KR101581639B1

KR101581639B1 - 신규한 균주 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101581639B1
Application number: KR1020150098603A
Authority: KR
Inventors: 염익태; 남지현; 장덕진
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2015-12-31

Abstract

본 발명은 신규한 균주 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 퍼클로레이트(perchlorate)를 제거하는, 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 균주, 상기 균주를 배양하는 방법, 상기 균주를 이용하여 퍼클로레이트를 제거하는 방법 및 상기 균주를 이용하여 질산염(nitrate)을 환원하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 아조스피라 속 PMJ (KCTC 12757BP) 균주는 퍼클로레이트 및 질산염을 제거할 수 있으므로, 퍼클로레이트 또는 질산염이 포함된 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수의 정화에 널리 활용될 수 있다.

Description

신규한 균주 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 및 이의 용도{Novel Azospira species PMJ and uses thereof}

본 발명은 신규한 균주 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 퍼클로레이트(perchlorate)를 제거하는, 기탁번호 KCTC 12757BP로 기탁된 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 균주, 상기 균주를 배양하는 방법, 상기 균주를 이용한 퍼클로레이트를 제거하는 방법 및 상기 균주를 이용한 질산염(nitrate)을 환원하는 방법에 관한 것이다.

퍼클로레이트(perchlorate, ClO₄ ^-)는 인체 유해성과 밀접한 관련이 있는 자극성 물질로 호흡기, 피부 등에 자극을 줄 수 있으며, 갑상선 기능장애를 유발할 수 있다. 갑상선은 혈액으로부터 요오드를 능동적으로 취하여 다른 기관들과 함께 대사를 조절하는 기능을 하는데, 퍼클로레이트는 요오드의 운반을 억제하여 갑상선에 의한 호르몬 생산을 방해하고, 장기노출 시에는 빈혈뿐만 아니라 치명적인 뇌손상을 발생시킨다고 알려져 있다.

상기 퍼클로레이트의 주요 배출원은 군수용품, 전기도금, 의약품 제조업 등의 공장으로, 국내의 경우에는 군사적 환경뿐만 아니라 LED 제조공장, 화학공장, 제련소 등에서 배출되고 있으며, 이에 따라 지하수 및 토양에서의 퍼클로레이트 오염이 보고되고 있다.

또한, 퍼클로레이트의 유출에 관한 사고도 심각한 편으로, 1997년 미국 네바다주 헨들슨 지역에 있는 화학공장에서 퍼클로레이트가 유출되어 애리조나, 남부 네바다, 캘리포니아 및 멕시코에서 약 1500-2000만 명의 식수 오염을 일으켰고, 국내의 경우에도 구미공단의 한 전자제품회사에서 세정제로 사용한 퍼클로레이트가 하수 처리되지 못한 채 낙동강으로 방류되어 수원을 오염시키는 사고가 있었다.

한편, 미국 환경보호청은 2009년 1월, 사람의 건강에 영향을 미치지 않는 퍼클로레이트의 일일 섭취량(RfD: refernce dose)은 체중 1kg당 0.007 mg 임을 공표하고, 이에 상응하는 식수의 권고기준을 15 ㎍/L로 정하였으며, 켈리포니아를 포함한 8개 주에서 약 6 ㎍/L의 자체 규제농도를 설정하고 있다.

국내의 경우, 미규제 유해물질인 퍼클로레이트가 낙동강수계 일부 정수장에서 17~19 ㎍/L 수준의 높은 농도로 검출되어 언론에 보도되었으며, 국내 군사시설물 인근지역에서도 검출됨에 따라 국내 학계 및 연구계 등에서도 퍼클로레이트에 대한 관심이 고조되고 있으며, 이에 따라 정부차원의 관리에 대한 필요성이 제기되고 있다. 퍼클로레이트의 배출허용기준은 아직 입법되지 않았으나, 2010년 먹는물 수질검사항목으로 지정됨에 따라 2010년 7월, 환경부와 국립환경과학원은 퍼클로레이트에 대한 먹는물 감시항목 권고기준치를 미국 환경보호청과 동일한 농도인 15 ㎍/L로 정하였으며, 낙동강 수계의 정수 문제가 발생한 경상북도와 대구광역시는 6 ㎍/L의 가이드라인을 설정하고 있다.

한편, 퍼클로레이트는 물에 대한 용해도(200 g/L, 상온)가 매우 높아 이동성이 크므로 지하수를 통해 오염이 빠르게 확산될 수 있으며, 다른 물질과의 반응성이 매우 낮고 화학적으로 안정하기 때문에 기존의 일반적인 처리공정으로는 제거하기 어렵다. 기존의 처리방법(흡착, 응집 등)으로는 쉽게 제거하기가 어려우므로 막분리, 이온교환법, 활성탄 흡착, 화학 및 전기화학적 환원, 전기투석과 같은 고도처리공정에 대한 연구가 진행되고 있으나, 이러한 공정은 적용성과 제거효율은 우수하나, 운전 중 부산물이 발생하여 후처리 공정이 필요하고 처리시설의 운영비용이 높다는 단점을 지니고 있다. 이에 반해, 생물학적 처리 방법은 운영비용이 저렴하고 다량의 폐수를 처리할 수 있으며, 퍼클로레이트를 단계적으로 환원하여 중간생성물 없이 최종적으로 인체에 무해한 염소이온(클로라이드, chloride)으로 분해되므로 친환경적인 처리방법으로 각광받고 있다.

