KR101587635B1

KR101587635B1 - Method for Detecting Methylation of Thyroid Cancer Specific Methylation Marker Gene for Thyroid Cancer Diagnosis

Info

Publication number: KR101587635B1
Application number: KR1020150029188A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 오태정; 이증훈; 구본석
Original assignee: (주)지노믹트리; 충남대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-02
Filing date: 2015-03-02
Publication date: 2016-01-22

Abstract

The present invention relates to a method for detecting the methylation of a thyroid cancer-specific methylation marker gene for the diagnosis of thyroid cancer or the progression of the same; a composition for the diagnosis of thyroid cancer or the progression of the same capable of detecting the methylation of the thyroid cancer-specific methylation marker gene; and a kit and a nuclear acid chip comprising the composition. More specifically, the present invention relates to a method for providing information to diagnose thyroid cancer or the progression of the same by detecting the methylation of the thyroid cancer-specific marker gene, which is specifically methylated in thyroid cancer cells; a composition for the diagnosis of thyroid cancer or the progression of the same, comprising a substance capable of detecting whether the thyroid cancer-specific marker gene is methylated or not; and a kit and a nuclear acid chip comprising the composition.

Description

METHOD FOR DETECTING Methylation of Thyroid Cancer-Specific Methylation Marker Gene for Thyroid Cancer Diagnosis

본 발명은 갑상선암 (thyroid cancer) 또는 갑상선암 진행 단계 진단을 위한 갑상선암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법, 갑상선암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화를 검출할 수 있는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 핵산칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갑상선암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 갑상선암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 검출하여 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, 및 갑상선암 특이적 마커 유전자의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 핵산칩에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting methylation of a thyroid cancer-specific methylation marker gene for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression stage, a composition for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression stage capable of detecting methylation of a thyroid cancer-specific methylation marker gene, Kits and nucleic acid chips. More specifically, the present invention relates to a method for detecting methylation of a thyroid cancer-specific marker gene that is specifically methylated in thyroid cancer cells to provide information for diagnosing the progress of thyroid cancer or thyroid cancer, A thyroid cancer or thyroid cancer progressive stage, a kit comprising the same, and a nucleic acid chip.

의학이 발달한 오늘날에도 인체 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 경우 5년 생존율은 50%미만이다. 전체 암환자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료 효과는 치료법의 문제 뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.Even today, when medical science is developed, the 5-year survival rate is less than 50% for human cancers, especially solid tumors (other than cancer). Approximately two-thirds of all cancer patients are found at an advanced stage, most of whom die within two years of diagnosis. The treatment effect of such poor cancer is not only the problem of the treatment method, but it is not easy to diagnose cancer in an early stage and it is not easy to accurately diagnose advanced cancer and follow up after treatment.

현재 임상에서 암의 진단은 문진 (history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억개, 암의 직경이 1㎝ 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액 내에서 찾는 종양마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다. 또한, 암의 치료에 주로 사용되는 항암제의 경우, 암의 용적이 적은 경우에만 그 효과를 나타내는 문제점이 있다.At present, the diagnosis of cancer is based on history taking, physical examination, and clinical pathology. Once suspected, the cancer is progressed to radiation examination and endoscopy. Finally, it is confirmed by histological examination. However, the current clinical testing method, the number of cancer cells 1 billion, the diameter of cancer is more than 1㎝ can be diagnosed. In this case, cancer cells already have the ability to metastasize, and more than half of the cancer has already metastasized. On the other hand, tumor markers that detect substances directly or indirectly produced by cancer in the blood are used for cancer screening. This is because the accuracy is limited, Even when it is not there, it often appears positively and causes confusion. Further, in the case of an anticancer agent mainly used for the treatment of cancer, there is a problem that the effect is exhibited only when the volume of cancer is small.

상기한 바와 같이, 암의 진단과 치료가 모두 어려운 것은 정상세포와 다른 점이 많고, 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암은 제멋대로 과잉으로 계속 자라며, 사망에서 해방되어 계속 생존하고, 주위조직을 침범하고 원위 장기로 확산(전이)되어서 인간을 사망하게 한다. 면역기전의 공격이나 항암 치료에도 생존하고, 끊임없이 진화하며 생존에 가장 유리한 세포군(클론)이 선택적으로 증식한다. 암세포는 다수의 유전자의 변이에 의해 발생하는 고도의 생존능력을 가진 생존체이다. 하나의 세포가 암세포로 바뀌고, 임상에서 보는 악성의 암 덩어리로 발전해 나가기 위해서는 다수의 유전자에 변이가 일어나야 한다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.As described above, the diagnosis and treatment of cancer are all difficult because they are different from normal cells, and are very complex and diverse. Cancer continues to grow excessively and excessively, is free from death and continues to survive, invading the surrounding tissues and spreading to the distal organs, leading to death. It also survives the attacks of immunological mechanisms and chemotherapy, and selectively proliferates cell clones that are constantly evolving and most beneficial to survival. Cancer cells are survivors with high viability due to mutation of multiple genes. In order to transform a single cell into a cancer cell and evolve into a malignant cancer mass seen in clinical practice, many genes must be mutated. Therefore, in order to diagnose and treat cancer in a fundamental way, it is necessary to approach it at the genetic level.

최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 단순한 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 단순 용이한 검사로 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능하다.Recently, genetic testing has been actively attempted in the diagnosis of cancer. The simplest representative method is to detect the presence or absence of ABL: BCR fusion gene as a gene marker of leukemia in blood. It is more than 95% accurate and easy to use. It is useful for diagnosis and treatment of chronic myelogenous leukemia. However, this method is applicable only to a minority of blood cancers.

혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자검사가 최근 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리형(free DNA)으로 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5~10배로 증가되며, 이렇게 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트(microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).Genetic tests using DNA in serum or plasma have recently been actively attempted. This is a method of finding cancer-related genes that are separated from cancer cells and come out into the blood and present as free DNA in the serum. In actual cancer patients, the DNA concentration in the serum is increased to 5 to 10 times that of the normal person, and it is found that most of this increased DNA is released from cancer cells. Cancer can be diagnosed by analyzing genes specific to cancer, such as mutations, loss of function, and loss of function of cancer genes (oncogene) and tumor suppressor genes with DNA released from these cancers. In actual serum, mutation-type K-Ras cancer gene, p53 tumor suppressor gene, methylation of p16 gene, and marking and instability of microsatellite were examined to determine the presence of lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, (Chen et al., Clin. Cancer Res. , 5: 2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res. , 59: 67, 1999; Sanchez- Cespedes, M. et al., Cancer Res. , 60: 892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res. , 5: 2689, 1999).

한편, 혈액 외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암 환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999), 갑상선암에서 미세침 흡인검체 (FNAB; Fine needle Aspirated Biopsy) 내에 존재하는 돌연변이 및 메틸화 이상 유전자를 검사하는 방법 (Zhang B. et al., Diagnostic Pathology 9:45, 2014)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동 분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다. On the other hand, the DNA of cancer can be also examined in a sample other than blood. Cancer Res. , Cancer Res. , Cancer Res. , Cancer Res. , 60: 5954, 1992) . In addition , the presence of cancer cells and cancer genes in bronchoalveolar lavage (CSF) A method for inspecting mutations and methylation abnormal genes present in fine needle aspirated biopsy (FNAB) in thyroid cancer (Zhang B , et al., 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res. , 59: et al., Diagnostic Pathology 9:45, 2014). However, in order to accurately diagnose cancers with various mutations and different mutations in individual cancers, a method of simultaneous and accurate automatic analysis of multiple genes is required, but this method has not yet been established.

최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR (이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.Recently, methods for diagnosing cancer through DNA methylation measurement have been suggested. When the CpG islands of a particular gene are hypermethylated, expression of the gene is silenced. This is a major mechanism in which the function of the gene is lost without mutation in the coding sequence of the gene's coding sequence in vivo and the function of tumor suppressor genes in human cancer is lost It is interpreted as a cause. Therefore, the search for methylation of the CpG isoform of the tumor suppressor gene is of great help in the study of cancer, and it can be used for diagnosis and screening of cancer by the methylation specific PCR (hereinafter referred to as MSP) or automatic base analysis Attempts have recently been made actively.

상당수의 질환은 유전자의 이상에 의해 발생하고, 유전자 이상 중 가장 많은 형태는 유전자의 코딩서열에 변화가 오는 것으로 이러한 유전자 자체의 변화(genetic change)를 돌연변이라고 한다. 어떤 유전자에 돌연변이가 있을 때, 그 유전자가 코딩하는 단백질은 구조와 기능이 바뀌고 장애와 결손을 가져오게 되며, 이러한 돌연변이 단백질은 질병을 유발한다. 그러나 특정 유전자에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 발현에 이상이 있으면 질병이 유발될 수 있다. 대표적인 예가 유전자 전사의 조절부위 CpG 섬의 시토신 염기부위에 메틸기가 붙는 메틸화로, 이 경우 그 유전자는 발현이 차단된다. 이와 같은 것을 후성유전적 변화 (epigenetic change)라고 하며, 이것도 돌연변이와 마찬가지로 자손세포에 전달되며, 동일한 효과, 즉 해당 단백질의 발현 상실을 야기한다. 가장 대표적인 것이 암세포에서 유전자 발현 조절부위 CpG 섬의 메틸화에 의해 종양억제 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 이는 발암의 중요한 기전이 된다 (Robertson, K.D. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000).Many diseases are caused by gene abnormalities, and the most common type of gene abnormalities is a change in the coding sequence of a gene, which is called a genetic change. When there is a mutation in a gene, the protein that the gene encodes changes in structure and function, leading to disability and deficiency, and this mutant protein causes disease. However, if there is an abnormality in the expression of the gene without mutation in the gene, the disease can be induced. A typical example is the methylation of methylation at the cytosine base site of the regulatory CpG island of gene transcription, in which case the gene is blocked from expression. This is called epigenetic change, which, like the mutation, is transmitted to progeny cells and causes the same effect, the loss of expression of the protein. The most prominent is that the expression of the tumor suppressor gene is blocked by the methylation of the CpG island in the gene expression regulatory region of cancer cells, which is an important mechanism of carcinogenesis (Robertson, KD et al., Carcinogensis , 21: 461, 2000).

암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 유전자 발현 조절부위 CpG 섬의 메틸화이다. In order to diagnose cancer accurately, it is important to understand not only the mutation gene but also the mechanism of the mutation of the gene. Previously, we have focused on mutations in the coding sequence of genes, ie, microscopic changes such as point mutations, deletions, insertions, and macroscopic chromosomal abnormalities. In recent years, however, extrinsic changes have been reported to be as important as methylation of the CpG islands in the gene expression regulatory region.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(Alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈 내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.In the genomic DNA of mammalian cells, there is a fifth base besides A, C, G, and T, which is 5-methylcytosine (5-mC) with a methyl group attached to the 5th carbon of the cytosine ring. 5-mC always comes only to C of the CG dinucleotide (5'-mCG-3 '), and this CG is often referred to as CpG. Most of C of CpG is methylated with a methyl group. Such methylation of CpG inhibits the repetitive sequence in the genome, such as Alu and transposon, from being expressed, and is the most common site of extracellular changes in mammalian cells. The 5-mC of this CpG is deaminated naturally to T, and thus the CpG in the mammalian genome has a frequency of 1% which is much lower than the normal frequency (1/4 x 1/4 = 6.25%) .

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995). There are exceptions in CpG that appear to be dense, and this is called CpG island. CpG islands are 0.2 to 3 kb in length, and the distribution percentage of C and G bases is more than 50% and the distribution percentage of CpG is higher than 3.75%. About 45,000 CpG islands are found in the whole human genome, and they are concentrated on promoter regions that regulate gene expression. Indeed, CpG islands appear in the promoters of housekeeping genes, which account for about half of the human genes (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop. , 5: 309, 1995).

한편, 정상인의 체세포(somatic cell)에서는 이들 중요 유전자 발현조절 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자와 비활성화(inactivation)된 X 염색체상의 유전자들은 메틸화되어 있다. In somatic cells of normal individuals, CpG islands are not methylated in these important gene expression regulatory regions, but imprinted genes and inactivated genes on X chromosomes are methylated so that they are not expressed during development .

발암과정 중에는 발현조절 부위 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기나 고사를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착과 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 발현조절 부위 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.During the carcinogenesis process, methylation occurs in the CpG isoform of the regulatory region, and the expression of the corresponding gene is disrupted. In particular, when methylation occurs in the CpG island of the regulatory region of tumor suppressor genes, which regulates cell cycle or apoptosis, regenerates DNA, participates in cell adhesion and intercellular coordination, and inhibits invasion and metastasis, As with mutations in the sequence, it blocks the expression and function of these genes, resulting in the development and progression of cancer. In addition, some methylation may appear on the CpG island due to aging.

흥미로운 사실은 선천성 암에서는 돌연변이가 발암의 원인이 되나, 후천성암에서는 돌연변이가 나타나지 않는 유전자들의 경우, 돌연변이 대신에 CpG 섬의 메틸화가 나타난다는 것이다. 대표적인 예로, 후천성 신장암의 VHL(von Hippel Lindau), 유방암의 BRCA1, 대장암의 MLH1, 위암의 E-CAD와 같은 유전자의 발현조절 부위 메틸화가 있다. 아울러, 전체 암 중 약 절반에서 p16의 프로모터 메틸화나 Rb의 돌연변이가 나타나며, 나머지 절반은 p53의 돌연변이나 그 계열로 p73, p14 등의 발현조절 부위 메틸화를 보인다. Interestingly, mutations in congenital malignancies cause carcinogenesis, but genes that do not show mutations in acquired cancer show methylation of CpG islands instead of mutations. Representative examples include the methylation of expression-regulating regions of genes such as VHL (von Hippel Lindau) of acquired kidney cancer, BRCA1 of breast cancer, MLH1 of colon cancer, and E-CAD of gastric cancer. In addition, about half of all cancers show promoter methylation of p16 or mutation of Rb, and the other half shows mutation of p53 or methylation of p53, p14, etc. expression regulatory regions.

이러한 메틸화 현상은 암의 종류에 따라 해당 암의 조직세포에서 유전자 별로 다르게 일어나며, 특정암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자를 해당 암의 메틸화 바이오마커로 선별할 수 있다.This methylation phenomenon is different for each gene in the tissue cells of the cancer depending on the kind of cancer, and a gene that is specifically methylated in a specific cancer can be selected by the methylation biomarker of the cancer.

