KR101576606B1 - 리포칼린 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증 완화용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리포칼린 2 억제제를 유효성분으로 포함하는, 신경병증성 통증 완화 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 리포칼린 2는 말초신경 손상 실험모델인 SNI에 의하여 손상된 뉴런과 관련된 부위에서 LCN2의 발현이 유의적으로 증가하고, LCN2 재조합 단백질을 투여하는 경우, 대뇌 피질 세포 및 척수에서 통증-관련 케모카인을 유의적으로 증가시키고, 통증에 대한 반응이 증가 되고, LCN2 결여 마우스에서 통증에 대한 반응이 감소된다. 따라서, LCN2를 억제하는 경우, 신경병증성 통증을 완화할 수 있음을 밝혀, 리포칼린 2의 억제제는 신경병증성 통증 완화제로서 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 리포칼린 2 억제제를 유효성분으로 포함하는, 신경병증성 통증 완화용 조성물에 관한 것이다.
신경병증성통증은 암, 자가면역 질환 및 대상포진 감염에 의한 신경 압박(nerve compression), 신경 외상(nerve trauma) 및 당뇨병과 같은 신경 손상에 의해 유발되는 급성 만성 통증이다. 성상세포(astrocyte) 및 소교세포(microglia)와 같은 아교 세포(glial cell)의 활성화는 신경병증성 통증의 병리학적의 요인 중 하나이다. 등 척수에서 활성화된 척수 소교세포는 사이토카인, 케모카인, 프로스타글란딘 및 산화질소와 같은 다양한 초기 면역 인자들을 방출한다. 이러한 인자들은 신경을 흥분시키고, 감각섬유로부터 통증-연관 신경전달물질의 방출을 증가시킨다. 이러한 과정은 통증을 증가시키고, 중추적 감작을 이끈다. 실제적으로, 케모카인은 신경병증성 통증의 발달에 중요한 역할을 한다.
LCN2(Lipocalin 2)는 리포칼린 패밀리의 일원으로, 지질 및 여타 소수성 분자와 결합하거나 그들을 운반한다(Flower, D. R. et al. 2000, Biochim Biophys Acta 1482: 9-24; Kjeldsen, L. et al. 2000, Biochim Biophys Acta 1482: 272-283). 또한, LCN2는 24p3 (Flower, D. R., et al. 1991. Biochem Biophys Res Commun 180: 69-74), SIP24(24 kDa superinducible protein)(Hamilton, R. T. et al. 1985, J Cell Physiol 123: 201-208) 및 NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, a human homologue of lcn2)(Borregaard, N. et al. 2006, Biometals 19: 211-215; Kjeldsen, L. et al. 1993, J Biol Chem 268: 10425-10432)로서 알려져 있다. 또한, LCN2는 세포의 아폽토시스 및 생존 모두에서 중요하다는 것이 알려졌고,(Nelson, A. M. et al. 2008, J Clin Invest 118: 1468-1478; Yousefi, S. et al. 2002, Cell Death Differ 9: 595-597; Devireddy, L. R. et al. 2005, Cell 123: 1293-1305; Devireddy, L. R. et al. 2001, Science 293: 829-834; Tong, Z. et al. 2003, Biochem J 372: 203-210; Tong, Z. et al. 2005, Biochem J 391: 441-448), 배발생(embryogenesis) 중에 신장에서 세포 분화를 유도하는데 중심적인 역할을 하고(Yang, J. et al. 2002, Mol Cell 10: 1045-1056), 신장을 허혈성 손상으로부터 보호한다는 점이 알려져 있다(Mishra, J. et al. 2004, J Am Soc Nephrol 15: 3073-3082; Mori, K. et al. 2005, J Clin Invest 115: 610-621). 또한, LCN2는 활성 신장 손상의 표시자로 제시되어 왔다(Mori, K. et al. 2007, Kidney Int 71: 967-970). 다양한 형태의 위장관 손상에서 LCN2는 세포 이동을 촉진함으로써 점막의 재생을 용이하게 한다(Playford, R. J. et al. 2006, Gastroenterology 131: 809-817). 상기한 바와 같이, LCN2의 다양한 역할에 대한 것이 밝혀져 있으나, LCN2의 신경병증성 통증에 대한 역할에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 LCN2가 신경병증성 통증을 유발할 수 있다는 점을 밝혀LCN2를 억제하면, 신경병증성 통증을 완화할 수 있다는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 리포칼린 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증 완화용 조성물을 제공함에 있다.
