KR101580051B1

KR101580051B1 - 양친성 고분자

Info

Publication number: KR101580051B1
Application number: KR1020140099708A
Authority: KR
Inventors: 유연규
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2014-08-04
Filing date: 2014-08-04
Publication date: 2015-12-23
Also published as: US9902784B2; US9790287B2; US20180009909A1; US20160060361A1

Abstract

본 발명은 친수성 구조 및 소수성 구조를 다량 포함하고 있어, 소수성 표면을 가진 막 단백질을 수용액 상에서 효율적으로 안정화시킬 수 있는 양친성 고분자에 관한 것이다.

Description

양친성 고분자{Amphiphilic polymer}

본 발명은 양친성 고분자에 관한 것이다.

생체의 단백질 중 세포막에 존재하는 막 단백질은 전체 유전체의 30% 이상을 차지하고 있다. 특히 G-protein coupled receptor(GPCR)와 같은 수용체 또는 이온 채널 단백질들은 생체의 신호 전달 과정을 담당하며 암, 신경계 질환, 면역계 질환, 염증 질환 등 다양한 질환과 연관성이 있을 뿐만 아니라, 현재 개발되고 있는 약물 표적의 60% 이상을 차지하여 질병의 진단 및 신약개발에 중요한 위치를 차지한다. 이러한 막 단백질들의 기능은 리간드와 같은 다른 분자와의 상호작용에 의하여 유발된다. 따라서 막 단백질의 리간드 등과의 상호 작용을 분석하기 위하여 정제된 활성 구조의 막 단백질을 준비하는 기술과 막 단백질을 지지체에 고정화하는 기술은 막 단백질과 리간드의 결합 특이성을 분석하는 핵심 기술이 되며 이러한 기술은 약학, 생명공학 분야에의 응용에 필수적이다.

단백질의 안정화 및 고정화를 위한 많은 기술들이 개발되어 있지만 막 단백질의 구조적 특성 때문에 막 단백질의 정제는 물론 안정화와 고정화 기술이 매우 제한적이다. 수용성 단백질의 경우 단백질 표면에 주로 친수성 아미노산 잔기로 노출되고 이들이 물 분자와 상호 작용을 하여 쉽게 안정화될 수 있다. 반면에 막 단백질은 표면이 소수성 잔기로 구성된 소수성 표면이 많아서 이중 지질막에 존재할 때 지질의 소수성 부위에 인접하게 위치하여 안정한 구조를 이룬다. 그러나 지질이 제거된 수용액 상태에서는 막 단백질의 소수성 표면은 물 분자와 상호작용 하기보다는 소수성 표면끼리 서로 무작위적으로 결합하여 활성을 갖지 못하는 불용성의 침전물을 이룬다. 따라서 막 단백질의 기능 연구를 위한 정제 과정은 수용성이면서 막 단백질의 소수성 표면을 안정화할 수 있는 계면활성제를 필요로 한다.

적절한 계면 활성제는 막 단백질의 활성 구조를 유지하면서 막 단백질의 소수성 표면과 결합하여 막 단백질이 수용액 상태에서도 무작위로 뭉치지 않고 활성 구조를 유지하도록 한다. 그러나 시판되는 많은 종류의 계면활성제 중에 특정 막 단백질이 수용액 조건에서 활성을 갖도록 하는 계면활성제는 소수이며, 이러한 계면활성제를 확인하는 복잡한 과정이 필요하다. 예를 들어 GPCR과 같은 수용체 단백질들을 수용액에서 활성 구조를 유지하도록 하는 활성을 갖는 계면활성제는 그리 많지 않으며 b-octylglucoside (OG)과 dodecylmaltoside (DDM)가 막 단백질을 수용액 환경에서 안정화하는데 효과가 큰 것으로 알려지고 있지만 (Journal of Biological Chemistry, 2001, vol 276, pp 32403-32406. Protein Expression and Purification 2012, vol. 86 pp 12-20), 이러한 계면활성제들은 모든 막 단백질에 범용적으로 적용할 수 없으며 높은 비용이 소요되는 단점이 있다.