특정암에 대한 메틸화 바이오마커에서 CpG에 관해 3가지 공통된 특징을 보이는데, 이는 종양억제 유전자의 발현조절 부위 CpG 섬의 과메틸화, 나머지 CpG 염기부위의 과소메틸화, 및 메틸화 효소, 즉 DNA 시토신 메틸트랜스퍼라제(DNMT)의 활성증가가 그것이다 (Singal, R. & Ginder, G.D., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K.W., Brit. J. Cancer, 83:1583, 2000). There are three common features of CpG in the methylation biomarkers for certain cancers, including hypermethylation of the CpG isoform of the tumor suppressor gene expression regulatory region, hypomethylation of the remaining CpG base region, and methylation enzyme, DNA cytosine methyltransferase K. & Brown, R. & Ginder, GD, Blood , 93: 4059, 1999. Robertson, K. et al., Carcinogensis , 21: 461,2000 , KW, Brit. J. Cancer , 83: 1583, 2000).

발현조절 부위 CpG 섬이 메틸화되어 있을 때, 그 해당 유전자의 발현이 차단되는 이유는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 메틸화된 시토신에 메틸 CpG 부착 단백질(MECP)이나 CpG 부착 도메인 단백질(domain protein, MBD) 및 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase)가 부착되면서 염색체의 크로마틴 구조를 바꾸고 히스톤을 변화시키기 때문인 것으로 추측되고 있다.The reason why the expression of the corresponding gene is blocked when the CpG island is methylated is not clarified. However, the methylated cytosine has a methyl CpG attachment protein (MECP), a CpG domain protein (MBD) and a histone It is presumed that histone deacetylase adheres to chromatin and changes the chromatin structure and changes the histone.

발현조절 부위 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 이것이 발암에 2차적인 변화인지에 대해 논란이 있으나, 분명한 사실은 종양관련 유전자의 발현 조절부위 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 따라서 이는 암의 진단과 조기진단, 발암위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다는 것이다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변, 미세침 흡인검체 등에서 종양관련 유전자의 발현조절 부위 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000; Zhang B. et al., Diagnostic Pathology 9:45, 2014). It is clear that the methylation of the CpG islands directly induces carcinogenesis or that this is a secondary change in carcinogenesis, but it is clear that the methylation of the expression-regulatory gene of the tumor-associated gene is an important indicator of cancer, And the early diagnosis of cancer, the prediction of cancer risk, the prediction of cancer prognosis, the follow-up treatment, and the prediction of response to chemotherapy. Recently, attempts have been made to examine the methylation of expression-regulating regions of tumor-associated genes in blood, sputum, saliva, stool, urine, micro needle aspiration specimens and the like for use in various cancer therapies (Esteller, M. et al. Cancer Res, 59:67, 1999; Sanchez -Cespedez, M. et al, Cancer Res, 60:. 892, 2000; Ahlquist, DA et al, Gastroenterol, 119:.... 1219, 2000; Zhang B. et al., Diagnostic Pathology 9:45, 2014).

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 조기 진단, 발암 위험 또는 암의 예후 예측 등이 가능한 효과적인 갑상선암 특이적 메틸화 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 유전자가 갑상선암세포에서 특이적으로 메틸화되어 있으며, 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써 갑상선암을 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Under these technical backgrounds, the inventors of the present application attempted to develop an effective thyroid cancer-specific methylation marker capable of early diagnosis, cancer risk, or cancer prognosis prediction. As a result, POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) Methylation of the thyroid gland, and using this as a biomarker, the degree of methylation can be measured to confirm the diagnosis of thyroid cancer. Thus, the present invention has been completed.

본 발명의 주된 목적은 갑상선암 진단에 효과적으로 사용될 수 있는 갑상선암에서 특이적으로 메틸화되는 갑상선암 특이적 메틸화 바이오마커를 제공하고, 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다. The main object of the present invention is to provide a thyroid cancer-specific methylation biomarker which is specifically methylated in thyroid cancer which can be effectively used for the diagnosis of thyroid cancer, and to provide information necessary for diagnosis of thyroid cancer or thyroid cancer progression stage, a thyroid cancer biomarker gene CpG And a method for detecting methylation of an island region.

본 발명의 다른 목적은 갑상선암 특이적 메틸화 마커 유전자인 POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 유전자의 메틸화를 검출할 수 있는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression stage which can detect methylation of POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) gene, which is a thyroid cancer-specific methylation marker gene, and a kit comprising the same.

본 발명의 다른 목적은 갑상선암 특이적 메틸화 마커 유전자인 POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 유전자의 메틸화를 검출할 수 있는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 핵산칩을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a nucleic acid chip for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression stage capable of detecting methylation of POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) gene which is a thyroid cancer-specific methylation marker gene.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 DNA에서 POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for detecting a cancer, comprising: (a) separating DNA from a clinical sample; And (b) detecting methylation of the CpG island region of the POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) thyroid cancer biomarker gene in the separated DNA. In order to provide information necessary for diagnosis of the thyroid cancer or thyroid cancer progression stage, A method for detecting methylation of a marker gene CpG island region is provided.

본 발명은 또한, POU4F1 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression, which comprises a substance capable of detecting whether methylation of the CpG island region of the POU4F1 gene is detected.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing the progress of a thyroid cancer or thyroid cancer comprising the composition.

본 발명은 더욱이, POU4F1 갑상선암 바이오마커 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션 할 수 있는 프로브를 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 핵산칩을 제공한다.
The present invention further provides a nucleic acid chip for the diagnosis of thyroid cancer or thyroid carcinoma progression stage, which comprises a probe capable of hybridization with a fragment comprising a methylated CpG island of a POU4F1 thyroid cancer biomarker gene.

본 발명에 따른 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화 검출 방법 및 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 키트를 이용하면, 갑상선암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 갑상선암을 진단할 수 있어 유용하다.
In order to provide information necessary for the diagnosis of the thyroid carcinoma or thyroid carcinoma progression stage according to the present invention, the method for detecting methylation of the CpG island region of the thyroid cancer biomarker gene and thyroid carcinoma or thyroid carcinoma progression stage diagnostic kit, And can diagnose thyroid cancer more accurately and quickly than usual methods.

도 1은 정상조직과 갑상선암 조직으로부터 CpG 마이크로어레이 분석을 통하여 갑상선암 진단을 위한 메틸화 바이오 마커를 발굴하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 갑상선암 CpG 마이크로어레이 데이터로부터 갑상선암 특이적 과메틸화 유전자를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 5개의 바이오 마커 후보 유전자의 갑상선암 세포주에서 메틸화 정도를 파이로시퀀싱으로 측정한 그래프이다.
도 4a는 POU4F1 메틸화 바이오마커의 갑상선암 조직 및 이와 연접하는 정상소견조직에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 그래프이다.
도 4b는 독립적인 갑상선 조직시료를 대상으로 POU4F1 메틸화 바이오마커의 갑상선암 조직 및 이와 연접하는 정상소견조직에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 그래프이다.
도 4c는 ROC 커브 분석을 수행하여 갑상선암 진단에 대한 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 측정한 그래프이다.FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of extracting a methylated biomarker for the diagnosis of thyroid cancer through analysis of CpG microarray from normal tissue and thyroid cancer tissue.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a process for selecting thyroid cancer-specific hypermethylated genes from thyroid cancer CpG microarray data.
FIG. 3 is a graph showing the degree of methylation in thyroid cancer cell lines of five biomarker candidate genes measured by pyrosequencing.
FIG. 4A is a graph showing the degree of methylation of the POU4F1 methylated biomarker in the thyroid cancer tissue and the normal tissues associated therewith by pyrosequencing.
FIG. 4B is a graph showing the degree of methylation in a thyroid cancer tissue and normal tissues associated with the POU4F1 methylated biomarker in an independent thyroid tissue sample measured by a pyrosequencing method. FIG.
FIG. 4c is a graph showing the sensitivity and specificity for the diagnosis of thyroid cancer by performing ROC curve analysis.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 발명에서는 정상인과 갑상선암 환자간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 5개의 바이오마커 후보 유전자를 선별하였다. 바이오마커 후보 중 POU4F1 유전자가 갑상선암 진단에 유용함을 확인하였으며, 이에 본 발명은 갑상선암에서 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자인 POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 유전자의 CpG 섬을 바이오마커로 사용하는 것을 기초로 한다. 선별된 POU4F1 유전자는 갑상선암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다. In the present invention, five biomarker candidate genes with the greatest difference in methylation between normal and thyroid cancer patients were selected. It was confirmed that POU4F1 gene is useful for the diagnosis of thyroid cancer. Therefore, the present invention is based on the use of CpG island of POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) gene, which is a gene specifically methylated in thyroid cancer, as a biomarker do. The selected POU4F1 gene can also be used for thyroid cancer screening, risk assessment, prediction, diagnosis of disease, diagnosis of stage of disease and selection of therapeutic target.

하나의 실시예에서, 바이오마커 후보 유전자 선별 방법은 다음과 같다: (a) 정상 세포와 암 세포에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA에 결합하는 단백질과 반응시켜 메틸화된 DNA를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 메틸화된 DNA를 증폭시킨 후, CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션한 다음, 정상 세포와 암 세포 간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the biomarker candidate gene selection method is as follows: (a) separating genomic DNA from normal cells and cancer cells; (b) separating the methylated DNA by reacting the separated genomic DNA with a protein binding to methylated DNA; And (c) amplifying the methylated DNA, hybridizing it to a CpG microarray, and then selecting a gene having the greatest difference in the degree of methylation between normal cells and cancer cells as a methylation marker gene .

갑상선암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 갑상선암을 조기 진단할 수 있게 하는데, 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 갑상선암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 따라서, 정상으로 보이는 세포에서의 갑상선암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 갑상선암을 조기 진단할 수 있다.Identifying genes that are methylated in thyroid cancer and multiple stages of abnormality enables accurate and effective early diagnosis of thyroid cancer. Early diagnosis of cells likely to form thyroid cancer using the methylated gene markers is possible. If a gene that has been confirmed to be methylated in cancer cells is methylated in a cell that appears to be clinically or morphologically normal, the normal appearing cell is undergoing carcinogenesis. Thus, by confirming the methylation of thyroid cancer-specific genes in normal-appearing cells, early diagnosis of thyroid cancer can be made.

본 명세서에서 암의 "조기 진단"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 "조기 확인"은 세포가 형질전환되는 형태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 의미한다.As used herein, the term "early diagnosis" of cancer is to discover the possibility of cancer before metastasis, preferably before a morphological change is observed in tissue or cells. In addition, "early identification" of cell transformation means that the transformation is likely to occur at an early stage before the cell is transformed into a form.

"세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다. "Cell transformation" means that cell characteristics are changed from one form to another, such as from normal to abnormal, from non-positive to heterozygous, from undifferentiated to differentiated, from stem cells to non-stem cells. In addition, the transformation can be recognized by cell morphology, phenotype, biochemical properties, and the like.

또한, 갑상선 조직의 세포 성장성 이상 (이형증 진행)을 검출할 수 있으며, 갑상선암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 갑상선암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.In addition, the possibility of development of tissue to thyroid cancer can be evaluated by determining the cell growth abnormality (dysplasia progression) of thyroid tissue and determining the frequency of methylation of tissue having the possibility of thyroid cancer progression.

더욱이, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이터는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 갑상선암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.Furthermore, new targets for establishing and treating methylation lists using multiple genes can be identified. In addition, the methylation data according to the present invention may establish a more accurate thyroid cancer diagnostic system in conjunction with other non-methylated biomarker detection methods.

개체의 임상샘플에서 핵산 바이오 마커의 메틸화를 확인함으로써, 여러 단계 또는 기(期)의 갑상선암 진행을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 메틸화는 하이퍼메틸화일 수 있다.By confirming the methylation of the nucleic acid biomarker in a clinical sample of an individual, the progression of thyroid cancer at various stages or stages can be diagnosed. At this time, the methylation may be hypermethylated.

하나의 실시예에서, 상기 CpG 섬 부위는 POU4F1 유전자의 5' 발현조절부위에 위치할 수 있으며, 다른 실시예에서 메틸화는 유전자 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 검출될 수 있다. In one embodiment, the CpG island region may be located at the 5 'expression control region of the POU4F1 gene, and in another embodiment, the methylation proceeds from the outside of the gene control region to the inside, Can be detected.

구체적으로, 상기 갑상선암 바이오마커 유전자의 CpG 섬 부위는 서열번호 16 또는 서열번호 17로 표시되는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 16은 별도로 변형되지 않은 POU4F1 유전자 CpG 섬 부위의 염기 서열을 포함하고, 상기 서열번호 17은 메틸화 확인을 위해 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합으로 변환하였을 때의 POU4F1 유전자 CpG 섬 부위의 염기 서열을 포함한다. Specifically, the CpG island region of the thyroid cancer biomarker gene may have the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: SEQ ID NO: 16 contains the nucleotide sequence of the CpG island region of the POU4F1 gene, which has not been modified, and SEQ ID NO: 17 has been converted to bisulfite, hydrogensulfite, disulfite or a combination thereof for confirmation of methylation Of the POU4F1 gene CpG islands.

이를 바탕으로, 본 발명은 서열번호 17로 표시되는 POU4F1 유전자 또는 이의 단편을 포함하는 핵산으로, 상기 POU4F1 유전자 또는 이의 단편은 적어도 하나의 사이토신 염기를 우라실 또는 혼성화 과정에서 사이토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변환되도록 처리된 것을 특징으로 하는 갑상선암 검출용 변형 핵산에 관한 것이다. On the basis thereof, the present invention provides a nucleic acid comprising the POU4F1 gene or fragment thereof of SEQ ID NO: 17, wherein the POU4F1 gene or fragment thereof comprises at least one cytosine base in a uracil or other And then transformed into a base.

또한, 본 발명은 서열번호 17로 표시되는 POU4F1 유전자 또는 이의 단편을 포함하는 변형 핵산 바이오마커로, 상기 POU4F1 유전자 또는 이의 단편은 적어도 하나의 사이토신 염기를 우라실 또는 혼성화 과정에서 사이토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변환되도록 처리된 것을 특징으로 하는 갑상선암 검출용 변형 핵산 바이오마커에 관한 것이다.The present invention also relates to a modified nucleic acid biomarker comprising the POU4F1 gene or fragment thereof as shown in SEQ ID NO: 17, wherein the POU4F1 gene or fragment thereof comprises at least one cytosine base detected as uracil or a different cytosine from the hybridization process Wherein the transformed nucleic acid biomarker is a transformed nucleic acid biomarker for detection of thyroid cancer.

일 관점에서, 본 발명은 (a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 DNA에서 POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention provides a method for the detection of (a) isolating DNA in a clinical sample; And (b) detecting methylation of the CpG island region of the POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) thyroid cancer biomarker gene in the separated DNA. In order to provide information necessary for diagnosis of the thyroid cancer or thyroid cancer progression stage, To a method for detecting methylation of a marker gene CpG island region.