본 발명은 리포칼린 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증 완화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에서는 SNI 구축 마우스에서, SNI에 의하여 손상된 뉴런과 관련된 부위에서 LCN2의 발현이 유의적으로 증가하고, LCN2 재조합 단백질을 투여하는 경우, 대뇌 피질 세포 및 척수에서 통증-관련 케모카인을 유의적으로 증가시키고, LCN2 결여 마우스에서 통증에 대한 반응이 감소됨을 확인하고, 마우스에서 통증에 대한 반응이 증가됨을 확인하고, 상기의 통증은 수용성 통증이 아닌, 신경병증성 통증임을 확인하였고, LCN2 중화 항체를 SNI 구축 마우스에 주사하는 경우, 신경병증성 통증을 완화할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 LCN2의 억제제는 신경병증성 통증 완화에 유용하게 사용될 수 있다. 여기서, LCN2의 억제제는 LCN2의 발현 또는 활성 억제제 또는 LCN2 수용체 길항제일 수 있다.
상기 발현 억제제는 LCN2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RNAi, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있다.
본 발명에서 "발현 억제"에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것뿐만 아니라 발현이 감소된 것도 포함된다. 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 안티센스 분자를 이용하는 것이 가장 보편적이다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개방형 고리 (open loop) 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합점에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다. 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.
상기 안티센스 분자로는 3중제, 리보자임(ribozyme), RNAi, 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다. 3중제는 이중 나선 DNA 주변을 감아 3 본쇄 나선을 형성하도록 함으로써 전사 개시가 억제되도록 한다(Maher et al.,Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991). 리보자임은 1 본쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 보유한 RNA 효소이다. 리보자임은 표적 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 부위 특이적으로 절단시킴으로써 표적 유전자의 단백질 발현을 억제한다(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990). RNAi(RNA interference)는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀 형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 또는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000). 상기 RNAi 방법에 사용되는 소분자 RNA는 표적 유전자와 상동성을 가지는 이중가닥 RNA 분자이다. 상기에서 RNA 분자를 제조하는 방법으로는 공지된 화학적 합성 방법 및 효소적 방법을 사용할 수 있다. 예를들면, RNA 분자의 화학적 합성은 문헌에 개시되어 있는 방법을 사용할 수 있으며(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999), RNA 분자의 효소적 합성은 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 파아지 RNA 폴리머라제를 이용하는 방법이 문헌에 개시되어 있다(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989). 안티센스 핵산은 표적 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 혼성화되어 2본쇄 분자를 형성함으로써 표적 유전자의 mRNA 해독을 저해하여 단백질 발현을 억제한다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988). 상기 안티센스 핵산은 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 형태로서 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학 합성법, 예를 들어 문헌(Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008)에 기재된 바와 같이 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드로 황화시키는 포스포아미다이트 화학과 같은 방법에 의해 매우 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 LCN2에 대한 siRNA는 LCN2 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합의 친화도 및 뉴클레아제(nuclease) 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
LCN2 단백질의 활성 억제제는 리포칼린 2 수용체 (24p3R) 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는, LCN2의 활성을 중화시킬 수 있는 항-LCN2 항체일 수 있다.
상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 LCN2 단백질의 결합 도메인을 억제하여 LCN2 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 LCN2 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
본 발명에서 항-LCN2 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 LCN2 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
다클론 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 랫트와 같은 여러 온혈 동물로부터 당해 분야의 통상적인 기술 중의 하나를 사용할 수 있다. 즉, 항원을 복막 내, 근육 내, 안내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역시킨다. 상기 항원에 대한 면역성은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 부스터(booster) 면역처리에 따른 다음, 혈청의 소형 샘플을 수집하고 목적하는 항원에 대한 반응성을 시험한다. 동물의 역가가 일단 항원에 대한 이의 반응성의 관점으로 정체 상태에 도달하면, 다량의 다클론 면역혈청을 1주 마다의 출혈 또는 동물을 방혈시킴으로써 수득할 수 있다. 단클론 항체도 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다(Kennettm McKearn and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980). 단클론 항체는 LCN2 단백질을 면역원으로 하여 동물을 면역화시키고, 면역화된 동물의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, LCN2 단백질을 선택적으로 인식하는 하이브리도마를 선별하며, 선별한 하이브리도마를 배양하고, 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 분리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 단클론 항체는 LCN2 단백질을 선택적으로 인식하는 항-LCN2 항체를 생산하는 상기의 하이브리도마를 동물에 주입하고, 주입 후 일정기간이 지난 다음 회수한 동물의 복수로부터 분리함으로써 제조할 수 있다.
본 발명에서는 LCN2 억제제를 국소 (협측(buccal), 설하, 피부 및 안내의 투여를 포함), 비경구(피하, 피내 근육내, 혈관내 및 관절내의 투여를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수도 있으며, 바람직하게는 비경구 투여이나, 이에 한정되는 것은 아니다. LCN2 억제제는 적합한 희석제에 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 뇌 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로서 사용된다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.