이와 관련하여, 퍼클로레이트 환원 미생물(perchlorate reducing bacteria, PRB)은 퍼클로레이트를 전자수용체, 아세테이트 등을 전자공여체로 이용하여 산화수 +7인 퍼클로레이트(ClO₄ ^-)를 산화수 +5인 클로레이트(chlorate, ClO₃ ^-), 산화수 +3인 클로라이트(chlorite, ClO₂ ^-)로 전환시키며, 최종적으로 산화수 -1인 클로라이드(Cl^-)로 최종 전환시킨다(ClO₄ ^-→ClO₃ ^-→ClO₂ ^-→Cl^-+O₂).

상기 퍼클로레이트의 생물학적 처리 방법은 지하수에 포함된 저농도의 퍼클로레이트(0.01~18 mg/L) 제거를 위한 연구 위주로 이루어졌다. 최근, 비군사 시설의 토양 및 지하수에서 100 mg/L 수준의 고농도 퍼클로레이트가 보고되었지만, 100 mg/L 정도의 고농도 퍼클로레이트가 포함된 실폐수나 지표수, 일상에서 발생하는 폐수처리에 대한 연구결과는 아직 미흡한 실정으로, 고농도 퍼클로레이트의 처리 및 먹는물 감시항목 권고치 이하까지 처리 가능한 신균주 확보에 대한 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 종래의 퍼클로레이트 환원 미생물보다 퍼클로레이트 제거 능력이 우수한 미생물의 탐색을 위하여 연구한 결과, 슬러지에서 분리한 신규한 아조스피라 속 PMJ 균주(Azospira sp. PMJ, KCTC 12757BP)가 100 mg/L 수준의 고농도 퍼클로레이트를 국내의 먹는물 감시항목 권고치 및 경상북도와 대구광역시의 정수 가이드라인 농도인 6 ㎍/L 이하까지 제거함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

특허공개번호 제10-2014-0091997호

본 발명의 하나의 목적은 퍼클로레이트(perchlorate)를 제거하는, 기탁번호 KCTC 12757BP로 기탁된 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 퍼클로레이트를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 질산염(nitrate)을 환원하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 퍼클로레이트(perchlorate)를 제거하는, 기탁번호 KCTC 12757BP로 기탁된 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 균주를 제공한다.

본 발명의 퍼클로레이트(perchlorate)를 제거하는, 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 균주는 이에 제한되지 않지만, 구체적인 예로 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "퍼클로레이트(perchlorate, ClO₄ ^-)"란, 호흡기, 피부 등에 자극을 주는 물질을 의미하고, 퍼클로레이트에 과다 노출되면 갑상선 장애, 빈혈 및 뇌손상을 야기한다고 알려져 있다. 군사용 폭발물과 로켓 추진제에 주로 사용되는 물질이지만 때때로 전자관련 생산공정에서 부산물로 나오는 것으로 보고되고 있으며, 이에 따른 지하수 및 토양의 퍼클로레이트 오염이 보고되고 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 하수처리장 슬러지를 혐기반응조에 식종하고, 혐기성 조건을 유지한 상태로 퍼클로레이트를 주기적으로 주입하면서 연속배양을 실시한 후, 수확한 미생물로 2차 농화배양을 진행하고, 상기 2차 농화배양액을 단계적으로 희석하여 콜로니의 모양이 다른 다섯 균주를 순수분리하였으며, 상기 균주들의 퍼클로레이트 제거 효율을 확인한 결과, PMJ 균주가 퍼클로레이트를 분석한계 이하까지 제거함을 확인하였다(표 1).

또한, 상기 균주는 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 포함된 퍼클로레이트를 제거할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 균주는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자 및 서열번호 2로 기재된 퍼클로레이트 환원효소 유전자를 갖는다.

본 발명의 용어, "16S rRNA"란, 16S 리보솜 RNA(16S ribosomal RNA)라고도 불리며, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA를 의미한다. 상기 16S rRNA의 서열은 동종(同種)간에는 다양성이 거의 없는 반면에, 타종(他種)간에는 다양성이 나타나므로 생물동정에 사용되며, 배양이 불가능하거나 어려운 생물, 또는 보고된 적이 없는 생물의 동정 및 분류에 특히 유용하게 사용된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 16S rRNA 유전자를 증폭시켜 염기서열을 결정한 후 분자 계통학적으로 분석한 결과, 아조스피라 속에 속하는 다른 균주들과 99%의 유사도를 보여 PMJ 균주는 아조스피라 속에 속하는 신규한 균주임을 알 수 있었다(도 1).

본 발명의 용어, "퍼클로레이트 환원효소"란, 퍼클로레이트를 환원시키는 화학반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 구체적인 예로, 상기 효소의 기질은 환원된 전자 수용체인 클로레이트(chlorate), 질산염 또는 퍼클로레이트일 수 있으며, 본 발명의 목적상 퍼클로레이트일 수 있다. 상기 효소는 클로레이트 환원효소와 밀접하게 연관되어 있지만, 클로레이트 환원효소가 오직 클로레이트에만 작용하는 반면에, 퍼클로레이트 환원효소는 클로레이트 또는 퍼클로레이트 모두에 작용할 수 있다는 점에서 차이점이 발생한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 분리균주 PMJ의 퍼클로레이트 환원효소 유전자를 분자 계통학적으로 분석한 결과, 베타-프로테오박테리아(β-proteobacteria)의 디클로로모나스(Dechloromonas) 및 아조스피라 속에 속하는 일부 균주들과 동일한 퍼클로레이트 환원효소를 가지고 있음을 확인하여, 상기 균주는 퍼클로레이트 환원 미생물에 속하는 아조스피라 속 신균주임을 알 수 있었다(도 2). 이에, 상기 균주를 "아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ"로 명명하고, 이를 2015년 2월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12757BP를 부여받았다.

본 발명의 상기 균주는 퍼클로레이트를 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 추가로 질산염을 환원할 수 있다.

