KR101578461B1 - Skin whitening coumarin compound having inhibitory ability of melanin synthesis, composition for whitening skin and purification method of cumarin compound - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제, 그를 함유하는 피부 미백용 조성물 및 상기 쿠마린계 화합물의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명은 당귀추출물로부터 분리된 쿠마린계 화합물이 저농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현하고 세포 독성이 없어, 상기 쿠마린계 화합물이 피부 미백제로서 유효하며, 이를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용도의 피부외용제 조성물 및 기능성 식품에 유용하게 적용될 수 있다.The present invention relates to a skin whitening agent comprising a coumarin compound having the ability to inhibit melanin production, a skin whitening composition containing the same, and a method for separating the coumarin compound.
The present invention relates to a cosmetic composition for skin whitening, a composition for skin whitening comprising the same, a melanin pigmentation composition containing the same, And can be usefully applied to skin external composition compositions and functional foods for prevention and improvement.
Description
본 발명은 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제, 그를 함유하는 피부 미백용 조성물 및 상기 쿠마린계 화합물의 분리방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴보다 저농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현하고 세포 독성이 없으므로, 쿠마린계 화합물이 피부 미백제로서 유효하며, 이를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용도의 피부외용제 조성물과 기능성 식품으로의 용도 및 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법에 관한 것이다. The present invention relates to a skin whitening agent composed of a coumarin compound having the ability to inhibit melanin production, a skin whitening composition containing the same, and a method for separating the coumarin compound. More particularly, the present invention relates to a skin whitening agent, The present invention relates to a cosmetic composition for skin whitening, a composition for preventing or improving melanin pigmentation, and a composition for external application for skin preventing or improving melanin pigment, which is effective as a skin whitening agent, As a functional food, and a method for separating coumarin-based compounds from Angelica giganteum extracts.
사람의 피부색을 결정하는 요인으로는 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무를 들 수 있다. Factors that determine the skin color of a person include the activity of melanocytes that make the melanin pigment, the distribution of the blood vessels, the thickness of the skin, and the presence or absence of pigment in and out of the human body such as carotenoids and bilirubin.
이중에서 인체내의 멜라닌 형성 세포인 멜라노사이트에서 타이로시나제(tyrosinase) 효소 작용으로 인해 생성되는 흑색 멜라닌(melanin) 색소를 가장 중요한 요인으로 들 수 있다. Among them, the melanin pigment produced by tyrosinase activity in melanocyte, a melanocyte-forming cell in the human body, is the most important factor.
일반적으로 생성된 멜라닌은 멜라노좀(melanosome) 상태로 주변의 케라티노사이트(keratinocyte)로 이동되며 각질화에 의해 제거되지만, 이러한 과정이 생리적 및 환경적 요인으로 인해 원활히 진행되지 못할 경우 기미, 주근깨, 색소침착 등과 같은 피부색소 침착의 이상 증상이 야기된다. Generally, melanin is melanosomally transferred to peripheral keratinocytes and is removed by keratinocyte. However, if this process is not proceeded smoothly due to physiological and environmental factors, And abnormalities of skin pigmentation such as depression and irregularity.
이에, 피부 미백에 관해 높아지는 관심과 꾸준한 시장 요구에 따라, 천연식물소재로부터 추출된 미백활성성분이 유효성분으로 함유됨으로써, 피부 안정성이 개선하고 피부자극이 없으면서 티이로시나제(tyrosinase) 저해 활성을 가지는 화장료 조성물에 대한 연구 개발이 활발하다. In view of the increased interest in skin whitening and steadily increasing market demand, whitening active ingredients extracted from natural plant materials are contained as active ingredients, thereby improving skin stability and inhibiting tyrosinase inhibition activity without skin irritation The research and development of a cosmetic composition having a variety of active ingredients has been actively conducted.
상기 천연식물소재의 일례로서, 상백피(일본공개특허 소55-44375, 소64-26507, 소64-83009, 평1-25687, 평5-139950, 한국공개특허 제92-002109호, 제97-021273호), 감초(일본공개특허 소60-214721, 소63-23809, 소64-63506, 평1-149706, 한국공개특허 제92-002109호, 제97-025601호) 등의 다수가 타이로시나제 저해 활성에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다고 보고되어 있다. 그러나, 이상의 천연식물소재로부터 추출된 미백 화장료 조성물의 경우, 여전히 안전성, 안정성, 변색 가능성 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데 문제점이 지적되어, 실제 사용시에는 낮은 함량으로 인해 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.As an example of the above natural plant material, there can be mentioned an algae (Japanese Patent Laid-open No. 55-44375, Japanese Laid-open Patent Application No. 64-26507, Japanese Laid- 021273), licorice (Japanese Patent Laid-open Nos. 60-214721, 63-23809, 64-63506, 1-149706, Korean Patent Publication Nos. 92-002109 and 97-025601) And inhibits melanin production by acting on the inhibitory activity of cinnamic acid. However, in the case of the whitening cosmetic composition extracted from the above natural plant material, there is still a problem in using the cosmetic or pharmaceutical product at an effective concentration or higher in view of safety, stability, and discoloration potential. In actual use, .
현재 천연식물소재에서 추출되어 티이로시나제(tyrosinase) 저해 활성이 입증된 원료로서, 하이드로퀴논(hydroquinone), 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아스코르빈산(ascorbic acid) 등이 사용되고 있다. 그러나, 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안정성 문제, 화장료 배합시 제형 및 그 안정성 문제 등으로 인해 사용이 제한되고 있다.Hydroquinone, kojic acid, arbutin, ascorbic acid and the like are currently used as raw materials extracted from natural plant materials and having proven tyrosinase inhibitory activity . However, use thereof is limited due to insufficient whitening effect, stability to the skin, problems in formulations and stability of cosmetic compositions, and the like.
