KR20230118396A - 효소를 이용한 나린진 아세테이트 합성방법 및 이의 합성용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효소를 이용한 나린진 아세테이트 합성방법에 관한 것으로서, 리파아제 존재 하에, 나린진(naringin)과, 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)를 반응시키는 나린진 아세테이트 합성방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 효소를 이용한 나린진 아세테이트 합성방법 및 이의 합성용 키트에 관한 것으로서, 위치 선택성 리파아제 존재 하에 나린진과 아실 공여체를 여러 반응조건에서 반응시킴으로써 짧은 시간 내에 나린진 아세테이트로의 전환율을 최대화할 수 있는 나린진 아세테이트 합성방법 및 이의 합성용 키트에 관한 것이다.
플라보노이드는 자연에서 얻을 수 있는 항산화 물질로, 일반적으로 과일, 야채, 꽃, 차 등에서 얻을 수 있고, 다양한 생물학적, 약리학적 활성으로 만성 질환의 예방 및 치료제로 각광받고 있는 물질이다.
나린진은 대표적인 시트러스 플라보노이드로, 자몽 및 감귤류 껍질에 광범위하게 분포되어 있으며 강력한 항산화, 항균제 및 항암효과 등의 약리학적 활성을 보이고, 혈당과 콜레스테롤 수치를 낮춘다고 밝혀졌다. 또한, 나린진 보충제는 비만, 당뇨병, 고혈압, 대사증후군 치료제로써 활용 가능하다.
시트러스 계열은 세계적으로 연간 최대 9천만 톤이 유통되는 중요한 과일 중 하나로, 상당한 양의 시트러스 껍질 폐기물이 발생되는데, 이러한 폐기물에 플라보노이드가 많이 포함되어 있어 다양한 산업으로의 적용에 대한 관심이 높아지고 있다.
하지만, 일반적으로 글리코실화된 플라보노이드는 소수성 환경에서 용해도와 안정성이 낮기 때문에 생체이용률에 제한적이다. 즉, in vitro 시스템에서의 생물학적 효과를 in vivo 시스템에서 적용하는 것을 방해하는 요인이 된다. 플라보노이드의 항산화 효과 및 라디칼 제거 능력은 그들의 화학 구조뿐만 아니라 친유성 정도에도 의존하기 때문이다.
글리코실화된 플라보노이드는 많은 수산기의 존재로 불안정하여 빛, 산소, 고온 등에 의해 분해되기 쉽다. 따라서 체내 흡수력과 안정성을 높이기 위해 지질상에서의 나린진 용해도를 높여야 한다.
나린진의 용해도를 높이기 위한 전략으로 아실화가 있는데, 화학적 아실화 방법은 고온 또는 고압에서 이루어지기 때문에 폴리올과 같은 불안정한 물질을 아실화하기 어렵다. 또한, 폴리올인 플라보노이드의 위치특이적 아실화를 하기 위해 보호 및 탈보호 단계가 필요하다. 이 과정에서 독성 부산물 또는 고온과 같은 가혹한 반응 조건이 필요하기에, 화학적 아실화 방법은 환경에 미치는 악영향과 안전에 대한 우려로 인하여 식품분야에 적용하기 제한적이다.
한편, 효소적 방법으로 리파아제가 이용되고 있는 플라보노이드 에스터 합성 연구가 대두되고 있다. 리파아제는 유기 및 수성 상에서 이용 가능하고 안정성이 있기 때문에 생물 공정에서 잠재력이 있는 효소로 알려져 있다. 특히 미생물 리파아제는 유기용매에서 안정적일 뿐만 아니라 보조 인자가 불필요하며 넓은 특이성을 가지고 있다. 따라서 반응 메커니즘, 구조 등에 대한 연구가 많이 진행되었으며 다양한 산업 분야에 활용되고 있다.
그러나 효소적 합성에는 효소의 높은 비용과 단백질이므로 주변 환경에 의해 효소의 변성이 일어날 수 있고 분리 및 정제가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 자유 효소의 단점을 극복하기 위한 전략으로 고정화가 있다. 고정화 효소를 사용하게 되면 분리가 용이하여 재사용이 가능하므로 효소의 소모가 감소한다. 또한, 열과 유기용매에 대한 안정성이 증가하므로 고정화효소를 이용한 플라보노이드 에스터 합성 연구가 많이 진행되고 있다.