또한, 본 발명은 (a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 DNA에서 POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는, 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하여 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계를 진단하는 방법에 관한 것이다.(A) isolating DNA from the clinical sample; And (b) detecting methylation of the CpG island region of the thyroid cancer biomarker gene, wherein the methylation of the CpG island region of the POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) thyroid cancer biomarker gene is detected in the separated DNA, thereby detecting a thyroid cancer or thyroid cancer progression The present invention relates to a method for diagnosing a stage.

본 명세서에서 사용되는 "샘플," "임상샘플" 또는 검체"는 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함하고, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변을 포함하며, 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 미세침 흡인검체 역시 포함될 수 있다. 즉, 상기 임상샘플은 예를 들어, 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 미세침 흡인검체, 소변 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. &Quot; Sample, "" clinical sample, or specimen" as used herein includes all biological fluids of a wide variety of biological fluids obtained from individuals, body fluids, cell lines, tissue culture, etc. depending on the type of analysis being performed, Blood, serum, plasma, and urine, and may also include cells, tissues, biopsies, paraffin tissues, and fine needle aspirates, that is, the clinical sample may include, for example, a suspected cancer patient, The method of obtaining body fluids and tissue biopsies from mammals is usually performed by a method known in the art, including, but not limited to, It is widely known.

하나의 실시예에서, (a') 정상 대조군에서 분리된 샘플 및 개체의 임상샘플에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b') 상기 분리된 게놈 DNA를 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로 처리하는 단계; (b'') 상기 시약으로 처리된 게놈 DNA 또는 이의 단편에서 POU4F1 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화 상태를 확인하는 단계; 및 (b''') 정상 대조군과 비교하여 POU4F1 유전자의 메틸화 수준이 증가하면 갑상선암으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, (a ') isolating genomic DNA from a sample isolated from a normal control and from a clinical sample of the subject; (b ') treating the separated genomic DNA with a reagent that differentially transforms methylated DNA and unmethylated DNA; (b ") confirming the methylation status of the CpG island region of the POU4F1 gene in the genomic DNA treated with the reagent or a fragment thereof; And (b "') determining the thyroid cancer as an increase in the level of methylation of the POU4F1 gene compared to a normal control.

이 때, 상기 메틸화는 POU4F1 유전자 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 염기서열 변화를 통해 검출될 수 있으며, 이 때 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합인 시약을 처리하여 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 상이하게 변형시킬 수 있다.At this time, the methylation can be detected by the presence or absence of nucleotide sequence or the result of amplification with a primer capable of amplifying a fragment containing the CpG island of the POU4F1 gene, wherein the bisulfite, hydrogen sulfite, Sulfite or a combination thereof can be treated to differentiate methylated DNA and unmethylated DNA.

상기 메틸화는 예를 들어 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 정량 PCR, 핵산 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 및 시퀀싱 바이 라이게이션으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The methylation can be detected by, for example, PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, methylated DNA specific binding antibody or aptamer PCR, quantitative PCR, nucleic acid chip, sequencing, sequencing bi-synthesis, and sequencing bi-ligation. However, the present invention is not limited thereto.

다른 관점에서, 본 발명은 POU4F1 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression, which comprises a substance capable of detecting whether or not methylation of the CpG island region of the POU4F1 gene is detected. The present invention also relates to a kit for diagnosing the progress of a thyroid cancer or thyroid cancer comprising the composition.

본 발명은 또한, POU4F1 유전자 CpG 섬 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물 또는 키트의 제조에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of a substance capable of detecting methylation of the CpG island region of the POU4F1 gene in the production of a composition or kit for the diagnosis of thyroid cancer or thyroid cancer progression stage.

상기 CpG 섬 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 메틸화된 CpG 섬 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 메틸화된 CpG 섬 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 메틸화된 CpG 섬 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클라아제, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.A substance capable of detecting methylation of the CpG island region includes a primer pair capable of amplifying a fragment containing a methylated CpG island region, a probe capable of hybridizing with the methylated CpG island region, and a methylated CpG island region Methylation-specific binding antibodies or methylation-specific binding antibodies, methylation-sensitive restriction endonucleases, sequencing primers, sequencing by-synthase primers, and sequencing by-ligation primers.

본 발명에 따른 키트의 일 예로는 POU4F1 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트일 수 있다.An example of the kit according to the present invention may be a kit for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression, comprising a primer capable of amplifying a fragment containing the methylated CpG island of POU4F1 gene, a kit comprising the composition.

상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫 번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두 번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 프라이머는 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하는 프라이머로 사용된다.The kit comprises a first container containing a partitioned carrier means for containing a sample, a preparation for sensitive cleavage of unmethylated cytosine, a second container containing a primer for amplifying a CpG containing nucleic acid, and a second container containing a cleaved or uncut nucleic acid And at least one container comprising a third container containing means for detecting the presence. Primers used in accordance with the present invention are used as primers to detect whether methylation has occurred on the genome.

구체적으로, 본 발명에 따른 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트의 다른 예로는 POU4F1 유전자의 CpG섬 또는 그 발현조절 부위의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 갑상선암 진단용 키트일 수 있다. 상기 PCR 프라이머 쌍은 예를 들어 서열번호 5 및/또는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있고, 상기 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머는 예를 들어 서열번호 13의 서열을 가질 수 있다.Specifically, the composition for diagnosing the progress of thyroid carcinoma or thyroid carcinoma according to the present invention, another example of a kit containing the composition includes a PCR primer pair for amplifying a fragment containing CpG islands of the POU4F1 gene or CpG islands thereof And a sequencing primer for pyrosequencing the PCR product amplified by the primer pair. The PCR primer pair may, for example, have the sequence of SEQ ID NO: 5 and / or SEQ ID NO: 6, and the sequencing primer for pyrosequencing the PCR product may have the sequence of SEQ ID NO: 13, for example.

본 발명의 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 이용하면 검체에서 갑상선 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 이는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 단계는 갑상선 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. The composition for diagnosing the progress of thyroid cancer or thyroid carcinoma of the present invention and the kit containing the same can be used to determine the abnormal growth tendency (dysplasia progression degree) of thyroid tissue in a specimen. Which comprises determining the methylation status of the nucleic acid isolated from the sample and wherein the methylation step of the nucleic acid is characterized by comparing the methylation step of the nucleic acid isolated from the sample lacking the cell growth abnormalities (dysplasia) of the thyroid tissue have.

또 다른 관점에서, 본 발명은 POU4F1 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬의 메틸화 부위를 포함하는 단편과 하이브리다이제이션 할 수 있는 프로브를 포함하는 갑상선암 또는 갑상선암 진행단계 진단용 핵산칩에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a nucleic acid chip for diagnosing thyroid cancer or thyroid cancer progression stage, which comprises a probe capable of hybridization with a fragment containing the methylation site of the POU4F1 thyroid cancer biomarker gene CpG island.

상기 프로브는 갑상선암 바이오마커의 CpG와는 상보적이면서 동시에 상기 갑상선암 바이오마커 유전자 부위의 CpG를 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. Wherein the probe comprises a base sequence complementary to CpG of a thyroid cancer biomarker and capable of hybridizing with a fragment containing CpG of the thyroid cancer biomarker gene region.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 갑상선 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 갑상선 조직의 세포 성장성 이상(이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.Using the methylation marker gene of the present invention, it is possible to detect a cell growth abnormality (progression of dysplasia) of a thyroid tissue in a specimen. The method comprises contacting a sample comprising one or more nucleic acids isolated from a sample with an agent capable of determining one or more methylation states. The method comprises identifying the methylation status of one or more regions in one or more nucleic acids, wherein the methylation status of the nucleic acid is indicative of the methylation status of the same region in the nucleic acid of the sample not having cell growth abnormalities (dysplasia progression) It is possible to make a difference.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 형질전환된 갑상선암 세포를 확인할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the thyroid carcinoma or thyroid cancer cell can be identified by examining the methylation of the marker gene using the composition for the diagnosis of thyroid cancer or thyroid carcinoma progression, a kit or a nucleic acid chip containing the same.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 갑상선암을 진단할 수 있다. 구체적으로, 다음의 단계를 통해 키트를 사용하여 개체 내 갑상선암을 진단할 수 있다:In another embodiment of the present invention, thyroid cancer can be diagnosed by examining the methylation of the marker gene using the composition for diagnosing the progress of the thyroid cancer or thyroid cancer, the kit or the nucleic acid chip containing the same. Specifically, the kit can be used to diagnose thyroid cancer in an individual through the following steps:

(a) 개체로부터 분리된 임상샘플에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;(a) isolating genomic DNA from a clinical sample separated from the individual;

(b) 상기 분리된 게놈 DNA 또는 이의 단편을 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계;(b) treating the separated genomic DNA or a fragment thereof with one or more reagents that modify methylated DNA and unmethylated DNA differently;

(c) 상기 처리된 게놈 DNA 또는 이의 단편에 대한 증폭효소 및 증폭 가능한 프라이머, 또는 이와 상보적이거나 엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드의 연속적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키되, 처리된 게놈 DNA 또는 이의 단편을 증폭시켜 하나 이상의 증폭산물을 만들거나 증폭시키지 않는 단계; 및(c) contacting the treated genomic DNA or fragments thereof with one or more primers comprising an amplification enzyme and an amplifiable primer, or a contiguous sequence of nucleotides capable of hybridization under complementary or stringent conditions, Amplifying the DNA or fragment thereof to make or amplify one or more amplification products; And

(d) 상기 증폭산물의 존재 또는 부재에 기초하여 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드의 메틸화 상태 또는 수준을 결정함으로써, 갑상선암을 검출하는 단계. (d) detecting a thymic cancer by determining the methylation status or level of one or more CpG dinucleotides based on the presence or absence of said amplification product.

이 때, 상기 프라이머는 예를 들어 서열번호 5 및/또는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있고, 경우에 따라서 상기 증폭 산물을 시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 시퀀싱 프라이머는 예를 들어, 서열번호 13의 서열을 가질 수 있다.In this case, the primer may have, for example, the sequence of SEQ ID NO: 5 and / or SEQ ID NO: 6, and may optionally further include a sequencing primer for sequencing the amplification product. The sequencing primer may, for example, have the sequence of SEQ ID NO: 13.

상기 시약은 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합일 수 있으며, 상기 증폭효소는 내열성 DNA 폴리머라제 또는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 폴리머라제일 수 있다. 상기 개체로부터 분리된 임상샘플은 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 미세침 흡인검체, 소변 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The reagent may be a bisulfite, a hydrogensulfite, a disulfite, or a combination thereof, and the amplification enzyme may be a thermolabile DNA polymerase or a polymerase having no 5'-3 'exonuclease activity . The clinical sample separated from the subject may be selected from the group consisting of cells, tissues, biopsies, paraffin tissues, blood, serum, plasma, micro needle aspirates, urine, and combinations thereof, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 갑상선암 또는 갑상선암 진행 단계 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 갑상선암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 미세침 흡인검체, 소변 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the possibility of progressing to thyroid cancer by examining the methylation of a marker gene using a composition for diagnosing the progress of thyroid cancer or thyroid cancer, a kit containing the same, or a nucleic acid chip using a sample showing a normal phenotype Can be diagnosed. The sample may be selected from the group consisting of solid or liquid tissues, cells, blood, serum, plasma, fine needle aspiration specimen, urine, and combinations thereof, but is not limited thereto.

상기 메틸화 측정방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 (sequencing by synthesis), 시퀀싱 바이 라이게이션 (sequencing by ligation) 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The methylation assay can be performed using PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR, pyrosequencing, sequencing by sequencing by synthesis, sequencing by ligation, and bisulfite sequencing. However, the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 임상샘플로부터 샘플 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 DNA를 갑상선암 바이오마커 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 갑상선암 바이오마커 유전자 CpG 섬의 메틸화 여부를 결정하는 단계. In the present invention, a method for detecting whether or not methylation of the gene comprises the steps of: (a) separating sample DNA from a clinical sample; (b) amplifying the separated DNA using a primer capable of amplifying a fragment containing a CpG island of a thyroid cancer biomarker gene; And (c) determining whether the methylation of the CpG isoform of the thyroid cancer biomarker gene is based on whether or not the product amplified in the step (b) is produced.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 갑상선암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 갑상선암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 갑상선암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.
In another embodiment of the present invention, the frequency of methylation of genes that are specifically methylated in thyroid cancer can be examined and the likelihood of tissue thyroid cancer development being assessed by determining the frequency of methylation of tissues with potential for thyroid cancer progression.

메틸화 조절 바이오 마커의 스크리닝Screening of methylation-regulated biomarkers

본 발명에서는 세포 또는 조직이 형질전환되거나 세포의 형태가 다른 형태로 변화될 때에 메틸화되는 바이오 마커 유전자를 스크리닝하였다. 여기서, "형질전환" 세포는 정상형태가 비정상형태로, 비-종양성이 종양성으로, 미분화형태가 분화형태로 바뀌는 등의 세포 또는 조직의 형태가 다른 형태로 변화되는 것을 의미한다.In the present invention, a biomarker gene that is methylated when a cell or tissue is transformed or a cell shape is changed to another form was screened. Here, the term "transformed" cell means that the cell or tissue is changed into a different form such as a normal form, an abnormal form, a non-positive form, a non-differentiated form, or a differentiated form.

본 발명의 일 실시예에서는 갑상선암 환자의 암조직과 이와 연접한 정상조직으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA만을 획득하기 위하여, 상기 게놈 DNA를 메틸화된 DNA에 결합하는 MBD2bt와 반응시킨 후, MBD2bt 단백질에 결합하는 메틸화된 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 MBD2bt 단백질에 결합하는 메틸화된 DNA를 증폭한 후, 정상인 유래 DNA는 Cy3으로, 갑상선암 환자 유래 DNA는 Cy5로 표지한 다음, human CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션시켜 정상조직과 갑상선암 조직간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 5개의 유전자를 바이오 마커 후보로 선택하였다.In one embodiment of the present invention, genomic DNA was isolated from cancer tissues and normal tissues associated with thyroid cancer patients. To obtain only methylated DNA from genomic DNA, the genomic DNA was reacted with MBD2bt that binds to the methylated DNA, and then the methylated DNA bound to the MBD2bt protein was isolated. The methylated DNA binding to the separated MBD2bt protein was amplified and the DNA derived from the normal human was labeled with Cy3, the DNA derived from the thyroid cancer patient was labeled with Cy5, and hybridized to a human CpG microarray to obtain methylated Five genes with the largest difference were selected as biomarker candidates.

본 발명에서는 상기 5개의 바이오 마커 후보가 메틸화되었는지 추가로 확인하기 위하여, 파이로시퀀싱을 수행하였다. In the present invention, pyrosequencing was performed to further confirm whether the five biomarker candidates were methylated.

