KR101579722B1 - 유지류 및 섬유소 생분해성 종균제 개발 - Google Patents
유지류 및 섬유소 생분해성 종균제 개발 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유지류 및 섬유소 생분해성 종균제 개발에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유지류 및 섬유소 생분해성 종균제 개발에 관한 것이다.
1992년 브라질 리우데자네이루에서 열린 ‘환경과 개발에 관한 지구정상회담’의 흐름에 따라 우리나라의 환경부는 1998년 ‘음식물 폐기물 자원화 기본계획(1998-2002)을 수립하면서 환경적, 경제적 편익과 효율성을 제고시킨 자원 재순화형 사회건설을 목표로 하고 있다. 음식물 폐기물은 폐기물관리법에 의해 2005년부터 직접적인 매립이 금지되었으며, 2013년부터는 음식물류폐기물 발생폐수(음폐수)의 해양배출이 전면 금지되는 등 배출 및 처리에 대한 규제가 강화되고 있는 한편 유기성 폐기물 자원으로서 관심이 증가되고 있다.
대한민국의 전체 음식물 폐기물 발생량은 2000년 11,434톤/일에서 2009년 14,123천톤/일 증가하여 1인당 발생량도 하루 0.24kg(2000년 기준)에서 0.28kg(2009년 기준)으로 증가하였다.
배출원별 음식물 폐기물 발생비율을 보면 생활폐기물 중 음식물 폐기물이 차지하는 비중은 23%에 달한다. 특히 전체 음식물류 폐기물 중 69%가 일반가정에서 배출되고 있다. 일부 음식물류 폐기물은 동물사료로 재활용(81.1%)되며 이중 일부는 다시 소각(5.5%)된다. 나머지 음식물류 폐기물은 매립(11.3%)되거나 해양투기(2.0%) 등의 방법으로 처리되고 있어 환경을 오염시키는 주범이 되고 있다.
음식물 폐기물 발생은 경제적인 측면에 있어서 버려지는 식량자원의 가치로 환산하면 연간 약 18조원에 달하며, 이를 처리하는 비용도 연간 약 6천억원 이상의 비용이 소요되는 것으로 알려져 있다.
매년 우리나라에서는 많은 양의 유기성 폐기물이 발생되고 있으며, 그 유기성 폐끼물 중에서도 음식물 폐기물이 가장 커다란 문제점으로 대두되고 있다. 일반적으로 음식물류 폐기물은 미생물에 의하여 분해 가능한 유기물의 함량이 높기 때문에 유기성폐기물로 분류되고 있다. 하지만 분류된 음식물 폐기물의 처리시 가장 큰 문제점은 80~85%에 이르는 수분함량(함수율)이다. 왜냐하면, 높은 함수율은 음식물 폐기물의 운반시 운반무게를 증가시키는 문제, 악취발생의 문제, 자원화 및 매립시 다량의 침출수 발생 문제 및 이로인한 지하수 오염 등 2차 오염문제 등을 유발하기 때문이다. 즉, 음식물 폐기물의 발생시 발생원 내에서 곧바로 발생된 음식물 폐기물을 감량화하는 것이 사회경제적으로 비용을 절약할 수 있는 기술개발이 매우 필요하다.
음식물 폐기물의 처리방법은 매립, 소각, 탈수, 건조, 발표를 통한 소멸, 퇴비화, 사료화 등으로 나뉠 수 있는데 매립의 경우 많은 양의 침출수를 발생시켜 지하수 및 토양을 오염시켜 지하수 및 토양을 오염시키고 있다.
소각 처리할 경우, 음식물 폐기물의 수분은 발열량 저하의 원인이 되며, 그에 따른 보조연료의 사용증가 및 다이옥신과 같은 대기오염발생들의 심각한 문제점이 있다. 퇴비화의 경우, 염분제거의 기술적 측면에서 그 효과를 얻지 못하고 있기 때문에 작물폐해로 실패한 방법이다. 또한, 건조방법 및 발효 후 건조방법은 매일 건조기로부터 남은 음식물을 수거해야하는 단점과 건조과정에서 많은 에너지가 소비되는 단점이 있다.
종래 방법의 단점을 보완하기 위해서는 음식물 폐기물의 악취를 제거할 뿐만 아니라, 음식물 폐기물을 감량할 수 있는 미생물 등을 활용한 친환경적인 처리방법이 필요하다.
따라서, 음식물 폐기물 처리의 새로운 보완대책으로 호기성 미생물이 음식물 폐기물 내에 존재하는 유기성 물질을 분해하면서 소멸시키는 방법인 미생물에 의한 생물학적 소멸 방법이 종래 방법에 비해 경제적이면서 음식물 폐기물의 발생량 자체를 줄이는 이상적인 처리기술이라고 볼 수 있다.