계면활성제 이외에 막 단백질을 수용액에서 안정화 시키는 방법으로 지질과 계면활성제 또는 지질과 지질안정화 단백질을 이용하여 각각 바이셀 (bicelle) (Analytical Biochemistry, 2000, vol. pp284, 327-333)과 나노디스크 (nanodisc) (Nano Letter 2002, vol 2, pp 853-856)를 형성하는 방법이 활용되고 있다. 이들 방법들은 막 단백질을 이중 지질막과 유사한 환경의 수 나노미터 크기의 구조체를 형성하는 특징을 가지고 있어 막 단백질들을 지질막 환경에서 수용액 상태로 유지하는 장점을 갖는다. 그러나 이러한 방법은 제조 과정이 복잡하고 고비용이 소요되는 단점을 갖는다.

고분자를 이용하여 막 단백질을 안정화 시키는 방법도 알려지고 있다. 앰피폴(amphipol)이라는 고분자는 폴리아크릴산에 알킬기를 도입하여 소수성 부위와 친수성 부위를 동시에 한 폴리머 분자 내에 동시에 갖는 특성이 있는 고분자로서 막 단백질 안정화 효과가 높은 것이 보고되고 있다 (Biochemistry, 2006, vol.45, pp 13954-13961). 그러나 이러한 고분자는 생산 효율이 낮고 막 단백질의 지질막 재조립 활성은 아직 보고되지 않고 있다. 또한 앰피폴의 합성 수율이 높지 않아 제조 비용이 많이 소요되는 단점이 있고 앰피폴의 막 단백질의 지질막 재조립 기능은 아직 보고되지 않고 있다. 또한 앰피폴은 형광물질, biotin 등 단백질의 특성 분석이나 고정화 과정에 이용될 수 있는 있는 작용기를 특정 위치에 도입하는 과정이 복잡하고 고분자의 특정 위치에 도입하기가 어렵다는 단점이 있다.

따라서 생체에서 중요한 기능을 하며 신약 개발의 표적 단백질들인 수용체 및 이온 채널과 같은 막 단백질들에게 범용적으로 적용할 수 있는 수용액 안정화 기술이 필요하며 본 발명에서는 생체 친화성 폴리글루탐산에 고정화를 위한 작용기, 소수성 작용기, 그리고 친수성 작용기를 동시에 도입함으로서 친수성과 소수성 부위를 동시에 갖는 양친성 고분자이면서 고정화를 위한 작용기를 동시에 포함하는 고분자의 제조 방법을 개발하고 이러한 고분자를 이용하여 수용액 환경에서의 막 단백질 안정화 기술, 막 단백질의 고정화 기술 그리고 막 단백질의 지질막 재조립 기술을 개발하고자 한다.

Biochemistry, 2006, vol.45, pp 13954-13961

본 발명은 수용액 상의 막 단백질의 안정화를 위해 사용될 수 있는 양친성 고분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 양친성 고분자의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 양친성 고분자를 이용한 막 단백질의 안정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 양친성 고분자를 이용한, 막 단백질 고정 기판을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 하기 화학식 1로 표시되는 양친성 고분자:

[화학식 1]

(식 중, R1은 형광염료, 비오틴기 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르보닐기이고;

R2, R3, R4 및 R5는 서로 독립적으로 히드록시기, 또는 친수성 또는 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며,

R3는 서로 동일하거나 상이한 구조로서, 반복되는 R3 중 1개 이상은 친수성 아민으로부터 유래하는 구조이고, 1개 이상은 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며;

n은 1 내지 1,000의 정수임).

2. 위 1에 있어서, 상기 형광 염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 양친성 고분자.

3. 위 1에 있어서, 상기 친수성 아민은 히드록시기 또는 아미노기로 치환된, 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자.

4. 위 1에 있어서, 상기 소수성 아민은 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자.

5. 위 1에 있어서, 친수성 아민 유래 구조와 소수성 아민 유래 구조의 몰비는 1:9 내지 9:1인, 양친성 고분자.

6. 위 1에 있어서, 중량평균분자량이 5,000 내지 50,000인, 양친성 고분자.

7. 폴리감마글루탐산을 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르복시산과 DCC(dicyclo-hexylcarbodiimide)와의 반응 생성물과 반응시키는 단계; 및

상기 반응을 거친 폴리감마글루탐산을 DCC와 반응시킨 후, 친수성 아민 및 소수성 아민과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 양친성 고분자의 제조 방법:

[화학식 1]

n은 1 내지 1,000의 정수임).

8. 7에 있어서, 상기 형광 염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 양친성 고분자의 제조 방법.