본 발명의 LCN2 억제제는 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 적합한 담체의 예로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소로비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀루로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 에멀전, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도; 환자의 연령, 체중, 건강, 성별; 환자의 약물에 대한 민감도; 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율; 치료 기간; 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중 kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎍/체중kg/day의 유효량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 LCN2 억제제는 신경병증성 통증의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 또는 음료 등에 첨가할 수 있다. 상기 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있으며, 특수영양식품 (예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 음료 (예, 과실 음료, 채소류 음료, 발효음료류 등) 및 천연조미료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
식품 또는 음료 중의 LCN2 억제제의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 리포칼린 2 억제제를 개체에 투여하여 신경병증성 통증을 완화시키는 방법을 제공한다.
상기 리포칼린 2 억제제를 투여하는 경로는 국소 (협측(buccal), 설하, 피부 및 안내의 투여를 포함), 비경구(피하, 피내 근육내, 혈관내 및 관절내의 투여를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 포함한다.
상기 개체는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경병증성 통증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 신경병증성 통증 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 “mRNA 수준을 측정하는 제제”는 리포칼린 2 유전자의 mRNA에 상보적인 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브를 포함한다.
본 발명에서 "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 “프로브”란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다
본 발명에서 “단백질 수준을 측정하는 제제”는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신경병증성 통증 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 리포칼린 2 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는, 리포칼린 2 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 항원-항체 복합체를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 상기 항원-항체 복합체란 리포칼린 2 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원(redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료로부터 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 신경병증성 통증의 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 mRNA 발현 수준은 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등의 방법을 통해 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 단백질 발현 수준은 리포칼린 2 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 이용하여, 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 통해 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법들을 통하여, 생물학적 시료에서 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 정상군(대조군)에서의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교함으로써, 정상군(대조군)에 비해 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 현저하게 증가하면 신경병증성 통증인 것으로 진단할 수 있으며, 신경병증성 통증 발생 위험을 예측할 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에 신경병증성 통증 예방 또는 치료 후보물질을 처리하여 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계;를 포함하는 신경병증성 통증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 경우, 리포칼린 2 mRNA 또는 단백질의 발현이 감소되는 경우, 신경병증성 통증에 대한 치료제로 판단할 수 있다.
본 발명의 리포칼린 2 억제제는 염증에 의한 신경병증성 통증에 대한 반응을 완화시킬 수 있으므로, 신경병증성 통증에 대한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 말초신경계 손상 실험 모델인 SNI(spared nerve injury) 마우스에서 LCN2의 발현 양상을 나타낸 도이다[A 및 B:척수의 일측의 후각(ipsilateral dorsal horn); C:반대측(contralateral side)후각, D:등쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglia;DRGs)].
도 2는 SNI 마우스에서 LCN의 발현 위치를 면역염색법에 의하여 확인한 도이다[Dorsal:(A-a:대조군의 척수의 후각; A-b SNI 마우스 척수의 반대측 후각; A-c SNI 마우스 척수의 일측 후각; A-d,f 척수 후각에서 NeuN과 이중 면역 염색);
Ventral:(A-a 대조군의 척수의 전각; A-b SNI 마우스 척수의 반대측 전각; A-c SNI 마우스 척수의 일측 전각; A-d,f SNI 마우스 척수 전각에서 NeuN과 이중 면역 염색);
B:SNI 구축 마우스에서 척수 일측에서 LCN2(녹색)을 IBA-1(a) 또는 GFAP(b)와 이중 면역 염색).
도 3은 SNI 구축 마우스에서 기계적 이질통에 대한 PWT(paw withdrawal threshold)를 나타낸 도이다.
도 4는 SNI 구축 마우스 척수에서, LCN2 소교세포의 활성화 및 p38 MAPK의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 5는 SNI 구축 마우스 척수에서, LCN2 소교세포의 활성화 및 p38 MAPK의 발현 위치를 나타낸 도이다.
도 6 SNI 구축 마우스 척수에서, CCL2 및 CXCL1의 발현 양을 나타낸 도이다.
도 7은 SNI 구축 마우스 척수에서, 24p3R의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 8은 SNI 구축 마우스 척수에서, 24p3R 및 LCN2가 함께 발현되는지 결정하기 위하여, LCN2 및 24p3R을 이중 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 대뇌 피질 세포에서, 케모카인 발현 양을 나타낸 도이다.
도 10은 마우스에서, 급성 수용성 통증 또는 신경병증성 통증에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 11은 SNI 통증 모델 실험에서, 리포칼린 2 중화 항체를 척수강 내 주사하여 리포칼린 2를 억제하는 경우, 신경병증성 통증에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 2는 SNI 마우스에서 LCN의 발현 위치를 면역염색법에 의하여 확인한 도이다[Dorsal:(A-a:대조군의 척수의 후각; A-b SNI 마우스 척수의 반대측 후각; A-c SNI 마우스 척수의 일측 후각; A-d,f 척수 후각에서 NeuN과 이중 면역 염색);
Ventral:(A-a 대조군의 척수의 전각; A-b SNI 마우스 척수의 반대측 전각; A-c SNI 마우스 척수의 일측 전각; A-d,f SNI 마우스 척수 전각에서 NeuN과 이중 면역 염색);
B:SNI 구축 마우스에서 척수 일측에서 LCN2(녹색)을 IBA-1(a) 또는 GFAP(b)와 이중 면역 염색).