즉, 갑상선암 세포주 B-CPAP, K1, TPC-1, 8505C, SW-1736 및 HTH74 로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여 바이설파이트를 처리한 후, 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA를 증폭하였다. 이후, 상기 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱을 수행하여 메틸화 정도를 측정하였다. 그 결과, POU4F1 바이오 마커 유전자가 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.
That is, whole genomic DNA was isolated from the thyroid cancer cell lines B-CPAP, K1, TPC-1, 8505C, SW-1736 and HTH74 and treated with bisulfite and then genomic DNA converted into bisulfite was amplified. Then, the amplified PCR product was subjected to pyrosequencing to measure the degree of methylation. As a result, it was confirmed that the POU4F1 biomarker gene was methylated.

갑상선암에 대한 바이오 마커Biomarkers for thyroid cancer

본 발명에서는 갑상선암 진단을 위한 바이오 마커를 제공한다.
The present invention provides a biomarker for diagnosing thyroid cancer.

갑상선암에 대한 바이오 마커-정상세포와의 비교를 위한 암세포의 용도Biomarkers for thyroid cancer - Use of cancer cells for comparison with normal cells

본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.In this embodiment, "normal" cells refer to cells that do not exhibit abnormal cell morphology or changes in cytostatic properties. "Tumor" refers to a cancer cell, and "non-tumor" refers to a cell that is part of a diseased tissue but not a tumor.

본 발명은 일 관점에서, 갑상선암과 갑상선암 바이오마커 유전자의 하이퍼메틸화 사이의 관련성 발견에 기반을 둔 것이다.The present invention is based, in one aspect, on the discovery of the association between hypermethylation of thyroid cancer and thyroid cancer biomarker genes.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 갑상선 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 갑상선 조직의 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.For other uses of the diagnostic kit and nucleic acid chip of the present invention, the methylation step of one or more nucleic acids isolated from a sample can be determined to early diagnose abnormal growth of the thyroid tissue of the specimen. Wherein the methylation step of the one or more nucleic acids is characterized by comparing the methylation status of one or more nucleic acids isolated from a sample that does not have a cell growth abnormality of the thyroid tissue. The nucleic acid is preferably a CpG-containing nucleic acid such as a CpG island.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 갑상선암 바이오마커 유전자의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 개체의 갑상선 조직에서 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. Other uses of the diagnostic kits and nucleic acid chips of the present invention can diagnose cell growth abnormalities in the thyroid tissue of an individual, including determining the methylation of a thyroid cancer biomarker gene isolated from a sample.

상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.The term "soybean" means a property that is liable to suffer from the cell growth abnormality. A specimen with a lysate is a specimen that does not have any cell growth abnormality yet, but has an increased tendency to exist or to have a cell growth abnormality.

본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 핵산의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 개체의 갑상선 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for diagnosing abnormality in cell growth of a thyroid tissue of an individual, comprising contacting a sample containing a nucleic acid of a sample with a preparation capable of determining the methylation state of the sample and confirming methylation of the nucleic acid to provide.

본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다. The method of the invention comprises determining the methylation of at least one site of one or more nucleic acids isolated from a sample. Herein, the term "nucleic acid" or "nucleic acid sequence" means an oligonucleotide, a nucleotide, a polynucleotide or a DNA or RNA of a genomic or synthetic origin of a fragment, a single strand or a double strand thereof, a genomic origin or a synthetic DNA or RNA of origin, PNA (peptide nucleic acid), or a DNA quantity or RNA substance of natural or synthetic origin. It will be apparent to those skilled in the art that if the nucleic acid is RNA, it is replaced by ribonucleotides A, G, C and U, respectively, instead of deoxynucleotides A, G, C and T.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.
Any nucleic acid that can detect the presence of differently methylated CpG islands can be used. The CpG island is a CpG-rich region in the nucleic acid sequence.

메틸화(methylation)Methylation

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다. Any nucleic acid in purified or untreated form in the present invention may be used, and any nucleic acid containing or suspected of containing a nucleic acid sequence containing a target site (for example, a CpG-containing nucleic acid) may be used . The nucleic acid region that can be differentially methylated is a CpG island, which is a nucleic acid sequence having a high CpG density compared to other dinucleotide CpG nucleic acid sites. The doublet CpG, when predicted by the ratio of G * C base pairs, has a probability of only 20% in vertebrate DNA. At certain sites, the density of double CpG is ten times higher than in other parts of the genome. CpG islands have an average G * C ratio of about 60%, and the average G * C ratio of DNA represents an average of 40%. CpG islands typically have a length of about 1 to 2 kb, with about 45,000 CpG islands in the human genome.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.In several genes, the CpG islands start from the upstream of the promoter and extend to the downstream transcription site. In the promoter, methylation of CpG islands usually suppresses gene expression. The CpG island may also surround the 5 'region of the gene coding region, as well as the 3' region of the gene coding region. Thus, CpG islands are found in several sites, including coding sequence upstream of the regulatory region comprising the promoter region, coding region (e.g., exon region), downstream of the coding region, such as the enhancer region and intron do.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.Typically, the CpG-containing nucleic acid is DNA. However, the method of the present invention can be applied, for example, to a sample containing DNA or RNA containing DNA and mRNA, wherein the DNA or RNA may be single-stranded or double-stranded, or a DNA-RNA hybrid And the like.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.A nucleic acid mixture can also be used. The specific nucleic acid sequence to be detected may be a fraction of a large molecule and the unique sequence from the beginning may exist in the form of a separate molecule constituting the entire nucleic acid sequence. The nucleic acid sequence need not be a nucleic acid present in a pure form, and the nucleic acid may be a small fraction in a complex mixture such as a whole human DNA. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) used to measure the degree of methylation of the nucleic acid contained in the sample, or the nucleic acid contained in the sample used to detect the methylated CpG island, Can be extracted by various methods.

핵산은 정보를 코드하거나 핵산의 전사를 조절하는 DNA 부위인 조절 부위를 포함할 수 있다. 조절 부위는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. "프로모터"는 전사를 지시하는데 필요한 최소한의 서열이고, 프로모터-의존성 유전자에서 세포 타입 특이적, 조직 특이적 또는 외부 시그널이나 제제에 의한 유도성을 조절할 수 있다. 프로모터는 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치한다. 프로모터 부위의 전체 또는 부분의 핵산 수는 CpG 섬 부위의 메틸화를 측정하는데 적용될 수 있다. 타겟 유전자 프로모터의 메틸화는 외곽에서부터 내부로 진행한다. 그러므로, 세포 전환의 초기 단계는 프로모터 부위의 외곽에서의 메틸화를 분석함으로써 검출할 수 있다.The nucleic acid may comprise a regulatory region that is a DNA region that codes for information or regulates transcription of the nucleic acid. The regulatory region comprises at least one promoter. A "promoter" is the minimum sequence required to direct transcription, and can regulate cell type-specific, tissue-specific or external signal or inducibility by the agent in the promoter-dependent gene. The promoter is located in the 5 'or 3' region of the gene. The number of nucleic acids in whole or part of the promoter region can be applied to measure the methylation of the CpG island region. The methylation of the target gene promoter proceeds from the outside to inside. Therefore, the initial stage of cell turnover can be detected by analyzing the methylation at the outside of the promoter region.

검체로부터 분리된 핵산은 개체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 갑상선암이나 갑상선암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 갑상선 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.The nucleic acid isolated from the sample is obtained by a biological sample of the individual. If you want to diagnose the progression of thyroid cancer or thyroid cancer, you should isolate the nucleic acid from the thyroid tissue by scrap or biopsy. Such samples can be obtained by various medical procedures known in the art.

본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 갑상선 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 갑상선 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.
In one embodiment of the invention, the degree of methylation of the nucleic acid of the sample obtained from the sample is measured relative to the same nucleic acid portion of the sample without the cell growth abnormality of the thyroid tissue. Hypermethylation refers to the presence of a methylated allele in one or more nucleic acids. A sample without thyroid tissue growth abnormality does not show a methylated allele when tested for the same nucleic acid.

샘플(sample)Sample (sample)

본 발명은 갑상선암의 조기 확인에 대하여 기술하고 있으며, 갑상선암 특이적 유전자 메틸화를 이용하고 있다. 갑상선암 특이적 유전자의 메틸화는 종양 부위의 부근 조직에서도 일어났다. 그러므로, 갑상선암의 조기 확인 방법은 액체 또는 고체 조직을 포함하는 모든 샘플로 갑상선암-특이적 유전자의 메틸화의 유무를 확인할 수 있다. 상기 샘플은 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 미세침 흡인검체, 소변 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
The present invention describes the early identification of thyroid cancer and uses specific gene methylation of thyroid cancer. The methylation of thyroid cancer - specific genes also occurred in the nearby tissues of the tumor. Therefore, early detection of thyroid cancer can confirm the presence or absence of methylation of the thyroid cancer-specific gene in all samples containing liquid or solid tissue. The sample may be selected from the group consisting of cells, tissues, biopsies, paraffin tissues, blood, serum, plasma, micro needle aspirates, urine, and combinations thereof, but is not limited thereto.

메틸화 검출 방법Methylation detection method

메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)Methylation specific PCR

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.
When biosulfite is treated with genomic DNA, the cytosine in the 5'-CpG'-3 region is left as it is when it is methylated, and when it is unmethylated, it changes into uracil. Therefore, a PCR primer corresponding to the 5'-CpG-3 'nucleotide sequence was prepared from the base sequence after bisulfite treatment. At this time, PCR primers corresponding to methylation and two types of primers corresponding to unmethylated primers were prepared. When genomic DNA is converted into bisulfite and then PCR is carried out using the above two types of primers, PCR products are produced by using primers corresponding to the methylated nucleotide sequence when methylated, and in the case of unmethylated PCR products are produced using primers corresponding to unmethylated sequences. The methylation can be qualitatively confirmed by agarose gel electrophoresis.

실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)Real time methylation specific PCR (PCR)

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 핵산프로브 (e.g., TaqMan 등)를 이용하여 검출하는 방법과 형광염료 (e.g., Sybergreen, Evagreen 등)를 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro 메틸화 DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.
Real-time methylation specific PCR is the conversion of methylation-specific PCR method to real-time measurement method. The PCR primer corresponding to the methylation of biosulfite treated with genomic DNA was designed and real-time PCR was performed using these primers . At this time, there are two methods of detecting using a nucleic acid probe complementary to the amplified nucleotide sequence (eg, TaqMan) and detecting using a fluorescent dye (eg, Sybergreen, Evagreen, etc.). Therefore, real-time methylation-specific PCR can quantitatively analyze only methylated DNA. At this time, a standard curve was prepared using an in vitro methylated DNA sample, and the degree of methylation was quantitatively analyzed by amplifying a gene having no 5'-CpG-3 'sequence in the nucleotide sequence as a negative control for standardization.

파이로시퀀싱Pyrosequencing

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.
The pyrosequencing method is a method of converting the bisulfite sequencing method into quantitative real-time sequencing. Similar to bisulfite sequencing, genomic DNA was transformed by treatment with bisulfite, and PCR primers corresponding to sites lacking the 5'-CpG-3 'nucleotide sequence were prepared. The genomic DNA was treated with bisulfite, amplified with the PCR primer, and subjected to real-time sequencing using a sequencing primer. The amounts of cytosine and thymine were quantitatively analyzed in the 5'-CpG-3 'region and the degree of methylation was expressed as a methylation index.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩PCR or quantitative PCR using methylated DNA-specific binding protein and DNA chip

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 프로모터 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다. In PCR or DNA chip method using methylated DNA-specific binding protein, when a protein specifically binding to methylated DNA is mixed with DNA, only the methylated DNA can be selectively isolated because the protein specifically binds to the methylated DNA . Genomic DNA was mixed with methylated DNA-specific binding protein and only methylated DNA was selectively isolated. These isolated DNAs were amplified using a PCR primer corresponding to the promoter region and then methylated by agarose electrophoresis.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.
In addition, methylation can be measured using a quantitative PCR method. The methylated DNA separated by a methylated DNA-specific binding protein is labeled with a fluorescent dye and hybridized to a complementary probe-integrated DNA chip to measure methylation . Here, the methylated DNA-specific binding protein is not limited to MBD2bt.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제Detection of differential methylation - methylation-sensitive restriction endonuclease

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.Detection of differential methylation can be accomplished by contacting the nucleic acid sample with a methylation sensitive restriction endonuclease that cleaves only the unmethylated CpG site and cleaving the unmethylated nucleic acid.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다. In a separate reaction, the sample was contacted with an isochisomer of a methylation-sensitive restriction endonuclease that cleaves both methylated and unmethylated CpG sites to cleave the methylated nucleic acid.

특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.A specific primer was added to the nucleic acid sample and the nucleic acid was amplified by a conventional method. If the amplification product is present in the sample treated with the methylation-sensitive restriction endonuclease and the amplification product is not present in the sample treated with the methylation-sensitive restriction endonuclease isokisome that cleaves both methylated and unmethylated CpG sites , And methylation occurred at the analyzed nucleic acid site. However, even in samples that were treated with methylation-sensitive restriction endonuclease isokisomes that did not have an amplification product in the sample treated with the methylation-sensitive restriction endonuclease and cleaved both methylated and unmethylated CpG sites, Not present means that no methylation has occurred in the nucleic acid region analyzed.

여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. Here, a "methylation-sensitive restriction endonuclease" is a restriction enzyme that contains CG at the recognition site and is active when C is methylated as compared to when C is not methylated (for example, SmaI). Non-limiting examples of methylation sensitive restriction endonuclease include MspI, HpaII, BssHII, BstUI and NotI . These enzymes can be used alone or in combination. Other methylation sensitive restriction endonucleotides include, but are not limited to SacII and EagI .

메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.Isokimers of methylation-sensitive restriction endonuclease are limited endonucleases with the same recognition sites as methylation sensitive restriction endonuclease, but cleave both methylated CGs and unmethylated CGs, for example MspI .

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.The primers of the present invention are engineered to be "substantially" complementary to each strand of the locus to be amplified and comprise the appropriate G or C nucleotides, as described above. This means that the primer has sufficient complementarity to hybridize with the corresponding nucleic acid strand under the conditions of performing the polymerization reaction. The primers of the present invention are used in an amplification process, wherein the amplification process is an enzymatic sequencing reaction in which the target locus increases in exponential numbers through many reaction steps, such as, for example, PCR. Typically, one primer (antisense primer) has homology to the negative (-) strand of the locus and the other one (sense primer) has homology to the positive (+) strand. Once the primer is annealed to the denatured nucleic acid, the chain is extended by enzymes and reagents such as DNA polymerase I (Klenow) and nucleotides, resulting in a new synthesis of the + and - strands containing the target locus sequence. When the newly synthesized target locus is also used as a template and the cycles of denaturation, primer annealing, and chain extension are repeated, exponential synthesis of the target locus sequence proceeds. The product of the continuous reaction is an independent double-stranded nucleic acid having a terminal end corresponding to the specific primer used in the reaction.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.
The amplification reaction is preferably a PCR commonly used in the art. However, alternative methods such as real-time PCR or linear amplification using isothermal enzymes can be used, and multiplex amplification reactions can also be used.