본 발명의 용어 "질산염(nitrate, NO₃ ^-)"이란, 산화제 또는 화학 비료로 쓰이는 수용성 화합물을 의미하고, 질산염이 유수나 지하수에 흘러들어가면 부영양화를 초래할 수 있다고 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 50 ㎎/L의 질산염을 1.5일 동안 1.8 ㎎/L까지, 3일 동안 0.5 ㎎/L 이하까지 탈질화할 수 있음을 확인하였다(도 4).

또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 상기 균주를 전자수용체인 퍼클로레이트와 전자공여체인 아세테이트(acetate)가 포함된 배지에서 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "전자수용체"란, 산화환원반응에서 전자(수소)공여체로부터 전자(수소)를 받아들이는 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 전자수용체는 본 발명의 균주가 이용하는 기질일 수 있고, 이에 제한되지 않지만, 구체적인 예로 퍼클로레이트, 클로레이트 또는 질산염일 수 있다.

전자수용체인 상기 퍼클로레이트는, 상기 균주를 배양하는 배지에 50 ㎎/L 내지 700 ㎎/L, 구체적으로 100 ㎎/L 내지 500 ㎎/L의 농도로 포함될 수 있으며, 또 다른 전자수용체인 상기 질산염은, 상기 균주를 배양하는 배지에 25 ㎎/L 내지 100 ㎎/L, 구체적으로 40 ㎎/L 내지 60 ㎎/L의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "전자공여체"는 산화환원반응에서, 전자수용체에 전자(수소)를 부여하는 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 전자공여체는 본 발명의 균주가 이용하는 기질로 전자(수소)를 제공하는 분자를 의미하고, 상기 균주의 기질 이용을 도움으로써 상기 균주의 생장율을 높이는 분자일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 구체적인 예로 아세테이트(acetate), 숙시네이트(succinate) 또는 카사미노산(casamino acid)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 전자수용체로서 100 mg/L의 퍼클로레이트와 전자공여체로서 500 mg/L의 아세테이트가 포함되어, 상기 아세테이트가 퍼클로레이트의 5배 농도로 포함된 배지에서 배양하였을 때, 높은 생장율을 나타내는 것을 확인하였고, 아세테이트는 퍼클로레이트 5배 수준의 농도를 사용하는 경우에 균주의 생장이 유리하다는 것을 확인하였다(표 2).

상기 전자공여체 또는 전자수용체 이외에도, 본 발명의 균주는 온도, pH, 접종량 등의 다양한 조건이 갖추어진 곳에서 배양될 수 있으며, 구체적인 예로 온도는 20 내지 40℃, pH는 6 내지 8에서 배양될 수 있으며, 접종량은 전체 배지 100 중량%에 대하여, 5.0 내지 20 중량% 포함하여 배양될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주의 성장특성을 분석한 결과, 분리균주 PMJ는 전자수용체로서 100 mg/L의 퍼클로레이트와 전자공여체로서 500 mg/L의 아세테이트가 포함되어, 상기 아세테이트가 퍼클로레이트의 5배 농도로 포함된 배지를 사용하여 배양하는 경우에 가장 높은 생장율을 나타낸다는 것을 확인하였고(표 2), 또한 상기 배지 조건에서 30℃가 적정 배양온도임을 확인하였다(표 3). 또한, 상기 균주의 퍼클로레이트 제거 특성을 확인한 결과, 상기 분리균주 PMJ는 아세테이트를 탄소원과 에너지원으로 이용하여 효과적으로 성장할 수 있으며, 약 70~80 mg/L의 퍼클로레이트를 1일 만에 먹는물 감시항목 권고기준치인 15 ㎍/L보다 낮은, 분석한계인 2 ㎍/L 이하로 제거함을 알 수 있었고, 퍼클로레이트 제거율은 전체 양의 99.99% 이상, 제거 속도는 0.72~0.86 mg ClO₄ ^-/L·h로 농도가 높아질수록 제거 속도가 빠르게 진행됨을 알 수 있었다(도 3 및 표 4).

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 균주의 질산염 환원 특성을 확인하기 위하여, 전자수용체로서 퍼클로레이트 대신에 50 mg/L의 질산염 및 전자공여체로서 500 mg/L의 아세테이트가 포함된 배지를 6.5 내지 7.0의 pH로 맞추고, 상기 균주를 전체 중량의 10.0 중량% 접종하여 배양하였다. 그 결과, 상기 균주는 50 ㎎/L의 질산염을 1.5일 동안 1.8 ㎎/L까지, 3일 동안 0.5 ㎎/L 이하까지 탈질화할 수 있음을 확인하였고, 질산염 환원율은 96.60%, 제거 속도는 0.53 ㎎ NO₃ ^--N/L·h임을 확인하였다(도 4 및 표 6).

또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 상기 균주를 이용한 퍼클로레이트를 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명의 퍼클로레이트 제거방법은 제거대상인 퍼클로레이트를 포함하는 시료를 아조스피라 속 PMJ 균주와 반응시켜서, 상기 시료에 포함된 퍼클로레이트를 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어, "시료"란, 퍼클로레이트를 포함하는 오염수를 의미하며, 질산염을 추가로 포함하는 오염수일 수 있고, 구체적인 예로 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수 등일 수 있으나, 퍼클로레이트 또는 질산염이 포함되는 한, 이에 제한되지 않는다.

이때, 상기 반응온도는 구체적으로 20 내지 40℃, 더욱 구체적으로 25 내지 35℃, 더더욱 구체적으로 30℃가 될 수 있고; 상기 반응시간은 구체적으로 1 내지 48시간, 더욱 구체적으로 12 내지 36시간, 더더욱 구체적으로 24시간이 될 수 있다.

또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 상기 균주를 이용한 질산염을 환원하는 방법을 제공한다.

