4. 용매 선택
글리세롤 아세테이트 합성에 있어 최적의 용매를 선정하기 위해 다양한 용매를 이용하였다. 각 용매의 친수성을 고려하여 DMSO (Dimethyl Sulfoxide), 아세토니트릴, THF (Tetrahydrofuran), t-부탄올 (tert-Butanol) 및 1,2-디클로로에탄을 이용하였다 (도5). 친수성이 매우 강한 DMSO의 존재 하에 반응물들은 잘 섞이지 못하여 13.58%의 결과를 보였다. 글리세롤은 친수성 물질로, 소수성인 메틸 아세테이트에 대해 용해도가 낮다. 메틸 아세테이트 존재 하에서 글리세롤은 효소와 결합하여 친수성 막을 형성할 수 있으며 형성된 막은 메틸 아세테이트와 효소의 접촉을 방해하여 글리세롤 아세테이트 합성을 저해한다. t-부탄올, THF, 아세토니트릴, 1,2-디클로로에탄의 존재하에서 글리세롤과 메틸 아세테이트는 잘 혼합되어 효소의 표면의 막 형성을 막아서 글리세롤 아세테이트 전환 반응을 향상시킬 수 있다. 이에 따라 아세토니트릴, THF, 1,2-디클로로에탄에 대하여 각각 80.12%, 87.28%, 87.55%의 전환율이 기록되었다. 특히 친수성 및 소수성을 모두 지닌 t-부탄올의 존재하에서 THF의 결과인 87.28%보다 높은 95.00%의 전환율을 나타내었다. 따라서 t-부탄올을 최적 용매로 선정하였다.
5. 크루드글리세롤 이용
바이오디젤 생산 공정에서 글리세롤은 정제되지 않은 크루드글리세롤의 형태로 생산된다. 크루드글리세롤의 글리세롤 함량은 원료에 따라 다르며, 여기 사용된 크루드글리세롤의 글리세롤 함량은 87% 였다. 순수 글리세롤과 크루드글리세롤의 글리세롤 아세테이트 생산을 비교하기 위해 순수 글리세롤 및 크루드글리세롤을 이용하여 실험을 수행하였다 (도6). 리파아제로 Novozym 435의 농도를 2.5 g/L로 설정하고 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율은 1:40으로 설정하였으며 t-부탄올을 용매로 사용하였다. 반응은 진탕배양기에서 40℃, 180rpm으로 설정하여 12시간 동안 수행하였다. 그 결과 같은 양의 순수 글리세롤 및 크루드글리세롤에서 각각 95.00% 와 85.21%의 글리세롤 아세테이트 전환율을 보였다.
결과적으로, 최적화된 조건하에서 글리세롤 아세테이트 생산 반응의 전환율은 95.00%를 기록하였다. 지금까지 효소를 이용한 글리세롤 아세테이트 생산에 대한 연구는 진행된 바 없다. 따라서 본 발명은 친환경적 글리세롤 아세테이트 생산 공정의 개발에 있어 초석이 될 수 있을 것으로 기대한다.

Claims (9)

  1. 무위치 선택성 리파아제의 존재 하에 글리세롤과 메틸 아세테이트를 반응시키는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 무위치 선택성 리파아제는 고정화된 리파아제인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리파아제가 0.5 내지 15.0 g/L 의 농도인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글리세롤과 메틸 아세테이트의 몰 비율이 1:5 내지 1:60 인 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 반응이 20℃ 내지 50℃ 에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 반응이 용매 하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 용매는 t-부탄올 (tert-Butanol), 아세토니트릴, THF (Tetrahydrofuran), DMSO (Dimethylsulfoxide), 1,2-디클로로에탄으로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택한 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 용매는 친수성 및 소수성을 모두 지니고 있는 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 글리세롤은 순수 글리세롤 및 크루드글리세롤로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택한 것을 특징으로 하는 글리세롤 아세테이트의 제조 방법.
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