KR101570754B1 - Composition for selecting green rice leafhopper-resistant variety containing Grh1 gene comprising DNA marker RM18166, RM18171, and Indel 15040 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA 마커인 RM18166, RM18171 및 Indel 15040으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편의 존재여부를 검출하는 프라이머를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물, 구체적으로는, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 방법 및 벼 선별 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 끝동매미충 저항성 개체를 선발하는 방법을 이용하면, 끝동매미충 저항성 유전자의 위치와 아주 밀접하게 연관된 마커를 이용하여 효율적으로 끝동매미충 저항성 및 감수성 개체를 구분할 수 있다.The present invention relates to a composition for selecting endemic hermit crab resistant rice varieties, which comprises a primer for detecting the presence or absence of one or more oligonucleotides or fragments thereof selected from the group consisting of RM18166, RM18171 and Indel 15040 as DNA markers, Comprising at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6. The present invention also relates to a method for isolating genomic DNA from a rice sample, Amplifying the target sequence by using the separated genomic DNA as a template and performing amplification reaction using at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6; And detecting the amplification product. The present invention also relates to a rice selection kit and a rice selection kit. According to the present invention, it is possible to efficiently distinguish endomycetes resistance and susceptibility by using a marker closely related to the position of the endomycetes resistance gene.
Description
본 발명은 RM18166, RM18171 및 Indel 15040으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편의 존재여부를 검출하는 프라이머를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물, 구체적으로는, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 방법 및 벼 선별 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for selecting endemic fungus resistant rice varieties, which comprises a primer detecting the presence or absence of one or more oligonucleotides or fragments thereof selected from the group consisting of RM18166, RM18171 and Indel 15040, And at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6. The present invention also relates to a method for isolating genomic DNA from a rice sample, Amplifying the target sequence by using the separated genomic DNA as a template and performing amplification reaction using at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6; And detecting the amplification product. The present invention also relates to a rice selection kit and a rice selection kit.
국제연합식량농업기구(FAO)의 통계에 의하면, 벼(Oryza sativa L.)는 식물병, 해충 및 잡초에 의해 생산량이 약 25% 손실된다.According to the statistics of the United Nations Food and Agriculture Organization (FAO), rice ( Oryza sativa L.) is lost about 25% in production by plant diseases, pests and weeds.
벼와 관련된 병의 종류는 흰잎마름병, 잎집무늬마름병, 모썩음병, 키다리병, 도열병 및 오갈병 등이 있으며, 이들 가운데 끝동매미충(green rice leafhopper;GRH)은 동아시아, 특히 우리나라와 일본의 북동부에서 벼멸구와 함께 벼에 가장 피해를 끼치는 해충 중의 하나이다(Ghauri, 1971, Bull Entomol. Res. 60:481-512). 본 해충은 벼에 대한 직접적인 피해보다 우리나라 주요 바이러스 병인 벼오갈병을 매개함으로서 벼 생산에 막대한 피해를 야기한다.Among them, green rice leafhopper (GRH) is one of the most important species in East Asia, especially in the northeastern part of Korea and Japan. It has been reported that rice horticulture, rice horticulture, Together they are one of the most harmful pests (Ghauri, 1971, Bull Entomol. Res. 60: 481-512). This pest is a major virus disease in Korea, rather than direct damage to the rice, causing damage to the production of rice by mediating the disease.