이러한 상황에서 나린진 아세테이트의 합성에 대하여 많은 연구가 진행되고 있지만, 짧은 시간 내에 높은 전환율을 얻기 위하여 최적화를 통해 합성되는 나린진 아세테이트의 효소적 합성에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
따라서 나린진 아세테이트의 효소적 합성으로 짧은 시간에 높은 전환율을 얻을 수 있는 기술적 특징에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.
(특허문헌 1) KR 10-1845042 B
효소적 합성으로 종래기술보다 더 짧은 시간에 더 높은 전환율을 달성할 수 있는 나린진 아세테이트를 합성하는 방법 및 합성용 키트를 제안하고자 한다.
상술한 종래기술에 따른 문제점을 해결하고자 본 발명에 따른 나린진 아세테이트 합성방법은, 리파아제 존재 하에, 나린진(naringin)과, 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)를 반응시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 리파아제는 위치 선택성을 갖는 리파아제일 수 있다.
바람직하게는, 상기 위치 선택성 리파아제는 고정화된 리파아제일 수 있다.
바람직하게는, 상기 리파아제는 Lipozyme TL IM일 수 있다.
바람직하게는, 상기 리파아제의 농도는 1 내지 9 g/L일 수 있다.
바람직하게는, 상기 리파아제의 농도는 1 내지 5 g/L일 수 있다.
바람직하게는, 상기 나린진(naringin)과, 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)의 몰비는 1:1 내지 1:11일 수 있다.
바람직하게는, 상기 나린진(naringin)과, 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)의 몰비는 1:5 내지 1:11일 수 있다.
바람직하게는, 상기 반응이 30 내지 60℃에서 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 반응이 40 내지 60℃에서 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 반응이 유기용매 하에서 이루어지며, 상기 유기용매는 아세토나이트릴, 아세톤, 1,4-다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올 및 1,2-다이클로로에테인으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 유기용매는 아세토나이트릴일 수 있다.
바람직하게는, 상기 나린진(naringin)과 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride)을 반응시킬 수 있다.
상술한 종래기술에 따른 문제점을 해결하고자 본 발명에 따른 나린진 아세테이트 합성용 키트는, 위치 선택성 리파아제; 나린진(naringin); 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate); 및 유기용매를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 리파아제는 Lipozyme TL IM일 수 있다.
바람직하게는, 상기 유기용매는 아세토나이트릴, 아세톤, 1,4-다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올 및 1,2-다이클로로에테인으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 유기용매는 아세토나이트릴일 수 있다.
상술한 종래기술에 따른 문제점을 해결하고자 본 발명에 따른 나린진 아세테이트 합성방법은, 아세토나이트릴인 유기용매에 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate), 나린진(naringin) 및 위치 선택성 리파아제를 첨가하여 40 내지 60℃에서 4 내지 24시간 동안 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 위치 선택성 리파아제는 Lipozyme TL IM일 수 있다.
상술한 과제해결수단으로 인하여, 낮은 선택도에 의해 부반응이 발생되고 고온 고압의 조건을 필요로 하여 환경오염 문제를 야기하는 화학적 촉매를 이용한 종래기술에 따른 에스터 합성방법과 달리, 효소의 기질 특성으로 인해 부반응이 거의 없고 상온 조건에서도 종래기술보다 더 짧은 시간 내에 더 높은 전환율을 달성할 수 있고, 친환경적으로 나린진 아세테이트를 합성할 수 있어서 나린진의 활용성을 더욱 높일 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 나린진 아세테이트를 합성하는 합성 반응식을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 나린진 아세테이트를 합성하는데 있어서 최적화 과정을 나타낸 도면이다.
도 3 내지 도 9는 본 발명에 따른 나린진 아세테이트를 합성하는 실험에 따른 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 나린진 아세테이트를 합성하는데 있어서 최적화 과정을 나타낸 도면이다.