하지만 요즘 시중에 유통되고 있는 음식물 폐기물의 액상화(slurry phase)에 따른 소멸 효능(또는 감량화)을 갖고 있다는 미생물에 의한 음식물 폐기물의 소멸율과 이 미생물에 의한 악취제거율의 조사에 따르면, 그 미생물의 수가 매우 적을 뿐만 아니라, 소멸용 발효장치에 음식물 폐기물을 장기 투입하면 음식물 폐기물 감량 소멸 효과가 매우 미흡한 것으로 알려져 있다. 특히, 섬유소와 같은 섬유소 성분은 자연 환경상에서 잘 분해되지 않으며, 미생물에 의한 소화(digestion)에서도 그 분해가 용이하지 않은 것으로 알려져 있다.
또한, 유통되고 있는 미생물 중 채소 내에 존재하는 섬유소를 분해하는 능력이 현저히 떨어져 미생물의 실용성이 낮은 것으로 판명되고 있다.
또한, 날이 갈수록 육류소비가 증가함에 따라 배출되는 유지류 분해를 위한 신규 미생물 분리 및 개발이 매우 시급한 상태이다.
상기와 같이, 유지류 및 섬유소 등에 의해 음식물 폐기물의 감량화는 제한적일 수 밖에 없어 이 문제를 해결하는 것이 본 발명의 과제이다. 다양한 음식물 폐기물의 감량화 기술 중 호기성퇴비화, 혐기성퇴비화, 지렁이퇴비화, 습식사료화, 건식사료화, 고속건조, 고속발효, 고속발효건조 등으로 연구가 진행되고 있다. 상기 기술 중에서 본 발명은 미생물 발효를 이용한 음식물 폐기물의 액상소멸방식인 음식물 폐기물 발생원 내에서 미생물에 의해 음식물 폐기물을 분해시키는 것으로 일부는 이산화탄소(CO2)로 기화시킴으로써 음식물 폐기물의 발생량을 획기적으로 감량화시킬 수 있다.
또한, 섬유소 제거 미생물을 포함하여 여러 성분의 음식물 폐기물을 분해하는 미생물 균주 및 종균제 개발이 아직 이루어지지 않고 있다. 그래서 본 발명에서는 이러한 문제점을 극복하고자 음식물 폐기물 중 유지류 및 섬유소를 분해하는 최적 미생물을 발견하고 분리하여 이들 성분들의 생분해성 미생물 균주 및 종균제 개발과 이들을 이용한 미생물 고정화 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 유지류 또는 섬유소 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 MG2(KACC91881P), JK1(KACC91878P), GOC2(KACC91879P) 및 DE(KACC91880P) 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 배양한 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 제공한다.
본 발명은 상기 M기 MG2(KACC91881P), JK1(KACC91878P)균주는 유지류 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 것을 특징으로 하는 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 제공한다.
본 발명은 상기 GOC2(KACC91879P), DE (KACC91880P)균주는 섬유소 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 것을 특징으로 하는 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 제공한다.
본 발명은 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 담체에 고정화한 유지류 또는 섬유소 음식물 폐기물 생분해용 미생물종균제를 제공한다.
본 발명은 상기 담체는 우드칩인 것을 특징으로 하는 유지류 또는 섬유소 음식물 폐기물 생분해용 미생물종균제를 제공한다.
본 발명은 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 혼합배양하여 배양액을 농축하는 단계; 및 상기 농축한 배양액을 우드칩에 고정화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 고정화 방법을 제공한다.
본 발명에서 유지류 및 섬유소 음식물 폐기물의 생분해 능력을 가진 미생물 균주를 새롭게 발견하였으며, 신규 미생물 균주를 이용한 미생물 고정화 방법의 활용방안과 이에 대한 기대효과를 도출할 수 있다. 첫째는 하수도법에 저촉되지 않는 미생물 분해방식을 이용한 음식물 폐기물의 분해효과를 확보하였으며, 두 번째는 음식물 쓰레기 발효-소멸 미생물을 이용하여 음식물을 제거함으로써 음식물 쓰레기 운반 및 최종처분에 대한 비용 부담 절감하는 효과를 얻을 수 있다.
향후 개발된 생분해성 미생물제제를 죵균제제로 활용하여 온도, 수분,산소 공급 등 미생물의 서식환경을 최적화한 설비장치에 투입 후 미생물 번식 촉진용 영양분을 첨가하여 음식물 발효-소멸시키는 방법을 연구하여 기술분야의 시장에서의 기술적인 우위를 확보할 수 있으며, 본 기술의 해외 판매 가능성도 매우 농후할 것으로 기대된다.
도 1은 유지류 생분해성 미생물 균주의 16s rRNA 동정 결과를 나타내었다.
도 2는 유지류 생분해성 미생물 균주의 형태학적 특성을 나타낸 현미경 사진이다.
도 3은 식용유 분해 균주인 MG2 균주의 pH별 조건에 따른 성장곡선 그래프이다,
도 4는 돼지기름 분해 균주인 JK1 균주의 pH별 조건에 따른 성장곡선 그래프이다,
도 5는 식용유 분해 균주인 MG2 균주의 온도별 조건에 따른 성장곡선 그래프이다,
도 6은 유지류 및 섬유소 생분해성 미생물 균주의 16s rRNA 동정 결과를 나타내었다.