차별적 메틸화의 검출-바이설파이트 시퀀싱 방법Detection of Differential Methylation - Bisulfite sequencing method

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.
Another method of detecting a nucleic acid containing methylated CpG involves contacting a sample containing nucleic acid with an agent to modify unmethylated cytosine and amplifying the CpG-containing nucleic acid of the sample using a CpG-specific oligonucleotide primer . Here, the oligonucleotide primer may be characterized in that methylated nucleic acid is detected by distinguishing modified methylated and unmethylated nucleic acids. The amplification step is optional, but is not necessary. The method relies on PCR reactions to distinguish between modified (e. G., Chemically modified) methylated and unmethylated DNA. Such a method is disclosed in U.S. Patent 5,786,146, which is described in connection with bisulfite sequencing for the detection of methylated nucleic acids.

바이설파이트 시퀀싱 방법Bisulfite sequencing method

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 메틸화-비의존적 (Methylation independent) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하지 않고 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭된 산물을 시퀀싱 프라이머를 이용하여 Sanger 방법으로 시퀀싱하거나 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing) 방법으로 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트 (bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다. Another method for detecting a nucleic acid containing methylated CpG comprises contacting a sample containing the nucleic acid with an agent for modifying unmethylated cytosine and contacting the sample with a CpG-containing nucleic acid of the sample using a methylation independent oligonucleotide primer . Here, the oligonucleotide primer may be characterized by amplifying the nucleic acid without distinguishing the modified methylated and unmethylated nucleic acid. This amplified product has been described in connection with bisulfite sequencing for sequencing by the Sanger method using a sequencing primer or by the next generation sequencing method for detection of methylated nucleic acid.

여기서 차세대 시퀀싱 방법은 시퀀싱 바이 신세시스 (Sequencing by synthesis)와 시퀀싱 바이 라이게이션 (Sequencing by ligation) 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법의 특징은 bacterial clone을 만드는 대신 단일 DNA 단편을 공간적으로 분리하여 in situ로 증폭하고 (clonal amplification), 시퀀싱을 해낸다는 것이다. 이때, 수십 만개의 단편을 동시에 읽어내기 때문에 매시브 페러럴 시퀀싱(massively parallel sequencing) 방법으로 불리기도 한다. Here, the next generation sequencing method may be a sequencing by synthesis method and a sequencing by ligation method. A feature of this method is that instead of making a bacterial clone, a single DNA fragment is spatially separated, amplified in situ (clonal amplification), and sequenced. At this time, it is sometimes referred to as a massively parallel sequencing method because it reads hundreds of thousands of fragments simultaneously.

기본적으로는 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis) 방법이며, 모노 혹은 디뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가면서 시그널을 얻는 방법을 사용하는데 파이로시퀀싱, ion torrent, Solexa 방법들이 여기에 해당한다. Basically, sequencing by synthesis is a method of acquiring signals by sequentially attaching mono or dinucleotides, including pyrosequencing, ion torrent, and Solexa methods.

시퀀싱 바이 신세시스에 기반하는 NGS 장비로는 로슈(Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나(Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지(Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 마지막으로 퍼시픽바이오사이언스(Pacific BioSciences)상의 PacBio 플랫폼이 있다. 454와 Ion PGM은 클로날증폭(clonal amplification)방법으로 emulsion PCR을 사용하며, HiSeq은 브릿지 증폭(Bridge amplification)을 사용한다. 시퀀싱 바이 신세시스 방법은 한 개의 뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가며 DNA를 합성시켜 나갈 때 발생되는 인산(phosphate), 수소이온, 혹은 미리 붙여 놓은 형광을 검출하여 서열을 읽어 나간다. 서열을 검출하는 방법에 있어, 454는 인산을 이용하는 파이로시퀀싱(pyroseqeuncing) 방법을 사용하며, Ion PGM은 수소이온 검출을 이용한다. HiSeq과 PacBio는 형광을 검출하여 서열을 해독한다.NGS devices based on sequencing by synthesis include Roche's 454 platform, Illumina's HiSeq platform, Life Technology's Ion PGM platform, and finally PacBio platform on Pacific BioSciences. have. 454 and Ion PGM use emulsion PCR as a clonal amplification method and HiSeq use bridge amplification. The sequencing bi-synthase method sequentially attaches one nucleotide and detects the phosphate, hydrogen ion, or pre-attached fluorescence generated when the DNA is synthesized and reads the sequence. In the method of detecting the sequence, 454 uses a pyroseqeuncing method using phosphoric acid, and Ion PGM uses hydrogen ion detection. HiSeq and PacBio detect fluorescence and decode the sequence.

시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation)은 DNA ligase를 이용하는 시퀀싱 기술로 DNA 염기서열에 존재하는 특정위치의 뉴클레오티드를 확인하는 기술이다. 대부분의 시퀀싱 기술이 중합효소를 사용하는 것과 달리 중합효소를 사용하지 않으며 DNA ligase가 미스매치 서열을 ligation하지 않는 특징을 이용한다. SOLiD 시스템이 여기에 해당한다. 이 기법에서는 간격을 두면서 두 개씩 염기를 읽는데, 프라이머 리셋(primer reset)을 통해 독립적으로 다섯 번을 반복하기 때문에, 최종적으로는 각 염기를 두 번씩 중복하여 읽어서 정확도를 높인다. Sequencing by ligation is a technique for identifying nucleotides at specific positions in a DNA sequence by a sequencing technique using DNA ligase. Unlike polymerase, most sequencing techniques do not use any polymerase, and DNA ligase does not ligate mismatched sequences. This is the SOLiD system. In this technique, two bases are read with spacing, which is repeated five times independently through primer reset, so that the accuracy is improved by reading each base twice in duplicate.

시퀀싱 바이 라이게이션 (Sequencing by ligation)의 경우, 16개 조합으로 만들어진 디뉴클레오티드 프라이머 셋트 중, 해당 염기서열에 대응되는 디뉴클레오티드 프라이머가 순차적으로 라이게이션되며, 이 라이게이션들의 조합을 최종적으로 분석하여 해당 DNA의 염기서열이 완성된다.
In the case of sequencing by ligation, the dinucleotide primers corresponding to the corresponding nucleotide sequences are sequentially ligated among the denucleotide primer sets made of 16 combinations, and the combination of these ligation is finally analyzed DNA sequence is completed.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 항체를 이용한 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 또는 시퀀싱 바이 라이게이션Sequencing using methylated DNA-specific binding proteins or antibodies, sequencing bi-synthesis or sequencing bi-ligation

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 항체를 이용한 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질 또는 항체를 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질 또는 항체가 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, Sanger 방법, 시퀀싱 바이 신세시스 또는 시퀀싱 바이 라이게이션 방법으로 메틸화 여부를 측정하였다. Sequencing or sequencing using methylated DNA-specific binding proteins or antibodies is a method in which a protein or an antibody specifically binding to a methylated DNA is mixed with DNA to bind specifically to the methylated DNA only, And can be selectively separated. Genomic DNA was mixed with methylated DNA-specific binding protein and only methylated DNA was selectively isolated. These isolated DNA fragments were amplified using PCR primers and then methylated by Sanger method, sequencing by synthase or sequencing by ligation method.

여기서 차세대 시퀀싱 방법은 Sequencing by synthesis 또는 Sequencing by ligation 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않으며, 항체는 5'-methyl-cytosine 항체에 제한되지 않는다.
Here, the next generation sequencing method can be characterized by sequencing by synthesis or sequencing by ligation method. Here, the methylated DNA-specific binding protein is not limited to MBD2bt, and the antibody is not limited to the 5'-methyl-cytosine antibody.

키트 (Kit)Kit

본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 샘플의 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 두 번째 용기 및 메틸화 CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 하나의 실시예에서, 상기 프라이머는 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하기 위한 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 정량 PCR, 핵산 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 또는 시퀀싱 바이 라이게이션에 사용하기 위한 프라이머일 수 있다. According to the present invention, there is provided a kit useful for detecting abnormality in cell growth of a specimen. The kit of the present invention comprises a partitioned carrier means for containing a sample, a second container containing a primer capable of amplifying the 5'-CpG-3 'base sequence region of the sample, and a second container containing a cleaved or truncated nucleic acid to amplify the methylated CpG- And a third container containing means for detecting the presence of nucleic acid that has not been detected. In one embodiment, the primers are selected from the group consisting of PCR for detecting methylation on the genome, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, methylated DNA specific binding protein , Primers for use in PCR, quantitative PCR, nucleic acid chip, sequencing, sequencing biosynthesis, or sequencing by-ligation using PCR, methylated DNA-specific binding antibody or extramammer.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
The carrier means is suitable for containing one or more containers such as bottles, tubes, and each container contains the independent components used in the method of the present invention. In the context of the present invention, those skilled in the art will readily be able to dispense the necessary formulation in a container.

기질temperament

타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.When the target nucleic acid region is amplified, the nucleic acid amplification product can be hybridized with a known gene probe immobilized on a solid support (substrate) in order to detect the presence of the nucleic acid sequence.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term "substrate" refers to a hybridization or enzymatic recognition site, such as a substance, structure, surface or material, abiotic, synthetic, inanimate, flat, spherical or specific binding, Or a large number of other recognition sites or a number of other recognition sites beyond a number of other molecular species composed of surfaces, structures or materials. The substrate can be, for example, a semiconductor, an (organic) synthetic metal, a synthetic semiconductor, an insulator and a dopant; Metals, alloys, elements, compounds and minerals; Assembled, disintegrated, etched, lithographed, printed and microfabricated slides, devices, structures and surfaces; Industrial, polymers, plastics, membranes, silicones, silicates, glasses, metals and ceramics; But are not limited to, wood, paper, cardboard, cotton, wool, cloth, woven and nonwoven fibers, materials and fabrics.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREENTM, ZETAPROBETM(Biorad) 및 NYTRANTM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.
Some types of membranes are known in the art to have an affinity for nucleic acid sequences. Specific, non-limiting examples of such membranes include nitrocellulose or polyvinyl chloride, diazotized paper, and membranes for gene expression detection, such as commercially available membranes such as GENESCREENTM, ZETAPROBETM (Biorad) and NYTRANTM have. Beads, glasses, wafers and metal substrates. Methods for attaching nucleic acids to such objects are well known in the art. Alternatively, screening can be performed in a liquid phase.

하이브리다이제이션 조건Hybridization conditions

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.In nucleic acid hybridization reactions, the conditions used to achieve a certain level of stringency will vary depending on the nature of the nucleic acid being hybridized. For example, hybridization conditions such as the length of the nucleic acid site to be hybridized, the degree of homology, the nucleotide sequence (for example, GC / AT composition ratio) and the nucleic acid type (for example, RNA or DNA) . An additional consideration is whether the nucleic acid is immobilized, for example, on a filter or the like.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
Examples of very stringent conditions include: 2X SSC / 0.1% SDS at room temperature (hybridization conditions); 0.2X SSC / 0.1% SDS at room temperature (low stringency conditions); 0.2X SSC / 0.1% SDS at 42 < 0 > C (conditions with normal stringency); 0.1X SSC at 68 ° C (conditions with high stringency). The cleaning process can be carried out using one of these conditions, for example a condition with high stringency, or the above conditions can be used respectively, and the conditions described above may be applied in whole or in part, Some can be done iteratively. However, as described above, optimal conditions vary depending on the particular hybridization reaction involved and can be determined through experimentation. Generally, conditions with high stringency are used for hybridization of critical probes.

표지(Label)Label

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
Important probes are detectably labeled and may be labeled, for example, as radioactive isotopes, fluorescent compounds, bioluminescent compounds, chemiluminescent compounds, metal chelates or enzymes. It is well known in the art to appropriately label such a probe, and can be carried out by a conventional method.

[실시예][Example]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: 갑상선암 특이적 메틸화 유전자 발굴Example 1: Detection of thyroid cancer-specific methylation gene

갑상선암에서 특이적으로 메틸화된 바이오 마커를 선별하기 위하여, 갑상선암환자 12명의 수술조직 (충남대병원 인체자원은행)으로부터 얻은 암 조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직 게놈 DNA 그리고 11명의 갑상선 암환자의 수술조직 (충남대병원 인체자원은행) 게놈 DNA 500ng을 초음파 분쇄(Vibra Cell, SONICS)하여, 약 200~300bp의 게놈 DNA 절편을 제작하였다. In order to screen specifically methylated biomarkers from thyroid carcinomas, cancer tissues obtained from the surgical tissues of 12 thyroid cancer patients (Chungnam National University Hospital Human Resource Bank), normal normal tissue genomic DNA associated with them, and surgical tissues of 11 thyroid cancer patients Genomic DNA fragments of approximately 200 to 300 bp were prepared by sonication of 500 ng of genomic DNA (Vibra Cell, SONICS).

게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA만을 획득하기 위하여, 메틸화 DNA에 결합한다고 알려진 메틸바인딩 도메인 (Methyl binding domain; MBD2b) (Moon et al., American Biotechnology Laboratory, 27(10): 23-25, 2009)을 사용하였다. 즉, 6X His가 tagging된 MBD2bt 2㎍을 게놈 DNA 500ng과 pre-incubation시킨 다음, Ni-NTA 마그네틱 비드 (Qiagen, USA)에 결합시켰다. 여기에 상기 초음파 분쇄된 정상인 및 갑상선암 환자 조직세포에서 분리한 게놈 DNA 500ng을 결합 반응 용액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton-X100, 5% 글리세롤, 25㎎/㎖ BSA)하에서 4℃, 20 분간 반응시킨 후, 700mM NaCl이 포함된 결합 반응 용액 500㎕를 이용하여 3회 세척한 다음, MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 QiaQuick PCR purification kit(QIAGEN, USA)을 사용하여 분리하였다. To obtain only methylated DNA from genomic DNA, a methyl binding domain (MBD2b) (Moon et al ., American Biotechnology Laboratory, 27 (10): 23-25, 2009) known to bind to methylated DNA was used Respectively. Namely, 2 μg of 6 × His-tagged MBD2bt was preincubated with 500 ng of genomic DNA and then bound to Ni-NTA magnetic beads (Qiagen, USA). 500 ng of the genomic DNA isolated from the supernatant-pulverized normal human and thyroid cancer patient tissue cells was suspended in a binding reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 3 mM MgCl ₂ , 0.1% Triton- , 5% glycerol, 25 mg / ml BSA) at 4 ° C for 20 minutes and then washed three times with 500 μl of a binding reaction solution containing 700 mM NaCl. Then, the methylated DNA bound to MBD2bt was subjected to QiaQuick PCR purification kit (QIAGEN, USA).