이에, 본 발명자들은 종래 천연식물소재로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백 화장료 조성물의 문제점을 개선하고자 노력한 결과, 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물을 분리하고, 상기 쿠마린계 화합물이 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴보다 저농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현하고 세포 독성이 없음을 확인하여 다양한 피부 미백용도에 적용함으로써, 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made efforts to improve the problem of a skin whitening cosmetic composition containing an active ingredient extracted from a natural plant material. As a result, the present inventors have succeeded in separating a coumarin-based compound from the Angelica gigantosa extract and found that the coumarin-based compound is a known melanin- The present invention has been accomplished by applying the present invention to various skin whitening applications by realizing excellent melanin production inhibitory effect at a low concentration than arbutin and confirming no cytotoxicity.
본 발명의 목적은 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백효능이 확인됨에 따라, 상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a skin lightening agent comprising the coumarin compound as a coumarin compound derived from Angelica gigas Nakai extract is confirmed to have a skin whitening effect according to the ability to inhibit melanin formation.
본 발명의 다른 목적은 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백효능을 가지는 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백으로 적합한 용도를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an application suitable for skin whitening containing an active ingredient of coumarin-based compound derived from Angelica gigas Nakai extract having melanin production inhibition and skin whitening effect.
본 발명의 또 다른 목적은 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for separating coumarin-based compounds from Angelica gigas Nakai extract.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a skin lightening agent comprising a coumarin compound having melanin production inhibitory activity, which is derived from Angelica gigas Nakai,
화학식 1
상기 화학식 1에서 R1은 수소, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 알킬렌기 및 페닐기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.In Formula 1, R 1 is any one selected from the group consisting of hydrogen, a C 1 -C 6 alkyl group, a C 1 -C 6 alkylene group, and a phenyl group.
더욱 바람직하게는 본 발명은 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 유래된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공한다.More preferably, the present invention relates to a composition comprising Angelica The present invention provides a skin lightening agent comprising a coumarin compound represented by the following formula (2) derived from gigas NaKai root extract.
화학식 2(2)
본 발명은 이상의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 및 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a cosmetic composition for skin whitening inhibiting melanin production comprising a skin lightening agent comprising a coumarin compound and a cosmetically acceptable carrier.
이때, 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에서의 상기 쿠마린계 화합물의 함량은 전체 조성물 함량에 대하여, 0.000001 내지 10중량%로 함유되는 것이다.At this time, the content of the coumarin compound in the cosmetic composition for skin whitening inhibiting melanin production is 0.000001 to 10% by weight based on the total composition.
본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물은 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼, 클렌징, 비누 및 콘실 스틱으로 이루어진 어느 하나의 제형에 적용되어 제공될 수 있다. The melanin-inhibiting skin whitening cosmetic composition of the present invention may be applied to any one of a cream, a skin, a lotion, a powder, a spray, a foundation, an essence, a gel, a pack, a foam, a cleansing, a soap, have.
본 발명은 이상의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for external application for skin for preventing and improving melanin pigment deposition comprising 0.000001 to 10% by weight of a skin lightening agent comprising the above coumarin compound as an active ingredient.
또한, 본 발명은 이상의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제0.000001 내지 10중량%를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.The present invention also provides a functional food for prevention and improvement of melanin pigment deposition comprising 0.000001 to 10% by weight of a skin lightening agent comprising the above coumarin compound as an active ingredient.
본 발명은 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공한다. 구체적으로, 건조된 당귀 뿌리의 분쇄물을 C1-C4 알코올로 추출하여 추출액을 얻는 단계; 상기 추출액을 건조한 후 물에 현탁하고 유기용매를 첨가하여 유기용매 분획물을 수득하는 단계; 상기 수득된 분획물을 농축하여 농축액을 얻는 단계; 및 상기 농축액을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계;로 이루어진 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공한다.The present invention provides a method for separating coumarin-based compounds from Angelica gigas Nakai extract. Specifically, the step of extracting the pulverized product of dried angelica root with C 1 -C 4 alcohol to obtain an extract; Drying the extract, suspending it in water and adding an organic solvent to obtain an organic solvent fraction; Concentrating the obtained fraction to obtain a concentrated liquid; And separating and purifying the concentrate by chromatography. The present invention also provides a method for separating a coumarin-based compound from an Angelicae Radix extract.
상기에서, 유기용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 시클로헥산 및 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용한다.In the above, the organic solvent uses at least one selected from the group consisting of ethyl acetate, acetone, ether, benzene, chloroform, hexane, cyclohexane and petroleum ether.
본 발명에 의하면, 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 저농도에서도 멜라닌 생성 억제 효과가 탁월함을 확인함으로써, 다양한 피부 미백용도에 유용하다. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a coumarin compound derived from Angelica gigas Nakai extract is excellent in the effect of suppressing melanin formation even at a low concentration, so that it is useful for various skin whitening applications.
이에, 본 발명의 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물은 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체에 안정성이 우수하여 그 효과가 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없는 안전성이 우수한 물질로서 이를 함유한 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물 또는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품에 적용할 수 있다.Thus, the coumarin-based compound derived from the Angelica gigantosa extract of the present invention is excellent in the prevention of blackening of skin cells, has excellent stability to the substance itself, maintains its effect for a long period of time, And a composition containing the same can be applied to a cosmetic composition for skin whitening, a composition for external application for skin for preventing and improving melanin pigmentation, or a functional food for prevention and improvement of melanin pigment deposition.
도 1은 본 발명의 당귀 뿌리추출로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물의 농도별 세포생존율 결과를 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 당귀 뿌리추출로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물의 농도별 멜라닌 생합성 억제실험 결과를 도시한 것이고,
도 3은 본 발명의 당귀 뿌리추출로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물의 농도별 멜라닌 생성에 영향을 주는 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, MITF 발현 억제에 대한 웨스턴 블럿 결과이다. Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a graph showing the cell survival rate of each of the coumarin compounds isolated and purified from Angelica gigas Root Extract of the present invention,
FIG. 2 is a graph showing the results of inhibition of melanin biosynthesis by concentrations of coumarin compounds isolated and purified from Angelica gigas Root Extract of the present invention,
FIG. 3 is the result of western blot for suppression of tyrosinase, Trp-1, Trp-2 and MITF expression, which affect melanin production by concentration of coumarin compounds isolated and purified from Angelica gigas Root Extract of the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공한다. The present invention provides a skin lightening agent comprising a coumarin compound having melanin production inhibitory activity, which is derived from Angelica gigas Nakai extract and is represented by the following formula (1).
