KR101585371B1 - 알지네이트 올리고당을 이용한 경구투여용 항균 약학적 조성물 - Google Patents

알지네이트 올리고당을 이용한 경구투여용 항균 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리소좀-알지네이트 복합체를 포함하는 경구투여용 항균 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트올리고당 복합체를 포함하는 경구투여용 항균 조성물은 인공위액(pH1.2) 및 인공장액(pH6.8)을 순차적으로 처리한 리소좀-알지네이트 복합체는 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였으므로, 장까지 높은 항균활성을 가지는 리소좀을 전달할 수 있어 경구투여용 항균제로 유용하게 활용할 수 있으며, 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 성인병 예방, 중성지질 개선 및 콜레스테롤 생성 억제 등의 효과를 동시에 가질 수 있는 효과가 있다.

Description

알지네이트 올리고당을 이용한 경구투여용 항균 약학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Antimicrobial for Oral Administration Using Alginate Oligosaccharide}
본 발명은 리소좀-알지네이트 복합체를 포함하는 경구투여용 항균 조성물에 관한 것으로, 장까지 높은 항균활성을 가지는 리소좀을 전달하기 위해 리소좀이 위를 통과후 장에서 방출될 수 있도록 pH에 민감한 천연 고분자 물질인 알지네이트(alginate)를 사용하여 비드(bead) 형태로 제조된 리소좀-알지네이트 복합체 및 이를 포함하는 경구투여용 항균 조성물에 관한 것이다.
종래에는 유해미생물들의 활성을 저해시키기 위하여 합성 유기계 항균성제 또는 무기계 항균성제를 사용하여 왔다. 그러나 기존의 합성 유기계 항균성제는 사람의 눈이나 피부, 후각에 자극성이 강하고, 그람 음성균(세포막 존재)에 대하여 약한 항균활성을 나타내는 단점이 있다. 무기계 항균성제는 대체적으로 항균력이 약하며, 특히 곰팡이류에 대해서는 항균성이 거의 없고, 수분과 접촉시에는 항균력이 급감한다는 단점이 있다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 선행연구에서 리조솜(lysosome)이 유해미생물들에 항균활성을 나타내는 것을 확인하고 리조솜을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법(대한민국 등록특허 제0853717)에 대해서 연구를 수행한바 있으며, 리소좀은 주로 동물이나 가축에 주사제로 사용되고 있다.
리소좀은 가수 분해 효소를 많이 함유하고 소화 작용을 하는 세포의 작은 기관으로서 0.25∼0.5㎛로 미토콘드리아보다 작으며 세균 등의 이물(異物)이나 노후한 자신의 세포를 소화하는 역할(自己消化)을 한다. 식세포 작용을 하는 세포질 중에 많이 볼 수 있고 세포내 성분의 대사에 관계하는 것 외에 특히 식세포작용으로 외계 이물질의 세포내 소화에 중요한 역할을 한다.
리소좀은 세포 마쇄액(磨碎液)의 원심분획법에 의하여 미토콘드리아와 미크로좀의 중간으로 분획이 되며 미토콘드리아와 달라서 한 겹의 막구조로 싸여 있으며, 이 내부는 약산성에 최적 pH를 가지는 가수분해효소의 존재가 밝혀져 있다. 예를 들면 산성 탈인산가수분해효소, 리보핵산가수분해효소, 가텝신, β-글루클로리타 아제, 아릴 술퍼타아제 등이 그 대표적인 효소이다. 하지만 이러한 리소좀 내 몇몇 의 효소만 알려져 있을 뿐, 많은 효소들의 기능적 특성을 아직 확인하고 있지 못한 실정이다.
한편, 알지네이트는(alginate)는 천연고분자 물질의 다당류로, 김, 파래, 우뭇가사리 등의 해조류의 표면에 풍부하게 포함되어 있으며, 알지네이트는 가지 사슬이 없는(1-4) 경합의 만뉴로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 그 조성과 함량에서 무작위로 결합하여 이루어진 화합물로, 체내에서 알지네이트는 소화가 되지 않는 것으로 알려져 있다.
또한, 알지네이트는 인체에 무해하며, 특히 소화기관에 대해서 매우 안정한 첨가제로 다양한 생리적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 알지네이트의 생리적 효과는 금속이온과의 반응성에 의한 중금속의 체외배출 작용 및 흡수억제, 혈중 콜레스테롤 저하 작용, 혈당강하 작용, 식이섬유에 의한 정장 작용, 면역증강 작용, 장내 유해 미생물의 증식억제 작용 등이 보고되고 있다. 특히 알지네이트는 화학적으로 2개의 나트륨 이온과 1개의 칼슘, 마그네슘 이온의 양이온 교환에 의하여 가교 결합을 함으로써 수용성 겔 또는 구형을 형성하는 특징이 있어 인체에 유용한 미생물을 쉽게 담지 할 수 있다. 알지네이트는 낮은 pH에서 팽윤 및 분해가 일어나지 않고 중성에서 팽윤 및 분해가 일어남으로써 알지네이트 입자는 위에서는 안정한 상태로 있으며, 소장 및 대장에서 팽윤 되어 함유된 유용한 물질에 대하여 방출을 조절할 수 있다 (대한민국 등록특허 제1234585호; ACARTURK, S.T., F, Journal of microencapsulation, 16(3):275, 1999).
종래의 기술에서 알지네이트 비드(alginate bead)는 이멀젼화, 내부가교법, 스프레이법 등으로 제조하였으나, 상기의 방법들은 알지네이트 비드의 연속적인 생산이 어려우며, 비드의 크기가 균일하지 못한 단점이 있다.