본 발명의 질산염 제거방법은 제거대상인 질산염을 포함하는 시료를 아조스피라 속 PMJ 균주와 반응시켜서, 상기 시료에 포함된 질산염을 제거하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 반응온도는 구체적으로 20 내지 40℃, 더욱 구체적으로 25 내지 35℃, 더더욱 구체적으로 30℃가 될 수 있고; 상기 반응시간은 구체적으로 1 내지 120시간, 더욱 구체적으로 24 내지 84시간, 더더욱 구체적으로 36 내지 60시간이 될 수 있다.

본 발명의 아조스피라 속 PMJ (KCTC 12757BP) 균주는 퍼클로레이트 및 질산염을 제거할 수 있으므로, 퍼클로레이트 또는 질산염이 포함된 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수의 정화에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 아조스피라 속 PMJ 균주와 퍼클로레이트 환원세균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 분자생물학적 계통분류도이다.
도 2는 아조스피라 속 PMJ 균주와 퍼클로레이트 환원세균의 퍼클로레이트 환원효소의 아미노산서열을 이용한 분자생물학적 계통분류도이다.
도 3은 아조스피라 속 PMJ 균주의 퍼클로레이트 제거 및 성장곡선 그래프이다.
도 4는 아조스피라 속 PMJ 균주의 질산염 환원 및 성장곡선 그래프이다.
도 5는 아조스피라 속 PMJ 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열이다.
도 6은 아조스피라 속 PMJ 균주의 퍼클로레이트 환원효소 유전자의 염기서열이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신균주 아조스피라 속( Azospira sp .) 균주의 분리 및 배양

본 발명에 사용된 균주는 경기도 수원시 성균관대학교 하수처리장의 슬러지에서 분리 배양된 아조스피라 속(Azospira sp.)을 사용하였다. 퍼클로레이트 환원 미생물의 농화배양을 위하여 100 ㎎/L의 퍼클로레이트와 500 ㎎/L의 아세테이트가 포함된 최소배지(1.44 g/L Na₂HPO₄·2H₂O, 0.849 g/L KH₂PO₄, 0.1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L ㎎ SO₄·7H₂O, 4 ㎎/L FeSO₄·7H₂O, 0.6 ㎎/L Na₂MoO₄·2H₂O, 0.6 ㎎/L H₃BO₃, 0.6 ㎎/L Na₂SeO₃)를 이용하였다. 1차 농화배양을 위하여 퍼클로레이트와 아세테이트가 함유된 최소배지에 성균관대학교 하수처리장 슬러지를 혐기반응조에 식종하고, 혐기성조건을 유지하기 위하여 질소 가스로 치환하였다. 교반속도와 온도는 각각 150 rpm과 상온을 유지하였으며, 2~3일에 한 번씩 퍼클로레이트를 주기적으로 주입하면서 연속배양을 실시하였다.

퍼클로레이트 환원 미생물만을 선별하기 위하여 혐기반응조에서 1차 농화배양된 미생물을 수확하여 회분배양 방법으로 2차 농화배양을 진행하였다. 이때의 배지조성은 1차 농화배양과 동일하고, 혐기성조건을 위하여 테프론 제제의 마개가 있는 플라스크를 질소 가스로 치환하였으며, 30℃, 120 rpm으로 교반배양 하였다. 2차 농화배양 단계의 회분배양은 2일 주기로 퍼클로레이트를 주입하고, 일주일 주기로 미생물을 수확하고, 염소와 사멸된 미생물 등의 생장 저해물질을 세척하여 퍼클로레이트 환원 미생물의 생장에 유리한 환경을 제공하였다.

퍼클로레이트 환원 미생물을 순수분리하기 위하여 2차 농화배양액을 10,000 배까지 단계 희석하여 동일 배지가 포함된 serum vial에 접종하여 일차 배양하고, 한천배지에 10회 이상 계대하여 콜로니의 모양이 다른 다섯 균주를 순수분리 하였다. 각각 분리된 균주는 122 ㎎/L의 퍼클로레이트와 500 ㎎/L의 아세테이트가 포함된 최소배지에서 각각 4일간 배양하였으며, EPA 331 method와 수질오염공정시험법(ES. 04364.1b)에 의거하여 액체 크로마토그래피 질량 분석계(LC/MS/MS)를 이용하여 퍼클로레이트를 분석하였다. 분석 기기로는 Waters Quattro Premier XE를 사용하였고, 컬럼은 C18 (20 × 50 ㎜, 3 ㎛)을, 이동상 용매는 메탄올(MeOH)과 포름산(Formic acid)을 혼합하여 사용하였다. 분석한계는 2 μ/L (ppb)까지 가능하기 때문에 퍼클로레이트의 농도에 따라 희석하여 분석하였다.

각 분리 균주의 퍼클로레이트 제거효율을 표 1에 나타내었으며, 표 1의 결과에 의거하여 퍼클로레이트를 분석한계 이하까지 제거하는 우수균주 PMJ를 선정하였다.