화학식 1
상기 화학식 1에서 R1은 수소, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 알킬렌기 및 페닐기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.In
더욱 바람직하게는 본 발명의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제는 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 분리 정제된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물(7-hydroxy-6-(3-methylbut-2-enyl)chromen-2-one)로 이루어진 것이다. More preferably, skin lightening agents consisting of coumarin-based compounds of the present invention, Angelica (Angelica gigas NaKai) coumarin-based compounds to the purified extract isolated from the roots of the formula 2 (7-hydroxy-6- ( 3-methylbut-2- enyl) chromen-2-one.
화학식 2(2)
본 발명의 당귀추출물은 당귀(Angelica gigas NaKai)로부터 추출하여 얻은 것이 바람직하다. 이때, 당귀(Angelica gigas NaKai)는 미나리과에 속하는 다년생 풀로, 한방에서는 그 뿌리를 말린 것이 주로 약제로 이용된다. 맛은 달고 매우며 성질은 따뜻하다. 당귀는 심경, 간경, 비경에 작용하며, 혈액 생성을 촉진시켜 빈혈의 예방 및 치료에 효과적이고, 스트레스로 인한 생리불순에 효과적이며, 보혈, 부인병에 좋은 것으로 알려져 있다. 또한 대변을 통하게 하고 출혈을 멈추게 한다. 약리실험을 통해 진정작용, 진통작용, 강압작용, 억균작용, 약한 이뇨작용, 이담작용 등이 밝혀져 있다. The Angelica gigantosa L. extract of the present invention is an Angelica sp. gigas NaKai ). ≪ / RTI > At this time, Angelica gigas NaKai ) is a perennial grass belonging to the dragonfly family, and the dried root is mainly used as a medicine. The taste is sweet and very warm and the quality is warm. It is effective for prevention and treatment of anemia, effective for physiological impurity due to stress, and good for blood and women's diseases. It also causes stool to stop and bleeding. Pharmacological experiments have shown that sedation, analgesic action, coercive action, insecticidal action, mild diuretic action, and dandruff action.
이에, 대한민국특허 제252194호에서는 당귀의 펙틴질 다당류를 유효성분으로 함유하는 면역 증강제를 보고하고 있으며, 대한민국특허 제336182호에서는 당귀의 히드록시신남산 유도체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료제 조성물을 공지한 바 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2005-0121324호에서는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트를 유효성분으로 이용하여 배뇨장애 및 부종 치료제로 보고하고 있고, 대한민국 공개특허 제2006-0078343호 및 대한민국특허 제187881호에서는 항암제 조성물로 보고된 바 있다. Korean Patent No. 252194 discloses an immune enhancer containing pectin polysaccharide of Angelica gigas Nakai as an active ingredient and Korean Patent No. 336182 discloses a composition for the prevention and treatment of dementia comprising a hydroxycinnamic acid derivative of Angelica gigantosa as an active ingredient I have noticed. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2005-0121324 discloses an agent for treating micturition disorder and edema using dexacin or dexacinol angelate as an active ingredient. In Korean Patent Publication Nos. 2006-0078343 and 187881 Has been reported as an anticancer composition.
또한, 당귀추출물로부터 분리한 쿠마린계 화합물에 대하여, 대한민국특허 제829122호에서는 폐암 예방 조성물로 보고되어 있으며, 대한민국특허 제1039750호는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 보고한 바 있다.Korean Patent No. 829122 discloses a coumarin-based compound isolated from Angelica gigas extract, which has been reported as a composition for preventing lung cancer. Korean Patent No. 1039750 discloses a pharmaceutical composition for inhibiting multidrug resistance which contains a coumarin compound as an active ingredient .
그러나 쿠마린계 화합물, 특히 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물에 대한 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백 효능에 대한 보고는 아직까지 없다. However, there is no report on the skin whitening effect according to the ability to inhibit melanin production of coumarin-based compounds derived from coumarin-based compounds, in particular, Angelica sinensis extract.
이에, 본 발명은 종래 항암 등의 약학적 기능이 아닌, 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물에 대하여, 멜라닌 합성 유도 자체를 억제하는 물질까지 스크리닝(screening)할 수 있는 쥐의 멜라노마 세포(B16F1 mouse melanoma cell)를 대상으로 실험한 결과, 강력한 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하고, 특히, 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴(arbutin)보다 저농도에서 멜라닌 생성 억제효과가 높은 결과를 확인함에 따라, 쿠마린계 화합물이 피부 미백효능을 구현하는 유효성분으로서 사용될 수 있음을 제공한다.Accordingly, the present invention relates to a method for screening a coumarin-based compound derived from Angelica gigas Nakai extract, which is not a pharmacological function such as anticancer or the like, against melanin synthesis-induced self-inducing substance itself in rat melanoma cells (B16F1 mouse melanoma cell). As a result, it was confirmed that a strong melanin production inhibitory effect was confirmed, and in particular, a melanin production inhibitory effect was high at a lower concentration than arbutin, a known melanin production inhibitor, Can be used as an effective ingredient for realizing a skin whitening effect.
또한, 본 발명의 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물은 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 세포 독성이 없어 멜라닌 생성을 억제하므로, 물질 자체의 우수한 안정성으로 그 효과가 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없어 안전성이 우수하다.In addition, the coumarin-based compound derived from the Angelica gigantosa extract of the present invention is excellent not only in the effect of preventing blackening of skin cells but also because it has no cytotoxicity and inhibits the production of melanin, There is little skin irritation and safety is excellent.
이에, 본 발명은 이상의 당귀추출물로부터 유래된 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 및 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a cosmetic composition for skin whitening inhibiting melanin production comprising a skin whitening agent comprising a coumarin compound inhibiting melanin production derived from the above Angelica gigantosa extract and a cosmetically acceptable carrier.