도 3 내지 도 9는 본 발명에 따른 나린진 아세테이트를 합성하는 실험에 따른 실험결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 설명한다. 이 과정에서 도면에 도시된 선들의 두께나 구성요소의 크기 등은 설명의 명료성과 편의성을 위해 과장되게 도시될 수 있다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자 또는 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
1. 시약 및 효소
나린진은 시그마 알드리치 (St. Louis, Missouri, USA)에서 구매하였다.
아세트산, 아세트산 무수물, 메틸 아세테이트, 바이닐 아세테이트, 프로필 아세테이트, 뷰틸 아세테이트, 아세톤, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올, 그리고 1,2-다이클로로에테인은 대정화금(경기도, 한국)에서 구매하였다. 에틸 아세테이트, 아세토나이트릴, 그리고 테트라하이드로퓨란(THF)은 준세이(도쿄, 일본)에서 구매하였다.
고정화 효소로는 상업적으로 널리 사용되는 Novozym 435 (Candida antarctica lipase B immobilized on acrylic resin), Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus immobilized on silica gel carrier), and Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei immobilized on resin carrier)을 선택하였고, 이들은 노보자임(Bagsværd, 덴마크)에서 구매하였다.
2. 나린진 아세트이트 합성방법
효소 반응을 통해 나린진 아세테이트를 합성하였다 (도 1 참조). 반응시키기 전에 유기용매는 3-Å molecular sieves (150 g/L)을 이용하여 일주일 이상 건조시켰다. 나린진은 실리카겔이 있는 데시케이터에서 일주일 이상 건조하였다.
유기용매에 녹인 나린진 (10 mM)과 아실 공여체 (10-110 mM)를 50 mL serum bottle에 넣었으며 working volume 20 mL이었다. 일정 효소 양(1-9 g/L)을 넣어주었다. 유기용매의 증발을 막기 위해 serum bottle을 밀봉했으며, mixture는 shaking incubator에서 180 rpm으로 48 시간 반응시켰다.
3. 반응조건의 최적화
최적화는 한 번에 한 변수만 조작하고 그 외 변수는 고정하며 단계별로 변수에 대한 최적화해 나가는 방식인 one factor at a time (OFAT) 방법으로 진행하였다.
나린진 아세테이트 전환율에 영향을 주는 변수로 고정화 효소의 종류, 효소의 농도, 아실 공여체의 선택, 반응물의 몰 비율, 반응 온도, 용매의 종류를 선정하였다(도 2 참조).
기본 반응 조건으로 5 g/L의 효소, 아실 공여체는 바이닐 아세테이트, 반응물의 몰 비율 1:1, 반응 온도 40℃에서 진행하고, 용매로 tert-아밀 알코올을 사용하였다. 반응은 shaking incubator에서 180 rpm으로 48 시간 반응시켰다. 기본조건을 시작으로 각 단계별로 선정된 조건을 다음 단계에 적용하였다.
먼저, 고정화 효소의 종류에 따른 전환율의 영향을 확인하기 위해 상용화된 고정화 리파아제 3가지 (Novozym 435, Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM)를 스크리닝 하였다. 이때 조건은 기본 반응 조건이다.
다음으로, 효소 농도 (Lipozyme TL IM)는 1-9 g/L 사이를 조사하였다.
아실 공여체 선택에서는 3 g/L의 Lipozyme TL IM을 이용하여 아세트산, 아세트산 무수물, 메틸 아세테이트, 바이닐 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 뷰틸 아세테이트에 대해 스크리닝 하였다.
반응물의 몰비율은 1:1-1:11 범위를 조사하였으며, 이때 아실 공여체는 바이닐 아세테이트와 아세트산 무수물이다.
반응 온도는 30-60 ℃에서 조사하였으며 이때 반응물의 몰 비율은 1:5이다. 마지막으로, 다양한 유기용매 (아세토나이트릴, 1,4-다이옥세인, 아세톤, THF, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올, 1,2-다이클로로에테인)에 대한 영향을 파악하였다.
4. 분석방법
정량분석은 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하였으며, Agilent 1260 infinity Ⅱ (Agilent, California, USA)를 사용하였다. HPLC 분석을 위해 반응을 마친 후 1 mL syringe를 이용하여 용액을 채취하였다.