도 7 내지 8은 섬유소 분해 미생물 균주의 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 9는 섬유소 분해 미생물 균주의 CMC cell weight 성장 곡선 그래프이다.
도 10은 섬유소 분해 미생물 균주의 CMCase 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 섬유소 분해 미생물 균주의 온도 및 pH 조건별 CMCase 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 유지류 및 섬유소 분해 미생물 균주가 고정된 우드칩의 FE-SEM 사진이다.
도 2는 유지류 생분해성 미생물 균주의 형태학적 특성을 나타낸 현미경 사진이다.
도 3은 식용유 분해 균주인 MG2 균주의 pH별 조건에 따른 성장곡선 그래프이다,
도 4는 돼지기름 분해 균주인 JK1 균주의 pH별 조건에 따른 성장곡선 그래프이다,
도 5는 식용유 분해 균주인 MG2 균주의 온도별 조건에 따른 성장곡선 그래프이다,
도 6은 유지류 및 섬유소 생분해성 미생물 균주의 16s rRNA 동정 결과를 나타내었다.
도 7 내지 8은 섬유소 분해 미생물 균주의 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 9는 섬유소 분해 미생물 균주의 CMC cell weight 성장 곡선 그래프이다.
도 10은 섬유소 분해 미생물 균주의 CMCase 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 섬유소 분해 미생물 균주의 온도 및 pH 조건별 CMCase 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 유지류 및 섬유소 분해 미생물 균주가 고정된 우드칩의 FE-SEM 사진이다.
본 발명은 유지류 및 섬유소 음식 폐기물 생분해성을 갖는 MG2, JK1, GOC2 및 DE 균주를 단독배양 또는 둘 이상 혼합배양하여 얻을 수 있는 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 균주에 관한 것이다.
보다 자세하게는, 상기 MG2, JK1 균주는 유지류 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 균주이며, GOC2 및 DE 균주는 섬유소 생분해성을 갖는 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 균주에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 상기의 과제를 달성하기 위한 균주를 먼저 확보하기 위해 음식물 폐기물 내 유지류 및 섬유소를 분해하는 균주를 탐색하였다.
본 발명의 목적을 달성시키기 위해 가장 적합한 미생물 균조로 효모균류(맥주, 빵, 포도를 발효 시키는 군; Bacillus subtilis strain, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae), 고초균류(된장발효 미생물, 단백질; Bacillus amyloliquefaciens strain), 일반 토양세균류(탄수화물, 지질, 단백질, 방향족화합물 분해; Leucobatoer iarius strain), 유산균류(김치, 치즈, 우유발효 미생물이며 악취제거에 도움을 주는 미생물; Streptococus lactis, Lactobacillus plantarum))를 이용하여 음식물 폐기물의 분해 소멸처리에 적용할 수 있는 적합한 미생물 균주를 확보할 수 있다.
이를 위해 본 발명의 목적에 따른 일예로 유지류 분해 균주를 분리하기 위해 하수처리장에서 채취한 활성슬러지를 미생물원으로 사용하였고, 유지류 분해 미생물 균주의 탄소원으로는 돼지기름, 소기름, 식용유(옥수수유)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 탄소원으로 사용할 수 있다.
상기 탄소원을 함유하는 미생물 균주 분리용 배지는 무기배지일 수 있으며, 보다 상세하게는 무기배지인 C 배지(C-medium)일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 하수처리장에서 채취한 미생물원을 상기 탄소원을 함유하는 배지에 접종하여 호기적 조건하(30℃, 120rpm)에서 배양할 수 있다. 구체적으로는 10 내지 50℃에서 수 일 동안 배양할 수 있으며, 보다 구체적으로는 20 내지 30℃에서 7일 내지 20일 동안 배양할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 배양 후, 육안으로 성장이 확인된 균주를 수차례 계대 배양하여 고체 LB배지에서 순수 분리해 낼 수 있다.
또한 본 발명은 상기 순수 분리된 균주를 16s rRNA 분석, 형태적인 특성, 배양학적 특성, 생리 및 생화학적 특성을 기초로 하여 본 발명에 의한 균주가 유지류 및 섬유소 생분해성을 갖는 strain MG2, JK1, GOD2 및 DE 균주라는 것을 동정하였고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 12월 18일자로 기탁하였다.
상기에서 순수 분리된 유지류 분해 미생물의 동정은 얻어진 16s rRNA 서열을 토대로 BLAST를 통하여 서열 비교하였다. 분석 결과는 도1과 도6에 나타내었다.
상기 순수 분리된 유지류 분해 미생물 균주를 형태학적 특성, 배양학적 특성, 생리 및 생화학적 특성을 관찰하였으며, 분석 결과는 도 1 내지 2에 나타내었다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 또 다른 일예로, 상기 분리 및 동정한 미생물 균주의 유지류 생분해성을 확인하기 위해 상기 탄소원별로 미생물 균주의 유지류 분해 특성을 분석하였다. 그 결과는 도 3 내지 5에 나타내었다.