이후, 상기 MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 Cy5로 표지하였다. 정상인과 갑상선암 환자간의 메틸화 정도를 간접적으로 비교하기 위하여 표준비교 DNA를 제작하였다. 표준비교 DNA는 메틸화 분석을 위해 사용한 12명의 갑상선암 환자의 암과 연접한 정상 조직의 게놈 DNA를 동량으로 혼합하고 이를 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 Cy3로 표지하였다. 상기 표준비교 DNA 및 정상인과 갑상선암 환자의 DNA 각각을 혼합한 후, 244K human CpG 마이크로어레이(Agilent, USA)에 하이브리다이제이션시켰다 (도 1). 상기 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음. Agilent scanner를 이용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 이미지로부터 시그날 값의 계산은 Feature Extraction 프로그램 v. 9.5.3.1(Agilent)을 이용하여 정상인과 갑상선암 환자 시료 간 시그날의 상대적인 강도 차이를 계산하였다. Thereafter, the methylated DNA bound to the MBD2bt was amplified using a genomic amplification kit (Sigma, USA, Cat. No. WGA2), and 4 μg of the amplified genomic DNA was amplified by BioPrim Total Genomic Labeling system I (Invitrogen Corp.). , USA). Standard comparison DNA was prepared to indirectly compare the degree of methylation between normal and thyroid cancer patients. Standard comparison DNAs were prepared by mixing equal amounts of genomic DNA of normal tissue associated with cancer of 12 thyroid cancer patients used for methylation analysis and amplifying DNA using genome amplification kit (Sigma, USA, Cat. No. WGA2) Then, 4 쨉 g of the amplified genomic DNA was labeled with Cy3 using BioPrime Total Genomic Labeling system I (Invitrogen Corp., USA). The standard comparison DNA and the DNA of normal human and thyroid cancer patients were mixed and hybridized to a 244K human CpG microarray (Agilent, USA) (FIG. 1). After the hybridization, after a series of washing steps. And scanned using an Agilent scanner. The calculation of signal values from the microarray image is performed using the Feature Extraction program v. 9.5.3.1 (Agilent) was used to calculate the relative intensity difference between normal and thyroid cancer patient samples.

신뢰할 만한 하이브리다이제이션 시스날을 갖는 프로브들을 선별하기 위하여 GeneSpring 7.3 프로그램 (미국 Agilent 사)을 이용하여 cross gene error model을 적용하여 Cy3 시그날이 총 10개의 array중 최소 8개 array 이상에서 397.0 이상인 64,639개의 프로브들을 신뢰할 만한 시그날을 갖는 프로브들로 선별하였다. 이로부터 갑상선 정상조직에서 비메틸화된 프로브들을 선별하기 위하여 2개의 정상조직 array 전부에서 Cy5 시그날이 1,200 이하인 17,210개 프로브들을 선별하였다. 갑상선암에 특이적으로 과메틸화 되어 있는 프로브들을 선별하기 위하여 상기 17,210개 프로브로부터 총 8개의 갑상선암 조직 array중에서 최소 6개 이상에서 2.0배 이상 과메틸화된 프로브들을 512개 선별하였다. 이중 약 400 bp 이내에 존재하는 2개 이상의 연접한 프로브에서 과메틸화를 동시에 나타내는 5개의 바이오마커 유전자 후보 (BAPX1, PCBP1, POU4F1, SHQ1, TMED1)를 발굴하였다 (도 2). To select probes with reliable hybridization cysts, we applied the cross gene error model using the GeneSpring 7.3 program (Agilent, USA), and found that the Cy3 signal was 64,639 Probes were selected with probes with a reliable signal. From these, 17,210 probes with a Cy5 signal of 1,200 or less were selected in all two normal tissue arrays to select unmethylated probes in the normal thyroid tissue. To select probes that are specifically hypermethylated on thyroid cancer, 512 methylated probes were selected from at least six of the eight thyroid cancer tissue arrays from the above 2,710 probes. Five biomarker gene candidates ( BAPX1 , PCBP1 , POU4F1 , SHQ1 , TMED1 ) were identified that exhibited hypermethylation simultaneously in two or more connected probes within about 400 bp (Figure 2).

상기 방법으로 분석한 바이오마커 후보 유전자들의 유전자들의 각 프로브에 해당하는 부위의 염기서열에 대해서 MethPrimer (http://itsa.ucsf.edu/~urolab/ methprimer/index1.html)을 이용하여 CpG islands가 존재하는 것을 확인하였다.Using the method of MethPrimer ( http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html ), the nucleotide sequences of the regions corresponding to the respective probes of the genes of the biomarker candidate genes analyzed by the above method were compared with the CpG islands .

[표 1] 갑상선암 진단용 메틸화 바이오 마커 후보유전자 목록[Table 1] List of candidate methylation biomarker genes for diagnosis of thyroid cancer

^a, 전사개시부위 (+1)로부터의 염기서열 거리 (bp)
^a, the nucleotide sequence distance (bp) from the transcription start site (+1)

실시예 2: 암 세포주에서의 바이오마커 유전자의 메틸화 측정Example 2: Measurement of the methylation of a biomarker gene in a cancer cell line

실시예 1에서 선별된 바이오마커 후보 유전자의 메틸화 상태를 확인하기 위하여, 갑상선암 세포주를 대상으로 파이로시퀀싱을 수행하였다.In order to confirm the methylation state of the biomarker candidate gene selected in Example 1, pyrosequencing was performed on thyroid cancer cell lines.

바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 충남대병원 이비인후과 연구실로부터 제공받은 갑상선암 세포주 B-CPAP, K1, TPC-1, 8505C, SW-1736 및 HTH74으로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.From the thyroid cancer cell lines B-CPAP, K1, TPC-1, 8505C, SW-1736, and HTH74, which were supplied from the chestnut hospital of Chungnam National University Hospital to transform unmethylated cytosine into uracil using bisulfite, , And 200 ng of genomic DNA was treated with bisulfite using EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA). When DNA is treated with bisulfite, the unmethylated cytosine is transformed into uracil and the methylated cytosine remains unchanged. The bisulfite-treated DNA was eluted with 20 μl of sterilized distilled water to perform pyrosequencing.

상기 5개의 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 2 및 표 3과 같다. The PCR and sequencing primers for the pyrosequencing of the five genes were designed using the PSQ assay design program (Biotage, USA). PCR and sequencing primers for methylation determination of each gene are shown in Tables 2 and 3 below.

[표 2] PCR 프라이머 [Table 2] PCR primers

[표 3] 메틸화 마커 유전자의 시퀀싱 프라이머 서열[Table 3] Sequencing primer sequence of methylation marker gene

바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP(Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 적정 어닐링 온도에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다. 20 ng of genus DNA converted to bisulfite was amplified by PCR. 5 μl of Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 μl of 2.5 mM dNTP (Solgent, Korea), 2 μl of PCR primer 10 pmole / 占 퐇)) was treated at 95 占 폚 for 5 minutes, followed by 45 times at 95 占 폚 for 40 seconds, 45 seconds at a proper annealing temperature and 40 seconds at 72 占 폚, and then reacted at 72 占 폚 for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold Q96 시약 (Qiagen, Germany)을 처리한 후, PyroMark Q96 ID 시스템(Qiagen, Germany)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. The amplified PCR product was treated with PyroGold Q96 reagent (Qiagen, Germany) and pyrosequencing was performed using PyroMark Q96 ID system (Qiagen, Germany). After the pirosequencing, the degree of methylation was measured by calculating the methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG site.

상기 바이오마커 후보 유전자의 갑상선암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 상기 5개의 바이오 마커 후보 유전자중 POU4F1 유전자만이 6개의 세포주 전부에서 높은 수준으로 과메틸화되어 있는 것을 확인하였다. 나머지 4개 유전자는 갑상선암 세포주에서 메틸화가 되어 있지 않은 것으로 확인되어 바이오마커 후보에서 제외시켰다. 이에 다음과 같이, 이를 검증하기 위하여 조직시료를 이용한 메틸화 검증 실험을 추가로 진행하였다.
As shown in FIG. 3, the degree of methylation of the biomarker candidate gene in the thyroid cancer cell line was quantitatively determined using a pyrosequencing method. As a result, only the POU4F1 gene among the five biomarker candidate genes was found in all six cell lines It was confirmed that methylation was high at high level. The remaining four genes were excluded from the biomarker candidates because they were not methylated in the thyroid cancer cell line. In order to verify this, methylation verification experiments using tissue samples were conducted as follows.

실시예 3: 갑상선 조직에서의 바이오마커 후보유전자의 메틸화 측정Example 3: Measurement of methylation of a biomarker candidate gene in thyroid tissue

실시예 2의 POU4F1 바이오마커 후보유전자가 갑상선암 진단용 마커로서의 유용성을 가지려면, 갑상선 정상조직에서는 비메틸화 또는 낮은 메틸화 수준을 나타내어야 하고, 반면에 갑상선암 조직에서는 정상조직에 비하여 높은 메틸화 수준을 나타내어야 한다.For the POU4F1 biomarker candidate gene of Example 2 to be useful as a marker for the diagnosis of thyroid cancer, the thymus normal tissue should show a non-methylated or low methylation level, whereas a thyroid cancer tissue should exhibit a higher methylation level .

따라서, 이를 검증하기 위하여, 1차적으로 바이오마커 발굴실험에 사용하였던 갑상선 정상조직 (n = 11)과 갑상선암 조직 (n = 27)으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다. 게놈 DNA로부터 분리된 POU4F1 정상 서열은 서열번호 16에 나타내었고, 바이설파이트로 전환된 POU4F1 서열은 서열번호 17에 나타내었다.Therefore, in order to verify this, genomic DNA was isolated from normal thyroid tissue (n = 11) and thyroid cancer tissue (n = 27), which were used for biomarker excitation experiments, and EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA), followed by elution with 20 μl of sterilized distilled water for pyrosequencing. The POU4F1 normal sequence isolated from genomic DNA is shown in SEQ ID NO: 16, and the POU4F1 sequence converted to bisulfite is shown in SEQ ID NO:

상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕(10pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다. 20 ng of genomic DNA converted into bisulfite was amplified by PCR. PCR reaction solution (20 ng of biosulfite-converted genomic DNA, 5 占 퐇 of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), 5 占 퐇 of Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 占 퐇 of 2.5 mM dNTP (Solgent, Korea) (10 pmole / μl)) was treated at 95 ° C for 5 minutes, followed by 45 cycles of 95 ° C for 40 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 40 seconds, followed by reaction at 72 ° C for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold Q96 시약(Qiagen, Germany)을 처리한 후, PyroMark Q96 ID 시스템(Qiagen, Germany)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. The amplified PCR product was treated with PyroGold Q96 reagent (Qiagen, Germany) and pyrosequencing was performed using PyroMark Q96 ID system (Qiagen, Germany). After pyrosequencing, the degree of methylation was measured by calculating the methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG site.

그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, POU4F1 유전자는 정상조직에 비하여 갑상선암 조직에서 매우 높은 수준 및 빈도로 과메틸화되어 있는 것을 확인하였다 (P = 0.0003, Mann-Whitney test). 이는 바이오마커 발굴을 위해 실험한 CpG microarray 실험과 일치하는 결과를 나타내 주는 것으로, POU4F1 유전자가 갑상선암 바이오마커로서의 유용성이 있을 가능성을 보여주는 결과이다.
As a result, as shown in FIG. 4A, the POU4F1 gene was hypermethylated at a very high level and frequency in thyroid cancer tissues (P = 0.0003, Mann-Whitney test). This result is consistent with the CpG microarray experiment that was conducted for biomarker discovery, which shows that the POU4F1 gene may be useful as a biomarker for thyroid cancer.

실시예 4: 독립적 갑상선암환자 조직에서의 바이오 마커 유전자의 메틸화 측정Example 4: Measurement of biomarker gene methylation in an independent thyroid cancer patient tissue

POU4F1 유전자의 갑상선암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 보다 심도있게 평가하기 위하여 독립적인 갑상선 조직을 대상으로 메틸화 재검증을 진행하였다. 이를 위하여 59예의 갑상선암 조직 (충남대병원 인체자원은행)과 60예의 암과 연접한 정상조직 (충남대병원 인체자원은행)을 대상으로 실시예 3과 동일한 방법으로 메틸화 검증실험을 진행하였다. To further evaluate the usefulness of the POU4F1 gene as a biomarker for the diagnosis of thyroid cancer, methylation revalidation was performed on independent thyroid tissues. For this purpose, methylation assays were carried out in the same manner as in Example 3, with 59 cases of thyroid cancer tissue (Chungnam National University Hospital Human Resource Bank) and 60 tissues normalized to cancer (Chungnam National University Hospital Human Resource Bank).

독립적인 갑상선 조직시료를 대상으로 POU4F1 유전자의 메틸화 정도를 측정한 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 정상 갑상선 조직에 비하여 갑상선암 조직에서 매우 높은 수준 (P < 0.0001, Mann-Whitney test) 및 빈도로 과메틸화되어 있는 것을 확인하였다.
The degree of methylation of the POU4F1 gene was measured in independent thyroid tissue samples. As shown in FIG. 4B, the level of methylation of POU4F1 gene was significantly higher than that of normal thyroid tissue (P <0.0001, Mann-Whitney test) Methylated.

실시예 5: Example 5: POU4F1POU4F1 바이오마커 유전자의 갑상선암 진단능력 평가 Evaluation of biomarker gene diagnostic ability of thyroid cancer

실시예 3 및 4에서 갑상선암 마커로서의 유용성을 확인한 POU4F1 유전자에 대하여, 추가적으로 갑상선암 진단에 대한 능력을 평가하기 위하여 MedCalc 프로그램 (MEDCALC, 벨기에)을 이용한 ROC 커브 (Receiver Operating Characteristic) 분석을 수행하였다. For the POU4F1 gene which confirmed its usefulness as a thyroid cancer marker in Examples 3 and 4, an ROC curve analysis using the MedCalc program (MEDCALC, Belgium) was performed to further evaluate the ability to diagnose thyroid cancer.