채취한 용액은 메탄올로 10배 희석시킨 후, syringe filter를 이용하여 효소와 잔여물을 제거해서 2 mL vial에 주입하였다. 분석에 사용한 컬럼은 INNO Column C18 (120 Å, 5 μm, 4.6 × 250 mm)이다. Injection volume은 5 μL이고, 컬럼 온도는 50℃를 유지하였다.
이동상으로 3% acetic acid in water (A)와 100% methanol (B)를 이용하였다. 유속은 1 mL/min이며 gradient는 다음과 같다. (A/B) 0 min-70/30, 5 min-0/100, 10 min-0/100, 15min-70/30, 20 min-70/30. UV detector을 이용하여 280 nm에서 분석하였다. 전환율은 나린진의 초기 농도와 반응 후 농도 비율을 나타낸 하기 수식 1로 계산하였다. 나린진의 calibration curve는 메탄올을 이용하여 얻었다. 오차 막대와 오차 범위는 표준편차를 나타냈다 (n=2).
[수식 1]
정성분석은 liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)를 이용하였으며, Agilent 1260 infinity Ⅱ와 InfinityLab LC/MSD를 사용하였다. 분석을 위해 채취한 용액을 methanol로 100배 희석시켜서 필터링 후 2 mL vial에 주입하였다. Injection volume, 컬럼, 컬럼 온도는 HPLC 분석 방법과 동일하게 하였다.
이동상은 0.1% formic acid in water (A)와 0.1% formic acid in acetonitrile (B)을 이용하였다. 유속은 1 mL/min이며 gradient는 다음과 같다. (A/B) 0 min-70/30, 5 min-0/100, 10 min-0/100, 15min-70/30, 20 min-70/30. 나린진은 SIM (m/z 603.20)으로 확인하였고, 나린진 아세테이트는 SCAN을 통해 확인하였다. 질량 스펙트럼은 600에서 700까지 m/z 범위를 스캐닝하였다.
5. 실험 및 실험결과
5-1. 고정화된 효소 선택
나린진 아세테이트 합성에 적합한 효소를 찾기 위해 대표적인 고정화 리파아제 Novozym 435, Lipzoyme TL IM, Lipzoyme RM IM을 스크리닝하였다.
리파아제는 유래 또는 특이성에 따라 분류되며, 특이성에는 기질특이성, 위치특이성, 입체특이성이 있다. Novozym 435는 무위치선택성인 Candida antarctica lipase B (CALB)에서 유래하였으며 소수성의 캐리어 acrylic resin으로 고정화되어 있다. Lipzoyme TL IM은 1,3-specific인 Thermomyces lanuginosus lipase이며, 실리카겔에 고정화되어 있다. Lipozyme RM IM은 1,3-specific인 Rhizomucor miehei lipase이며, 페놀-포름 알데히드 공중 합체를 기본으로 하는 약한 음이온 교환 수지로 고정화되어 있다.
도 3을 참조한다. 실험 결과 Novozym 435, Lipzoyme TL IM, Lipzoyme RM IM 차례로 17.06%, 29.89%, 19.91% 전환율을 얻었으며, Lipzoyme TL IM이 가장 높은 전환율을 보였다.
5-2. 효소 농도 선택
효소의 양은 경제적으로 중요한 요인이므로 적은 양의 효소를 이용하여 최대 효율을 얻는 것은 중요하다.
따라서 효소의 양에 따른 나린진 아세테이트의 전환율을 확인하기 위해 Lipozyme TL IM의 농도를 1, 3, 5, 7, 9 g/L로 설정하여 실험을 진행하였다.
도 4를 참조한다. 1 g/L와 3 g/L의 전환율은 22.77%, 33.48%로 증가하였고, 5 g/L의 전환율은 29.89%로 감소하였다. 그 이후로 전환율이 계속 감소하여 7 g/L와 9 g/L일 때 각각 27.60%, 26.29%를 보였다. 따라서 3 g/L를 최적 효소 농도로 결정하였다.
5-3, 아실 공여체 선택
나린진 아세테이트는 나린진과 아실 공여체의 친핵성 아실 치환 반응에 의해 합성된다.