도 3은 SNI 구축 마우스에서 기계적 이질통에 대한 PWT(paw withdrawal threshold)를 나타낸 도이다.
도 4는 SNI 구축 마우스 척수에서, LCN2 소교세포의 활성화 및 p38 MAPK의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 5는 SNI 구축 마우스 척수에서, LCN2 소교세포의 활성화 및 p38 MAPK의 발현 위치를 나타낸 도이다.
도 6 SNI 구축 마우스 척수에서, CCL2 및 CXCL1의 발현 양을 나타낸 도이다.
도 7은 SNI 구축 마우스 척수에서, 24p3R의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 8은 SNI 구축 마우스 척수에서, 24p3R 및 LCN2가 함께 발현되는지 결정하기 위하여, LCN2 및 24p3R을 이중 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 대뇌 피질 세포에서, 케모카인 발현 양을 나타낸 도이다.
도 10은 마우스에서, 급성 수용성 통증 또는 신경병증성 통증에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 11은 SNI 통증 모델 실험에서, 리포칼린 2 중화 항체를 척수강 내 주사하여 리포칼린 2를 억제하는 경우, 신경병증성 통증에 대한 반응을 나타낸 도이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
1]말초신경 손상 모델인
SNI
-모델 마우스에서
LCN2
(
lipocalin2
)의 발현 양상 확인.
1.
SNI
(
spared
nerve
injury
) 모델 구축
야생형 C57BL/6 마우스 및 LCN2-결여 마우스(Samtaco Inc., Osan, South Korea 및 Dr.Shizo Akira, Osaka University, Japan)를 2%의 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 후, 3 가닥의 좌골 신경 중 비골 신경, 경골 신경 및 비복 신경을 노출시켰다. 비골 및 경골 신경을 비단실으로 단단하게 결찰하고, 상기 두 신경의 ~2mm 조각을 제거하였다. 비복 신경은 온전하게 유지하였고, 상처는 식염수로 관주하고, 층으로 외과적 피부봉합기를 이용하여 봉합하였다. 수술하지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였고, 수술한 날짜를 0일로 맞추었다.
2.
RT
-
PCR
에 의한
LCN2
발현 양상 확인.
LCN2의 신경병증성 통증에서 역할을 규명하기 위하여, 실시예 1-1의 마우스를 안락사시키고, PBS에 담근후, 동맥에서 혈액을 추출하였다. SNI-손상 마우스의 척수에서 LCN2의 발현을 RT-PCR을 통하여 확인하였다. 등쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglion;DRGs) 및 허리의 척수를 빠르게 절단하였다. 척수의 후각(dorsal horn)을 추출하기 위하여, L4-L6에 상응하는 부위를 4 등분으로 나누었다(dorsal right, dorsal left, ventral right 및 ventral left); 상기 4개의 부위를 바로 액체질소로 얼렸고, mRNA를 추출하기 위하여, Trizol reagent(Life Technologies, Carlsbad, CA)로 균질화 하였다. 상기 4개의 부위로부터의 2 ug의 총 RNA를 첫번째 가닥 cDNA 합성 키트(first strand cDNA synthesis kit;MBI Fermentas, Hanover, Germany)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 이 후, DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler(MJ Research, Waltham, MA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 이용할때 하기 표 1의 프라이머를 이용하였다. PCR 산물을 분석하기 위하여, 각각의 10 ul의 PCR 산물을 1% 아가로오스 젤에서 전기영동하였고, UV로 LCN2의 발현여부를 확인하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다. LCN2의 발현 양상을 도 1에 나타내었다.
| 염기 서열 | 서열번호 | ||
| LCN2 정방향 프라이머 | 5`ATGTCACCTCCATCCTGGTC-3` | 1 | |
| LCN2 역방향 프라이머 | 5`-CACACTCACCACCCATTCAG-3` | 2 | |
| GAPDH 정방향 프라이머 | 5`-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3` | 3 | |
| GAPDH 역방향 프라이머 | 5`-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3` | 4 | |
도 1의 A 및 B에 나타난 바와 같이, 척수의 일측의 후각(ipsilateral dorsal horn)에서 SNI 모델 구축 후, 1일 내지 3일 후 LCN2의 mRNA 수준이 현저하게 증가함을 확인하였다.