퍼클로레이트 환원 미생물의 분리 및 제거능력 비교

분리 균주	PMJ	PS2-b	PB-a	PB-b	PB-c
최종 농도 (㎎/L)	N.D	71.6	43.1	95.7	69.9
환원 효율 (%)	99.998	41.311	64.672	21.557	42.705

(N.D: 검출되지 않음 (<0.002 ㎎/L))

실시예 2. 신균주 아조스피라 속 균주의 동정 및 명명

상기 실시예 1에서 퍼클로레이트 분해능력이 우수한 분리균주 PMJ의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자를 증폭(27F-1492R 프라이머 세트; Lane, 1991)시켜 염기서열을 결정한 후 분자 계통학적으로 분석한 결과를 도 1 및 서열번호 1에 나타내었다. 상기 16S rRNA 유전자 염기서열은 ABI 3730XL DNA analyser(Applide biosystem, USA)를 이용하여 분석하였다. 확인된 염기서열의 길이는 약 1414 bp로 16S rRNA 유전자의 일부분을 포함한다. 유전자은행(Genebank) 데이터베이스의 블라스트 검색(BLASTsearch)을 이용하여 균주의 대략적인 분류학적인 위치를 추정하였다. 확인된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과 Ribosomal database project(RDP; http://rdp.cme.msu.edu), Genbank(http://ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터베이스로부터 기존에 보고된 퍼클로레이트 환원 미생물의 염기서열을 확보하고, Mega6 프로그램을 이용하여 Kimura 2-parameter 모델과 neighbor-joining 방법으로 염기서열 간의 진화적 거리와 계통도를 추론하였다. 또한, 부트스트랩(bootstrap) 값은 1,000회의 resampled data로부터 계산하였다. 계통분석 결과 PMJ는 아조스피라 속에 속하는 다른 균주들과 99%의 유사도를 보여 본 속에 속하는 신균주로 추정하였다.

분리균주 PMJ의 퍼클로레이트 환원효소 유전자(perchlorate reductase A gene)를 pcrA-V1과 pcrA-V2 프라이머 세트(Vigliotta et al., 2010)를 이용하여 증폭하였으며 ABI 3730XL DNA analyser(Applide biosystem, USA)를 이용하여 염기서열을 결정한 후, Expasy translate tool을 이용하여 아미노산 서열로 변환하고, open reading frame(ORF)을 확인하였다. 또한, 분리균주 PMJ의 퍼클로레이트 환원효소 ORF와 기존에 보고된 퍼클로레이트 환원 미생물의 퍼클로레이트 환원효소 아미노산 서열을 이용하여 분자 계통학적으로 분석하였고, 상기 결과를 도 2 및 서열번호 2에 나타내었다. 기존에 보고된 퍼클로레이트 환원 미생물의 아미노산 서열을 Genbank의 데이터베이스로부터 확보하고, Mega6 프로그램을 이용하여, Jones-Taylor-Thornton(JTT) 모델과 Maximum Likelihood 방법으로 서열 간의 진화적 거리와 계통도를 추론하였다. 또한, 부트스트랩 값은 1,000회의 resampled 데이터로부터 계산하였다.

계통분석 결과, PMJ는 퍼클로레이트 환원 미생물로 가장 널리 알려진 베타-프로테오박테리아(β-proteobacteria)의 디클로로모나스(Dechloromonas) 및 아조스피라 속에 속하는 일부 균주들과 동일한 퍼클로레이트 환원효소를 가지고 있음을 확인하였다. 상기 결과를 토대로 퍼클로레이트 환원 미생물에 속하는 아조스피라 속 신균주로 추정하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 균주를 "아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ"로 명명하고, 이를 2015년 2월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12757BP를 부여받았다.

실시예 3. 아조스피라 속 PMJ 균주의 성장특성

실시예 3-1. 기질 이용능력

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 아조스피라 속 PMJ 균주의 기질 이용능을 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

퍼클로레이트 환원 신균주 아조스피라 속 PMJ의 기질 이용능

전자 수용체		전자 공여체		생장율 (μ, h ^-1 )
퍼클로레이트	1 mM	아세테이트	1 mM	0.005
			6 mM	0.016
			10 mM	0.021
			15 mM	0.012
		5 mM 부틸산		자라지 않음
		5 mM 숙시네이트		0.030
		1 g/L 카사미노산		0.021
		5 mM 에탄올		0.002
	2 mM	20 mM 아세테이트		0.01
	5 mM	50 mM 아세테이트		매우 느리게 자람
2.5 mM 클로레이트		10 mM 아세테이트		0.033
2.5 mM 질산염		10 mM 아세테이트		0.028

(1 mM 퍼클로레이트: 100 ㎎ ClO₄ ^-/L, 1 mM 아세테이트: 50 ㎎ CH₃COO^-/L, 2.5 mM 질산염: 50 ㎎/L NO₃ ^--N/L)

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, PMJ 균주는 퍼클로레이트 외에 클로레이트(chlorate)와 질산염(nitrate)을 환원할 수 있으며, 아세테이트를 전자공여체로 사용한 회분배양 실험에서 클로레이트>질산염>퍼클로레이트의 순으로 생장하였다.

또한, 전자수용체를 퍼클로레이트로 이용하는 회분배양 시험에서는 전자공여체로 숙시네이트(succinate)을 이용할 경우 가장 빠른 생장을 보였으며, 10 mM의 아세테이트(acetate)와 1 g/L의 카사미노산(casamino acid)의 경우 동일한 생장율을 나타내었다. 카사미노산의 경우 아세테이트보다 긴 지체기(lag phase)를 가지므로, 아세테이트의 사용이 생장에 더 유리하다고 판단하였다. 에탄올의 경우 아주 낮은 생장율을 보였으며, 부틸산(butylate)에서는 전혀 생장하지 못하였다. 또한, 분리균주 PMJ는 1 mM의 퍼클로레이트에서 가장 잘 생장하고, 농도가 높아질수록 생장율이 감소하였다. 특히, 5 mM의 퍼클로레이트에서는 생장이 매우 느렸으며, 매우 긴 지체기(lag phase)를 가지고 있음을 확인하였다. 이는 1 mM에서 지속적으로 배양한 균주를 사용했기 때문으로 생각되며 5 mM의 퍼클로레이트에서 적응시킬 경우 생장율의 계산이 가능할 것으로 추정하였다.