바이러스에 감염된 벼는 잎 전체가 짙은 녹색이 되는 동시에 잎맥을 따라 백색의 반점이 나타나고, 생육이 극히 나빠져서 출수기 쯤에는 건강한 벼의 반 정도밖에 키가 자라지 못하며 분얼(分蘖)은 많아진다. 병에 걸린 식물체는 거의 출수하지 않거나 출수하더라도 이삭이 충실하지 못하다. 상기 바이러스는 주로 끝동매미충에 의하여 매개된다. 바이러스를 가진 끝동매미충은 성충 상태로 자운영, 밀, 보리 등 월동작물이나 논둑의 잡초에서 겨울을 나고 이듬해 봄 못자리로 날아와 바이러스를 옮기므로 끝동매미충을 방제하는 것이 중요하다. 지금까지 벼오갈병의 원인 바이러스인 벼오갈병 바이러스(rice dwarf virus)에 대해 저항성을 나타내는 벼 유전자원 또는 유전자가 밝혀지지 않아 매개충인 끝동매미충을 화학적 방제하거나 본 해충에 대해 저항성 품종을 육성하고 있다.The virus-infected rice leaves become dark green, and white spots appear along the leaf veins. The growth is extremely bad, and only about half of healthy rice is grown at the beginning of spring, and the number of tears is increased. The diseased plants rarely go out or the leaves are not faithful. The virus is mainly mediated by endoptera. It is important to control the endoptera, because the endemic ladyworm with the virus is wintering in the weed of wintertime crops such as chestnut, wheat, and barley, and weeds in the spring of next year. Until now, rice genetic resources or genes showing resistance to rice dwarf virus, the causative agent of rice dwarf virus, have not been identified. Therefore, chemical control of endopterotic ferns or breeding of resistant cultivars against this pest is being fostered.
그러나 저항성 품종을 육성하고자 할 때 전통적인 육종 방법은 유용 유전자원 도입을 위해서 대량의 유전자원 또는 계통을 생물검정을 통해 저항성 여부를 판단하여야하므로 저항성 품종을 개발하기까지는 오랜 시간과 노력이 동반되어야 한다. 또한 저항성 검정에 있어서 온도, 광량, 습도, 식물체의 생육정도 등 각종 검정조건에 따라 해충에 저항성의 정도가 달라 저항성 품종을 선발하는 데에 어려움이 있어 가장 효율적인 검정방법인 분자표지방법이 매우 필요한 실정이다.However, when cultivating resistant cultivars, traditional breeding methods must judge the resistance of a large number of genetic resources or strains through bioassay in order to introduce useful genetic resources, so it takes a long time and effort to develop resistant cultivars. In addition, in the resistance test, it is difficult to select resistant cultivars because of various degrees of resistance to pests due to various test conditions such as temperature, light intensity, humidity, and plant growth. Therefore, the most effective assay method, to be.
분자 표지방법은 분자 육종시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 널리 이용되고 있다. 분자 표지를 이용한 벼 육종은 환경변이에 영향을 받지 않고 어린 시기에 형질을 탐색할 수 있기 때문에 대량의 자원을 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있다. 가장 먼저, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Tag DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism)검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다.Molecular labeling methods are widely used in molecular breeding systems for the search of useful traits, identification of species of organisms, identification of breed classification, and analysis of the relationship of group populations. Pigmenting of rice using molecular markers is advantageous in that it can analyze large amounts of resources accurately and quickly because it can detect traits in young age without being influenced by environmental variation. First, RFLPs (Restriction Fragment Length Length Polymorphisms) method based on the difference in nucleotide sequence length caused by mutation of restriction enzyme recognition sites in chromosomes have been developed, but this method is troublesome to use radioactive isotopes. Thereafter, a randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method has been developed as a nucleic acid fingerprinting method using PCR (Polymerase Chain Reaction). In the PCR method, a small oligonucleotide composed of 10 to 20 nucleotides (hereinafter referred to as a "primer") is annealed with DNA or RNA of an organism, and then a heat-resistant DNA polymerase It is a way to lose. This requires only a small amount of DNA (1-50 ng) compared to other methods, and has the advantage of being able to confirm the results easily and quickly. Among these methods, the RAPD method has the disadvantage that the reproducibility is low because the nonspecific PCR product is amplified. The AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) method is a method for detecting a high DNA polymorphism, There is a disadvantage that the appearance and analysis are complicated.