이에, 본 발명에서는 현재 주사제로만 사용하고 있는 리소좀을 경구투여 제제로 제조하여 항균활성을 향상시키기 위해 예의 노력한 결과, 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트 올리고당 복합체를 제조하여 장 내 환경인 중성 pH 이상에서 리소좀이 방출되는 것을 확인하였으며,
별도의 가교제를 첨가하지 않은 라이소자임-알지네이트 혼합액 또는 라이소자임-알지네이트 올리고당 혼합액을 이용하는 경우, pH 1 내지 pH 2 환경인 위에서 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당이 겔화되어 라이소자임-알지네이트 복합체 또는 라이소자임-알지네이트 복합체를 형성하여 라이소자임을 보호하여, 장까지 높은 항균활성을 가지는 라이소자임을 전달할 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 체내 흡수 가능한 알지네이트 올리고당을 사용하여, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 성인병 예방, 중성지질 개선 및 콜레스테롤 생성 억제 등의 효과를 동시에 가질 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 리소좀-알지네이트 복합체 및/또는 리소좀-알지네이트올리고당을 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항균제 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 라이소자임-알지네이트(lysozyme-alginate) 또는 라이소자임-알지네이트 올리고당(lysozyme-alginate oligosaccharide)혼합액을 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항균제 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 리소좀-알지네이트 복합체(lysosome-alginate complex) 또는 리소좀-알지네이트올리고당 복합체(lysosome-alginate oligosaccaride)를 유효성분으로 포함하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 리소좀은 계란 흰자 유래일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트 올리고당 복합체는 (a) 1 내지 3 중량부의 알지네이트 또는 알지네이트올리고당 용액 및 10 내지 30 중량부의 리소좀 용액을 혼합하는 단계; 및 (b) 전기방사(Electro spraying) 장치를 사용하여 상기 혼합액을 염화칼슘(CaCl2) 용액에 처리하여 리소좀-알지네이트 비드를 제조하는 단계; 를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 알지네이트 올리고당은 알지네이트에 분해효소인 알지네이트 라이에이즈(alginate lyase)를 6 내지 24시간 동안 처리하여 제조한 것으로, 20 Da 내지 200 Da 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 전기방사 장치와 염화칼슘 용액 간의 거리는 7 내지 8 ㎝일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 염화칼슘 용액의 pH는 3 내지 6일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리소좀-알지네이트 비드 또는 리소좀-알지네이트 올리고당의 크기는 500 ㎛ 내지 750 ㎛일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트 올리고당 복합체는 pH 1 내지 pH 2 환경인 위에서는 용해되지 않고, pH 6 내지 pH 8 환경인 장 내에서 용해되어 리소좀이 방출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오균(Vibrio), 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유해미생물에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 장염(gastroenteritis) 및 설사병(diarrhea)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질병에 대한 치료효과를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 중성지질 개선 또는 콜레스테롤 생성을 억제시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 라이소자임-알지네이트(lysozyme-alginate) 또는 라이소자임-알지네이트 올리고당(lysozyme-alginate oligosaccharide)혼합액을 포함하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혼합액은 별도의 가교제가 추가로 첨가되지 않은 단순 혼합액으로,
pH 1 내지 pH 2 환경인 위에서 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당이 겔화되어 라이소자임-알지네이트 복합체 또는 라이소자임-알지네이트 복합체를 형성하여 라이소자임을 보호하며,
pH 6 내지 pH 8 환경인 장 내에서 겔화된 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당이 용해되어 라이소자임이 방출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 혼합액 총 중량부에 대하여 라이소자임은 0.1 내지 20 중량부, 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당은 1 내지 3 중량부 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 알지네이트 올리고당은 알지네이트에 분해효소인 알지네이트 라이에이즈(alginate lyase)를 6 내지 24시간 동안 처리하여 제조한 것으로, 20 Da 내지 200 Da 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오균(Vibrio), 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유해미생물에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 장염(gastroenteritis) 및 설사병(diarrhea)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질병에 대한 치료효과를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 중성지질 개선 또는 콜레스테롤 생성을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트올리고당 복합체를 포함하는 경구투여용 항균 조성물은 인공위액(pH1.2) 및 인공장액(pH6.8)을 순차적으로 처리한 리소좀-알지네이트 복합체는 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였으므로, 장까지 높은 항균활성을 가지는 리소좀을 전달할 수 있어 경구투여용 항균제로 유용하게 활용할 수 있으며, 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 성인병 예방, 중성지질 개선 및 콜레스테롤 생성 억제 등의 효과를 동시에 가질 수 있는 효과가 있다.
도 1은 리소좀-알지네이트 복합체의 제조과정에서 사용하는 전기방사 장치의 모식도 및 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 계란 흰자 유래 리소좀의 농도에 따른 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 3은 본 발명의 리소좀-알지네이트 복합체의 리소좀 방출을 확인하기 위해 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 확인한 데이터이다.
도 4는 리소좀-알지네이트 복합체 제조시, 염화칼슘 용액의 pH 조건에 따른 영향을 알아보기 위해 pH 3 및 pH 6의 조건으로 제조된 리소좀-알지네이트 복합체의 표면을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 관찰한 데이터이다.
도 5는 pH 조건을 다르게 하여 제조한 리소좀-알지네이트 복합체의 리소좀 방출 정도를 확인하기 위해 대장균(E. coli)과 240분 동안 반응시킨 후 항균활성을 확인한 데이터이다.
도 6은 라이소자임-알지네이트 혼합액을 인공위액(pH 1.2)에 2시간 동안 반응시킨 다음, 인공장액(pH 6.8)에서 반응시켰을 때를 관찰한 데이터이다.
도 7은 본 발명의 라이소자임-알지네이트 혼합액의 항균활성을 나타낸 것으로, (A) 계란 흰자 유래 라이소자임 처리농도에 따른 항균활성, (B) 인공위액(pH 1.2)에서의 라이소자임-알지네이트 처리농도에 따른 항균활성 및 (C) 인공장액(pH 6.8)에서 라이조자임-알지네이트 처리농도에 따른 항균활성을 확인한 데이터이다.
도 8은 라이소자임-알지네이트 올리고당 혼합액을 인공위액(pH 1.2)에 2시간 동안 반응시킨 다음, 인공장액(pH 6.8)에서 반응시켰을 때를 관찰한 데이터이다.