상기 결과를 토대로, 분리균주 PMJ는 100 ㎎/L의 퍼클로레이트와 500 ㎎/L의 아세테이트 농도에서 높은 생장율을 나타내는 것을 확인하였고, 아세테이트는 퍼클로레이트 5배 수준의 농도를 사용하는 경우에 균주의 생장이 유리하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3-2. 배양온도

아조스피라 속 PMJ 균주의 적정 배양온도를 조사하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

퍼클로레이트 환원 신균주 아조스피라 속 PMJ의 적정 배양온도

온도 (℃)	25	30	35
생장율 (μ, h^-1)	0.014	0.021	0.016

상기 표 3에서 보듯이, 분리균주 PMJ는 100 ㎎/L의 퍼클로레이트와 500 ㎎/L의 아세테이트가 포함된 최소배지를 이용할 경우, 적정 배양온도는 30℃임을 알 수 있었다.

실시예 4. 아조스피라 속 PMJ 균주의 퍼클로레이트 제거 특성

실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 아조스피라 속 PMJ 균주의 퍼클로레이트 분해활성을 조사하기 위해서 500 mL 테프론제제의 마개가 있는 삼각플라스크에 100 mg/L(1 mM)의 퍼클로레이트와 500 mg/L의 아세테이트가 포함된 최소배지로 구성된 배지를 pH 6.5~7.0로 맞추고, 다수의 200 mL 배지에 전체 중량의 10.0 중량%로 PMJ 균주를 각각 접종하였다. 질소로 치환된 혐기적 조건, 30℃, 120 rpm으로 교반배양하며, 배양시간에 따른 퍼클로레이트의 제거능을 측정하였다. 일정한 시간 간격으로 시료를 채취하여 분광 광도계를 이용하여 600 nm 파장에서 광학 밀도를 측정하고, 배양액을 0.2 ㎛의 멤브레인 필터로 여과 후 105℃에서 24시간 건조하여 중량(dry cell weight, DCW)을 측정하여 PMJ 균체의 성장 및 바이오매스를 측정하였다. 퍼클로레이트의 분석은 LC/MS/MS를 사용하였다.

그 결과, 본 발명 아조스피라 속 PMJ 균주는 아세테이트를 탄소원과 에너지원으로 이용하여 효과적으로 성장할 수 있으며, 이 과정에서 퍼클로레이트를 분석한계 이하(<2 ㎍/L)로 제거함을 확인하였다. 이에, PMJ 균주의 성장과 퍼클로레이트의 분해에 관한 결과를 도 3에 나타내었다. PMJ 균주는 약 70~80 ㎎/L의 퍼클로레이트를 1일 만에 분석한계 이하(<2 ㎍/L)까지 완전히 분해할 수 있었으며, 퍼클로레이트 제거율은 전체 양의 99.99% 이상, 제거 속도는 0.72~0.86 ㎎ ClO₄ ^-/L·h로 농도가 높아질수록 제거 속도가 빠르게 진행되었고, 상기 결과를 하기 표 4로 정리하였다.

또한, 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 아조스피라 속 PMJ 균주를 회분배양하고, Monod 식을 이용하여 성장 특성(1) 및 퍼클로레이트 분해특성(2)을 확인하였으며, 하기에 표기하였다.

(1) 성장특성

μ는 비증식속도(h^-1), μ_max는 최대 비증식속도(h^-1), S는 기질의 농도(퍼클로레이트, ㎎/L), K_S는 반포화상수(㎎/L)를 나타낸다.

(2) 전자 수용체 mass balance

S는 기질의 농도(퍼클로레이트, ㎎/L), q_max는 최대 비환원속도(㎎ ClO₄ ^-/㎎ DCW·h), K_m는반포화상수(㎎ ClO₄ ^-/L), X는 바이오매스 (DCW, ㎎/L)를 나타낸다.

상기 균주의 성장 특성 및 퍼클로레이트 분해특성의 분석 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 퍼클로레이트 환원 신균주 아조스피라 속 PMJ의 최대 비증식속도는 0.125~0.127 h^-1이었으며, 퍼클로레이트의 최대 비환원속도는 시간과 건조중량당 0.013~0.040 ㎎ ClO₄ ^-/㎎ DCW·h로 나타났다. 또한, 표 4에 기재된 Km 값을 통해 퍼클로레이트에 대한 환원효소의 친화도가 매우 높음을 알 수 있었다.

퍼클로레이트 환원 신균주 아조스피라 속 PMJ의 동력학 계수

동력학 계수			Test Ⅰ	Test Ⅱ
초기 농도(㎎ ClO₄ ^-/L)			82.58	69.1
최종 농도 (㎎ ClO₄ ^-/L)			<0.002	<0.002
환원 효율 (%)			99.998	99.997
환원 속도 (㎎ ClO₄ ^-/L·hr)			0.860	0.720
동력학 (Kinetics)	성장 (Growth)	μ_max (h^-1)	0.127	0.125
	성장 (Growth)	K_s (㎎/L)	-	0.002
	이용 (Utilization)	q_max (㎎ ClO₄ ^-/㎎ DCW·hr)	0.013	0.040
	이용 (Utilization)	K_m (㎎ ClO₄ ^-/L)	3.20E-19	1.26E-18

분리균주 PMJ의 퍼클로레이트에 대한 반응 상수들을 기존에 보고된 퍼클로레이트 환원 미생물 종의 값과 함께 표 5에 나타내었다.