본 발명의 목적에 따른 또 다른 일예로 섬유소 분해 균주를 분리하기 위해 전라남도의 한 축산가에서 가져온 소의 분변과 부패된 짚을 적적히 섞은 토양시료, 광주광역시 광주우치동물원의 기린, 염소의 분변, 그리고 기타 음식물처리기 안의 음식물 폐기물을 미생물원으로 사용하였으며, 섬유소 분해 미생물 균주의 탄소원으로는 CMC(carboxymethylcellulose), Avical, Xylan으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 탄소원으로 사용할 수 있다.
상기 탄소원을 함유하는 미생물 균주 분리용 배지는 무기배지일 수 있으며, 보다 상세하게는 무기배지인 C 배지(C-medium)일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 미생물원을 상기 탄소원을 함유하는 배지에 접종하여 호기적 조건하(30℃, 120rpm)에서 배양할 수 있다. 구체적으로는 10 내지 50℃에서 수 일 동안 배양할 수 있으며, 보다 구체적으로는 20 내지 30℃에서 최소 10회 이상 계대 배양할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 배양에 사용한 배지 조성은 표 3에 나타내었다.
상기 배양 후, 육안으로 성장이 확인된 균주를 수차례 계대 배양하여 고체 LB배지에서 순수 분리해 낼 수 있다.
또한 본 발명은 상기 계대 배양을 통해 순수 분리된 미생물 균주는 1.0%(w/v)의 carboxymethyl cellulose soldium salt(CMC 배지)의 평판에 재차 도말되어 분리하였으며, 분리된 단일 균주들은 16s rRNA 분석을 통하여 동정, 형태적인 특성, 배양학적 특성, 생리 및 생화학적 특성 분석을 기초로 하여 본 발명에 의한 균주가 섬유소 생분해성을 갖는 strain GOD2 및 DE 균주라는 것을 동정하였고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 12월 18일자로 기탁하였다.
상기에서 순수 분리된 섬유소 분해 미생물의 동정은 얻어진 16s rRNA 서열을 토대로 BLAST를 통하여 서열 비교하였다. 분석 결과는 도1과 도6에 나타내었다.
상기 순수 분리된 섬유소 분해 미생물 균주를 형태학적 특성, 배양학적 특성, 생리 및 생화학적 특성을 관찰하였으며, 분석 결과는 도 7 내지 8에 나타내었다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 상기 분리 및 동정한 미생물 균주의 섬유소생분해성을 확인하기 위해 상기 미생물 균주의 CMCase 효소 활성도를 측정하였다. 그 결과는 도 10 내지 11에 나타내었다.
또한 본 발명은 상기 순수 분리 및 동정한 유지류 및 섬유소 생분해성을 갖는 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 미생물 고정화 방법을 제공한다.
구체적으로는, 상기 선택된 미생물 균주를 배양하고 미생물 균주의 적절한 서식 환경을 제공하기 위해 담체에 미생물 균주를 접종한 후에 음식물 폐기물의 소멸, 유지류의 소멸 및 섬유소의 소멸에 관한 실험을 수행할 수 있다.
상기 미생물 고정화 방법은 유지류 및 섬유소 음식물 폐기물의 생분해성을 갖는 균주를 하나 이상 혼합배양하는 단계; 및 상기 혼합배양을 통해 얻어진 유지류 및 섬유소 미생물 균주를 담체에 고정화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 고정화 방법을 제공한다.
상기 담체는 우드칩인 것일 수 있으며 구체적으로는 편백나무 재질의 우드칩인 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 우드칩은 높은 기공률을 가지고 있으며, 물에 쉽게 용해되지 않아 음식물 폐기물 처리장치에서 장기간 사용이 가능하며, 목적에 맞는 다양한 미생물 균주를 담지할 수 있을 뿐만 아니라, 짧은 시간에 담지된 미생물들을 활성화시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 연구자는 우드칩을 담체로 한 미생물 고정화 방법을 확보하였다.
보다 구체적으로는, 본 발명에서 분리 및 동정된 유지류 및 섬유소 미생물 균주를 혼합한 후 원심분리기를 이용해 유지류 및 섬유소 미생물을 농축시키는 단계; 상기 미생물을 농축시킨 농축액을 상기 우드칩에 고정시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 고정시키는 단계는 우드칩 5 내지 20g 을 거즈에 넣고, 우드칩이 담긴 거즈에 상기 농축액에 넣어 5 내지 20시간 동안 고정시킬 수 있다. 5시간 이하로 고정할 경우에는 우드칩에 미생물을 농축시킨 농축액이 충분히 고정화되지 않으며 20시간 이상으로 농축시킬 경우 20시간 이후부터는 시간이 지남에 따른 별다른 변화가 나타나지 않는다.