본 발명에 따른 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에서 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제의 함량은 사용목적, 제품의 제형이나 용도에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 전체 조성물 함량에 대하여, 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%, 더욱 바람직하게는 0.0002 내지 2중량%로 함유된다. 이때, 0.000001 중량% 미만으로 함유되면, 멜라닌 생성 억제 효과 및 미백효과를 기대할 수 없고, 10중량%를 초과하면, 안정성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있다. 본 발명의 실시예에서 가장 바람직하게는 0.00025중량%를 사용하여 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하나, 이에 한정되지 않는다. In the cosmetic composition for inhibiting melanin production according to the present invention, the content of the skin whitening agent composed of a coumarin compound may be varied depending on the purpose of use, the formulations and uses of the product, but preferably the content of the coumarin compound 0.001 to 10% by weight, more preferably 0.0002 to 2% by weight of the skin whitening agent. If it is contained in an amount of less than 0.000001% by weight, an effect of inhibiting the formation of melanin and a whitening effect can not be expected, and if it exceeds 10% by weight, stability or formability is difficult. In an embodiment of the present invention, 0.00025% by weight is most preferably used to produce a skin-whitening cosmetic composition for inhibiting melanin production, but the present invention is not limited thereto.
이에, 본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 쿠마린계 화합물은 5㎍/㎖ 이하의 농도에서 우수한 세포생존율(%)을 보여, 세포 독성을 나타내지 않으며, 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴(arbutin) 농도 1 일 때, 쿠마린계 화합물은 0.0025∼0.005 배 낮은 농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현한다[표 1 및 표 2].Thus, the coumarin compound contained as an active ingredient in the cosmetic composition for skin whitening inhibition of melanin production of the present invention shows excellent cell viability (%) at a concentration of 5 μg / ml or less and does not show cytotoxicity, When the inhibitor arbutin concentration is 1, the coumarin compound achieves excellent melanin generation inhibitory effect at a concentration of 0.0025 to 0.005 times lower ( Table 1 and Table 2 ).
따라서, 본 발명의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 유효성분으로 함유한 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물은 천연추출물의 안정성 측면에서 높은 농도로 사용할 수 없음을 감안한다면, 낮은 농도에서도 미백효과를 발휘할 수 있으므로, 기미, 주근깨, 일광에 의한 흑화 등의 예방, 개선 및 치료에 유용하다. Therefore, the cosmetic composition for skin whitening inhibiting melanin production containing a skin whitening agent comprising the coumarin compound of the present invention as an active ingredient can not be used at a high concentration in view of the stability of the natural extract, It is useful for prevention, improvement and treatment of stains, freckles, and blackening caused by sunlight.
본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물은 이상의 유효성분인 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 이외에, 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. The cosmetic composition for skin whitening inhibition of melanin production of the present invention may contain a cosmetically acceptable carrier in addition to a skin whitening agent composed of coumarin compounds as the above-mentioned effective ingredients.
그 일례로는 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 등이 있으며, 통상적으로 화장품에 사용되는 임의의 다른 성분을 사용할 수 있다. Examples of such a surfactant include a fatty substance, an organic solvent, a solubilizing agent, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, water, A chelating agent, a preservative, a vitamin, a blocking agent, a wetting agent, an essential oil, a dye, a pigment, a hydrophilic or lipophilic active agent, a lipid vesicle and the like, and any other ingredient commonly used in cosmetics can be used.
또한, 본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에는 상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 유효성분으로 함유하되, 주 효과를 손상시키지 않은 범위 내에서, 닥나무추출물, 알부틴, 에틸아스코빌에텔, 유용성 감초추출물, 아스코빌글루코사이드, 나이아신아마이드, 알파-비사볼올, 아스코빌테트라이소팔미테이트 등의 다른 성분 1종 이상을 함유하여, 주 효과에 상승효과를 제공할 수 있다. The cosmetic composition for skin whitening inhibition of melanin production according to the present invention contains a skin whitening agent consisting of the above coumarin compound as an active ingredient and contains a mallow extract, arbutin, ethyl ascorbyl ether, It may contain at least one of other ingredients such as licorice extract, ascorbyl glucoside, niacinamide, alpha-bisabolol, ascorbyl tetraisopalmitate, etc. to provide a synergistic effect on the main effect.
본 발명에 있어서, 피부 미백용 화장료 조성물은 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 제형으로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 제형 형태로도 제조될 수 있다. In the present invention, the skin whitening cosmetic composition may be in the form of a solution, a gel, a solid or a paste anhydrous product, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in water, a suspension, a microemulsion, a microcapsule, a microgranule or an ionic (liposome) A cream, a skin, a lotion, a powder, a spray, or a conceal stick. It can also be prepared in the form of a foam or a formulation of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
구체적으로, 피부 미백용 화장료 조성물은 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼, 클렌징, 비누 및 콘실 스틱(conceal stick)으로 이루어진 어느 하나의 제형에 적용될 수 있다. Specifically, the cosmetic composition for skin whitening can be applied to any one of a cream, a skin, a lotion, a powder, a spray, a foundation, an essence, a gel, a pack, a foam, a cleansing, a soap and a conceal stick.
또한, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물의 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백 효능을 이용하여, 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 피부 과학분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 피부외용제 형태로 제공될 수 있다.The present invention also relates to a skin care cosmetic composition comprising a skin-acceptable medium or a base, which comprises skin-whitening effect according to skin-whitening activity of a coumarin-based compound derived from Angelica gigasini extract, The present invention is not limited thereto.
이에, 본 발명은 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for external application for skin for preventing and improving melanin pigment deposition comprising 0.000001 to 10% by weight of a skin whitening agent comprising a coumarin compound as an active ingredient.
즉, 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체가 안정성이 우수하고 피부 자극이 거의 없는 안전성이 우수한 물질로서, 피부외용 연고 또는 패치제와 같은 약품 조성물에 첨가할 때, 별다른 부작용 없이 강력한 피부 미백효과를 나타낼 수 있다.That is, the coumarin-based compound derived from Angelica gigasini extract is excellent in safety against blackening of skin cells, excellent in stability, excellent in stability and hardly irritating to skin, and used as a skin external ointment or patch When added to a pharmaceutical composition, a strong skin whitening effect can be exhibited without any side effects.
상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 이외에, 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있으며, 상기의 성분들이 함량 역시 피부과학 분야에서 허용되는 범위의 양으로 도입될 수 있다.In addition to the skin whitening agent consisting of the coumarin compound, it may contain adjuvants conventionally used in the field of dermatology, and the contents of the above components may also be introduced in an amount within the range permitted in the skin science field.