아실 공여체의 영향을 파악하기 위해, 아세트산, 아세트산 무수물, 메틸 아세테이트, 바이닐 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 뷰틸 아세테이트를 이용하여 실험을 진행하였다.
도 5를 참조한다. 실험 결과 아세트산 무수물과 바이닐 아세테이트일 때 각각 36.91%, 33.48%로 높은 전환율을 얻었다. 따라서 본 연구는 바이닐 아세테이트와 아세트산 무수물을 최적 아실 공여체로 선정하였다.
아실 공여체는 카보닐기에 비결합 전자쌍을 가진 이탈기가 결합된 화합물이다. 이탈기가 강한 염기성일수록 전자쌍을 더 많이 제공하여 더 안정된다. 반면 안정될수록 이탈기의 능력은 떨어진다.
일반적으로 이탈기의 능력은 산 염소화물 (acid chloride) > 무수물 (anhydride) > 카복실산 (carboxylic acid) = 에스터 (ester) > 아마이드 (amide) 이다. 따라서 에스터에 비해 무수물이 반응성이 더 높다.
또한, 아세트산 무수물은 두 개의 카보닐기를 가지고 있기 때문에 복잡한 반응 (complex reaction)을 할 수 있다. 먼저, 아세트산 무수물은 나린진의 알코올과 반응하여 나린진 아세테이트를 합성하고, 아세트산이 생성된다. 생성된 아세트산은 새로운 아실 공여체로써 남은 나린진과 반응하여 나린진 아세테이트를 합성한다. 그러므로 아실 공여체로 아세트산 무수물을 이용할 때 가장 높은 전환율을 보였다.
5-3. 나린진과 아실 공여체의 몰 비율 선택
효소 반응에서 기질의 농도는 중요한 요소로, 반응물의 몰비를 변화시켜 실험을 진행하였다. 나린진과 아실 공여체의 몰비를 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 1:11까지 변화시켜 반응물의 몰 비율이 나린진 아세테이트의 전환율에 미치는 영향을 파악하였다.
도 6을 참조한다. 실험 결과 아세트산 무수물의 경우, 1:1와 1:3에서 전환율은 각각 36.91%, 75.72%으로 증가하고, 1:5에서 크게 증가하여 전환율 86.63%를 얻었다. 그 이후 1:7, 1:9, 1:11일 때 85.61%, 86.41% 그리고 87.19%의 전환율을 얻었으며 이는 1:5의 결과와 비슷하다.
바이닐 아세테이트의 경우, 1:1, 1:3, 1:5에서 33.48%, 70.29%, 94.47%로 증가하였다. 그 이후 1:7, 1:9, 1:11에서 96.07%, 96.55%, 96.70%의 전환율을 얻었다. 바이닐 아세테이트도 아세트산 무수물과 비슷하게 몰 비율 1:5 이후에는 변화가 크지 않았다.
리파아제를 통한 전이 에스터화는 가역반응이기 때문에 반응 평형이 전이 에스터화로 이동하기 위해 과량의 아실 공여체 농도가 요구된다. 리파아제를 통한 아실공여체와 나린진의 전이 에스터화 메커니즘에 따르면, 아실 공여체가 효소와 먼저 반응한 후 나린진이 반응하여 나린진 아세테이트가 형성된다. 따라서 과량의 아실 공여체가 존재한다면, 효소의 활성부위와 더 많이 반응하여 중간체를 형성할 것이고, 더 많이 형성된 중간체는 나린진과 반응하여 나린진 아세테이트의 전환율을 증가시킨다.
5-4. 반응 온도 선택
효소반응에서 반응 온도는 효소의 활성 및 변성과 기질의 용해도에 영향을 미치는 요소이다.
기질과 용매의 용해도와 끓는점, 그리고 효소의 안정성을 고려하여 30, 40, 50, 60℃에서 각각 실험을 진행하였다. 도 7을 참조한다. 실험 결과 아세트산 무수물은 30℃에서 81.25%였고, 40, 50, 60℃일 때 전환율은 각각 86.63%, 87.13%, 87.68%로 미세한 차이를 보였다. 바이닐 아세테이트의 결과도 순서대로 90.03%, 94.47%, 94.65%, 그리고 94.40%로 아세트산 무수물과 비슷한 결과를 보였다
5-5. 반응 용매 선택
반응 매질에서 유기용매를 사용하면 열역학적 평형이 가수분해보다 에스터 합성에 유리하도록 이동한다. 또한, 대부분의 유기용매는 수성 매체보다 끓는점이 낮아서 용매 제거에 용이하여 분리 정제 공정에 유리하다.