상기 고정시키는 단계 후, 상기 우드칩을 꺼내 10 내지 50시간 동안 자연 건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 유지류 및 섬유소 생분해성 미생물 균주를 고정화 시킨 우드칩의 FE-SEM 사진은 도 12에 나타내었다.
본 발명의 또 다른 양태로는 상기 미생물 고정화 방법을 이용한 유지류 및 섬유소 음식물 폐기물 생분해용 미생물종균제를 제공한다.
상기 유지류 및 섬유소 음식물 폐기물 생분해용 미생물종균제는 상기 담체에 상기 미생물 균주를 접종한 후에 자연 건조하여 고정화 시켜 제조할 수 있다.
또한, 미생물 종균제는 적절한 수준의 생균수를 포함하고 있어야 하지만 시중에 유통되고 있는 제품들을 분석하였을 때 종균제의 생균수가 일정 기준 이하이거나 미생물을 포함하지 않은 제품 즉, 관리제인 경우가 많다는 문제점들이 있다. 하지만 본 발명은 종래의 문제점을 극복할 수 있는 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 종균제를 제공하고 있다.
본 발명에 따른 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 종균제는 특정 폐기물에 선택적으로 작용하여 분해능을 발휘하는 미생물 균주를 고농도로 배양하여 농축한 다음, 본 발명의 미생물 고정화 방법으로 담체를 이용해 미생물 균주를 고정화한 미생물 종균제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 미생물 고정화 방법을 이용하여 담체에 더 많은 미생물 균주를 담지할 수 있어 빠른 활성화 속도를 가지며 오랫동안 종균제의 기능을 가질 수 있는 장점이 있다.
상기 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 종균제는 다양한 종류의 음식물 폐기물에 적응키 위해 본 발명에서 제공하고 있는 MG2, JK1, GOD2 및 DE 미생물 균주로부터 두 가지 이상 포함하여 제조하는 것이 바람직하다.
상기 유지류 및 섬유소 생분해용 미생물 종균제는 미생물 균주의 증식을 도와주는 영양물질을 더 포함할 수 있다. 상기 영양물질은 인위적으로 첨가된 미생물 균주 뿐만 아니라, 다른 미생물의 증식도 도와 줄 수 있는 유기 영양소 및 무기 영양원일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
이하 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명될 수 있으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
실험예 1. 음식물 폐기물 내 유지류 분해에 특화된 미생물 균주의 분리
유지류 분해 균주를 분리하기 위해 하수처리장에서 채취한 활성슬러지를 이용하였고, 유지류의 분해균주는 돼지기름, 소기름, 식용유(옥수수유)를 탄소원으로 분리용 배지(C-medium)에 접종하여 호기적 조건 하(30℃, 120rpm)에서 배양하였다. 사용된 배지조성은 하기 (표1)에 나타내었다.
상기 균주를 배양한 배지 용액을 육안으로 보아, 성장이 확인된 균주를 10회 계대배양(subculture)을 실시한 후, 고체 LB 평판배지에 재차 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 사용된 상기 고체 LB 평판배지의 조성은 하기 (표2)에 나타내었다. 상기 고체 LB 평판배지에 발생된 콜로니를 이용하여 유지류 분해 균주의 순수분리를 실시한 후, 순수 분리된 유지 분해 균주는 16s RNA 분석을 통하여 동정 및 분리 선택되었다. 상기 분리된 유지류 분해 균주의 동정 및 분석 결과는 도1 과 도6에 나타내었다.
< 표 1> 미생물 균주를 배양하기 위한 배지(liquid C-medium)
< 표 2> 미생물 배양용 LB 고체 배지
실시예 1. 유지류 분해 미생물 균주의 동정
상기 분리된 미생물 균주들의 동정은 16S rRNA gene을 sequencing 함으로써 이루어졌다. 16S RNA는 genomic extraction과 이에 상응하는 PCR에 따르는 한 쌍의 20F(5 uM)(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC)와 1510R(5 uM)(5'-ACGGCTACCTTGTTAGA) primer를 사용하여 증폭하였다. PCR(polymerase chain reaction) 혼합은 2ul dNTP, 2ul 1 x PCR buffer, 0.2ul의 20F(5 uM) 및 1510R(5 uM) primer, 10ul DNA template, 5ul rTaq을 믹스쳐로 혼합하였다. PCR 샘플은 먼저 94℃에서 5분 동안 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 90초간 extention 하여 30회 cylcle을 반복한 다음 72℃에서 5분 동안 증폭시켰다.
상기 증폭된 16S rRNA는 automated sequencer(Model 4200; DNA Analyzer Gene READIR, Li-COR, Inc., USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 서열분석 결과를 이용하여 염기서열상 가장 가까운 위치에 있는 균들과 비교하기 위해 NCBI Blast search program을 사용하여 database로부터 비교분석하였으며 이를 Strain MG2, JK1 로 명명하였다. NCBI Blast search program을 사용한 분석 결과는 도 1과 도 6에 나타내었다. 그 결과를 보면, 식용유를 기질로 이용하여 성장한 분리 균주 중 strain MG2는 Pseudomonas aeruginosa strain과 99% 유사성을 보였다.