퍼클로레이트 환원 미생물의 성장 및 환원 특성 비교

미생물	최대 비증식 속도, μ_max (h^-1)	최대 비환원 속도, q_max (㎎ ClO₄ ^-/㎎ DCW·day)	반포화상수, K_m (㎎ ClO₄ ^-/L)	문헌
Vibrio dechloratans		1.68	-	Korenkov et al. (1976)
Wolinella succcinogenes		2.57	-	Wallace et al. (1998, 1996)
Azospirillum sp. SN1A	0.069	4.60	2.2	Waller et al . (2004)
Azospirillum sp. ABL1	0.086	5.43	4.8	Waller et al . (2004)
Dechloromonas sp. INS	0.067	4.35	18	Waller et al . (2004)
Dechloromonas sp. RC1	0.085	6.00	12	Waller et al . (2004)
Dechloromonas sp. PC1	-	3.1	0.14	Nerenberg et al . (2006)
Azospira sp. GR-1	0.1	5.65	-	Rikken et al . (1996)
Azospira sp. KJ	0.20	24	33	Logan et al . (2001)
Azospira sp. PDX	0.24	7.5	12	Logan et al . (2001)
Azospira sp. HCAP-C	-	4.4	76.6	Dudley et al . (2008)
Azospira sp. PMJ	0.13	0.96	<0.002	본 발명

상기 표 5에서 보듯이, 퍼클로레이트에 대한 PMJ의 최대 비증식속도는 0.13 h^-1로 퍼클로레이트 환원 미생물의 범주 안에 속하였으며, 최대 비환원속도와 반포화상수는 각각 0.96 ㎎ ClO₄ ^-/㎎ DCW·day와 <0.002 ㎎ ClO₄ ^-/L로 기존에 알려진 분해 균주 중 가장 적은 수치를 나타내었다. 이는, PMJ의 최대 비환원속도의 경우 100 ㎎/L 이하의 퍼클로레이트에서 배양했을 뿐 아니라, 1일 동안 분석한계(2 ㎍/L) 이하까지 퍼클로레이트를 완전히 분해하였기 때문에 다른 미생물보다 낮은 수치를 나타낸 것으로 생각된다. 본발명의 아조스피라속 PMJ 균주는 다른 아조스피라속 균주인 GR-1, KJ, PDX, HCAP-C 균주에 비해 퍼클로레이트 제거 효율이 현저히 우수함을 확인하였다.

또한, 다른 퍼클로레이트 환원 미생물에 비해 낮은 Km 값은 퍼클로레이트에 대한 환원효소의 높은 친화력을 나타낸다는 것을 의미하고, 이는 Nerenberg 등(2006)이 보고한 디클로로모나스 속 PC1(Dechloromonas sp. PC1)과 매우 유사한 특징으로써, 기존에 보고된 퍼클로레이트 환원 미생물보다 저농도의 퍼클로레이트 환경에서도 경쟁적 우위를 차지할 가능성이 매우 높다고 사료된다.

위 결과를 토대로, 본 발명의 신균주 아조스피라 속 PMJ는 음용수, 지표수 뿐만 아니라 정수시설과 산업폐수 등의 퍼클로레이트를 권고기준 이하의 농도로 처리하기에 적합한 분해 미생물임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 아조스피라 속 PMJ 균주의 질산염 환원 특성

실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 아조스피라 속 PMJ 균주의 질산염 환원능을 조사하기 위해서 serum vial에 2.5 mM (50 ㎎/L)의 질산염과 500 ㎎/L의 아세테이트가 포함된 최소배지로 구성된 배지를 pH 6.5~7.0로 맞추었고, 50 mL 배지에 전체 중량의 10.0 중량%로 PMJ 균주를 각각 접종하였다. 질소로 치환된 혐기적 조건에서 30℃, 120 rpm으로 교반배양하며, 질산염의 환원능을 측정하였다. 일정한 시간 간격으로 시료를 채취하여 분광 광도계를 이용하여 600 nm에서 광학 밀도를 측정하였으며, 배양액을 0.2 ㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 105℃에서 24시간 동안 건조한 중량을 측정하여 PMJ 균체의 성장 및 바이오매스를 측정하였다. 질산염 농도의 측정은 0.2 ㎛ 공극의 필터로 여과한 시료를 질소-질산 시약 세트(Cat. 26053-45)와 DR 2500 분광 광도계(HACH Company, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하는 HACH 발색법을 사용하였다.

PMJ 균주의 성장과 질산염 환원에 관한 결과를 도 4에 나타내었다. PMJ 균주는 50 ㎎/L의 질산염을 1.5일 동안 1.8 ㎎/L까지, 3일 동안 0.5 ㎎/L 이하까지 탈질화할 수 있음을 확인하였다. 또한, 질산염 환원율은 96.60%이었으며, 제거 속도는 0.53 ㎎ NO₃ ^--N/L·h로 관찰되었다(표 6).

이어서, 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 PMJ 균주를 전자수용체로 질산염을 이용하여 회분배양하고, 퍼클로레이트와 동일한 Monod 식을 이용하여 성장 특성 및 질산염 환원특성을 확인하였다. 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 질산염에 대한 퍼클로레이트 환원 신균주 아조스피라 속 PMJ의 최대 비증식속도는 0.1 h^-1이었으며, 질산염의 최대 비환원속도는 시간과 건조중량당 0.020 ㎎ NO₃ ^--N/㎎ DCW·h, 질산염에 대한 기질친화도는 8.6~8.8 ㎎/L임을 확인하였다.