9. 위 7에 있어서, 상기 친수성 아민은 히드록시기 또는 아미노기로 치환된, 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자의 제조 방법.

10. 위 7에 있어서, 상기 소수성 아민은 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자의 제조 방법.

11. 수용액 내의 막 단백질을 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 양친성 고분자와 결합시켜 막 단백질-양친성 고분자 복합체를 형성하는, 막 단백질의 안정화 방법.

12. 위 11에 있어서, 상기 양친성 고분자의 소수성 아민 유래 구조가 막 단백질의 소수성 표면과 소수성 상호작용하고, 친수성 아민 유래 구조가 막 단백질의 수용액에 대한 용해도를 증가시키는, 막 단백질의 안정화 방법.

13. 기재 상에 부착된 아비딘 또는 스트렙타아비딘 및 이에 결합된 막 단백질-하기 화학식 2로 표시되는 양친성 고분자 복합체를 포함하는, 막 단백질 고정 기판:

[화학식 1]

(식 중, R1은 비오틴기이고;

n은 1 내지 1,000의 정수임).

14. 변성된 막 단백질에 위 1 내지 6 중 어느 한 항의 양친성 고분자를 가하는, 막 단백질의 구조 복원 방법.

15. 14에 있어서, 상기 변성은 막 단백질에 계면활성제를 가하여 유발된 것인, 막 단백질의 구조 복원 방법.

본 발명의 양친성 고분자는 친수성 구조 및 소수성 구조를 다량 포함하고 있어, 소수성 표면을 가진 막 단백질을 수용액 상에서 효율적으로 안정화시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 양친성 고분자가 N-말단에 아미노기에 결합된 형광염료를 포함하는 경우, 막 단백질의 형광 표지에 사용될 수 있으며, 비오틴기를 포함하는 경우, 막 단백질의 고정에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 폴리감마글루탐산으로부터 본 발명의 일 구현예에 따른 양친성 고분자를 합성하는 모식도이다.
도 2는 양친성 고분자에 의한 막 단백질의 안정화 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1-1의 양친성 고분자, SDS 및 β-D-octylglucoside의 CMC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ETA를 계면활성제인 sarkosyl(검은선), DDM(푸른선), 그리고 실시예 1-1의 양친성 고분자(붉은선)를 사용하여 정제하였을 때, size exclusion chromatography를 이용하여 크기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Bacteriorhodopsin(BR)이 약한 계면활성제인 β-D-옥틸 글루코시드에 의해 안정화된 활성 구조를 갖는 경우(푸른색), 강한 계면활성제인 SDS에 의해 변성된 경우(검은색), 본 발명의 일 구현예에 따른 양친성 고분자에 의해 활성 구조를 되찾은 경우(붉은색)의 가시광 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 양친성 고분자를 이용하여 막 단백질을 기판에 고정하는 과정을 개략적으로 도시한 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 양친성 고분자를 제공한다.

본 발명의 양친성 고분자는 하기 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

n은 1 내지 1,000의 정수임).

본 발명의 양친성 고분자는 폴리감마글루탐산을 기본 골격으로 하여, 폴리감마글루탐산의 N-말단 아미노기와 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산, 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬카르복시산과의 중합에 의해 아미드 결합이 형성되고, 글루탐산 반복 단위 및 C-말단의 카르복시기와 친수성 또는 소수성 아민과의 중합에 의해 아미드 결합이 형성된 구조를 갖는다(도 1).

본 발명의 양친성 고분자는 친수성 아민으로부터 유래한 친수성 구조와 소수성 아민으로부터 유래한 소수성 구조를 모두 갖는다. 이에 따라 막 단백질이 수용액 내에서도 원래의 활성 구조를 유지할 수 있도록 안정화시키는 데에 사용될 수 있다.

구체적으로, 막 단백질은 세포막에 끼어있는 단백질로 세포의 성장과 분화에 관여하며 다양한 질병에 대하여 연관성을 나타내는 단백질로서, 세포막에서 추출하기가 어렵고 세포내에 존재하는 수용성 단백질들과 달리 소수성 표면을 가져, 추출 후 수용액 상태에서 소수성 표면끼리 서로 응집하여 활성을 갖지 못하는 불용성의 침전물을 형성한다. 이에 막 단백질은 그 구조 및 기능 분석에 있어 어려운 점이 있다.