실시예 2. 분리 균주 MG2, JK1 균주의 형태학적 분리
유지류 생분해능을 가진 MG2 및 JK1 균주의 성장에 관한 특성분석을 수행하였다. 즉, strain MG2 및 JK1의 분리된 균주를 각각 계대 배양하여 그람염색을 한 후, 광학현미경을 이용하여 상기 균주들의 형태학적 관찰하였다. 그 결과는 도 1 내지 2에 나타내었다. 그람염색법을 실시한 결과, Strain MG2는 양성으로 관찰되었고, Strain JK1은 음성으로 관찰되었다.
실시예 3. 분리 및 동정된 유지류 생분해성 미생물 균주의 성장 특성 분석.
분리 및 동정된 유지류 생분해성 미생물 균주의 성장 특성을 조사하기 위해 200ml C-medium에 유지류 0.5%(w/v)를 넣고 분리된 MG2 및 JK1 미생물 균주 1%(w/v)를 접종하여 배양하였다. 미생물의 성장은 미생물의 배양액의 흡광도를 통하여 간접적으로 측정하였다(도 3 내지 5). 자외선/가시광선 흡광광도계(UV-1240, Shimadzu, Japan)를 사용하여 흡광파장 660nm에서 배양액을 석영 셀(Hellma co., Germany)에 주입하여 배양액의 흡광도를 측정하였다.
3-1. 최적 pH 조사
pH의 조건에 따른 미생물 균주 성장의 영향을 파악하기 위하여 배양액의 초기 pH를 pH5, pH6, pH7, pH9, pH10 으로 조절하여 최적 pH를 조사하였고, 배양온도에 대한 영향을 조사하기 위하여 25℃, 30℃, 35℃, 45℃ 배양조건에서 최적온도를 조사하여 성장곡선을 나타내었다. 각각의 탄소원별 pH 조건에 따른 균주의 배양액 흡광도를 나타낸 구체적인 실험 결과는 도 3 내지 5에서 나타내고 있다.
도 3은 탄소원을 식용유로 사용하였을 때 pH 변화에 따른 유지류 분해 균주 성장곡선을 나타낸 결과이다.
도 4는 탄소원을 돼지기름으로 사용하였을 때 pH 변화에 따른 유지류 분해 균주 성장곡선을 나타낸 결과이다.
도 3 내지 4의 결과로 보아, MG2, JK1 미생물 균주를 다양한 pH 조건에서 배양하였을 때, MG2 균주는 pH 7 과 pH 9에서 가장 높은 성장을 보였고, JK1 균주 pH 10에서 높은 성장을 보였다.
3-2. 최적 온도 조사
탄소원을 식용유로 사용하였을 때, 유지류 분해 균주의 성장에 있어서 온도의 조건에 따른 영향을 파악하기 위하여 배양액의 배양온도가 25℃, 30℃, 35℃, 45℃ 인 배양조건에서 최적온도를 조사하여 성장곡선을 나타내었다. 구체적인 실험 결과는 도 5에서 나타내고 있다.
도 5의 결과로 보아, MG2, JK1 미생물 균주를 다양한 온도 조건에서 배양하였을 때, MG2 균주는 30℃에서 가장 높은 성장을 보였고, JK1 균주 30℃에서 높은 성장을 보였다.
실험예 2. 음식물 폐기물 내 섬유소 분해에 특화된 미생물 균주의 분리
섬유소 분해 미생물 균주를 분리하기 위해 전라남도 A축산가에서 가져온 소의 분변, 부패된 짚과 적절히 섞은 토양시료와 광주광역시 광주우치동물원의 기린, 염소의 분변과 음식물처리기안의 스펀지를 시료로 사용하여 섬유소 분해 미생물을 탐색하였다.
상기 섬유소 분해 미생물의 분리용 배지는 무기배지에 탄소원을 CMC(carboxymethylcellulose), Avicel, Xylan을 탄소원으로 각각 사용하였다. 상기 시료를 분리용 배지(C-medium)에 접종하여 호기적 조건 하(30℃, 120rpm)에서 배양한 후, 육안으로 성장이 확인된 균주를 신선한 상기 배지에 접종하여 10회 이상 계대배양을 실시하였다. 실험에 사용된 배지조성은 하기 (표3)에 나타내었다.