도 9는 알지네이트에 (A) 알지네이트 분해효소를 6시간 처리하였을 때, (B) 알지네이트 분해효소를 12시간 처리하였을 때 및 (C) 알지네이트 분해효소를 6시간 처리하였을 때, 제조한 알지네이트 올리고당을 이용하여 제조한 라이소자임-알지네이트 올리고당 혼합액의 항균활성을 나타낸 데이터이며, (D)는 알지네이트 분해효소 처리시간에 따른 라이소자임-알지네이트 올리고당 혼합액의 항균활성을 비교한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 선행연구에서 리조솜(lysosome)이 유해미생물들에 항균활성을 나타내는 것을 확인하고 리조솜을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법(대한민국 등록특허 제0853717)에 대해서 연구를 수행한바 있으나, 리소좀은 주로 동물이나 가축에 주사제로 사용되고 있는 실정으로, 본 발명에서는 현재 주사제로만 사용하고 있는 리소좀을 경구투여 제제로 제조하여 항균활성을 향상시키고자 하였다.
본 발명은 리소좀-알지네이트 복합체를 포함하는 경구투여용 항균 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결은 모색하였다. 이를 통해 pH 1 내지 3의 환경인 위에서는 리소좀이 방출되지 않고, pH 4 내지 8의 환경인 장에서 리소좀이 방출되는 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트 올리고당 복합체를 제공할 수 있으며, 상기 리소좀-알지네이트 복합체는 장까지 높은 항균활성을 가지는 리소좀을 전달할 수 있어 경구투여용 항균제로 유용하게 활용할 수 있으며, 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 성인병 예방, 중성지질 개선 및 콜레스테롤 생성 억제 등의 효과를 동시에 가질 수 있는 효과가 있다.
따라서, 본 발명은 리소좀-알지네이트 복합체(lysosome-alginate complex) 또는 리소좀-알지네이트올리고당 복합체(lysosome-alginate oligosaccaride)를 유효성분으로 포함하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물을 포함한다.
상기 리소좀(lysosome)은 달걀, 메추리알, 타조알, 오리알로 구성된 군에서 선택된 가금류 알의 흰자 유래일 수 있으며, 바람직하게 달걀 흰자에서 분리한 것일 수 있다. 또한, 상기 리소좀에 포함되어 있는 라이소자임(lysozyme)을 분리하여 라이소자임-알지네이트 복합체 또는 라이소자임-알지네이트 올리고당 복합체를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트 올리고당 복합체는 (a) 1 내지 3 중량부의 알지네이트 또는 알지네이트올리고당 용액 및 10 내지 30 중량부의 리소좀 용액을 혼합하는 단계; 및 (b) 전기방사(Electro spraying) 장치를 사용하여 상기 혼합액을 염화칼슘(CaCl2) 용액에 처리하여 리소좀-알지네이트 비드를 제조하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.
좀 더 구체적으로 설명하면,
먼저 상기 (a) 단계는 1 내지 3 중량부의 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당 용액 및 10 내지 30 중량부의 리소좀 용액을 혼합하는 단계로, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 비드가 제대로 형성되지 않거나 리소좀의 항균활성이 감소되는 문제가 발생할 수 있다.
리소좀은 공지된 방법으로 달걀 흰자에서 분리할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 달걀 흰자(난백)에서 리소좀이 함유된 세포를 분리한 다음, 원심분리를 이용하여 리소좀을 추출하였다. 상기에서 추출한 리소좀의 항균력을 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 20 내지 30%의 리조솜 농도에서 항균력이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에서는 1 내지 3 중량부의 알지네이트 용액과 10 내지 30 중량부의 리소좀 용액을 혼합하여 사용하였으며, 바람직하게는 2 중량부의 알지네이트 용액과 20 중량부의 리소좀 용액을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 1%, 2% 및 3%의 알지네이트 용액과 10%, 20%, 30%, 40% 및 50 %의 리소좀 용액을 각각 혼합하여 알지네이트 비드를 제조한 다음, 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 측정하였으며, 그 결과 표 1에 나타난 바와 같이 40% 및 50% 리조솜 용액과 1%의 알지네이트 용액을 혼합하여 사용한 경우에는 알지네이트 비드가 형성되지 않은 것을 확인하였으며, 2%의 알지네이트 용액과 20%의 리소좀 용액을 혼합한 경우 가장 높은 항균활성을 보이는 것을 확인하였다.
다음으로, (b) 단계는 전기분사(Electrospray) 장치를 사용하여 상기 혼합액을 염화칼슘(CaCl2) 용액에 처리하여 리소좀-알지네이트 비드를 제조하는 단계이다.
상기 전기분사(Electrospray) 기술은 액체(liquid)를 전기적으로 분산시키는 기술에서 출발하였으며, 1968년 대기압 하에서 고분자(macromolecule)를 기상(gas phase)으로 전환이 가능해 지면서 샘플 용액을 작은 투브로부터 질소(nitrogen)을 흐름 속의 강력한 전기장으로 분사가 가능해졌다. 다양한 생물분자들이 전기분사를 통해 연구되고 있으며 시료는 물/유기용매(메탄올, 이소프로판, 아세토니트릴 등) 혼합액에 용해되어 직접 주사(injection) 된다.
본 발명의 일실시예에서는 주사기 펌프(Syringe pump) 속도를 33.3㎖/min, 전기분사장치(Electro spraying)를 10kV로 설정하여 수행하였으며, 주사기와 염화칼슘 용액과의 거리는 6 내지 8 ㎝, 바람직하게는 7 ㎝로 하여 리소좀-알지네이트 혼합액을 분사하였다.
상기 염화칼슘 용액에 리조솜-알지네이트 혼합액이 분사가 되면 칼슘이온(Ca2+)에 의해 알지네이트가 겔화되어 리소좀이 포함된 알지네이트 비드가 형성된다. 알지네이트를 구성하는 우론산(uronic acid)은 말단에 카복실기를 가지므로 음전하를 띄게 되며, 따라서 마그네슘 이온(Mg2 +), 칼슘 이온(Ca2 +), 스트론튬 이온(Sr2 +) 및 브롬 이온(Br2 +) 등과 같은 2가의 양이온들을 첨가하며 물리적 가격(physical crosslinking)가 형성되므로 알지네이트 수화젤을 만들 수 있다. 특히, 칼슘 이온(Ca2 +)에 의한 가교가 가장 잘 형성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 리소좀-알지네이트 비드의 크기는 20 ㎛ 내지 200 ㎛일 수 있다.