그 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이, POU4F1 유전자는 민감도 및 특이도가 각각 58.1% 그리고 81.7%를 나타내어 갑상선암 진단에 대한 능력이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 4C, the sensitivity and specificity of the POU4F1 gene were 58.1% and 81.7%, respectively, indicating that the ability to diagnose thyroid cancer was excellent.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having thus described the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that this specific description is only a preferred embodiment and that the scope of the present invention is not limited thereby . It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> Genomictree, Inc. <120> Method for Detecting Methylation of Thyroid Cancer Specific Methylation Marker Gene for Thyroid Cancer Diagnosis <130> 034 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAPX1 Primer <400> 1 aggggtttga ttttaagttt 20 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAPX1 Primer <400> 2 actactctct ccaccttaca ttctcc 26 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCBP1 Primer <400> 3 tgaagttttg gtaggtagtt tttgaataa 29 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCBP1 Primer <400> 4 cccacctcct acccttatat 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU4F1 Primer <400> 5 gggtttaggt gttagaggag tgta 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU4F1 Primer <400> 6 tactactacc aaaccctccc tc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHQ1 Primer <400> 7 gttttagagg gagaatgtaa ggt 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHQ1 Primer <400> 8 acccctaaaa aaaaacaatt ccc 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMED1 Primer <400> 9 ggtatttttg gttaaggata atatataga 29 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMED1 Primer <400> 10 atcccaatca ccctctaatc tac 23 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for BAPX1 <400> 11 tttaagtttt aagttaagtt atatt 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for PCBP1 <400> 12 aggagtatat tattgttttt aatg 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for POU4F1 <400> 13 ggggttagag ttgtaggaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for SHQ1 <400> 14 gtaaggtaga gagagtagtg 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for TMED1 <400> 15 atagaagtta ttgttaatga gttt 24 <210> 16 <211> 3000 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Confirmed from thyroid cancer patient <400> 16 gtgtgtgtgt acgctgaggg gaggaaggat cccaactaca ccctgttaac tgttttttcc 60 ttttgattac tagaagcctt agatcacccg gagctcgttt gaaacgtggg tttgtacacg 120 gttgaaggag acaaacaata agagaaatgc acaatttcat ttcaacagct tttcccgagt 180 agaaagcaca cgctccttgt ggctcctaag tggctgtcac tggcggtgcc tgacacagtt 240 atattcacaa caacaacaaa aaagtatgcg gaggaaatta aattatatgg aaatcaatag 300 cgtctgactg cttcaaacaa atgtctgtca ccgcgattat tctccaggaa cctatttata 360 aacctttaaa gaaacaggtt cttgcagcaa aagacagcac cttctgcatt tctgtgttgt 420 tatttatact gtatacagag gaatgcgcgg gcataattta acgtagaaat gtccagctgt 480 atacattata caacagcttg ttaggcatcc cgaagaggag gaatgcctaa gtaatgctca 540 tatattcaag gcttgctatc agggagaaga aacatacaca catacacaca cacgcacgca 600 cacacacaca cacacacaca catagagggg cgtgcgcgca tctcgtcttt tttattctaa 660 aaggtgccca cccttagaca atagctggac cttctgatct ttccagacca cggtgggaaa 720 ggtgaggcgg gcagtgcgca tgcccgggta gctacaggtg catcacctgc gctgtccttg 780 ctggtggtca ctataagagc ggctcccacg cgctggtcgc ggccggacga gcgcgcgcgc 840 gcgcagacgc acggggccgc cgagaaggag agcgcgcgtc agacagacgg agacagctga 900 tgcctgtcag cgcggtgggg ccgcgagctc tcgcgagagc tccccgggac ggccgcgaga 960 agtggggctc aggtgttaga ggagtgcatc ccgtcggcgc gcggggctag agctgtcgga 1020 gaagcgggac cgcgaggccg gcgcgcggcg ctctgcgcgg tcagagggag cgcctggcag 1080 cagcaggagc agcagcagca gcccgcggcg gggccgccgc cagccgccgc gaccgccgcg 1140 gctgcagcct ccgaagggag gccgggtgag ccggcgtacg cactttcccg cggactttcg 1200 gagtgtttgt ggatatacat gccaagccgc cacgatgatg tccatgaaca gcaagcagcc 1260 tcactttgcc atgcatccca ccctccctga gcacaagtac ccgtcgctgc actccagctc 1320 cgaggccatc cggcgggcct gcctgcccac gccgccggta agcgccccac gcccgcggcc 1380 ccggcccgcg cgcccgcccc tccccgtctc cgaaacgctg catgtcgggg gctggtgtgt 1440 gcaggtcccg gtgcggggaa ctgcgggcag ggggtgtaga gcagtcccgc agcgaggcac 1500 gttttgtccg gcggccctta atgtcgtgtt cctgtctgcc tctgcctccg cgtcaggcgc 1560 ctgcgatcgg agtagggagc gctggggcca ggactctcga cttccctcta ctttctctgt 1620 taatttcacg cctcagaaag gcagtctctg tgcgtgctcg ggtgtgtgac acgggtcccc 1680 agctgcgagt tacatttcca tttcttcttt tccctctttt tcgtctccca cgcccgtttc 1740 cggaatgtgt tcttgtgtcc ccctttctcc ctacttctgt ccccctctcc acgctcccat 1800 cccttctcgt ctgccccctc cctggtcgtc aatgtgcccc ctctccgtct ttcccgctct 1860 ccactgcccc caaacccgtt gttattttgg ttgctttgtg tttgcccttc gcatgctgtg 1920 ctttccggcc tgtgtgtgtg tttcttctgt tgttttgttt tgctcttttg gttttgtggt 1980 ttttttggtt tggtttgtgt cgcctgcagc tgcagagcaa cctcttcgcc agcctggacg 2040 agacgctgct ggcgcgggcc gaggcgctgg cggccgtgga catcgccgtg tcccagggca 2100 agagccatcc tttcaagccg gacgccacgt accacacgat gaacagcgtg ccgtgcacgt 2160 ccacttccac ggtgcctctg gcgcaccacc accaccacca ccaccaccac caggcgctcg 2220 aacccggcga tctgctggac cacatctcct cgccgtcgct cgcgctcatg gccggcgcgg 2280 gcggcgcggg cgcggcggcc ggcggcggcg gcgcccacga cggcccgggg ggcggtggcg 2340 gcccgggcgg cggcggcggc ccgggcggcg gccccggggg aggcggcggt ggcggcccgg 2400 ggggcggcgg cggcggcccg ggcggcgggc tcctgggcgg ctccgcgcac cctcacccgc 2460 atatgcacag cctgggccac ctgtcgcacc ccgcggcggc ggccgccatg aacatgccgt 2520 ccgggctgcc gcaccccggg ctggtggcgg cggcggcgca ccacggcgcg gcagcggcag 2580 cggcggcggc ggcggccggg caggtggcag cggcatcggc ggcggcggcc gtggtgggcg 2640 cagcgggcct ggcgtccatc tgcgactcgg acacggaccc gcgcgagctc gaggcgttcg 2700 cggagcgctt caagcagcgg cgcatcaagc tgggcgtgac gcaggccgac gtgggctcgg 2760 cgctggccaa cctcaagatc ccgggcgtgg gctcactcag ccagagcacc atctgcaggt 2820 tcgagtcgct cacgctctcg cacaacaaca tgatcgcgct caagcccatc ctgcaggcgt 2880 ggctcgagga ggccgagggc gcccagcgcg agaaaatgaa caagcctgag ctcttcaacg 2940 gcggcgagaa gaagcgcaag cggacttcca tcgccgcgcc cgagaagcgc tccctcgagg 3000 3000 <210> 17 <211> 3000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG region of modified POU4F1 <400> 17 gtgtgtgtgt aggttgaggg gaggaaggat tttaattata ttttgttaat tgtttttttt 60 ttttgattat tagaagtttt agattattgg gagttggttt gaaaggtggg tttgtatagg 120 gttgaaggag ataaataata agagaaatgt ataattttat tttaatagtt tttttggagt 180 agaaagtata ggttttttgt ggtttttaag tggttgttat tgggggtgtt tgatatagtt 240 atatttataa taataataaa aaagtatggg gaggaaatta aattatatgg aaattaatag 300 ggtttgattg ttttaaataa atgtttgtta tggggattat tttttaggaa tttatttata 360 aatttttaaa gaaataggtt tttgtagtaa aagatagtat tttttgtatt tttgtgttgt 420 tatttatatt gtatatagag gaatgggggg gtataattta aggtagaaat gtttagttgt 480 atatattata taatagtttg ttaggtattt ggaagaggag gaatgtttaa gtaatgttta 540 tatatttaag gtttgttatt agggagaaga aatatatata tatatatata taggtaggta 600 tatatatata tatatatata tatagagggg ggtgggggta tttggttttt tttattttaa 660 aaggtgttta tttttagata atagttggat tttttgattt ttttagatta gggtgggaaa 720 ggtgaggggg gtagtgggta tgttggggta gttataggtg tattatttgg gttgtttttg 780 ttggtggtta ttataagagg ggtttttagg ggttggtggg ggtgggagga gggggggggg 840 gggtagaggt agggggtggt ggagaaggag agggggggtt agatagaggg agatagttga 900 tgtttgttag gggggtgggg tggggagttt tggggagagt ttttggggag ggtggggaga 960 agtggggttt aggtgttaga ggagtgtatt tggtgggggg ggggggttag agttgtggga 1020 gaagggggat ggggaggtgg gggggggggg ttttgggggg ttagagggag ggtttggtag 1080 tagtaggagt agtagtagta gttggggggg gggtggtggt tagtggtggg gatggtgggg 1140 gttgtagttt tggaagggag gtggggtgag tgggggtagg tattttttgg gggattttgg 1200 gagtgtttgt ggatatatat gttaagtggt taggatgatg tttatgaata gtaagtagtt 1260 ttattttgtt atgtatttta ttttttttga gtataagtat tggtggttgt attttagttt 1320 ggaggttatt gggggggttt gtttgtttag gtggtgggta agggttttag gttgggggtt 1380 tgggttgggg ggttggtttt ttttggtttt ggaaaggttg tatgtggggg gttggtgtgt 1440 gtaggtttgg gtggggggaa ttgggggtag ggggtgtaga gtagtttggt agggaggtag 1500 gttttgttgg ggggttttta atgtggtgtt tttgtttgtt tttgttttgg ggttaggggt 1560 ttgggatggg agtagggagg gttggggtta ggattttgga ttttttttta ttttttttgt 1620 taattttagg ttttagaaag gtagtttttg tgggtgttgg ggtgtgtgat aggggttttt 1680 agttgggagt tatattttta tttttttttt tttttttttt tggtttttta ggttggtttt 1740 gggaatgtgt ttttgtgttt tttttttttt ttatttttgt tttttttttt aggtttttat 1800 tttttttggt ttgttttttt tttggtggtt aatgtgtttt tttttggttt ttttggtttt 1860 ttattgtttt taaattggtt gttattttgg ttgttttgtg tttgtttttg gtatgttgtg 1920 tttttgggtt tgtgtgtgtg ttttttttgt tgttttgttt tgtttttttg gttttgtggt 1980 ttttttggtt tggtttgtgt ggtttgtagt tgtagagtaa ttttttggtt agtttggagg 2040 agaggttgtt ggggggggtg gaggggttgg gggtggtgga tatggtggtg ttttagggta 2100 agagttattt ttttaagtgg gaggttaggt attataggat gaatagggtg tggtgtaggt 2160 ttatttttag ggtgtttttg gggtattatt attattatta ttattattat taggggttgg 2220 aattggggga tttgttggat tatatttttt ggtggtggtt ggggtttatg gtgggggggg 2280 gggggggggg ggggggggtg gggggggggg gggtttagga gggttggggg gggggtgggg 2340 gttggggggg gggggggggt tggggggggg gtttgggggg aggggggggt gggggttggg 2400 gggggggggg ggggggttgg gggggggggt ttttgggggg tttggggtat ttttattggt 2460 atatgtatag tttgggttat ttgtggtatt tggggggggg ggtggttatg aatatgtggt 2520 tggggttgtg gtatttgggg ttggtggggg ggggggggta ttaggggggg gtaggggtag 2580 gggggggggg gggggtgggg taggtggtag gggtatgggg ggggggggtg gtggtggggg 2640 tagggggttt ggggtttatt tgggattggg atagggattg gggggagttg gaggggttgg 2700 gggagggttt taagtagggg ggtattaagt tgggggtgag gtaggtggag gtgggttggg 2760 ggttggttaa ttttaagatt tggggggtgg gtttatttag ttagagtatt atttgtaggt 2820 tggagtggtt taggttttgg tataataata tgatggggtt taagtttatt ttgtaggggt 2880 ggttggagga ggtggagggg gtttaggggg agaaaatgaa taagtttgag ttttttaagg 2940 ggggggagaa gaagggtaag gggattttta tggtggggtt ggagaagggt tttttggagg 3000 3000 <110> Genomictree, Inc. <120> Method for Detecting Methylation of Thyroid Cancer Specific Methylation Marker Gene for Thyroid Cancer Diagnosis <130> 034 <160> 17 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAPX1 Primer <400> 1 aggggtttga ttttaagttt 20 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAPX1 Primer <400> 2 actactctct ccaccttaca ttctcc 26 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCBP1 Primer <400> 3 tgaagttttg gtaggtagtt tttgaataa 29 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCBP1 Primer <400> 4 cccacctcct acccttatat 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU4F1 Primer <400> 5 gggtttaggt gttagaggag tgta 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU4F1 Primer <400> 6 tactactacc aaaccctccc tc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHQ1 Primer <400> 7 gttttagagg gagaatgtaa ggt 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHQ1 Primer <400> 8 acccctaaaa aaaaacaatt ccc 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMED1 Primer <400> 9 ggtatttttg gttaaggata atatataga 29 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMED1 Primer <400> 10 atcccaatca ccctctaatc tac 23 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for BAPX1 <400> 11 tttaagtttt aagttaagtt atatt 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for PCBP1 <400> 12 aggagtatat tattgttttt aatg 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for POU4F1 <400> 13 ggggttagag ttgtaggaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for SHQ1 <400> 14 gtaaggtaga gagagtagtg 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer for TMED1 <400> 15 atagaagtta ttgttaatga gttt 24 <210> 16 <211> 3000 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Confirmed from thyroid cancer patient <400> 16 gtgtgtgtgt acgctgaggg gaggaaggat cccaactaca ccctgttaac tgttttttcc 60 ttttgattac tagaagcctt agatcacccg gagctcgttt gaaacgtggg tttgtacacg 120 gttgaaggag acaaacaata agagaaatgc acaatttcat ttcaacagct tttcccgagt 180 agaaagcaca cgctccttgt ggctcctaag tggctgtcac tggcggtgcc tgacacagtt 240 atattcacaa caacaacaaa aaagtatgcg gaggaaatta aattatatgg aaatcaatag 300 cgtctgactg cttcaaacaa atgtctgtca ccgcgattat tctccaggaa cctatttata 360 aacctttaaa gaaacaggtt cttgcagcaa aagacagcac cttctgcatt tctgtgttgt 420 tatttatact gtatacagag gaatgcgcgg gcataattta acgtagaaat gtccagctgt 480 atacattata caacagcttg ttaggcatcc cgaagaggag gaatgcctaa gtaatgctca 540 tatattcaag gcttgctatc agggagaaga aacatacaca catacacaca cacgcacgca 600 cacacacaca cacacacaca catagagggg cgtgcgcgca tctcgtcttt tttattctaa 660 aaggtgccca cccttagaca atagctggac cttctgatct ttccagacca cggtgggaaa 720 ggtgaggcgg gcagtgcgca tgcccgggta gctacaggtg catcacctgc gctgtccttg 780 ctggtggtca ctataagagc ggctcccacg cgctggtcgc ggccggacga gcgcgcgcgc 840 gcgcagacgc acggggccgc cgagaaggag agcgcgcgtc agacagacgg agacagctga 900 tgcctgtcag cgcggtgggg ccgcgagctc tcgcgagagc tccccgggac ggccgcgaga 960 agtggggctc aggtgttaga ggagtgcatc ccgtcggcgc gcggggctag agctgtcgga 1020 gaagcgggac cgcgaggccg gcgcgcggcg ctctgcgcgg tcagagggag cgcctggcag 1080 cagcaggagc agcagcagca gcccgcggcg gggccgccgc cagccgccgc gaccgccgcg 1140 gctgcagcct ccgaagggag gccgggtgag ccggcgtacg cactttcccg cggactttcg 1200 gagtgtttgt ggatatacat gccaagccgc cacgatgatg tccatgaaca gcaagcagcc 1260 tcactttgcc atgcatccca ccctccctga gcacaagtac ccgtcgctgc actccagctc 1320 cgaggccatc cggcgggcct gcctgcccac gccgccggta agcgccccac gcccgcggcc 1380 ccggcccgcg cgcccgcccc tccccgtctc cgaaacgctg catgtcgggg gctggtgtgt 1440 gcaggtcccg gtgcggggaa ctgcgggcag ggggtgtaga gcagtcccgc agcgaggcac 1500 gtttgtccg gcggccctta atgtcgtgtt cctgtctgcc tctgcctccg cgtcaggcgc 1560 ctgcgatcgg agtagggagc gctggggcca ggactctcga cttccctcta ctttctctgt 1620 taatttcacg cctcagaaag gcagtctctg tgcgtgctcg ggtgtgtgac acgggtcccc 1680 agctgcgagt tacatttcca tttcttcttt tccctctttt tcgtctccca cgcccgtttc 1740 cggaatgtgt tcttgtgtcc ccctttctcc ctacttctgt ccccctctcc acgctcccat 1800 cccttctcgt ctgccccctc cctggtcgtc aatgtgcccc ctctccgtct ttcccgctct 1860 ccactgcccc caaacccgtt gttattttgg ttgctttgtg tttgcccttc gcatgctgtg 1920 ctttccggcc tgtgtgtgtg tttcttctgt tgttttgttt tgctcttttg gttttgtggt 1980 ttttttggtt tggtttgtgt cgcctgcagc tgcagagcaa cctcttcgcc agcctggacg 2040 agacgctgct ggcgcgggcc gaggcgctgg cggccgtgga catcgccgtg tcccagggca 2100 agagccatcc tttcaagccg gacgccacgt accacacgat gaacagcgtg ccgtgcacgt 2160 ccacttccac ggtgcctctg gcgcaccacc accaccacca ccaccaccac caggcgctcg 2220 aacccggcga tctgctggac cacatctcct cgccgtcgct cgcgctcatg gccggcgcgg 2280 gcggcgcggg cgcggcggcc ggcggcggcg gcgcccacga cggcccgggg ggcggtggcg 2340 gcccgggcgg cggcggcggc ccgggcggcg gccccggggg aggcggcggt ggcggcccgg 2400 ggggcggcgg cggcggcccg ggcggcgggc tcctgggcgg ctccgcgcac cctcacccgc 2460 atatgcacag cctgggccac ctgtcgcacc ccgcggcggc ggccgccatg aacatgccgt 2520 ccgggctgcc gcaccccggg ctggtggcgg cggcggcgca ccacggcgcg gcagcggcag 2580 cggcggcggc ggcggccggg caggtggcag cggcatcggc ggcggcggcc gtggtgggcg 2640 cagcgggcct ggcgtccatc tgcgactcgg acacggaccc gcgcgagctc gaggcgttcg 2700 cggagcgctt caagcagcgg cgcatcaagc tgggcgtgac gcaggccgac gtgggctcgg 2760 cgctggccaa cctcaagatc ccgggcgtgg gctcactcag ccagagcacc atctgcaggt 2820 tcgagtcgct cacgctctcg cacaacaaca tgatcgcgct caagcccatc ctgcaggcgt 2880 ggctcgagga ggccgagggc gcccagcgcg agaaaatgaa caagcctgag ctcttcaacg 2940 gcggcgagaa gaagcgcaag cggacttcca tcgccgcgcc cgagaagcgc tccctcgagg 3000 3000 <210> 17 <211> 3000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG region of modified POU4F1 <400> 17 gtgtgtgtgt aggttgaggg gaggaaggat tttaattata ttttgttaat tgtttttttt 60 ttttgattat tagaagtttt agattattgg gagttggttt gaaaggtggg tttgtatagg 120 gttgaaggag ataaataata agagaaatgt ataattttat tttaatagtt tttttggagt 180 agaaagtata ggttttttgt ggtttttaag tggttgttat tgggggtgtt tgatatagtt 240 atatttataa taataataaa aaagtatggg gaggaaatta aattatatgg aaattaatag 300 ggtttgattg ttttaaataa atgtttgtta tggggattat tttttaggaa tttatttata 360 aatttttaaa gaaataggtt tttgtagtaa aagatagtat tttttgtatt tttgtgttgt 420 tatttatatt gtatatagag gaatgggggg gtataattta aggtagaaat gtttagttgt 480 atatattata taatagtttg ttaggtattt ggaagaggag gaatgtttaa gtaatgttta 540 tatatttaag gtttgttatt agggagaaga aatatatata tatatatata taggtaggta 600 tatatatata tatatatata tatagagggg ggtgggggta tttggttttt tttattttaa 660 aaggtgttta tttttagata atagttggat tttttgattt ttttagatta gggtgggaaa 720 ggtgaggggg gtagtgggta tgttggggta gttataggtg tattatttgg gttgtttttg 780 ttggtggtta ttataagagg ggtttttagg ggttggtggg ggtgggagga gggggggggg 840 gggtagaggt agggggtggt ggagaaggag agggggggtt agatagaggg agatagttga 900 tgtttgttag gggggtgggg tggggagttt tggggagagt ttttggggag ggtggggaga 960 agtggggttt aggtgttaga ggagtgtatt tggtgggggg ggggggttag agttgtggga 1020 gaagggggat ggggaggtgg gggggggggg ttttgggggg ttagagggag ggtttggtag 1080 tagtaggagt agtagtagta gttggggggg gggtggtggt tagtggtggg gatggtgggg 1140 gttgtagttt tggaagggag gtggggtgag tgggggtagg tattttttgg gggattttgg 1200 ggtgtttgt ggatatatat gttaagtggt taggatgatg tttatgaata gtaagtagtt 1260 ttattttgtt atgtatttta ttttttttga gtataagtat tggtggttgt attttagttt 1320 ggaggttatt gggggggttt gtttgtttag gtggtgggta agggttttag gttgggggtt 1380 tgggttgggg ggttggtttt ttttggtttt ggaaaggttg tatgtggggg gttggtgtgt 1440 gtaggttggg gtggggggaa ttgggggtag ggggtgtaga gtagtttggt agggaggtag 1500 gtttggttgg ggggttttta atgtggtgtt tttgtttgtt tttgttttgg ggttaggggt 1560 ttgggatggg agtagggagg gttggggtta ggattttgga ttttttttta ttttttttgt 1620 taattttagg ttttagaaag gtagtttttg tgggtgttgg ggtgtgtgat aggggttttt 1680 agttgggagt tatattttta tttttttttt tttttttttt tggtttttta ggttggtttt 1740 gggaatgtgt ttttgtgttt tttttttttt ttatttttgt tttttttttt aggtttttat 1800 tttttttggt ttgttttttt tttggtggtt aatgtgtttt tttttggttt ttttggtttt 1860 ttattgtttt taaattggtt gttattttgg ttgttttgtg tttgtttttg gtatgttgtg 1920 tttttgggtt tgtgtgtgtg ttttttttgt tgttttgttt tgtttttttg gttttgtggt 1980 ttttttggtt tggtttgtgt ggtttgtagt tgtagagtaa ttttttggtt agtttggagg 2040 agaggttgtt ggggggggtg gaggggttgg gggtggtgga tatggtggtg ttttagggta 2100 agagttattt ttttaagtgg gaggttaggt attataggat gaatagggtg tggtgtaggt 2160 ttatttttag ggtgtttttg gggtattatt attattatta ttattattat taggggttgg 2220 aattggggga tttgttggat tatatttttt ggtggtggtt ggggtttatg gtgggggggg 2280 gggggggggg ggggggggtg gggggggggg gggtttagga gggttggggg gggggtgggg 2340 gttggggggg gggggggggt tggggggggg gtttgggggg aggggggggt gggggttggg 2400 gggggggggg ggggggttgg gggggggggt ttttgggggg tttggggtat ttttattggt 2460 atatgtatag tttgggttat ttgtggtatt tggggggggg ggtggttatg aatatgtggt 2520 tggggttgtg gtatttgggg ttggtggggg ggggggggta ttaggggggg gtaggggtag 2580 gggggggggg gggggtgggg taggtggtag gggtatgggg ggggggggtg gtggtggggg 2640 tagggggttt ggggtttatt tgggattggg atagggattg gggggagttg gaggggttgg 2700 gggagggttt taagtagggg ggtattaagt tgggggtgag gtaggtggag gtgggttggg 2760 ggttggttaa ttttaagatt tggggggtgg gtttatttag ttagagtatt atttgtaggt 2820 tggagtggtt taggttttgg tataataata tgatggggtt taagtttatt ttgtaggggt 2880 ggttggagga ggtggagggg gtttaggggg agaaaatgaa taagtttgag ttttttaagg 2940 ggggggagaa gaagggtaag gggattttta tggtggggtt ggagaagggt tttttggagg 3000 3000