그러나, 본 발명의 고분자는 친수성 구조와 소수성 구조를 모두 가져, 수용액 상의 막 단백질에 가하는 경우, 고분자의 소수성 구조와 막 단백질 표면과의 소수성 상호 작용에 의해 고분자가 막 단백질 표면을 감싸서 막 단백질-양친성 고분자 복합체를 형성한다. 그리고 고분자의 친수성 구조가 복합체의 수용액의 대한 용해도를 개선시켜, 수용액 내에서 소수성 부분 끼리의 응집을 막을 수 있다(도 2).

폴리감마글루탐산은 글루탐산의 알파 탄소의 아민과 감마 탄소의 카르복시기가 펩타이드 결합으로 연결된 친수성이 높고 생체 친화적인 고분자로서, 중량평균분자량 10,000인 폴리감마글루탐산을 예로 들자면 약 78개의 카르복시기를 가져 친수성 또는 소수성 구조가 결합할 수 있는 부위를 다수 가지고 있고, 각 카르복시기들이 감마글루탐산 단위만큼 서로 이격되어 있으므로 입체 저항에 의한 영향을 최소화하면서 친수성 및 소수성 구조를 다량 도입할 수 있다.

친수성 아민은 히드록시기, 아미노기 등의 친수성기를 가져 친수성을 나타낼 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 히드록시기 또는 아미노기로 치환된, 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민일 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

소수성 아민은 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 고분자에 있어서, 친수성 아민 유래 구조와 소수성 아민 유래 구조의 몰비는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 1:9 내지 9:1일 수 있다. 몰비가 상기 범위 내인 경우, 적정 수준의 친수성과 수수성을 모두 나타내어 수용액 상의 막 단백질을 충분히 안정화시킬 수 있다.

그리고, 폴리감마글루탐산은 N-말단 아미노기를 가지는데, 본 발명의 고분자가 N-말단 아미노기에 형광염료가 결합된 구조를 갖는 경우에는 막 단백질을 형광으로 표지할 수 있으므로, 보다 용이하게 막 단백질의 분석을 수행할 수 있도록 한다.

상기 형광염료는 카르복시기를 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, N-말단 아미노기에 비오틴기가 결합된 구조를 갖는 경우에는, 비오틴은 아비딘 및 스트렙타아비딘에 대한 결합력이 매우 우수하므로, 아비딘 또는 스트렙타아비딘이 부착된 기재에 막 단백질을 고정하는데에 사용할 수 있다.

본 발명의 양친성 고분자의 분자량은 특별히 한정되지 않고 안정화시키고자 하는 막 단백질의 분자량에 따라 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, 중량평균분자량이 5,000 내지 50,000일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 양친성 고분자의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 양친성 고분자의 제조 방법에 따르면 먼저, 폴리감마글루탐산을 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르복시산과 DCC(dicyclo-hexylcarbodiimide)와의 반응 생성물과 반응시킨다.

상기 형광염료는 전술한 형광염료일 수 있다.

카르복시기를 갖는 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르복시산을 DCC(dicyclo-hexylcarbodiimide)와 반응시키면, 카르복시기와 DCC 간의 반응으로 카르복시기를 갖는 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르복시산과 DCC가 결합된 화합물이 얻어진다.

그리고 상기 반응 생성물을 폴리감마글루탐산과 반응시키면, 폴리감마글루탐산의 N-말단 아미노기에 카르복시기를 갖는 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르복시산이 축합 중합하여, 아마이드 결합에 의해 결합된 구조가 얻어진다.

이러한 반응은 실온 조건에서도 높은 수율로 일어나고, N-말단 아미노기에 대하여 위치 특이적으로 일어난다.

이후, 상기 반응을 거친 폴리감마글루탐산을 DCC와 반응시킨 후, 친수성 아민 및 소수성 아민과 반응시킨다.

상기 반응을 거친 폴리감마글루탐산을 DCC와 반응시키면, 감마글루탐산 반복 단위의 카르복시기에 DCC가 결합된 구조가 얻어지고, 이를 친수성 아민 및 소수성 아민과 반응시키면, 상기와 마찬가지로 친수성 및 소수성 아민과 감마글루탐산 반복 단위의 카르복시기 간에 축합 중합하여, 아마이드 결합에 의해 결합된 본 발명의 하기 화학식 1의 양친성 고분자가 얻어진다.