이에 반해 SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법이다. 상기 초위성체는 1-5개의 단순염기서열이 반복되는 DNA군(repetitive DNA group)으로 대부분의 진핵생물의 게놈 내에서 고르게 분포되어 있는 것으로 알려져 있다. 상기 단순염기서열의 반복수는 품종간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있다. 특히 상기 SSR 마커 방법은 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 이와 같은 SSR방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중이다. 벼에서는 SSR 마커가 수없이 개발되어 품종육성이 사용되고 있지만 끝동매미충에 저항성을 가지는 품종의 선발에 관련된 효율적인 SSR 마커는 아직 알려지지 않았다. On the other hand, the SSR method is a method of analyzing supersatellite in an individual by preparing a PCR primer based on the nucleotide sequence information of the microsatellite region, which is a DNA repeated sequence. The supersatellite is a repetitive DNA group of 1-5 simple nucleotide sequences and is known to be uniformly distributed in the genome of most eukaryotes. Since the number of repetitions of the simple nucleotide sequence differs between cultivars or individuals, when this part is amplified by PCR reaction, polymorphism appears and it is actively used in genetic studies of animals and plants. In particular, the SSR marker method is frequently used for identification of species because of its high reproducibility. Due to the superiority of the SSR method, research is underway to develop SSR markers in several major crops. Although SSR markers have been developed in rice and variety breeding has been used in rice, effective SSR markers related to selection of cultivars resistant to endoptera were not yet known.
한편, 인디카 벼 품종은 자포니카 종보다 비교적 높은 수준의 끝동매미충 저항성을 나타내며, 6개의 유전자가 인디카 품종에서 동정되었다 (Fujita et al, 2006, Theor. Appl. Gnet. 113:567-573). 끝동매미충 저항성 품종인 Pe-bi-hun 유래의 우성 저항성 유전자좌인 Grh1은 5번 염색체의 단완에 존재하는 것으로 알려져 있지만 아직 클로닝되지는 않았다(Tamura et al, 1999,Breed Sci. 49:11-14).On the other hand, Indica rice varieties exhibit a relatively high level of endodermic resistance against Japonica species, and six genes have been identified in Indica varieties (Fujita et al, 2006, Theor. Appl. Gnet. 113: 567-573). Grh1 , a dominant resistance locus from Pe-bi-hun, a resistant endemic species, is known to exist in the short arm of
끝동매미충 저항성을 갖는 것에 관련된 유전자들의 위치 분석은 종래 여러 가지 분자표지, 예를 들면, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 마커 (Fukuta et al, 1998 Breed. Sci. 48: 243-249), SSR (Simple Sequence Repeat) 마커 (Fujita et al, 2006, Theor. Appl. Gnet. 113:567-573)등을 이용하여 벼에서 표지 되었지만 Grh1 유전자 위치 범위가 넓게 표지되어 기존 분자표지 결과가 실제 저항성 여부와 서로 다를 가능성이 매우 높은 문제점이 있었다.The analysis of the position of the genes related to the endoptera resistance was carried out using various molecular markers such as RFLP markers (Fukuta et al, 1998 Breed. Sci. 48: 243-249), SSR (Simple Sequence Repeat) markers (Fujita et al, 2006, Theor Appl Gnet 113:... 567-573) , but using such markers in rice Grh1 There is a high possibility that the result of existing molecular markers is different from the actual resistance or not.
이러한 배경하에 본 발명자들은 Grh1를 갖는 신광벼의 끝동매미충 저항성 근동질 유전자 계통(Near isogenic line ; NIL)라인을 육성하였으며, 이 벼에 존재하는 수많은 SSR 분자표지 중 PCR 및 아가로스 젤을 이용하여 쉽게 분석할 수 있고, 정확하게 저항성 품종을 선발할 수 있는 장점을 가지며 끝동매미충 저항성 유전자와 더욱더 긴밀하게 연관되어 있는 SSR 마커를 선발하여 유전자 위치를 표지하고 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances , the present inventors cultivated the near isogenic line (NIL) line of Shing Kwang Rice with Grh1 and found that it is easy to use the PCR and agarose gel among numerous SSR molecular markers present in the rice It has the advantage that it is able to analyze and accurately select resistant cultivars. The SSR markers more closely associated with the genes were selected to mark the gene positions and the present invention was completed.
본 발명의 하나의 목적은 RM18166, RM18171 및 Indel 15040로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편의 존재여부를 검출하는 프라이머를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a composition for selecting endemic fungus resistant rice varieties comprising a primer detecting the presence or absence of one or more oligonucleotides or fragments thereof selected from the group consisting of RM18166, RM18171 and Indel 15040.