도 3은 상기 방법으로 제조한 리소좀-알지네이트 복합체의 리소좀 방출을 확인하기 위해 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 확인한 데이터로, 본 발명의 일실시예에서 대장균을 배양한 배지에 리소좀-알지네이트 복합체를 처리하고 6시간 동안 리소좀 방출 항균성 실험을 수행하였다. 그 결과, 240분 이후부터 항균력을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 240분 이후 리소좀의 방출이 가장 활발하다는 것을 의미한다고 볼 수 있다. 또한, 20% 내지 30% 리소좀 용액과 2% 알지네이트 용액을 사용하여 제조한 리소좀-알지네이트 복합체의 항균활성이 우수한 것을 확인하였다.
상기 (b) 단계에서 염화칼슘 용액의 pH는 3 내지 6일 수 있으며, 바람직하게는 pH 3 조건의 염화칼슘 용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 리소좀-알지네이트 복합체 제조시, 염화칼슘 용액의 pH 조건에 따른 영향을 알아보기 위해 pH 3 및 pH 6의 조건으로 제조된 리소좀-알지네이트 복합체의 표면을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 pH 3.0 조건에서 알지네이트 비드를 제조하였을 때 비드의 표면이 조금 더 매끄럽게 형성되는 것을 관찰하였으나, 형태학적으로 큰 차이는 발견되지 않았으며, pH 3 내지 6 조건에서 알지네이트 비드의 제조가 가능함을 확인하였다.
또한, 표 2에 나타난 바와 같이 pH 6의 염화칼슘 용액을 이용하여 제조한 리소좀-알지네이트 비드는 44.05%, pH 5에서는 6.14%의 세포 사멸정도를 보이는 것을 확인하였으며, pH 3 및 pH 4에서는 항균활성이 없는 것을 확인하였다.
도 5는 각 pH 별로 제조한 리소좀-알지네이트 비드를 대장균과 240분 동안 반응시켰을 때, 대장균의 상대적인 세포 수를 측정한 것으로, pH 6에서는 대장균이 현저하게 감소한 것을 확인하였다.
즉, 상기 리소좀-알지네이트 복합체는 위와 유사한 환경인 pH 1 내지 3의 낮은 pH에서는 알지네이트 비드가 유지되어 리소좀이 방출되지 않으며, pH가 중성에 가까울수록 비드 안에 포획되어 있는 리소좀이 방출되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 조성물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오균(Vibrio), 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유해미생물에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 장염(gastroenteritis) 및 설사병(diarrhea)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질병에 대한 치료효과를 가질 수 있다.
본 발명에서는 고화제(solidification agent), 염화칼슘(CaCl2), 전기분사(electrospraying) 또는 약 성형 공정(drug-shape process)과 같은 추가적인 공정 필요없이 경구투여용 약물전달 시스템을 이용하기 위해 pH에 민감한 바이오폴리머에 조절되는 라이소자임(pH-sensitive biopolymer-controlled lysozyme)을 개발하고자 하였다. 라이소자임과 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당과 같은 바이오폴리머 혼합(incorporation)은 pH 변화에 의해 바이오폴리머의 물리화학적 특성이 변하게된다. 즉, 강한 산 조건에서는 알지네이트의 고체화를 유도하고 중성 pH 조건에서는 융해(dissolution)되므로, 알지네이트를 이용한 경구투여용 약물 전달 시스템의 활용이 가능하다.
따라서, 본 발명은 라이소자임-알지네이트(lysozyme-alginate) 또는 라이소자임-알지네이트 올리고당(lysozyme-alginate oligosaccharide)혼합액을 포함하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물을 포함한다.
상기 라이소자임 대신 항균활성을 가지 효소 또는 리소좀을 제한 없이 사용할 수 있으며, pH에 민감한 바이오폴리머를 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당 대신 적용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합액은 별도의 가교제가 추가로 첨가되지 않은 단순 혼합액으로,
pH 1 내지 pH 2 환경인 위에서 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당이 겔화되어 라이소자임-알지네이트 복합체 또는 라이소자임-알지네이트 복합체를 형성하여 라이소자임을 보호하며,
pH 6 내지 pH 8 환경인 장 내에서 겔화된 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당이 용해되어 라이소자임이 방출되는 것을 특징으로 한다.
상기 혼합액 총 중량부에 대하여 라이소자임은 0.1 내지 20 중량부, 알지네이트 또는 알지네이트 올리고당은 1 내지 3 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명이 일실시예에서, pH 변화에 따라 바이오폴리머인 알지네이트에 의해 라이소자임이 고정화되는지 확인하기 위해, 인공위액(pH 1.2) 및 인공장액(pH 6.8)에서 라이소자임이 고정화되는지 확인하였다. 상기 라이소자임(lysozyme)은 난백을 정제하여 얻어진 효소제로 리소좀 속에 포함되어 있는 다양한 효소 중에 하나인 것으로 알려져 있다.
도 6에 나타난 바와 같이, 인공위액에서는 수용성이던 알지네이트 비드가 비수용성으로 변화하여 알지네이트 비드가 육안으로 관찰되었으며, 인공장액에서는 알지네이트 비드가 작은 크기로 존재하거나 용액상에 떠있는 것을 관찰하였다. 이는 인공위액에서는 라이소자임 알지네이트에 고정화되어 비드형태의 복합체를 형성하는 것을 의미한다.
도 7은 라이소자임-알지네이트를 인공위액(pH 1.2)에서 2시간 처리한 다음, 인공장액(pH 6.8)에서의 라이소자임 항균력 실험 데이터를 나타낸 것으로, 도 7A는 순수한 라이소자임을 농도별로 처리하였을 때 대장균에 대한 항균력을 확인한 것이며, 도 7B는 순수한 라이소자임을 농도별로 인공위액에 2시간 동안 처리한 다음, 인공장액에서 대장균에 대한 항균활성을 확인한 것이다. 상기 도면에 나타나 바와 같이, 인공위액에서 라이소자임의 항균활성은 현저하게 감소하였으며 4.5㎎/㎖ 라이소자임을 처리한 그룹에서도 최대 80까지 항균력이 감소하는 것을 확인하였다.
반면, 도 7C는 2% 알지네이트 용액과 라이소자임을 농도별로 혼합한 다음, 각각의 혼합액을 인공위액에 2시간 동안 처리한 다음, 인공장액에서 대장균에 대한 항균력을 확인한 것으로, 도 7B와는 달리 라이소자임의 항균력이 도 7A와 비교하였을 때 90% 이상 유지되는 것을 확인하였다.