[화학식 1]

n은 1 내지 1,000의 정수임).

마찬가지로 상기 반응도 실온 조건에서도 높은 수율로 일어나고, 각 카르복시기가 감마글루탐산 반복 단위만큼 서로 떨어져 있으므로 입체 장애에 의한 반응성 저하를 최소화 할 수 있다.

상기 친수성 아민 및 소수성 아민은 전술한 친수성 아민 및 소수성 아민일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 양친성 고분자를 이용하여 막 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 막 단백질의 안정화 방법은 수용액 내의 막 단백질을 상기 양친성 고분자와 결합시켜 막 단백질-양친성 고분자 복합체를 형성한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 양친성 고분자는 친수성 구조 및 소수성 구조를 모두 가지므로, 상기 양친성 고분자의 소수성 아민으로부터 유래한 소수성 구조가 막 단백질의 소수성 표면과 소수성 상호작용하고, 친수성 아민으로부터 유래한 친수성 구조가 막 단백질의 수용액에 대한 용해도를 증가시킴으로써, 막 단백질이 수용액 상에서도 응집하지 않고 활성화된 구조를 유지할 수 있도록 한다.

또한, 본 발명은 막 단백질이 고정된 기판을 제공한다.

본 발명의 막 단백질 고정 기판은 기재 상에 부착된 아비딘 또는 스트렙타아비딘, 및 이에 결합된 막 단백질-양친성 고분자 복합체를 포함한다.

상기 양친성 고분자는 하기 화학식 2로 표시된다.

[화학식 2]

(식 중, R1은 비오틴기이고;

n은 1 내지 1,000의 정수임).

비오틴은 아비딘 및 스트렙타아비딘에 대한 친화력이 매우 우수하여, 서로 간에 강한 결합력을 갖는다.

이에, 아비딘 또는 스트렙타아비딘이 부착된 기재에 막단백질-양친성 고분자 복합체를 접촉시키면, 양친성 고분자의 비오틴기와 기재에 부착된 아비딘 또는 스트렙타아비딘 사이의 결합에 의해, 막 단백질을 기판에 고정시킬 수 있다.

친수성 및 소수성 아민의 종류와 몰비는 전술한 범위 내일 수 있다.

또한, 본 발명은 막 단백질의 구조 복원 방법을 제공한다.

변성된 막 단백질에 상기 양친성 고분자를 가하는 경우, 변성된 막 단백질이 다시 원래의 활성 구조를 되찾도록 할 수 있다.

변성 원인은 한정되지 않으며, 예를 들면 계면활성제를 가하여 변성이 유발된 것일 수 있다. 이하 계면활성제를 가하여 변성된 경우를 예로 들어 구체적으로 설명하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

막 단백질에 SDS 등의 강력한 계면활성제를 가하면 막 단백질의 변성이 일어나 원래의 활성을 잃게 된다. 그러한 경우에 상기 양친성 고분자를 가하면 막 단백질과 양친성 고분자가 결합하면서 양친성 고분자의 소수성 부위들이 막 단백질의 소수성 표면을 안정화하면서 막 단백질의 구조 형성을 촉진하여 막 단백질이 원래의 활성 구조를 되찾게 된다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 폴리감마글루탐산으로부터 양친성 고분자( APG )의 합성

1-1. 양친성 고분자의 합성

중량평균분자량 10,000의 폴리감마글루탐산(폴리감마글루탐산, 바이오리더스) 0.3g을 디메틸설폭사이드 용매에 녹인 후, 비오틴 60mol (7.3 mg)과 0.1mmol의 DCC와의 반응 혼합물을 가하여, 폴리감마글루탐산의 N-말단에 비오틴기를 결합시켰다.

이후, 상기 반응액에 2.4mmol의 DCC(0.495g)와 옥틸아민(1.3mmol, 0.167g)과 글루코사민(1.3mmol, 0.233g)을 가하며 45에서 교반하여, N-말단에 비오틴기가 도입되고, 친수성기로 글루코사민기, 소수성기로 옥틸기가 도입된 양친성 고분자를 제조하였다.