또한, 도 1의 C에 나타난 바와 같이, 일측 부분(ipsilateral side)에서 뇌의 반대측(contralateral side)에서의 mRNA 발현 수준보다 현저히 높음을 확인하였다.
또한, 도 1의 D에 나타난 바와 같이, SNI 모델의 등쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglia;DRGs)에서 LCN2 mRNA의 발현이 유도되지 않음을 확인하였다.
2.척수에서
면역형광염색법을
이용한
LCN2
단백질의 위치 확인
LCN2 단백질의 위치를 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 마우스를 안락사시키고, 0.1M의 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정 후, PBS에 담그었다. L4/5 척수 및 좌골신경을 제거하고, 하룻동안 상기와 같은 고정액으로 고정하였다. 이 후, 상기 척수 및 좌골 신경을 4℃, 30%의 수크로오스를 포함하는 0.1M의 PBS에서 보존시켰다. 냉동유지장치를 이용하여 10um 크기의 좌골 신경을 준비하여 젤라틴으로 덮힌 슬라이드에 올려놓았다. 그리고 30um 크기의 척수를 PBS에 보관하였다. 상온에서 1시간 동안 0.3% Triton X-100에서 4%의 일반 혈청(serum)으로 배경 염색을 제고하였다. 이 후 실험 목적에 따라 LCN2(염소, 1:500; R&D Systems), 24p3R (토끼, 1:200; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), NeuN(마우스, 1:200; Millipore, Billerica, MA), phospho-p38 MAPK (토끼, 1:200; Cell Signaling Technology), GFAP (마우스, 1:200; BD, Franklin Lakes, NJ), 및 IBA-1 (마우스, 1:200; Wako)에 대한 항체를 일차 항체로 이용하였고, 2차 항체로 FITC 또는 Cy3가 접합된 2차 항체를 이용하여(1:200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), LCN2가 어디서 발현되는지 확인하였고, 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, SNI 처리하지 않은 대조군 마우스의 척수의 후각의 깊은 층(deep layer) 및 전각(ventral horn)의 운동 신경에서 최소 LCN2-면역 반응을 확인하였다. 그러나, SNI-모델 구축 3일 후, LCN2의 면역 반응은 등축성 전각의 운동 신경에서 유의적으로 증가함을 확인하였다. 반면에, 일측 후각에서는 LCN2의 면역반응은 대조군에 비교하여 유의적으로 다르지 않음을 확인하였다.
또한, SNI 모델 마우스에서, 후각 및 전각에서 LCN2의 면역반응은 신경 마커 NeuN과 함께 위치함을 확인하였고, 소교세포 마커 IBA-1 또는 성상세포 마커 GFAP와 함께 위치하지 않음을 확인하였다.
<
실시예
2>
LCN2
유무에 따른
SNI
구축 마우스에서 기계적 통증에 대한 반응 확인.
말초 신경 손상 후, 통증 과민성과 LCN2의 관계를 확인하기 위하여, LCN2-결여 SNI 구축 마우스 및 야생형 SNI 구축 마우스의 기계적 통증에 대한 회피 반응정도를 비교하였고, 이 후 LCN2 재조합 단백질을 투여하여 기계적 통증에 대한 LCN의 역할을 확인하였다. 손상된 일측 및 손상되지 않은 반대측 후족(hind paws)에서 기계적 자극에 대한 민감도를 SNI 수술 전, SNI 수술 후 10일 동안 측정하였다.
보다 구체적으로, 다리의 기계적 민감도를 정량화하기 위하여, 투명한 플라스틱 박스에서 마우스를 메탈메쉬층(metal mesh floor)에 두었고, 2.0g 및 4.0g의von Frey hair를 이용하여 왼쪽 및 오른쪽 족에 적용하여, 발을 회피하는데 요구되는 자극 강도의 역치를 결정하였고, 상기 마우스들의 50% PWT(paw withdrawal threshold)를 Dixon`s up-down method로 측정하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, SNI 모델 구축 후, 야생형 마우스는 반대측 후족 또는 수술 전의 기본 값과 비교하여, 일측 후족에서 통증 과민성을 나타냄을 확인하였다. 그러나, LCN2 결여 마우스에서 SNI 모델 구축 1 내지 3일 후, SNI에 의하여 유도된 기계적 무해 자극에 대한 통증 반응은 상당히 감소됨을 확인하였다.
또한, 통증 민감도에 대한 LCN2의 효과를 확인하기 위하여, 재조합 LCN2을 0.1 또는 1㎍을 야생형 마우스에 주입하는 경우, 1㎍ 주입 3시간 후, PWT(paw withdrawal threshold)가 상당히 감소됨을 확인하였다. 상기의 PWT의 감소효과는 3일 동안의 시험기간동안 유지되었다. 반면에 낮은 양(0.1㎍)을 처리한 마우스의 PWT는 주입 3시간 내지 1일 후, 감소됨을 확인하였다.