즉, pH에 민감한 알지네이트와 라이소자임을 단순 혼합하여 실험을 진행한 결과 낮은 pH에서 알지네이트가 라이소자임을 고정화한 뒤 고체화되어 인공위액 환경에서도 라이소자임이 보호되는 것을 확인하였으며, 중성 pH에서 알지네이트 분해에 의해 라이소자임이 방출되며, 90% 이상의 항균활성을 갖는 것을 확인하여, 본 발명의 라이소자임 및 알지네이트가 별도의 가교과정 없이 단순하게 혼합된 혼합액을 사용하여도 경구투여용 항균제의 제조가 가능함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 조성물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오균(Vibrio), 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유해미생물에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 장염(gastroenteritis) 및 설사병(diarrhea)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질병에 대한 치료효과를 가질 수 있다.
상기 알지네이트 올리고당은 알지네이트에 분해효소인 알지네이트 라이에이즈(alginate lyase)를 6 내지 24시간 동안 처리하여 제조한 것으로, 20 Da 내지 200 Da 분자량을 가질 수 있으며, 상기 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 중성지질 개선 또는 콜레스테롤 생성을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 알지네이트에 알지네이트 분해효소인 알지네이트 라이에이즈(alginate lyase)를 처리하여 알지네이트 올리고당을 제조하였으며, 알지네이트 분해효소 처리시간을 각각 6시간, 12시간 및 24시간으로 하여 처리시간에 따른 알지네이트 올리고당의 효과를 비교하였다.
도 8은 도 6의 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행한 것으로, 인공위액에서 알지네이트 올리고당 비드가 형성된 것을 육안으로 관찰하였으며, 인공장액에서는 알지네이트 올리고당 비드가 작은 크기로 존재하거나 용액상에 떠있는 것을 관찰하였다. 이는 알지네이트와 마찬가지로 알지네이트 올리고당 역시 인공위액 조건인 낮은 pH에서 알지네이트 올리고당이 겔화되어 라이소자임이 고정된 비드형태의 복합체를 형성하는 것을 의미한다.
도 9는 라이소자임-알지네이트 올리고당 혼합액을 인공위액(pH 1.2)에서 2시간 처리한 다음, 인공장액(pH 6.8)에서의 라이소자임 항균력 실험 데이터를 나타낸 것으로, 도 9A 내지 도 9C는 각각 알지네이트 분해효소를 6시간, 12시간 및 24시간 처리하여 제조한 알지네이트 올리고당을 이용한 것으로, 4.5㎎/㎖ 라이소자임을 처리한 모든 그룹에서 90% 이상의 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였으며, 특히 도 9D에 나타난 바와 같이, 분해효소를 12시간 처리하여 제조한 알지네이트 올리고당을 라이소자임과 혼합하여 사용한 경우 라이소자임의 항균활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 리소좀-알지네이트 복합체 또는 리소좀-알지네이트올리고당 복합체를 포함하는 경구투여용 항균 조성물은 인공위액(pH 1.2) 및 인공장액(pH 6.8)을 순차적으로 처리한 리소좀-알지네이트 복합체는 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였으므로, 장까지 높은 항균활성을 가지는 리소좀을 전달할 수 있어 경구투여용 항균제로 유용하게 활용할 수 있으며, 리소좀-알지네이트올리고당 복합체의 경우, 장에서 리소좀을 방출하고 남은 알지네이트 올리고당이 체 내로 흡수되어 성인병 예방, 중성지질 개선 및 콜레스테롤 생성 억제 등의 효과를 동시에 가질 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 리소좀-알지네이트 복합체를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항균 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수도 있으나, 별다른 처리 없이 리소좀-알지네이트 복합체 그대로를 사용할 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 리소좀-알지네이트 복합체를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항균 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 리소좀-알지네이트 복합체를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항균 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 리소좀-알지네이트 복합체를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항균 조성물은, 바이러스 또는 유해미생물에 의해 발생하는 가축 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 동물 사료와 함께 혼합하여 제공될 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
달걀 흰자(난백) 유래의 리소좀 분리 및 분리된 리소좀의 항균활성 확인
1-1 : 리소좀 분리
본 발명에서는 달걀의 흰자에서 리소좀을 분리하기 위해 공지된 방법(대한민국 등록특허 제0853717호)를 참고하여 수행하였다.
간략하게 설명하면, 달걀의 흰자(난백)을 분리하여 점성을 제거하고 단백질의 손상을 방지하게 위하여 얼음 용기에 흰자를 넣은 다음 호모게나이져로 9500/min, 1~2분 정도 균질시켰다. 그 후 리소좀이 함우된 세포를 원심분리기로 1,000×g, 4℃에서 10분간 1차 원심분리하여 침전물(pellet)을 제거하고 상등액(supernatant)을 수득한 다음, 리소좀이 포함된 상등액을 원심분리기로 20,000 × g, 4℃에서 30분간 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 펠렛(pellet)을 수득하여 최종적으로 리소좀을 수득하였다.
1-2 : 리소좀의 항균활성 확인
실시예 1-1에서 분리한 달걀 흰자 유래 리소좀의 항균활성을 대장균을 이용하여 측정하였다.
먼저, 대장균인 E. coli K-12(한국미생물보존센터; KCCM 40939)를 LB(Luria-Bertani)-아가(agar) 플레이트에서 하룻밤(overnight) 동안 배앙한 다음, 하나의 콜로니(colony)를 취해 5㎖ LB 배지가 포함된 15㎖ 튜브에 접종하여 대장균의 OD(optical density) 값이 0.8이 될때까지 배양하였다.
그 다음 리소좀 농도 의존적인 CFU(colony forming unit)를 측정하기 위해 상기에서 배양한 대장균이 106 cells/㎖이 되도록 멸균한 증류수에 희석하였다. 상기 희석한 세포 100 ㎕와 100 mM 소듐 포스페이이트 버퍼에 녹인 리소좀 900 ㎕를 혼합한 다음, 100 ㎕을 취해 LB 플레이트에 스프레딩(spreading)한 다음, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 리소좀 농도는 최종적으로 0, 10, 20, 30, 40 및 50%가 되도록 첨가하였으며, CFU를 측정하였다.