이러한 합성 방법으로 생성되는 양친성 고분자는 전체 카복실기중 약 41%가 옥틸기로 치환되며 24%는 글루코실기로 치환된다. 이러한 양친성 고분자의 중량평균분자량은 17,000이며 100% 반응시 이론적인 생성량은 0.51g으로 계산된다. 실제 얻어진 양친성 고분자의 양은 0.28g으로서 약 55%의 수율을 갖는 것으로 계산된다. 이는 종래 막 단백질 안정화에 사용되는 앰피폴 등의 고분자의 5% 미만의 수율에 비해 현저히 높은 수율이다.

1-2. 양친성 고분자의 합성

비오틴 대신에 형광 염료인 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC)을 동일 몰로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 양친성 고분자를 합성하였다.

1-3. 양친성 고분자의 합성

비오틴 대신에 아세트산을 동일 몰로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 양친성 고분자를 합성하였다.

1-4. 양친성 고분자의 합성

옥틸아민 대신에 시클로헥실아민을 동일 몰로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 양친성 고분자를 합성하였다.

1-5. 양친성 고분자의 합성

옥틸아민과 글루코사민의 몰비를 7:3으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 양친성 고분자를 합성하였다.

1-6. 양친성 고분자의 합성

옥틸아민과 글루코사민의 몰비를 2:8로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 양친성 고분자를 합성하였다.

2. 양친성 고분자의 임계미셸농도 ( Critical micelle concentration , CMC ) 측정

상기 실시예 1-1 내지 1-6의 양친성 고분자와 계면활성제인 SDS, β-D-octylglucoside의 임계미셸농도를 측정하였다. 임계미셸농도는 pyrene의 형광으로 373nm와 384nm의 형광비를 이용하여 다양한 농도에서 측정하였다.

양친성 고분자의 경우 임계미셸농도가 다른 계면활성제에 비해 현저히 낮아, 보다 적은 양만으로도 사용이 가능함을 확인하였다. 도 3을 참조하면, 실시예 1-1의 양친성 고분자의 임계미셸농도가 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다(도 3).

양친성 고분자는 특정 농도 이상이 되면 미셸을 형성하고, 이러한 미셸이 실제로 막 단백질과 결합하는 단위에 해당하는데, 본 발명의 양친성 고분자는 임계미셸농도가 0.006%로서 기존의 계면활성제들의 임계미셀농도보다 현저히 낮아, 적은 농도로 사용하여도 막 단백질과 결합할 수 있다. 이는 본 발명의 양친성 고분자 내에 다수의 소수성 구조가 도입되고, 이들이 서로 쉽게 결합하여 미셸을 형성함에 의한 것으로 판단된다.

3. 정제된 막 단백질의 안정화

인간 엔도셀린 A 수용체(Endothelin receptor type A; ETA)는 대장균에서 발현되고, 이는 계면활성제인 sarkosyl을 이용하여 수용화한 후 정제된다(Protein Expression and Purification 2012, vol 84, pp 14-18).

정제된 수용액 상의 ETA는 계면활성제와 결합되어 있는데, 여기에 동일 몰의 실시예 1-1 내지 1-6의 양친성 고분자를 각각 첨가하여 ETA-양친성 고분자 복합체를 형성하였다. 이후에, size exclusion 크로마토그래피법에 의해서 계면활성제를 제거하여 ETA-양친성 고분자 복합체를 분리하였다.

도 4는 ETA를 계면활성제인 sarkosyl(검은선), DDM(푸른선), 그리고 실시예 1-1의 양친성 고분자(붉은선)를 사용하여 정제하였을 때, size exclusion chromatography를 이용하여 크기를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 이를 참조하면, ETA가 양친성 고분자와 복합체를 형성하고, 용이하게 정제된 것을 확인할 수 있다.

4. 변성된 막 단백질의 구조 복원

Halobacterium에서 발현되는 막 단백질인 Bacteriorhodopsin(BR)은 활성 구조를 가질 때 보라색을 나타내며, 이 보라색은 변성되어 활성 구조를 잃어버리면 노란색으로 변색된다. 활성 구조를 갖는 BR에 강력한 계면활성제인 SDS를 첨가하면 BR이 변성되어 활성 구조를 잃으면서 노란색을 나타내게 된다.

활성 구조를 잃은 BR 1몰에 실시예 1-1 내지 1-6의 양친성 고분자 1몰을 각각 첨가하고, 용액에 남아있는 SDS를 size exclusion chromatography를 통해 제거하였다.