<
실시예
3>
LCN2
-결여
SNI
(
spared
nerve
injury
) 구축 마우스에서
p34
MAPK
인산화 및 소교세포의 활성의 감소 확인.
1.
IBA
-1 및
p38
MAPK
(
mitogen
-
activated
protein
kinase
)활성화
양상 확인.
IBA-1 (마우스, 1:200; Wako) 및 phospho-p38 MAPK (토끼, 1:200; Cell Signaling Technology)에 대한 항체를 일차 항체로 이용하여, 실시예 1-2와 같은 방법으로, IBA-1의 발현 양상 및 phospho-p38 MAPK 활성화 양상을 확인하였다.
이의 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 일측 척수(ipsilateral spinal cord)에서 반대측 척수 부분과 비교하여 IBA-1의 면역반응이 높게 나타남을 확인하였다.
그러나, LCN2가 결여된 마우스에서 일측 척수의 IBA-1 면역반응이 약화됨을 확인하였다. 반면에, 반대측 척수 부분에서, 야생형 마우스와 LCN2 결여 마우스에서 IBA-1 면역반응의 차이점을 관찰할 수 없었다.
또한, SNI 3일 후, 일측 척수에서 p38 MAPK의 활성이 증가됨을 확인하였고, LCN2-결여 마우스에서 p38 MAPK 활성이 약화됨을 확인하였다.
LCN2-결여 마우스에서, 야생형의 마우스와 비교하여, 일측 척수 부분에서 p38 MAPK 활성이 감소됨을 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 이중 면역염색을 통하여, Iba-1 및 p38 MAPK가 같은 위치에 존재함을 확인하였다. 상기 결과는 말초 신경의 손상에 의하여, p38의 인산화와 함께 척수의 소교세포가 활성화됨을 확인하였다.
2.
LCN2
가 통증-연관
케모카인인
CCL2
,
CXCL1
의 발현양상 확인
실시예 1-1의 RT-PCR 방법에 의하여, 하기 표 2의 프라이머를 사용하여 LCN2가 통증-연관 케모카인인 CCL2 및 CXCL1의 발현 여부를 확인하였다.
이의 결과를 도 6에 나타내었다.
| 염기서열 | 서열번호 | |
| CCL2 정방향 프라이머 | 5`-TCAGCCAGATGCAGTTAACG-3` | 5 |
| CCL2 역방향 프라이머 | 5`-GATCCTCTTGTAGCTCTCCAGC-3` | 6 |
| CXCL1 정방향 프라이머 | 5`-CACACTCAAGAATGGTCGCGA-3` | 7 |
| CXCL1 역방향 프라이머 | 5`-TTGTCAGAAGCCAGCGTTCAC-3` | 8 |
도 6에 나타난 바와 같이, SNI 구축 2일 후, CCL2 및 CXCL1의 발현은 야생형 SNI 구축 마우스의 일측 척수에서 유의적으로 증가하였고, LCN2-결여 SNI 구축 마우스에서 야생형 마우스보다 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
그러나, 반대측 척수 부분에서의 CCL2 및 CXCL1의 발현은 LCN2-결여 마우스 및 야생형 마우스에서 차이가 없음을 확인하였다. 상기의 결과, LCN2는 통증 연관 케모카인 분비를 유도함을 알 수 있다.
3. 척수에서
LCN2
수용체(24
p3R
)의 발현확인
실시예 1-2와 같은 방법으로, LCN2(염소, 1:500; R&D Systems), 24p3R (토끼, 1:200; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), NeuN(마우스, 1:200; Millipore, Billerica, MA), GFAP (마우스, 1:200; BD, Franklin Lakes, NJ), 및 IBA-1 (마우스, 1:200; Wako)을 이용하여, 24p3R의 발현 양상을 확인하였으며, 이의 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 뉴런에서 24p3R 및 LCN2가 함께 발현되는지 확인하기 위하여, LCN2와 함께, 이중 면역염색을 수행하였으며, 이의 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 24p3R은 SNI를 하지 않은 대조군 마우스의 척수의 신경세포의 표면에서 높은 수준으로 발현하였고, SNI 구축 후, 24p3R의 발현이 SNI 구축 마우스 및 대조군에서 다소 차이가 있음을 확인하였다. SNI 3일 후, 24p3R의 세포에서의 분포를 결정하기 위하여, 다른 세포 마커를 이용하여, 24p3R을 위한 이중 면역염색을 수행한 결과, SNI 구축 후, 척수의 전각에서 24p3R의 면역 반응은 NeuN 또는 Iba-1과 동일한 위치에서 나타남을 확인하였으나, GFAP와 다른 위치에서 나타남을 확인하였다. 유사하게, 후각에서, 24p3R은 NeuN 또는 Iba-1-양성 세포에서 발현됨을 확인하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 24p3R 및 LCN2는 척수의 전각 및 후각에서 함께 공존함을 확인하였다. 상기 결과는 24p3R가 척수의 LCN2-발현 뉴런 또는 소교세포에 주로 발현됨을 나타낸다.