다른 방법으로는, 시간에 따른 생육 곡선은 OD600에서 0.08까지 대양한 다음 리소좀의 농도가 최종적으로 0, 10, 20, 30, 40 및 50%가 되도록 첨가한 다음, 5시간 동안 배양하였으며, 1시간 마다 CFU를 측정하였다.
상기 두가지 방법으로 측정한 결과를 하기 수학식 1(Han, S.and Yang, Y., Dyes and Pigments , 64(2):157, 2005)을 이용하여 사망율(mortality)을 도출하였다.
[수학식 1]
C (%) = 100 - (리소좀 처리한 군의 박테리아 수/ 리소좀을 처리하지 않은 대조군의 박테리아 수 X 100)
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 20 내지 30%의 리조솜 농도에서 항균력이 우수한 것을 확인하였다.
리소좀 및 알지네이트 농도에 따른 리소좀- 알지네이트 복합체 제조 및 항균활성 측정
2-1 : 리소좀- 알지네이트 복합체 제조
0.1ｇ의 소듐 알지네이트(Sodium alginate; A0682, Sigma-Aldrich, 미국)를 멸균된 증류수에 완전히 녹여 1%, 2% 및 3% 소듐 알지네이트를 각각 5㎖씩 준비하였으며, 실시예 1-1에서 분리한 리소좀이 각각 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 농도가 되도록하여 상기 1%, 2% 및 3% 소듐 알지네이트 용액에 각각 혼합하였다.
리소좀-알지네이트 비드는 도 1에 나타낸 바와 같이, 전기분사 방법(electrospraying techniques; Halle, J.P. et al ., Cell Transplant ., 3(5):365, 1994)을 사용하여 제조하였다.
구형비드 방울은 소듐 알지네이트와 리소좀의 혼합액을 압출하여 형성하였으며, 30 게이지 바늘 및 50 ㎝ 멸균된 실리콘 튜브(silicone tube; A-06485-14 Cole-Parmer, 미국)를 연결하여 10 ㎖ 일회용 플라스틱 주사기(disposable plastic syringe; FL22174, Ormond Beach, 미국)와 함께 실린지 펌프(syringe pump; 2 channel, 10 ㎕ to 10 ㎖ syringe, Kd Scientific, 미국)를 이용하여 압출하였다.
리소좀 및 소듐 알지네이트 혼합액은 일정한 유량(33.3 ㎕/min)으로 바늘 끝에서 내보내었으며, 방울은 정전기 및 중력의 작용에 의해 생성되었다. 정전기 전위는 고전압 DC 유닛(high voltage DC unit; Model ES30P 10W, HV power supply, Gamma high voltage, 미국)의 음극을 바늘에 연결하여 10 ㎸를 생성하여 형성하였으며, 양극 알루미늄 전극은 2%(w/v) 염화칼슘(calcium chloride; Sigma-Aldrich, 미국) 100 ㎖이 포함된 겔화조(gelling bath)에 접지하였다. 음극 전극/바늘 끝은 염화칼슘 용액 표면으로부터 7 ㎝ 떨어진 곳에 위치하였으며, 알지네이트 비드가 형성된 다음, 완전한 겔화를 위해서 2% 염화칼슘 용액에서 60분 동안 교반하면서 경화(hardening)시켰다.
완성된 알지네이트 비드는 LB 배지를 이용하여 세척한 다음, 실험에 사용하기 전까지 LB 배지가 들어있는 50 ㎝ 원심분리 튜브에 넣어 습도를 유지한 상태에서 4℃에서 보관하였다.
2-2 : 리소좀- 알지네이트 복합체의 항균활성 확인
본 발명에서는 리소좀의 항균활성을 유지하는 최적조건을 확립하게 위해 실시예 2에서 리소좀 및 알지네이트 농도별로 제조한 리소좀-알지네이트 비드 각각에 대한 항균활성을 측정하였다.
항균활성 측정은 실시예1-2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 하기 표 1에 비드의 생성여부 및 항균활성을 나타내었다.
리소좀 및 알지네이트 농도에 따른 비드형성 및 항균활성
Alginate Conc. Lysosome Conc.
10% 20% 30% 40% 50%
A* B** A B A B A B A B
1% ○ + ○ ++ ○ + - - - -
2% ○ ++ ○ +++ ○ ++ ○ + ○ +
3% ○ + ○ + ○ + ○ + ○ +
(*: Bead Formation, **: Antimicrobial Activity)
그 결과, 40% 및 50% 리조솜 용액과 1%의 알지네이트 용액을 혼합하여 사용한 경우에는 알지네이트 비드가 형성되지 않은 것을 확인하였으며, 2%의 알지네이트 용액을 사용한 경우 비드형성 정도 및 리소좀 항균활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히, 2%의 알지네이트 용액과 20%의 리소좀 용액을 혼합한 경우 가장 높은 항균활성을 보이는 것을 확인하였다.
리소좀- 알지네이트 복합체에서 리소좀 방출 확인
본 발명에서는 실시예 2-1에서 제조한 리소좀-알지네이트 복합체에서 리소좀 방출 여부 및 방출시간을 확인하기 위해 실험을 수행하였으며, 2%의 알지네이트에 리소좀을 농도별(10%, 20%, 30%)로 혼합하여 제조한 리소좀-알지네이트 비드를 사용하였다.
항균활성 측정은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 리소좀 대신 리조솜-알지네이트 비드를 첨가하여 1시간 마다 대장균의 생존정도를 측정하였으며 총 5시간 동안 측정하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 0분에서 120분까지는 도면에 나타내지는 않았지만 대장균에 대한 항균활성이 미미한 것으로 관찰되었으며, 240분 이후부터 50% 이상의 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 240분 이후 리소좀의 방출이 가장 활발하다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.
또한, 20% 내지 30% 리소좀 용액과 2% 알지네이트 용액을 사용하여 제조한 리소좀-알지네이트 복합체의 항균활성이 우수한 것을 확인하였다.