도 5를 참조하면, 실시예 1-1의 양친성 고분자를 가하고 SDS를 제거한 경우, BR이 보라색을 가져 활성 구조를 되찾은 것을 확인할 수 있다.

5. 막 단백질의 고정화

수용액 상의 ETA 1몰에 실시예 1-1의 비오틴이 부착된 양친성 고분자 1몰을 가하여, ETA-양친성 고분자 복합체를 형성하였다.

이후에, 스트렙타아비딘이 표면에 부착된 폴리카보네이트 기재 상에 ETA-양친성 고분자 수용액을 도포하여, 스트렙타아비딘과 양친성 고분자의 비오틴기 사이의 결합을 형성함으로써, 막 단백질 ETA를 기재 상에 고정시켰다(도 6).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 양친성 고분자:
[화학식 1]

(식 중, R1은 형광염료, 비오틴기 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르보닐기이고;
R2, R3, R4 및 R5는 서로 독립적으로 히드록시기, 또는 친수성 또는 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며,
R3는 서로 동일하거나 상이한 구조로서, 반복되는 R3 중 1개 이상은 친수성 아민으로부터 유래하는 구조이고, 1개 이상은 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며;
n은 1 내지 1,000의 정수임).
청구항 1에 있어서, 상기 형광 염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 양친성 고분자.
청구항 1에 있어서, 상기 친수성 아민은 히드록시기 또는 아미노기로 치환된, 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자.
청구항 1에 있어서, 상기 소수성 아민은 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자.
청구항 1에 있어서, 친수성 아민 유래 구조와 소수성 아민 유래 구조의 몰비는 1:9 내지 9:1인, 양친성 고분자.
청구항 1에 있어서, 중량평균분자량이 5,000 내지 50,000인, 양친성 고분자.
폴리감마글루탐산을 카르복시기를 갖는 형광염료, 비오틴, 탄소수 1 내지 10의 알킬카르복시산 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르복시산과 DCC(dicyclo-hexylcarbodiimide)와의 반응 생성물과 반응시키는 단계; 및
상기 반응을 거친 폴리감마글루탐산을 DCC와 반응시킨 후, 친수성 아민 및 소수성 아민과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 양친성 고분자의 제조 방법:
[화학식 1]

(식 중, R1은 형광염료, 비오틴기 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬 카르보닐기이고;
R2, R3, R4 및 R5는 서로 독립적으로 히드록시기, 또는 친수성 또는 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며,
R3는 서로 동일하거나 상이한 구조로서, 반복되는 R3 중 1개 이상은 친수성 아민으로부터 유래하는 구조이고, 1개 이상은 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며;
n은 1 내지 1,000의 정수임).
청구항 7에 있어서, 상기 형광 염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 양친성 고분자의 제조 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 친수성 아민은 히드록시기 또는 아미노기로 치환된, 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자의 제조 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 소수성 아민은 탄소수 1 내지 10의 알킬아민 또는 탄소수 5 내지 20의 시클로알킬아민인, 양친성 고분자의 제조 방법.
수용액 내의 막 단백질을 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 양친성 고분자와 결합시켜 막 단백질-양친성 고분자 복합체를 형성하는, 막 단백질의 안정화 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 양친성 고분자의 소수성 아민 유래 구조가 막 단백질의 소수성 표면과 소수성 상호작용하고, 친수성 아민 유래 구조가 막 단백질의 수용액에 대한 용해도를 증가시키는, 막 단백질의 안정화 방법.
기재 상에 부착된 아비딘 또는 스트렙타아비딘 및 이에 결합된 막 단백질-하기 화학식 2로 표시되는 양친성 고분자 복합체를 포함하는, 막 단백질 고정 기판:
[화학식 2]

(식 중, R1은 비오틴기이고;
R2, R3, R4 및 R5는 서로 독립적으로 히드록시기, 또는 친수성 또는 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며,
R3는 서로 동일하거나 상이한 구조로서, 반복되는 R3 중 1개 이상은 친수성 아민으로부터 유래하는 구조이고, 1개 이상은 소수성 아민으로부터 유래하는 구조이며;
n은 1 내지 1,000의 정수임).
변성된 막 단백질에 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 양친성 고분자를 가하는, 막 단백질의 구조 복원 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 변성은 막 단백질에 계면활성제를 가하여 유발된 것인, 막 단백질의 구조 복원 방법.