본 발명의 다른 하나의 목적은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for isolating genomic DNA from a rice sample, Amplifying the target sequence by using the separated genomic DNA as a template and performing amplification reaction using at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6; And detecting the amplification product. The present invention also provides a method for selecting endemic fungus-resistant rice varieties.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 키트를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a primer set comprising at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6; Restriction enzyme; And a reagent for carrying out an amplification reaction. The present invention also provides an endemic fungus resistant rice selection kit.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 RM18166, RM18171 및 Indel 15040으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편의 존재여부를 검출하는 프라이머를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공하며, 구체적으로는, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공한다.
In one aspect to accomplish the above object, the present invention provides a method for screening for endomycetes resistance-resistant rice varieties comprising a primer detecting the presence or absence of one or more oligonucleotides or fragments thereof selected from the group consisting of RM18166, RM18171 and Indel 15040 The present invention provides a composition for selecting endemic fungus resistant rice varieties comprising at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
본 발명자들은 RFLP 마커를 이용하여 Grh1 유전자가 벼의 5번 염색체의 RFLP 마커 XNpb309와 XNpb327 사이에 존재한다는 기존의 보고를 토대로, 통일형 품종 신광벼에서 유래된 근동질 유전자 계통과 교배된 F2 및 F3집단을 이용하여 Grh1 유전자 정밀지도를 작성하였다(도 1). 벼 5번 염색체 7.79-10.68 Mbp 사이에 위치하는 RM18141, RM18142, RM18147, RM18148, RM18154, RM18160, RM18161, RM18166, RM516, RM18171, Indel 15040, Indel 15510, RM18177, Indel15600, Indel15720, RM6082, RM5844, RM7409 및 RM249 마커를 사용하여 유전자 정밀지도를 작성한 결과, Grh1 유전자가 RM18161 영역에서 Indel15510 영역 사이에 존재한다는 사실을 확인하였다.
The present inventors have found that by using the RFLP markers Grh1 genes based on previous reports that exist between the RFLP markers XNpb309 and XNpb327 of
본 발명에서 용어, "끝동매미충(green rice leafhopper)"은 매미목 매미충과의 곤충으로 몸길이 수컷 4~5 mm, 암컷 6 mm이며, 몸빛깔이 등면은 선명한 초록색이며 정수리는 노란빛을 띤 녹색부터 노란색까지 변화가 있고 광택이 있다. 몸의 밑면은 수컷이 검은색이고 암컷은 연한 노란색이다. 정수리의 검은색 가로띠에서 뒤편 정중선에 1 개의 선이 있다. 홑눈의 뒤편에 양 겹눈을 잇는 검은색의 가로띠가 있다. 홑눈은 머리의 앞가장자리에 있으며 회색빛을 띤 노란색으로 투명하지 않고, 겹눈은 검은빛을 띤 갈색이다. 벼의 중요한 해충으로 그 밖에도 뚝새풀ㆍ보리ㆍ밀ㆍ조ㆍ피 등 화본과 식물에 기생한다. 성충과 약충이 숙주식물의 즙액을 빨아먹어 피해를 줄 뿐 아니라 벼오갈병을 매개하며, 특히 출수기에는 벼이삭의 즙액을 빨아먹어 임실률(稔實率:수분 성공비율)을 저하시키고 배설물이 그을음병을 일으킨다. 생육장애를 가져와 수확량이 줄어들 수도 있다. 피해를 입은 이삭은 이삭목이나 가지에 갈색의 반점이 생기며 벼알의 빛깔이 변해 얼룩진다. 한국ㆍ일본ㆍ타이완ㆍ미얀마ㆍ타이ㆍ인도 등지에 분포한다. 오갈병 발생지는 제2세대 약충이 주로 바이러스를 옮기므로 이시기에 방제에 역점을 두고, 제3화기에는 이삭을 가해하게 되므로 출수기 방제에 중점을 두어야한다. 약제방제로는 애멸구 방제약제와 비슷하나 약제저항성이 나타나고 있다.