상기의 결과를 바탕으로 이후의 항균활성 실험에서는 240분 이후의 대장균 생존율을 측정하였다.
pH 조건 변화에 따른 리소좀- 알지네이트 복합체의 안정성 확인
본 발명에서는 pH 조건 변화에 따른 리소좀-알지네이트 복합체의 안정성을 확인하기 위해 염화칼슘의 pH를 변화하여 리소좀-알지네이트 비드를 제조하였다.
20% 리소좀 및 2% 알지네이트 혼합액을 사용하여 실시예 2-1과 같은 방법으로 리소좀-알지네이트 비드를 제조하였으며, 2%(w/v) 염화칼슘 용액은 염산(HCl)을 이용하여 pH 3 내지 6이 되도록 하였다.
염화칼슘의 pH에 따른 리소좀-알지네이트 비드 형성 효과를 확인하기 위해 알지네이트 비드 표면을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 관찰하였다. 리소좀-알지네이트 비드는 건조하여 고정시켰으며, 건조된 샘플은 감압하에 금으로 코팅한 다음, FE-SEM(S- 4800, Hitachi,일본)을 이용하여 표면 이미지를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 pH 3.0 조건에서 알지네이트 비드를 제조하였을 때 비드의 표면이 조금 더 매끄럽게 형성되는 것을 관찰하였으나, 형태학적으로 큰 차이는 발견되지 않았으며, pH 3 내지 6 조건에서 알지네이트 비드의 제조가 가능함을 확인하였다.
또한, 상기에서 pH 별로 제조된 리조솜-알지네이트 비드의 리소좀 방출정도를 확인하기 위해 실시예 1-2와 동일한 방법으로 항균활성을 측정하였으며, 240분 동안 반응시킨 후, 대장균에 대한 항균활성을 측정하였다.
pH별로 제조된 리소좀-알지네이트 비드의 리조솜 방출 정도 확인
pH Cell Mortality (%)
pH 6 CaCl2 44.05
pH 5 CaCl2 6.14
pH 4 CaCl2 -43.60
pH 3 CaCl2 -287.93
pH 6의 염화칼슘 용액을 이용하여 제조한 리소좀-알지네이트 비드는 44.05%, pH 5에서는 6.14%의 세포 사멸정도를 보이는 것을 확인하였으며, pH 3 및 pH 4에서는 항균활성이 없는 것을 확인하였다.
도 5는 각 pH 별로 제조한 리소좀-알지네이트 비드를 대장균과 240분 동안 반응시켰을 때, 대장균의 상대적인 세포 수를 측정한 것으로, pH 6에서는 대장균이 현저하게 감소한 것을 확인하였다.
즉, 상기 리소좀-알지네이트 복합체는 위와 유사한 환경인 pH 1 내지 3의 낮은 pH에서는 알지네이트 비드가 유지되어 리소좀이 방출되지 않으며, pH가 중성에 가까울수록 비드 안에 포획되어 있는 리소좀이 방출되는 것을 확인하였다.
인공위액( pH 1.2) 및 인공장액 ( pH6 .8)에서 라이소자임 - 알지네이트 항균력 실험
5-1 : 인공위액 및 인공장액에서 라이소자임 - 알지네이트 관찰
본 발명에서는 경구투여용 약물전달 시스템을 이용하기 위해 pH에 민감한 바이오폴리머에 조절되는 라이소자임(pH-sensitive biopolymer-controlled lysozyme)을 개발하고자 하였으며, 리조솜 대신 리조솜에 포함되어 있는 것으로 알려진 라이소자임(Lysozyme from chicken egg white; 62971, Sigma-Aldrich, 미국)과 알지네이트를 단순 혼합한 후, 인공위액에서 2시간 동안 처리한 다음, 인공장액을 처리하였다.
먼저, 인공위액(artificial gastric juice)은 0.4ｇ염화나트륨(NaCl)을 증류수 200 ㎖에 녹인 후 염산(HCl, 약 1.4 ㎖)을 사용하여 pH가 1.2가 되도록 조정하여 준비하였으며, 인공장액(artificial intestinal juice)은 0.2M 제1인산칼륨(KH2PO4; 1.361 ｇ의 KH2PO4을 50 ㎖ 증류수에 녹여 제조) 20 ㎖ 및 0.2 N 수산화나트륨(NaOH; 0.8 ｇ의 NaOH를 100 ㎖ 증류수에 녹여 제조) 11.8 ㎖를 혼합한 다음, 최종 100 ㎖이 되도록 증류수를 첨가하여 제조하였다.
50 ㎎/ℓ 라이소자임과 2% 소듐 알지네이트의 혼합액 1 ㎖을 9 ㎖의 인공위액이 첨가된 15 ㎖ 튜브에 첨가한 다음 실온(room temperature)에서 천천히 기울이면서(tilt rotation) 2시간 동안 배양하였다. 도 6에 나타난 바와 같이 인공위액에서 알지네이트 입자가 형성되는 것을 육안으로 관찰할 수 있으며, 그 다음 형성된 라이조자임-알지네이트 입자를 1,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 인공위액을 완전히 제거한 다음, 5 ㎖의 인공장액을 처리하여 혼합하여 관찰한 결과, 인공장액에서는 알지네이트 비드가 작은 크기로 존재하거나 용액상에 떠있는 것을 관찰하였다. 이는 인공위액에서는 라이소자임 알지네이트에 고정화되어 비드형태의 복합체를 형성하는 것을 의미한다.
5-2 : 항균활성 측정
상기 실시예 5-1에서 인공위액을 처리한 후 인공장액을 처리하였을 때, 라이소자임의 항균활성을 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정하였다.
대조군으로 순수한 라이소자임의 항균활성 및 알지네이트와의 혼합 없이 라이소자임만을 인공위액을 처리한 후 인공장액을 처리하였을 때 항균활성을 측정하였따.
라이소자임의 경우, 0.01, 0.05, 0.5, 1.0, 2.25 및 4.5 ㎎/㎖이 되도록 증류수에 녹여 준비한 다음, 각각의 농도별로 항균활성을 측정하였으며, 라이소자임-알지네이트 혼합액 역시 라이소자임이 상기 농도가 되도록 준비하여 실험을 수행하였다.