본 연구는 에스터 합성을 유도하기 위해 반응 매질로 유기용매를 이용하였다. 리파아제는 소수성 유기용매에서 높은 활성과 안정성을 보이는 것으로 알려져 있으나, 친수성 탄화수소나 당의 에스터 합성에서 소수성 용매는 적절하지 않다. 따라서 비교적 친수성 유기용매인 아세토나이트릴, 1,4-다이옥세인, 아세톤, THF, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올, 1,2-다이클로로에테인에 대해 스크리닝하였다.
도 8을 참조한다. 아실 공여체로 아세트산 무수물을 이용한 경우, 아세토나이트릴을 용매로 사용했을 때 98.51%로 가장 높은 전환율을 보였다. 아세톤과 THF도 비슷하게 98.37%, 98.20% 전환율을 보인 반면, 1,2-다이클로로에테인은 가장 낮은 16.01%의 전환율을 보였다.
아실 공여체로 바이닐 아세테이트를 이용한 경우, 아세토나이트릴에서 전환율 98.49%로 가장 높은 전환율을 얻었으며, 뒤이어 tert-아밀 알코올과 tert-뷰틸 알코올이 94.47%, 91.16%의 전환율을 얻었다. 아세트산 무수물과 마찬가지로, 1,2-다이클로로에테인에서 가장 낮은 37.32%의 전환율을 보였다.
Log P 값은 물과 옥탄올 사이의 분배계수에 대한 로그 값으로, 소수성 정도를 나타낸다. Log P 값이 클수록 더 소수성이다.
나린진의 Log P 값은 -0.44, 아세트산 무수물과 바이닐 아세테이트의 Log P 값은 각각 -0.27, 0.73이다. 반응 용매는 Log P 값 순서대로 아세토나이트릴 (-0.33), 1,4-다이옥세인 (-0.27), 아세톤 (-0.16), THF (0.49), tert-뷰틸 알코올 (0.58), tert-아밀 알코올 (1.09), 1,2-다이클로로에테인 (1.48) 이다.
Log P 값이 2보다 작으면 친수성 유기용매, 4보다 크면 소수성 유기용매라고 표현한다. 유전 상수는 분극률 (polarizability)을 나타낸다. 일반적으로 유전 상수가 높으면 극성, 낮으면 비극성이라 한다. 반응 용매는 유전 상수 값 순서대로 1,4-다이옥세인 (2.25), tert-아밀 알코올 (5.78), THF (7.5), 1,2-다이클로로에테인 (10.4), tert-뷰틸 알코올 (10.9), 아세톤 (20.7), 아세토나이트릴 (37.5) 이다.
5-6. 반응 시간에 따른 전환율
OFAT 방법을 통해 얻은 최적조건 하에 반응시간 별 전환율을 확인하였다.
도 9를 참조한다. 실험 결과 아세트산 무수물을 사용한 경우 8시간 안에, 바이닐 아세테이트를 사용한 경우 24시간 안에 반응이 완료되었으며, 각 전환율은 98.51%, 97.54%였다. 종래기술에 따른 플라보노이드 에스터 합성 연구에서는 96시간 이상의 긴 반응시간을 요구하였으나, 선행연구와 본 연구를 비교하였을 때 짧은 시간 안에 반응한 것을 확인할 수 있다.
결론적으로, 일반적으로 에스터화를 통한 합성의 경우 긴 반응시간이 소모되고 비교적 전환율이 낮으며, 전이 에스터화를 통한 합성의 경우, 많은 효소의 양, 높은 몰 비율에서 반응을 진행하였으나, 본 연구에서는 주요 변수의 선택과 최적 조건의 결정에 따라 나린진 아세테이트의 전환율이 30% 미만에서부터 약 98%까지 향상했으며, 특히 아세트산 무수물을 아실 공여체로 사용할 경우 반응시간이 8시간 이내로 현저히 단축되었고, 이전 연구에 비해 전환율이 가장 높은 수준임을 확인할 수 있다.