4. 대뇌 피질 뉴런에
LCN2
재조합 단백질을 처리한 경우,
케모카인
발현 확인.
LCN2가 통증 관련 케모카인인 CCL2, CXCL1, CCL3, CCL5 및 CXCL10의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 대뇌 피질 뉴런을 배양하여, 대뇌 피질 뉴런에 LCN2 재조합 단백질을 1㎍ 및 10 ㎍을 처리하여, 표 3의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하여, 케모카인의 발현 양을 확인하였다. 이의 결과를 도 9에 나타내었다.
| 염기서열 | 서열번호 | |
| CCL3 정방향 프라이머 | 5`-ACTGCCTGCTGCTTCTCCTACA-3` | 9 |
| CCL3 역방향 프라이머 | 5`-AGGAAAATGACACCTGGCTGG-3` | 10 |
| CCL5 정방향 프라이머 | 5`-CTCACCATCATCCTCACTGCA-3` | 11 |
| CCL5 역방향 프라이머 | 5`-GCACTTGCTGCTGGTGTAGAAA-3` | 12 |
| CXCL10 정방향 프라이머 | 5`-AAGTGCTGCCGTCATTTTCT-3` | 13 |
| CXCL10 역방향 프라이머 | 5`-GTGGCAATGATCTCAACACG-3` | 14 |
도 9에 나타난 바와 같이, LCN2를 1㎍ 및 10㎍을 처리한 경우, 통증 관련 케모카인의 발현양이 증가함을 확인하였다. 상기 결과에 의하여, LCN2는 통증 관련 케모카인의 발현을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[
실시예
5]
LCN2
의 급성 수용성 통증 또는
신경병증성
통증에 대한 역할을 확인.
1. 기계적 통증에 대한 반응 확인.
LCN2 결여 마우스 및 야생형 마우스에서 다리의 기계적 자극에 대한 민감도를 정량화하기 위하여, 투명한 플라스틱 박스에서 마우스를 메탈메쉬층(metal mesh floor)에 두었고, 2.0g 및 4.0g의 von Frey hair를 이용하여 왼쪽 및 오른쪽 족에 적용하여, 발을 회피하는데 요구되는 자극 강도의 역치를 결정하였고, 회피반응 빈도를 측정하였다. 이의 결과를 도 10의 A에 나타내었다.
또한, 도 10의 A에 나타난 바와 같이, 급성 수용성 통증(acute nociceptive pain)에 대한 반응을 확인한 결과, Von filament test에서 기계적 자극(2.0 및 4.0g) 후, 발 회피 빈도의 현저한 차이를 보이지 않음을 확인하였다.
2.꼬리 담금 시험법(
tail
immersion
test
)을 이용한 급성 수용성 통증(
acute
nociceptive
pain
)에 대한 반응 확인
열에 대한 통증 민감도를 꼬리 담금 시험법을 이용하여 평가하였다.
보다 구체적으로, 마우스를 50ml의 원뿔형태의 튜브에 놓고, 꼬리 끝으로부터 1/3을 45℃, 50℃ 및 55℃의 물에 최대 15초 동안 담그었다. 활발한 꼬리의 구브러짐(vigorous tail flection)에 의하여 나타나는 꼬리를 튀기는 반응에 대한 경향성을 계산하였다. 이의 결과를 도 10의 B에 나타내었다.
도 10의 B에 나타난 바와 같이, 꼬리 담금 시험법에서 50℃ 또는 55℃에서 열적 자극에 대한 반응에 있어서 현저한 차이가 없음을 확인하였다. 그러나, 45℃의 열적 자극에 대한 반응에 있어서, LCN2-결여 마우스에서, 대조군에 비하여 다소 높음을 확인하였다.
3. 포르말린 시험법(
formalin
test
)으로 통증 반응 확인
5%의 포르말린을 포함하는 10 ㎕의 식염수를 왼쪽 후족 표면에 주사하였다. 이 후, 40분 동안 마우스를 관찰하였고, 포르말린 주입 후족을 빨거나(licking), 무는(biting)데 소비한 시간을 기록하였다. 포르말린 용액 주입 후 5분 동안을 1단계라고 하고, 주입 10분 내지 40분 후를 2단계라고 하고, 빨거나 무는 시간을 스톱-와치로 측정하였다. 이의 결과를 도 10의 C 및 D에 나타내었다. 또한, 포르말린 주사 후, 척수 소교세포의 활성 정도(면역염색법 이용)를 측정하였으며, 이의 결과를 도 10의 E에 나타내었다.