Claims

Methods for detecting methylation of the CpG island region of the thyroid cancer biomarker gene to provide information necessary for the diagnosis of thyroid cancer, including the following steps:
(a) separating DNA from a clinical sample; And
(b) detecting methylation of CpG island region of POU4F1 (POU class 4 homeobox 1) thyroid cancer biomarker gene in the separated DNA.

The method of claim 1, comprising the steps of:
(a ') isolating genomic DNA from a sample isolated from a normal control and from a clinical sample of the subject;
(b ') treating the separated genomic DNA with a reagent that differentially transforms methylated DNA and unmethylated DNA;
(b ") confirming the methylation status of the CpG island region of the POU4F1 gene in the genomic DNA treated with the reagent or a fragment thereof; And
(b ''') Determination of thyroid cancer when the level of methylation of POU4F1 gene is increased compared with normal control.

3. The method of claim 2, wherein the reagent is bisulfite, hydrogensulfite, disulfite, or a combination thereof.

The method according to claim 1, wherein the CpG island region is located at a 5 'expression control region of the POU4F1 gene.

The method according to claim 1, wherein the CpG island region of the thyroid cancer biomarker gene is represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO:

The method according to claim 1, wherein the methylation is detected through the presence or absence of nucleotide sequence change or the result of amplification with a primer capable of amplifying a fragment containing the CpG island of the POU4F1 gene.

The method according to claim 1, wherein the detection of methylation is performed using PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, methylated DNA specific binding antibody, Wherein the amplification is performed by a method selected from the group consisting of PCR using an extramammary, quantitative PCR, nucleic acid chip, sequencing, sequencing by-synthesis, and sequencing by-ligation.

2. The method of claim 1, wherein the clinical sample is selected from the group consisting of a cell suspected of being a cancer patient or a cell, tissue, biopsy, paraffin tissue, blood, serum, plasma, micro needle aspiration specimen, Lt; / RTI >

POU4F1 Thyroid carcinoma biomarker gene A composition for diagnosing thyroid cancer comprising a substance capable of detecting methylation of a CpG island region.

The method according to claim 9, wherein the substance capable of detecting methylation of the CpG island region is selected from the group consisting of a primer pair capable of amplifying a fragment containing a methylated CpG island region, a probe capable of hybridizing with a methylated CpG island region, Selected from the group consisting of methylation-specific binding proteins, methylation-specific binding antibodies or putamas, methylation sensitive restriction endonucleases, sequencing primers, sequencing by-synthase primers and sequencing by-ligation primers, At least one of which is at least one.

[Claim 11] The composition according to claim 10, wherein the substance capable of detecting methylation of the CpG island region is a primer pair capable of amplifying a fragment containing the methylated CpG island of the POU4F1 gene.

12. The composition of claim 11, further comprising a sequencing primer for sequencing the amplified product by the primer pair.

10. The method according to claim 9, wherein the methylation is confirmed by contacting a genomic DNA treated with a reagent for differentiating methylated DNA and unmethylated DNA with a substance capable of detecting methylation of the CpG island region of the POU4F1 gene &Lt; / RTI >

14. The method according to claim 13, wherein the genomic DNA is selected from the group consisting of a cell suspected to be a cancer suspicious patient or a cell, tissue, biopsy, paraffin tissue, blood, serum, plasma, micro needle aspiration specimen, urine, &Lt; / RTI > and the sample is separated from the sample.

14. The composition of claim 13, wherein the reagent is bisulfite, hydrogensulfite, disulfite or a combination thereof.

The composition according to claim 9, wherein the CpG island region of the thyroid cancer biomarker gene is represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17.

10. The composition of claim 9, wherein the CpG island region is located at a 5 ' expression control region of the POU4F1 gene.

The method according to claim 9, wherein the methylation is selected from the group consisting of PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, methylated DNA- Wherein the nucleic acid sequence is detected by a method selected from the group consisting of PCR using a primer, quantitative PCR, nucleic acid chip, sequencing, sequencing bi-synthesis, and sequencing bi-ligation.

A kit for the diagnosis of thyroid cancer comprising the composition of any one of claims 9 to 18.

A nucleic acid chip for thyroid cancer diagnosis comprising a probe capable of hybridization with a fragment containing a methylated CpG island of a POU4F1 thyroid cancer biomarker gene.