나아가, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물 또는 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 유래된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.Further, the present invention relates to a coumarin-based compound represented by the following general formula (I) derived from Angelica gigas Nakai extract or Angelica A functional food for prevention and improvement of melanin pigment deposition comprising a skin lightening agent consisting of a coumarin compound represented by the following formula (2) derived from gigas NaKai root extract as an active ingredient.
본 발명에 따른 기능성 식품의 바람직한 제형은 청량음료, 미네랄워터, 알코올음료 등의 음료 제품 또는 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.The preferred formulations of the functional food according to the present invention may be beverage products such as soft drinks, mineral water, alcoholic beverages, or health functional foods including vitamins and minerals.
본 발명의 쿠마린계 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 함량은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.The coumarin-based compound of the present invention can be added as it is or can be used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method. The content of the active ingredient may be suitably determined according to the intended use (prevention, health or hygiene).
본 발명의 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. The functional food for prevention and improvement of melanin pigment deposition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient. The above-mentioned natural carbohydrates are sugar saccharides such as monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and xylitol, sorbitol and erythritol. Examples of sweeteners include natural sweeteners such as tau martin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like.
상기 외에 본 발명의 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일주스, 과일주스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.In addition to the above, the functional food for prevention and improvement of melanin pigment deposition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickening agents, Preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the functional food of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juice, fruit juice drink and vegetable drink. These components may be used independently or in combination.
본 발명은 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공한다. 구체적으로는, 건조된 당귀 뿌리의 분쇄물을 C1-C4 알코올로 추출하여 추출액을 얻는 제1단계; The present invention provides a method for separating coumarin-based compounds from Angelica gigas Nakai extract. Specifically, the first step of extracting the pulverized product of dried angelica root with C 1 -C 4 alcohol to obtain an extract;
상기 추출액을 건조한 후 물에 현탁하고 유기용매를 첨가하여 유기용매 분획물을 수득하는 제2단계; A second step of drying the extract, suspending it in water and adding an organic solvent to obtain an organic solvent fraction;
상기 수득된 분획물을 농축하여 농축액을 얻는 제3단계; 및 A third step of concentrating the obtained fraction to obtain a concentrated liquid; And
상기 농축액을 크로마토그래피로 분리 정제하는 제4단계;로 이루어진다.And a fourth step of separating and purifying the concentrated liquid by chromatography.
본 발명의 분리방법에서 제1단계에서 사용된 당귀는 식품의약품안전청 공고 제2012 -110호 「생약 등의 잔류ㆍ오염물질 기준 및 시험방법」(식품의약품안전청 고시 제2011-42호, 2011. 8. 22)에 준하는 시험을 진행하여 통과한 약재를 사용한다.In the first step of the separation method of the present invention, the Angelica gigas Nakai was used in the Korean Food and Drug Administration Bulletin No. 2012-110, "Standards and Test Methods for Residues and Pollutants of Herbal Medicines" (Korea Food and Drug Administration Notice No. 2011-42, 2011. 8 Use the medicinal materials passed through the test according to 22).
제1단계는 생약재로 시판되는 당귀의 뿌리를 구입하여 잘게 분쇄한 후, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올을 이용하여 환류 냉각기가 달린 추출기에서 50∼100℃로 1∼5시간 가열 추출하여 추출액을 제조한다. In the first step, roots of Angelica gigas marketed as a herbal medicine are purchased and finely pulverized, and the mixture is heated and extracted at 50 to 100 ° C for 1 to 5 hours in an extractor equipped with a reflux condenser using a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms to prepare an extract do.
상기 얻은 추출액을 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상 더 추출한 후, 추출액을 합하여 감압 농축한 다음 동결건조 또는 분무건조하여 건조 추출물을 얻는다. The obtained extract is filtered with a filter, and the residue is further extracted one or more times by the same method. The extract is then combined, concentrated under reduced pressure, and then lyophilized or spray-dried to obtain a dried extract.
이후 제3단계는 상기의 건조 추출물을 물에 현탁한 후, 동일 부피의 유기용매를 첨가하고 액-액 추출하여 유기용매의 분획물을 얻는다.In the third step, the above-mentioned dried extract is suspended in water, and then an organic solvent of the same volume is added thereto and subjected to liquid-liquid extraction to obtain an organic solvent fraction.
이때, 유기용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 시클로헥산 및 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하며, 본 발명의 실시예에서는 디에틸에테르를 사용하여 얻은 분획물을 농축하여 농축액을 수득한다.At this time, at least one organic solvent selected from the group consisting of ethyl acetate, acetone, ether, benzene, chloroform, hexane, cyclohexane and petroleum ether is used. In the embodiment of the present invention, To obtain a concentrated liquid.
제4단계는 상기 농축액을 실리카겔, 활성 알루미나 등을 충진한 컬럼크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등을 이용하여 분리 정제한다.
In the fourth step, the concentrate is separated and purified by column chromatography packed with silica gel, activated alumina, etc., and high performance liquid chromatography (HPLC).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. The present invention is intended to more specifically illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
<< 실시예Example 1> 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리 및 정제 1> Isolation and purification of coumarin-based compounds from Angelica gigas Nakai extract
당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리 500g을 잘게 분쇄한 후에 메탄올 2L를 가하여 항온조에서 3시간 동안 2회에 걸쳐 증류 냉각하였다. 상기에서 증류 냉각시킨 추출액을 실온으로 냉각시키고, 거름종이로 여과 및 감압 농축하여 당귀 뿌리추출물을 수득하였다. 상기에서 수득한 당귀 뿌리추출물을 증류수에 용해시키고 동량의 디에틸에테르를 가하고, 분배하여 최종 디에틸에테르 분획물을 얻었다. 상기 디에틸에테르 분획물을 증발시켜 농축한 후, 디에틸에테르 분획물을 실리카 충진컬럼(silica gel 60(230-400 mash)-merk)을 이용하여 크로마토그래피를 실시하여 분리정제물 170mg을 얻었다. 상기 분리시 용출용매는 노말헥산과 에틸아세테이트의 혼합액을 사용하였다. Angelica gigas NaKai) root was finely pulverized and 2 L of methanol was added. The mixture was distilled and cooled in a thermostatic chamber for 2 hours. The extract solution, which had been distilled and cooled as described above, was cooled to room temperature, filtered through filter paper and concentrated under reduced pressure to obtain Angelica gigas Root Extract. The angelic root extract obtained above was dissolved in distilled water, and an equal amount of diethyl ether was added thereto, followed by partitioning to obtain a final diethyl ether fraction. The diethyl ether fractions were evaporated and concentrated. The diethyl ether fractions were then chromatographed on silica gel 60 (230-400 mash) -merk) to obtain 170 mg of isolated and purified product. As the elution solvent for separation, a mixed solution of n-hexane and ethyl acetate was used.