<표 3>
계대배양에 의해 분리된 미생물은 1.0%(w/v)의 carboxymethyl cellulose soldium salt(CMC 배지)의 평판에 재차 도말되어 순수 분리되었으며 분리된 단일 균주들은 섬유소 분해 균주임을 확인하기 위해 Congo 염색방법을 사용하였다. 섬유소를 분해하는 미생물은 효소, endoglucanase의 발현으로 섬유소 활성을 갖는다. 따라서 Cellulase 활성을 가진 미생물을 분리하기 위하여 Congo-red 염색법으로 확인하였다. 1% CMC, Avicel, Xylene 함유 섬유소 평판 배지에 순수 분리하여 액체배지에서 자란 미생물을 한 개의 콜로니가 생성되게 6개의 점을 찍어 48시간 배양하였다. 48시간 자란 콜로니들을 Congo-red(2mg/ml)로 15분간 반응을 시킨 후, 1M NaCl로 세척하였다. 이때 콜로니 주위에 clear(halo) zone을 형성되는데 이는 염색되지 않은 흰 부분을 의미하며 상기 부분은 효소에 의해 발현된 endoglucanase에 의해 CMC가 가수분해 되었음을 나타낸다. 따라서, Clear zone을 형성하며 cellulase 활성을 나타내는 균주를 선정하여 셀룰로오스 분해를 하였다고 판단하여 최종 균주로 선발 하였다. 상기 결과는 도 6 내지 8에 나타내었다.
상기 방법에 의해 분리된 균주는 16s rRNA gene을 sequencing 함으로써 동정하였다.
실시예 4. 섬유소 분해 미생물 균주의 동정
상기 분리된 미생물 균주들의 동정은 16S rRNA gene을 sequencing 함으로써 이루어졌다. 16S RNA는 genomic extraction과 이에 상응하는 PCR에 따르는 한 쌍의 27F(5 uM)(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC)와 1492R(5 uM)(5'-ACGGCTACCTT GTTAGA) primer를 사용하여 증폭하였다. PCR(polymerase chain reaction) 혼합은 2ul dNTP, 2ul 1 x PCR buffer, 0.2ul의 20F(5 uM) 및 1510R(5 uM) primer, 10ul DNA template, 5ul rTaq을 믹스쳐로 혼합하였다. PCR 샘플은 먼저 94℃에서 5분 동안 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 90초간 extention 하여 30회 cylcle을 반복한 다음 72℃에서 5분 동안 증폭시켰다.
상기 증폭된 16S rRNA는 automated sequencer(Model 4200; DNA Analyzer Gene READIR, Li-COR, Inc., USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 서열분석 결과를 이용하여 염기서열상 가장 가까운 위치에 있는 균들과 비교하기 위해 NCBI Blast search program을 사용하여 database로부터 비교분석하였으며 이를 토대로 type species 간의 유사도를 NCBI Blast search program을 사용한 분석 결과는 도 6에 나타내었다. 그 결과를 보면, CMC를 기질로 이용하여 성장한 분리 균주는 Strain DE, GOC2 로 각각 명명하였다. 상기 균주 중 strain G0C2는 Cellulomonas sp.와 83% 동일성을 보였으며, strain DE는 Exiguobacterium sp. 와 98% 동일성을 보였다.
실시예 5. 분리 균주 GOC2, DE 균주의 형태학적 분석
섬유소 생분해성을 가진 GOC2 및 DE 균주의 성장에 관한 특성분석을 수행하였다. 즉, strain GOC2 및 DE의 분리된 균주를 각각 계대 배양하여 그람염색을 한 후, 광학현미경을 이용하여 상기 균주들의 형태학적 관찰하였다. 그 결과는 도 7 내지 8에 나타내었다. 그람염색법을 실시한 결과, Strain GOC2는 양성으로 관찰되었고, Strain DE은 음성으로 관찰되었다. 또한, Strain GOC2는 구균을 형성하고 있으며, Strain DE는 간균을 형성하고 있다.
실시예 6. 분리 및 동정된 섬유소 생분해성 미생물 균주의 성장 특성 분석.
섬유소 분해에 특화된 미생물 균주의 성장 특성에 관한 실험결과 및 그 설명은 다음과 같다.
상기 Congo-red법에서 배지에 성장한 분리된 균체 중 환의 크기가 가장 큰 균체를 선택하여 미생물 성장 특성을 조사하였다. 도 9는 분리된 균주를 이용하여 균체농도를 mamdel's medium에서 비교하였으며, 이때 CMC를 분해하는 GOC2 및 DE 섬유소 분해 균주는 3일 후에 균체가 모두 성장하였다.
실시예 7. 분리 및 동정된 섬유소 생분해성 미생물 균주의 효소 활성도 분석.
상기 분리 및 동정된 섬유소 생분해성 미생물 균주 GOC2 및 DE 균주를 Mandel's 배지에서 CMC 효소 활성도를 측정하였다.
각각의 미생물을 2개의 250ml 플라스크에 100ml 배양액(Mandel's medium, (Carbocymethylcellulose sodium salt(Sigma-Aldrich Co., USA), Yesast extract, K2HPO43H2O , MgSO4·7H2O, MnSO47H2O,(NH4)2SO4, NaCl(Daejung Co.,Korea)) 에 5ml 접종을 시킨 후 10일간 배양을 한다. 일 단위로 배양한 1개의 플라스크에 2개의 e.p 튜브에 1ml을 넣고 원심분리를 13000rpm에 10분간 원심분리, 7000rpm에 20분간 원심분리 하여 배양상등액을 조효소액으로 실험을 하였다.