아실화를 통하여 생물학적 이용률이 개선된 나린진 에스터는 식품, 화장품, 의약품 등 다양한 분야에서 높은 잠재력을 가지고 있지만, 낮은 전환율과 긴 반응시간으로 인해 산업으로의 적용에 한계가 있었다. 본 연구에서 사용된 조건을 통해 얻은 향상된 전환율 및 반응시간은 나린진 아세테이트의 상용화에 기여할 것이며, 반응 조건을 단계별로 최적화하는 방법은 유사한 효소 공정 연구에 유용할 것으로 예상된다.
이상, 본 명세서에는 본 발명을 당업자가 용이하게 이해하고 재현할 수 있도록 도면에 도시한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당업자라면 본 발명의 실시예로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 보호범위는 특허청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.
Claims (19)
- 리파아제 존재 하에,
나린진(naringin)과, 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)를 반응시키는 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 리파아제는 위치 선택성을 갖는 리파아제인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 2 항에 있어서,
상기 위치 선택성 리파아제는 고정화된 리파아제인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 3 항에 있어서,
상기 리파아제는 Lipozyme TL IM인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 4 항에 있어서,
상기 리파아제의 농도는 1 내지 9 g/L인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 리파아제의 농도는 1 내지 5 g/L인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 4 항에 있어서,
상기 나린진(naringin)과, 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)의 몰비는 1:1 내지 1:11인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 나린진(naringin)과, 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate)의 몰비는 1:5 내지 1:11인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 4 항에 있어서,
상기 반응이 30 내지 60℃에서 이루어지는 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 9 항에 있어서,
상기 반응이 40 내지 60℃에서 이루어지는 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 4 항에 있어서,
상기 반응이 유기용매 하에서 이루어지며,
상기 유기용매는 아세토나이트릴, 아세톤, 1,4-다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올 및 1,2-다이클로로에테인으로 이루어진 군에서 선택되는 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 11 항에 있어서,
상기 유기용매는 아세토나이트릴인 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 4 항에 있어서,
상기 나린진(naringin)과 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride)을 반응시키는 나린진 아세테이트 합성방법.
- 위치 선택성 리파아제; 나린진(naringin); 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate); 및 유기용매를 포함하는 나린진 아세테이트 합성용 키트.
- 제 14 항에 있어서,
상기 리파아제는 Lipozyme TL IM인 나린진 아세테이트 합성용 키트.
- 제 15 항에 있어서,
상기 유기용매는 아세토나이트릴, 아세톤, 1,4-다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, tert-뷰틸 알코올, tert-아밀 알코올 및 1,2-다이클로로에테인으로 이루어진 군에서 선택되는 나린진 아세테이트 합성용 키트.
- 제 16 항에 있어서,
상기 유기용매는 아세토나이트릴인 나린진 아세테이트 합성용 키트.
- 아세토나이트릴인 유기용매에 아세트산 무수물(acetic anhydride) 또는 바이닐 아세테이트(vinyl acetate), 나린진(naringin) 및 위치 선택성 리파아제를 첨가하여 40 내지 60℃에서 4 내지 24시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 나린진 아세테이트 합성방법.
- 제 18 항에 있어서,
상기 위치 선택성 리파아제는 Lipozyme TL IM인 나린진 아세테이트 합성방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR102657363B1 (ko) * | 2023-09-01 | 2024-04-12 | 광운대학교 산학협력단 | 화학적 합성방법을 통한 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 나린진 화합물의 합성방법 및 합성용 키트 |
| KR102657359B1 (ko) * | 2023-09-01 | 2024-04-12 | 광운대학교 산학협력단 | 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 화합물 및 이에 따른 항산화 활성용 및 항염증용 조성물 |
| KR102672137B1 (ko) * | 2023-09-01 | 2024-06-03 | 광운대학교 산학협력단 | 효소적 합성방법을 통한 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 나린진 화합물의 합성방법 및 합성용 키트 |
-
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