<< 실험예Experimental Example 1> 구조분석 1> Structural analysis
상기 실시예 1에서 당귀 뿌리추출물로부터 분리정제물을 NMR 분광기(JEOL, ECA-500, JAPAN) 및 고속액체크로마토그래피(Shimadzu, HPLC Prominence, JAPAN)를 이용하여 구조 분석하였다[1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 1.77, 1.74 (6H,s. gem-(CH3)2), 3.36 (2H, d, J=7.2Hz, H-1'), 5.29 (1H, t, J=7.2 Hz, H-2'), 6.21 (1H, d, J=9.5Hz, H-3), 6.89 (1H, s, H-8), 7.17 (1H, s, H-5), 7.61 (1H, d, J=9.5 Hz, H-4), 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) δ: 17.9 (C-5′), 25.8 (C-4′), 28.7 (C-1′), 103.3 (C-8), 112.4 (C-10), 112.6 (C-3), 120.9 (C-2′), 125.3 (C-6), 128.4 (C-5), 135.4 (C-3′), 143.9 (C-4), 154.2 (C-9), 158.3 (C-2), 162.0 (C-7)].The Example 1 isolated from Angelica root extract in purified water NMR spectrometer (JEOL, ECA-500, JAPAN ) , and high performance liquid chromatography (Shimadzu, HPLC Prominence, JAPAN) were structural analysis using [1 H-NMR (CDCl 3, 500MHz) δ: 1.77, 1.74 (. 6H, s gem- (CH 3) 2), 3.36 (2H, d, J = 7.2Hz, H-1 '), 5.29 (1H, t, J = 7.2 Hz , H-2 '), 6.21 (1H, d, J = 9.5Hz, H-3), 6.89 (1H, s, H-8), 7.17 (1H, s, H-5), 7.61 (1H, d , J = 9.5 Hz, H-4), 13 C-NMR (CDCl 3 , 125 MHz) ?: 17.9 (C-5 '), 25.8 (C-10), 112.9 (C-3), 120.9 (C-2 '), 125.3 (C-6), 128.4 C-4), 154.2 (C-9), 158.3 (C-2), 162.0 (C-7)].
이상의 분광학적 결과로부터, 실시예 1에서 당귀 뿌리추출물로부터 분리 정제한 결과, 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물(7-hydroxy-6-(3-methylbut-2-enyl)chromen-2-one)을 확인하였다. From the above spectroscopic results, it was found that the coumarin compound (7-hydroxy-6- (3-methylbut-2-enyl) chromen-2-one) Respectively.
화학식 2(2)
<< 실험예Experimental Example 2> 세포 독성 시험( 2> Cytotoxicity test ( NRUNRU assayassay ) )
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물의 세포독성을 측정하였다. The cytotoxicity of the coumarin compound obtained in Example 1 was measured.
구체적으로는, B16F1(mouse melanoma cell)을 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dubeco? Modified Eagle Medium, Hyclone) 배지를 이용하여 96-웰 플레이트에 200㎕씩 나누어 넣고 37℃, CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이후 상기 쿠마린계 화합물을 농도별로 처리하여 같은 배양 조건에서 72시간 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 5㎎/㎖ 중성의 적색 시약을 첨가한 배양액을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 CaCl2 용액과 포름알데히드를 처리하고 수분간 400∼500 rpm으로 흔들어 준 뒤 이를 다시 제거하였다. Specifically, 200 μl of B16F1 (mouse melanoma cell) was divided into 96-well plates using DMEM / high glucose (Dubeco® Modified Eagle Medium, Hyclone) medium containing 10% of bovine serum and 1% Gt; C, < / RTI > CO2 incubator for 24 hours. Then, the coumarin-based compound was treated at different concentrations and cultured under the same culture conditions for 72 hours. After completion of the culturing, the culture medium was removed, and the medium supplemented with 5 mg / ml neutral red reagent was added thereto and cultured at 37 ° C for 2 hours. The culture was then removed, treated with CaCl 2 solution and formaldehyde, shaken at 400-500 rpm for several minutes, and then discarded.
그리고 1% 아세트산과 에탄올을 각 웰에 처리하고 10분간 잘 흔들어 준 다음 마이크로 플레이트 계수기(Microplate reader)를 이용하여 570nm/655nm의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.Then, 1% acetic acid and ethanol were added to each well, shaken well for 10 minutes, and the absorbance at 570 nm / 655 nm was measured using a microplate reader. The results are shown in Table 1 below.
상기 표 1 또는 도 1의 결과로부터, 쿠마린계 화합물 5㎍/㎖ 이하의 농도에서 우수한 세포생존율을 보임으로써, 세포 독성에 안정성을 확인하였다. From the results shown in Table 1 or FIG. 1, the cell survival rate was excellent at a concentration of less than 5 μg / ml of the coumarin-based compound, and the stability to cytotoxicity was confirmed.