도 10의 C 내지 D에 나타난 바와 같이, 포르말린을 족 끝 주사에(intraplantar injection)하는 경우, 전형적인 이상 통증 반응(biphasic pain response)을 보임을 확인하였다. 포르말린 주사 1분 후, 첫번째 단계에서 침해수용기(nociceptor)의 직접적인 반응으로부터 통증 반응이 나타났다. 반면에 두번째 단계는 감작의 기간 후, 염증반응이 일어나는 동안 통증 반응이 나타남을 확인하였다. 첫번째 단계에서는 LCN2-결여 마우스 및 야생형 마우스에서 차이점이 나타나지 않음을 확인하였으나, 두번째 단계에서 LCN2 결여 마우스에서 통증 반응이 현저하게 감소함을 확인하였다.
또한, 도 10의 E에 나타난 바와 같이, 포르말린 주사 후, LCN2 결여 마우스에서 척수 소교세포의 활성이 감소함을 확인하였다.
[
실시예
6]
리포칼린
2 중화항체 (
리포칼린
2 억제제)를
SNI
구축 마우스에 투여하는 경우, 통증 반응 확인
SNI-구축 마우스 (야생형 마우스)에 1 μg의 리포칼린 2 중화항체를 척수강 내 주사한 후, 실시예 5와 같은 방법으로 통증반응을 확인하였다. 이의 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 리포칼린 2 중화항체를 주사한 후, 일측 척수에서 통증에 대한 역치가 높아짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 리포칼린 2 억제제는 신경병증성 통증 완화에 효과가 있음을 확인하였다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> composition comprising lipocalin 2 inhibitor for alleviating
neuropathic pain
<130> P-136P
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for LCN2
<400> 1
atgtcacctc catcctggtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for LCN2
<400> 2
cacactcacc acccattcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for GAPDH
<400> 3
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for GAPDH
<400> 4
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for CCL2
<400> 5
tcagccagat gcagttaacg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for CCL2
<400> 6
gatcctcttg tagctctcca gc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for CXCL1
<400> 7
cacactcaag aatggtcgcg a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for CXCL1
<400> 8
ttgtcagaag ccagcgttca c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for CCL3
<400> 9
actgcctgct gcttctccta ca 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for CCL3
<400> 10
aggaaaatga cacctggctg g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for CCL5
<400> 11
ctcaccatca tcctcactgc a 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for CCL5
<400> 12
gcacttgctg ctggtgtaga aa 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is forward primer for CXCL10
<400> 13
aagtgctgcc gtcattttct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is reverse primer for CXCL10
<400> 14
gtggcaatga tctcaacacg 20
Claims (13)
- 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증 완화용 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 항체는 중화 항체인 것을 특징으로 하는, 신경병증성 통증 완화용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 인간을 제외한 개체에 투여하여 신경병증성 통증을 완화시키는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 개체는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 인간을 제외한 영장류 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 리포칼린 2 단백질 수준을 측정하는 제제로서, 상기 리포칼린 2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 상기 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 신경병증성 통증 진단용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 생물학적 시료로부터 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 신경병증성 통증을 예측하기 위한 정보제공방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 신경병증성 통증을 예측하기 위한 정보제공방법.
- 생물학적 시료에 신경병증성 통증 예방 또는 치료 후보물질을 처리하여 리포칼린 2 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계;를 포함하는 신경병증성 통증 치료제의 스크리닝 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120151377 | 2012-12-21 | ||
| KR20120151377 | 2012-12-21 |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20140081683A KR20140081683A (ko) | 2014-07-01 |
| KR101576606B1 true KR101576606B1 (ko) | 2015-12-10 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130155478A KR101576606B1 (ko) | 2012-12-21 | 2013-12-13 | 리포칼린 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증 완화용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101576606B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200015122A (ko) | 2018-08-02 | 2020-02-12 | 충남대학교산학협력단 | p38 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제가 함유된 나노입자를 포함하는 신경병증성 통증 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20200099495A (ko) | 2019-02-14 | 2020-08-24 | 경북대학교 산학협력단 | Lcn2 저해제를 유효성분으로 포함하는 당뇨성 신경손상질환 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2013
- 2013-12-13 KR KR1020130155478A patent/KR101576606B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J Biol Chem. Vol. 286(51), pages 43855-70 (2011.10.26) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200015122A (ko) | 2018-08-02 | 2020-02-12 | 충남대학교산학협력단 | p38 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제가 함유된 나노입자를 포함하는 신경병증성 통증 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20200099495A (ko) | 2019-02-14 | 2020-08-24 | 경북대학교 산학협력단 | Lcn2 저해제를 유효성분으로 포함하는 당뇨성 신경손상질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140081683A (ko) | 2014-07-01 |
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