질산염 환원 신균주 아조스피라 속 PMJ의 동력학 계수

동력학 계수			수치
초기 농도 (㎎ NO₃ ^--N/L)			53
최종 농도 (㎎ NO₃ ^--N/L)			1.8
환원 효율 (%)			96.604
환원 속도 (㎎ NO₃ ^--N/L·hr)			0.533
동력학 (Kinetics)	성장 (Growth)	μ_max (h^-1)	0.100
		K_S (㎎/L)	8.8
	이용 (Utilization)	q_max (㎎ NO₃ ^--N/㎎ DCW·hr)	0.020
		K_m (㎎ NO₃ ^--N/L)	8.6

상기 결과를 토대로, 본 발명의 신균주 아조스피라 속 PMJ는 각종 하·폐수 처리시설에서 퍼클로레이트와 질산염제거에 유용한 미생물로 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC12757BP

20150212

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Novel Azospira species PMJ and uses thereof <130> KPA150536-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1446 <212> RNA <213> Azospira sp. PMJ <220> <221> rRNA <222> (1)..(1446) <223> 16S rRNA of Azospira sp. PMJ <400> 1 catgcaagtc gaacggcagc acgggagctt gctcctggtg gcgagtggcg aacgggtgag 60 taatacatcg gaacgtaccc aggagtgggg gataacgtag cgaaagttac gctaataccg 120 catattctgt gagcaggaaa gcgggggatc gcaagacctc gcgctcttgg agcggccgat 180 gtcggattag ctagttggtg aggtaaaagc tcaccaaggc gacgatccgt agcaggtctg 240 agaggatgat ctgccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300 tggggaattt tggacaatgg gggcaaccct gatccagcca tgccgcgtga gtgaagaagg 360 ccttcgggtt gtaaagctct ttcggcgggg aagaaatggc aacggctaat atccgttgtt 420 gatgacggta cccgcataag aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480 tagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgcaggcg gtttcgtaag 540 acagacgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcgtt tgtgactgcg aggctagagt 600 acggcagagg ggggtagaat tccacgtgta gcagtgaaat gcgtagagat gtggaggaat 660 accgatggcg aaggcagccc cctgggttag tactgacgct catgcacgaa agcgtgggga 720 gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccctaaac gatgtcaact aggtgttgga 780 agggttaaac cttttagtac cgcagctaac gcgtgaagtt gaccgcctgg ggagtacggc 840 cgcaaggtta aaactcaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggat gatgtggatt 900 aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccta cccttgacat gccaggaact ttccagagat 960 ggattggtgc ccgaaaggga gcctggacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtcattaat tgccatcatt 1080 cagttgggca ctttaatgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140 agtcctcatg gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggtcgg tacagagggt 1200 tgccaagccg cgaggtggag ccaatcccag aaagccgatc gtagtccgga tcgcagtctg 1260 caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgt cgcggtgaat 1320 acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttc taccagaagt 1380 agttagccta accgtaagga gggcgattac cacggagatc gcctgccgaa aaaaaagtgc 1440 acttcc 1446 <210> 2 <211> 632 <212> DNA <213> Azospira sp. PMJ <220> <221> gene <222> (1)..(632) <223> perchlorate reductase A gene of Azospira sp. PMJ <400> 2 ctacatgtat ggtccgcatc gtatcaaata ccctttgatt cgcgttggcg aacgtggcga 60 aggaaagtgg cggcgcgcga cctgggagga ggcgctcgac atgattgccg acaagtgcgt 120 cgataccatc aaaaaccatg caccggattg catcagcgtt ttctcgccgg tgccggcggt 180 atcgcctgtg tcgttttcgg caggccaccg ctttgcccac tacattggcg cccacaccca 240 tactttcttc gactggtacg gtgatcatcc gactggccaa acccagacat gcggtgttca 300 gggcgatact gcggaaacgg ccgactggtt taattccaga tacatcattc tctggggatc 360 gaatcccacc cagacgcgaa ttcccgatgc acacttcctt tccgaggcac aactcaacgg 420 cacgaaaatc gtcagtattg cgccggactt caactcgtcg gcgattaagg tcgacaagtg 480 gattcatccg cagccaggta ccgatggcgc attggccttg gcgatggcgc atgtcatcat 540 caaagaaaag ctttatgacg cacataacct gaaggagcag acggatcttt cctatctggt 600 gcgcagtgat accaagcggt tcttacgtga ag 632

Claims

퍼클로레이트(perchlorate)를 제거하는, 기탁번호 KCTC 12757BP로 기탁된 아조스피라 속(Azospira sp.) PMJ 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 2로 기재된 퍼클로레이트 환원효소 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 추가로 질산염(nitrate)을 환원하는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 유래된 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서,
상기 퍼클로레이트는 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 포함된 것인 균주.
제1항의 균주를 전자수용체인 퍼클로레이트와 전자공여체인 아세테이트(acetate)가 포함된 배지에서 배양하는 방법에 있어서, 상기 방법은 퍼클로레이트를 먹는 물 감시항목 권고기준치인 15 ㎍/L보다 낮은, 2 ㎍/L 이하 수준까지 제거하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 퍼클로레이트는 50 ㎎/L 내지 700 ㎎/L이고, 상기 아세테이트는 퍼클로레이트의 5배 농도인 것인, 방법.
삭제
제7항에 있어서,
상기 퍼클로레이트 대신에 질산염 또는 클로레이트(chlorate)가 포함된 배지에서 배양하는 것인 방법.
제10항에 있어서,
상기 질산염은 25 ㎎/L 내지 100 ㎎/L인 것인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 방법은 질산염을 0.5 ㎎/L 이하 수준까지 제거하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 아세테이트 대신에 숙시네이트(succinate) 또는 카사미노산(casamino acid)이 포함된 배지에서 배양하는 것인 방법.
제7항에 있어서,
상기 균주는 전체 배지 100 중량%에 대하여, 5.0 내지 20 중량% 포함된 것인 방법.
제7항에 있어서,
상기 균주는 20 내지 40℃에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 균주는 pH 6 내지 8에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
퍼클로레이트를 포함하는 시료를 제1항의 균주와 반응시켜서, 상기 시료에 포함된 퍼클로레이트를 제거하는 단계를 포함하는, 퍼클로레이트를 제거하는 방법.
질산염을 포함하는 시료를 제1항의 균주와 반응시켜서, 상기 시료에 포함된 질산염을 제거하는 단계를 포함하는, 질산염을 환원하는 방법.