<< 실험예Experimental Example 3> 멜라닌 생합성 억제 효과 측정 3> Measurement of Melanin Biosynthesis Inhibitory Effect
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물에 대하여, 마우스 유래 B16F1 멜라노마(melanoma) 내 멜라닌(melanin) 생합성을 억제하는 효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 구체적으로는, B16F1(mouse melanoma cell) 세포를 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)에서 배양한 후, 이를 취하여 적정농도의 세포액을 조제하고, 이를 6-웰 플레이트에 분주한 다음, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 α-MSH(Melanocyte stimulating hormone, 멜라닌 세포 자극 호르몬)를 배지에 혼입하여 각 웰에 첨가하고 추출시료인 쿠마린계 화합물을 농도별로 함께 첨가하였다. 이때, 양성대조구는 500㎍/㎖ 농도의 알부틴을 사용하였다. In order to measure the effect of inhibiting melanin biosynthesis in mouse-derived B16F1 melanoma on the coumarin compound obtained in Example 1, the following experiment was conducted. Specifically, B16F1 (mouse melanoma cell) cells were cultured in DMEM / high glucose (Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone) containing 10% of bovine serum and 1% of antibiotics, This was dispensed into a 6-well plate and then cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours. After incubation for 24 hours, the medium was removed and α-MSH (melanocyte stimulating hormone) was added to the wells and added to each well, and the coumarin compound as an extraction sample was added together. At this time, arbutin at a concentration of 500 μg / ml was used as a positive control.
72시간 배양한 후 각 플레이트 내의 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하기 위해 우선 플레이트 내 나머지 배양액을 제거하고, 1×PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 티로신(trypsin)을 각 웰에 처리하고 세포를 떼어낸 후, 각 웰에 배양액을 처리하고 2㎖ 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 이를 10,000 rpm에 수분간 원심분리한 후 튜브 안의 배양액을 제거하고 PBS 처리하고, 다시 원심분리와 제거를 통해 세척하였다. 이후 PBS를 제거하고 건조시켰다. 이에 각각 1N NaOH(10% DMSO)를 처리하고, 다시 70℃에서 수분간 튜브의 뚜껑을 닫은 채 반응시켰다. 반응 후 96-웰 플레이트로 적정량을 분주한 후, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490㎚/655㎚에서 흡광도를 측정하였다. α-MSH를 첨가하지 않은 α-MSH(-) 그룹의 흡광도를 1로 놓고, 다른 그룹은 이에 대한 상대적인 비율로 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다. 음성대조군(α-MSH(-)로 표시)에는 α-MSH, 쿠마린계 화합물 등을 첨가하지 않았다. After culturing for 72 hours, the remaining culture medium in the plate was removed and washed with 1 × PBS (phosphate buffered saline) in order to measure intracellular melanin production in each plate. After trypsin was treated in each well and cells were removed, the culture was treated in each well and transferred to a 2 ml microtube. After centrifugation at 10,000 rpm for several minutes, the culture medium in the tube was removed, treated with PBS, and then centrifuged and removed. The PBS was then removed and dried. Each was treated with 1 N NaOH (10% DMSO) and reacted again at 70 캜 for several minutes while the lid of the tube was closed. After the reaction, an appropriate amount was dispensed into a 96-well plate, and the absorbance was measured at 490 nm / 655 nm using a microplate counter. The absorbance of the? -MSH (-) group to which? -MSH was not added was set to 1, and the other groups were measured at relative ratios. The results are shown in Table 2 below. A-MSH, a coumarin-based compound and the like were not added to the negative control group (represented by? -MSH (-)).
상기 표 2 또는 도 2의 결과에서 확인된 바와 같이, 실시예 1에서 분리정제된 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물은 농도 의존적으로 멜라닌 합성 저해능이 향상됨으로써, 미백 효과를 확인하였다. As can be seen from the results of Table 2 or FIG. 2, the coumarin compound represented by
<< 실험예Experimental Example 4> 4> 웨스턴Western 블럿Blot 실험 Experiment
B16F1(mouse melanoma cell)을 10% FBS-DMEM에 배양하고 이를 취하여 적정 농도 세포액을 조제하였다. 이를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지 제거 후 배지와 농도별 시료를 적정량 혼합한 뒤, 다시 동일 조건에서 72시간 배양시켰다. B16F1 (mouse melanoma cell) was cultured in 10% FBS-DMEM, and a suitable concentration of the cell solution was prepared. This was dispensed into a 6-well plate and then cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours. After culturing for 24 hours, the medium was removed, the sample was mixed with the appropriate amount of the medium, and then cultured for 72 hours under the same conditions.
Blank(블랭크)는 배지만을 넣은 대조군이며, 배양 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하기 위하여 티로신-EDTA 용액을 넣고 세포를 분리하여 마이크로튜브에 획득한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다. Blank (blank) was the control group in which the bacilli were placed. After incubation, the cells were collected by adding a tyrosine-EDTA solution to recover the cells in each plate, and the cells were collected in a microtube and centrifuged to remove the supernatant.
분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 세척하고 원심분리한 후, 펠렛에 PRO-PREPTM Protein Extract Solution(Intron, Inc.)을 처리하여 -20℃에서 15분 반응시켰다. 원심분리 진행 후, 상등액을 튜브로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다. 5% 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 트리스 완충용액에서 1시간 블로킹(blocking) 과정을 거친 후에 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, B-악틴(actin)항체와 각각 반응시켰다. 반응 후, donkey anti-goat lgG-HRP가 결합된 항체를 가하고, ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 일정 시간 동안 반응시킨 후 현상하였다. The separated pellet was washed with 1 x PBS (-) and centrifuged, and the pellet was treated with PRO-PREP TM Protein Extract Solution (Intron, Inc.) was treated and reacted at -20 ° C for 15 minutes. After centrifugation, the supernatant was transferred to a tube and stored at -20 ° C. The protein purified by the above method was subjected to electrophoresis using 8% SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. Trp-1, Trp-2, and B-actin antibodies were blocked in a Tris buffer solution containing 5% skim milk for 1 hour after blocking. After the reaction, donkey anti-goat lgG-HRP are added to the bound antibody, Immobilon TM Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore).
도 3은 본 발명의 당귀추출물로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물에 의한 멜라닌 생성에 영향을 주는 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, MITF 발현 억제에 관한 웨스턴 블록 결과이다.FIG. 3 is a Western block diagram showing inhibition of expression of tyrosinase, Trp-1, Trp-2 and MITF, which affects melanin production by coumarin compounds isolated and purified from Angelica gigas Nakai extract of the present invention.