CMCase에 대한 효소활성도 측정은 2%의 CMC용액의 0.5ml에 배양상등액 0.5ml을 혼합하여 50℃에서 30분간 반응시켜 생성된 환원당을 DNS 방법으로 측정한다.
CMCase 1unit는 1분동안 1u mole의 glucose를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
도 10의 CMC 효소 활성도 측정 결과, CMCase의 최고 활성은 배양 6일째 얻어졌다. 특히, GOC2 균주가 4일째 0.58 U/ml로 가장 높게 나타났으며 DE 균주는 3일째 0.32 U/ml로 가장 높게 나타났다
7-1. 온도 및 pH 조건에 따른 효소 활성도 분석
pH의 조건 및 온도에 따른 섬유소 분해 미생물 균주의 효소활성도 영향을 파악하기 위하여 섬유소 분해 균주의 균체를 pH 조건(3,5,7,9,10) 및 배양온도 조건(25℃, 30℃, 35℃, 40℃)을 변화하였을 때 나타나는 효소활성도를 측정하였다.
도 11에서 온도 및 pH에 따른 GOC2 및 DE 균주의 효소활성도를 비교한 결과, GOC2 및 DE 균주는 배양 온도 30℃, pH 7에서 가장 높은 활성도가 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 8. 유지류 및 섬유소 생분해 미생물 균주의 고정화 방법
상기에서 분리 및 동정된 유지류 및 섬유소의 분해에 뛰어난 효능을 발휘하는 미생물 균주들을 활용하여 상기 미생물 균주를 다공성 우드칩에 고정화하였다. 상기 고정화는 음식물 폐기물의 분해와 이에 따른 음식물 폐기물 내 내재된 유지류 및 섬유소의 분해에 대한 미생물 균주를 우드칩에 고정화한 방법으로 나아가, 유지류 및 섬유소 생분해성 종균제로 활용할 수 있다.
실험예 1 및 실험예 2에 따라 분리된 MG2, JK1, GOC2 및 DE 유지류 및 섬유소 분해 균주를 10일간 혼합배양한 후, 혼합배양한 배양배지(Mandel's medium, (Carbocymethylcellulose sodium salt(Sigma-Aldrich Co., USA), Yesast extract, K2HPO43H2O , MgSO4·7H2O, MnSO47H2O,(NH4)2SO4, NaCl(Daejung Co.,Korea)), LB medium,(Trypton(Acumedia, USA), Yeast extract, NaCl(Daejung Co, Korea)) 2L을 원심분리(x 8000g, 5분)하여 250ml로 농축시켰다. 우드칩(“편백 세상” http://www.bkmart.co.kr/에서 편백나무 재질의 우드칩 주문(5~7mm))10g씩 거즈에 넣어 봉한 다음, 상기 유지류 및 섬유소 분해 균주들을 농축 시킨 농축액에 20시간 담근 후 우드칩을 담은 거즈를 꺼내 자연건조하여 고정화하였다. 자연 건조된 바이오칩(상기 유지류 및 섬유소 분해 균주가 상기 우드칩에 고정되도록 한 형태를 “바이오칩” 이라 한다.)의 세공구조 및 미생물의 고정정도를 확인하기 위해서 FE-SEM을 이용하여 미생물 고정 전과 후를 비교하여 관찰하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
Claims (7)
- 유지류 또는 섬유소 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 Pseudomonas aeruginosa MG2(KACC91881P), Acinetobacter baylyi JK1(KACC91878P), Cellulomonas sp. GOC2(KACC91879P) 및 Exiguobacterium sp. DE(KACC91880P) 균주의 혼합균주를 배양한 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 Pseudomonas aeruginosa MG2(KACC91881P), Acinetobacter baylyi JK1(KACC91878P)균주는 유지류 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 것을 특징으로 하는 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 Cellulomonas sp. GOC2(KACC91879P), Exiguobacterium sp. DE (KACC91880P)균주는 섬유소 음식물 폐기물 생분해성을 갖는 것을 특징으로 하는 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주.
- 제 1항 내지 3항중 어느 한 항의 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 담체에 고정화한 유지류 또는 섬유소 음식물 폐기물 생분해용 미생물종균제.
- 제 4항에 있어서,
상기 담체는 우드칩인 것을 특징으로 하는 유지류 또는 섬유소 음식물 폐기물 생분해용 미생물종균제.
- 제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 유지류 또는 섬유소 생분해용 미생물 균주를 혼합배양하여 배양액을 농축하는 단계; 및 상기 농축한 배양액을 우드칩에 고정화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 고정화 방법.
- 제 6항에 있어서,
상기 농축한 배양액을 우드칩에 5 내지 20시간 동안 고정시키는 것을 특징으로 하는 미생물 고정화 방법.
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