도 7A는 순수한 라이소자임을 농도별로 처리하였을 때 대장균에 대한 항균력을 확인한 것이며, 0.01 ㎎/㎖을 제외하고는 모두 90% 이상의 항균활성을 보이는 것을 확인하였다.
도 7B는 순수한 라이소자임을 농도별로 인공위액에 2시간 동안 처리한 다음, 인공장액에서 대장균에 대한 항균력을 확인한 것으로, 최대 80%까지 항균활성이 감소하는 것을 확인하였다.
반면, 도 7C는 라이소자임-알지네이트 혼합액을 인공위액에 2시간 동안 처리한 다음, 인공장액에서 대장균에 대한 항균력을 확인한 것으로, 도 7B와는 달리 라이소자임의 항균활성이 높게 유지되는 것을 확인하였으며, 4.5 ㎎/㎖ 라이소자임의 경우 90% 이상 항균활성이 유지되는 것을 확인하였다.
즉, pH에 민감한 알지네이트와 라이소자임을 단순 혼합하여 실험을 진행한 결과 낮은 pH에서 알지네이트가 라이소자임을 고정화한 뒤 고체화되어 인공위액 환경에서도 라이소자임이 보호되어, 라이소자임의 항균활성이 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
인공위액( pH 1.2) 및 인공장액 ( pH6 .8)에서 라이소자임 - 알지네이트 올리고당 항균력 실험
6-1 : 알지네이트 올리고당 준비
알지네이트 올리고당(alginate oligosaccharide)은 알지네이트에 알지네이트 분해효소를 처리하여 제조하였다.
먼저, 100 ㎖ 병(bottle)에 2%(w/v) 소듐 알지네이트 50 ㎖을 준비한 다음, 0.001%의 알지네이트 라이에이즈(alginate lyase; A1603, Sigma-Aldrich,미국)을 첨가하여 알지네이트 올리고당을 제조하였으며, 올리고당 단위에 따른 고정화 효율을 확인하기 위해 6시간, 12시간 및 24시간 동안 알지네이트 분해효소를 처리하여 알지네이트 올리고당을 제조하였다. 반응이 끝난 후, 상기 100 ㎖ 병을 121℃에서 15분 동안 멸균(오토클레이브; autoclave)한 다음, -4℃에서 보관하였다.
6-2 : 인공위액 및 인공장액에서 라이소자임 - 알지네이트 올리고당 관찰
알지네이트 올리고당이 알지네이트와 동일하게 낮은 pH에서 비드를 형성하여 라이소자임의 항균활성을 보호하는지 확인하기 위해 실시예 5-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
도 8은 도 6의 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행한 것으로, 인공위액에서 알지네이트 올리고당 비드가 형성된 것을 육안으로 관찰하였으며, 인공장액에서는 알지네이트 올리고당 비드가 작은 크기로 존재하거나 용액상에 떠있는 것을 관찰하였다. 이는 알지네이트와 마찬가지로 알지네이트 올리고당 역시 인공위액 조건인 낮은 pH에서 알지네이트 올리고당이 겔화되어 라이소자임이 고정된 비드형태의 복합체를 형성하는 것을 의미한다.
6-3 : 항균활성 측정
올리고당 단위에 따른 고정화 효율을 확인하기 위해 실시예 6-1에서 알지네이트에 분해효소를 6시간, 12시간, 24시간 처리하여 각각 제조한 알지네이트 올리고당을 라이소자임과 혼합하여 항균활성을 측정하였으며, 실시예 5-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 9는 라이소자임-알지네이트 올리고당 혼합액을 인공위액(pH 1.2)에서 2시간 처리한 다음, 인공장액(pH 6.8)에서의 라이소자임 항균력 실험 데이터를 나타낸 것으로, 각각 알지네이트 분해효소를 6시간(도 9A), 12시간(도 9B) 및 24시(도 9C) 처리하여 제조한 알지네이트 올리고당을 이용했을 때, 4.5㎎/㎖ 라이소자임을 처리한 모든 그룹에서 90% 이상의 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였으며, 특히 도 9D에 나타난 바와 같이, 분해효소를 12시간 처리하여 제조한 알지네이트 올리고당을 라이소자임과 혼합하여 사용한 경우 라이소자임의 항균활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 리소좀-알지네이트올리고당 복합체(lysosome-alginate oligosaccaride)를 유효성분으로 포함하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리소좀은 계란 흰자 유래인 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리소좀-알지네이트 올리고당 복합체는
    (a) 1 내지 3 중량부의 알지네이트올리고당 용액 및 10 내지 30 중량부의 리소좀 용액을 혼합하는 단계; 및
    (b) 전기방사(Electro spraying) 장치를 사용하여 상기 혼합액을 염화칼슘(CaCl2) 용액에 처리하여 리소좀-알지네이트 올리고당 비드를 제조하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오균(Vibrio), 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유해미생물에 대한 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 리소좀-알지네이트올리고당 복합체는 pH 1 내지 pH 2 환경인 위에서는 용해되지 않고,
    pH 6 내지 pH 8 환경인 장 내에서 용해되어 리소좀이 방출되는 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  6. 라이소자임-알지네이트 올리고당(lysozyme-alginate oligosaccharide) 혼합액을 포함하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혼합액은 별도의 가교제가 추가로 첨가되지 않은 혼합액으로,
    pH 1 내지 pH 2 환경인 위에서 알지네이트 올리고당이 겔화되어 라이소자임-알지네이트 올리고당 복합체를 형성하여 라이소자임을 보호하며,
    pH 6 내지 pH 8 환경인 장 내에서 겔화된 알지네이트 올리고당이 용해되어 라이소자임이 방출되는 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 혼합액 총 중량부에 대하여 라이소자임은 0.1 내지 20 중량부, 알지네이트 올리고당은 1 내지 3 중량부 포함된 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 알지네이트 올리고당은 알지네이트에 분해효소인 알지네이트 라이에이즈(alginate lyase)를 6 내지 24시간 동안 처리하여 제조한 것으로, 20 Da 내지 200 Da 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오균(Vibrio), 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유해미생물에 대한 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 경구투여를 위한 항균용 약학적 조성물.


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박현중 외 2인, 한국화학공학회 학술대회 발표논문집, 2013 가을(10/23~10/25, 대구 EXCO), 19권 2호, p.1539.*

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