그 결과, 쿠마린계 화합물 5 ㎍/㎖ 농도에서 티로시나아제, Trp-1, Trp-2 및 MITF 발현이 억제되었다. 따라서 쿠마린계 화합물은 멜라닌 생성 단계에 관여하는 효소들의 발현이 억제됨을 확인하였다.As a result, expression of tyrosinase, Trp-1, Trp-2 and MITF was inhibited at a concentration of 5 mu g / ml of the coumarin compound. Therefore, it was confirmed that coumarin compounds inhibited the expression of enzymes involved in the melanin production step.
<< 처방예Prescription example 1> 1> 유연화장수의 제조Manufacture of softening longevity
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 유연화장수의 처방은 하기 표 3과 같다. The prescription of the softening longevity containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 3 below.
구체적으로, 소듐히알루로네이트는 프로펠러믹서(3000rpm)로 정제수에 분산하여 1% 용액상태로 준비하였다. 소듐히알루로네이트를 제외한 원료 1 내지 8은 프로펠러믹서를 사용하여 수상 용해조에 500rpm으로 균일화시키고 75℃에서 가온하여 완전 용해한 후, 실온으로 냉각하였다. 이후, 별도의 용해조에 원료 9 내지 11을 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하고 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 유연화장수를 제조하였다.Specifically, sodium hyaluronate was dispersed in purified water with a propeller mixer (3000 rpm) to prepare a 1% solution.
<< 처방예Prescription example 2> 영양화장수의 제조 2> Manufacture of nutrition lotion
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 영양화장수의 처방은 하기 표 4와 같다.The prescription of the nutritional lotion containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 4 below.
구체적으로, 프로펠러믹서를 이용하여 카보머를 4000rpm으로 분산하여 2% 용액상태로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 6을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7 내지 14을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 그 다음 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양화장수를 제조하였다.Specifically, the carbomer was dispersed at 4000 rpm using a propeller mixer to prepare a 2% solution state.
<< 처방예Prescription example 3> 에센스의 제조 3> Production of Essence
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 에센스의 처방은 하기 표 5와 같다. The formulation of the essence containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 5 below.
구체적으로, 소듐히알루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서(2000rpm)로 분산하여 1중량% 함유용액으로 준비하였다. 또한 카보머는 정제수에 프로펠러믹서(4000rpm)로 분산하여 2중량% 함유용액으로 준비하였다. 한편, 수상 용해조에 원료 1 내지 12를 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하고, 가온된 수상을 다시 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13 내지 15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 이에, 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 에센스를 제조하였다.Specifically, sodium hyaluronate and hydroxyethylcellulose were each dispersed in purified water in a propeller mixer (2000 rpm) to prepare a solution containing 1% by weight. The carbomer was also dispersed in purified water with a propeller mixer (4000 rpm) to prepare a solution containing 2% by weight. On the other hand,
<< 처방예Prescription example 4> 영양크림의 제조 4> Manufacture of nutritional cream
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 영양크림의 처방은 하기 표 6과 같다. The formulation of the nutritional cream containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 6 below.
구체적으로, 수상 용해조에 원료 1 내지 8을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 별도의 유상 용해조에 원료 9 내지 16을 투입하여 80℃까지 가온 용해한 후 상기 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양크림을 제조하였다.Specifically,
<< 처방예Prescription example 5> 팩의 제조 5> Manufacture of pack
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 팩의 처방은 하기 표 7과 같다. The formulation of the pack containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 7 below.
구체적으로, 별도의 용해조에 원료 1 내지 8을 완전 용해시켜 교반 혼합하고, 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 팩을 제조하였다.Specifically,
<< 처방예Prescription example 6> 연고의 제조 6> Manufacture of ointment
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 연고의 처방은 하기 표 8과 같다. The formulation of the ointment containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 8 below.
<< 처방예Prescription example 7> 7> 패취제의Patchy 제조 Produce
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 패취제의 처방은 하기 표 9와 같다. The formulation of the patch containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 9 below.
<< 처방예Prescription example 8> 기능성 음료의 제조 8> Manufacture of functional beverage
상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 기능성 음료의 처방은 하기 표 10과 같다. The formulation of the functional beverage containing the coumarin compound obtained in Example 1 as an active ingredient is shown in Table 10 below.
구체적으로, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 제조된 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다. Specifically, the above components were mixed according to a conventional health drink manufacturing method, and the mixture was heated at 85 DEG C for about 1 hour with stirring, and the resulting solution was filtered to obtain a sterilized 2 liter container, which was sealed and sterilized, Respectively.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백효능이 확인됨에 따라, 상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공하였다. As described above, the present invention provides a skin lightening agent comprising the coumarin compound according to the present invention, wherein the coumarin compound derived from Angelica gigas Nakai extract has a skin whitening effect according to the ability to inhibit melanin formation.
본 발명의 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물은 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체에 안정성이 우수하여 그 효과가 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없는 안전성이 우수한 물질로서 이를 함유하여, 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물 또는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품 분야에 유용하게 적용할 수 있다.
The coumarin-based compound derived from the Angelica gigantosa extract of the present invention is excellent in the prevention of blackening of skin cells, is excellent in stability to the substance itself, is maintained for a long period of time and has excellent safety without skin irritation. , And can be effectively applied to cosmetic compositions for whitening skin, composition for external application for skin prevention and improvement of melanin pigmentation, or functional foods for prevention and improvement of melanin pigment deposition.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is evident that many alternatives, modifications and variations will be apparent to those skilled in the art.
Claims (9)
화학식 1
상기 화학식 1에서 R1은 수소, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 알킬렌기 및 페닐기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.A skin lightening agent comprising a melanin-inhibiting coumarin compound represented by the following formula (1) derived from Angelica gigas Nakai extract:
Formula 1
In Formula 1, R 1 is any one selected from the group consisting of hydrogen, a C 1 -C 6 alkyl group, a C 1 -C 6 alkylene group, and a phenyl group.
화학식 2
(2)
미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물.A skin lightening agent comprising the coumarin compound of claim 1 or 2,
A cosmetic composition for skin whitening inhibiting melanin production comprising a cosmetically acceptable carrier.
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