The term "green rice leafhopper" in the present invention refers to insects of the order Lepidoptera, 4 to 5 mm in length, 6 mm in female, body color is clear green, and the head is yellowish green to yellow There is change and there is gloss. The underside of the body is black for males and light yellow for females. There is one line in the rear midline of the crown of the crown. There is a black horizontal strip that connects the two eyes at the back of the eye. The single eye is on the front edge of the head and is not transparent in grayish yellow, and the compound eyes are blackish brown. It is an important insect pest of rice and it is parasitized to other plants such as raspberry, barley, wheat, Adults and nymphs suck the juice of the host plant not only to damage but also to mediate rice gut disease, especially sucking the juice of rice ears during the heading period to lower the fertility rate (water fertility rate) ≪ / RTI > The yield may be reduced by causing growth disturbances. The damaged Isaac has a brown speck in the neck or branch of the ears, and the color of the rice is changed and it is stained. They are distributed in Korea, Japan, Taiwan, Myanmar, Thailand and India. Since the second generation nymphs mainly carry viruses, the emphasis is on the control of the virus in this period, and the third firearms are subjected to ears. The drug control is similar to the drug for controlling the offspring, but the resistance to the drug appears.
본 발명에서 용어, "끝동매미충 저항성"은 벼에서 끝동매미충이 기생하지 못하도록 하는 형질을 갖는 식물체로 끝동매미충에 내성을 갖는 벼를 말한다. 구체적으로 끝동매미충 저항성 유전자인 Grh1유전자를 갖는 벼를 4회 역교배하여 저항성 근동질 유전자를 갖는 품종을 육성하였으며, 상기 육성된 품종에 끝동매미충의 2령 유충을 접종한 후 저항성 여부를 확인한 결과, 끝동매미충 저항성 유전자를 갖는 품종이 끝동매미충에 저항성을 갖는 것을 확인하였다(표 2).In the present invention, the term "endoptera resistance" refers to a rice plant having a resistance to parasitism of endopterotic flora in rice, and resistant to endopterotic flora. Specifically, the rice with the Grh1 gene, which is a resistance gene for the endoptera , was cultivated four times to breed a strain having a resistant endogenous gene. After inserting the second instar larva of the endoptera, It was confirmed that varieties with endomycetes resistance genes were resistant to endoptera (Table 2).
본 발명에서 용어, "Grh1"은 상기와 같은 끝동매미충 저항성 형질을 나타내게 하는 유전자로서, 끝동매미충 저항성 품종인 Pe-bi-hun 유래의 우성 저항성 유전자좌이고, Grh1은 5번 염색체의 단완에 존재하는 것으로 알려졌으나, 아직 클로닝되지는 않았다.In the present invention, the term " Grh1 " is a dominant resistance locus derived from Pe-bi-hun, a resistant endemic fungus resistance gene, and Grh1 is present in the short arm of
본 발명의 일 실시예에서는 벼에서 끝동매미충의 저항성을 갖게 하는 Grh1 유전자의 위치를 SSR 마커의 하나인 RM18166, RM18171과 새롭게 개발한 Indel 15040 마커를 사용하여 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, the position of the Grh1 gene which gives resistance to the endoptera in rice was confirmed using RM18166 and RM18171, which are SSR markers, and a newly developed Indel 15040 marker.
본 발명에서 용어, "벼(Oryza stiva)"는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로, 동인도 원산의 식용작물로 논이나 밭에 심는다. 높이는 1m 정도이고 잎은 가늘고 길며 성숙하면 줄기 끝에 이삭이 나와 7월 말에서 8월 경 꽃이 핀 후 열매를 맺는다. 벼의 열매를 찧은 것을 쌀이라고 하며, 전세계 인구의 40% 정도가 쌀을 주식량(主食糧)으로 한다. 벼속에 속하는 식물로는 20여 종(種) 이상이 알려져 있으나 실제로 재배되고 있는 것은 벼(O. sativa)가 대부분이다. 이병될 수 있는 질병으로는 키다리병, 도열병, 흰잎마름병, 줄무늬잎마름병, 오갈병(끝동매미충) 및 충해(혹명나방, 벼멸구) 등이 알려져 있다.
In the present invention, the term "rice ( Oryza stiva "is an annual plant of the monocotyledonous liana, and it is planted in rice field and field with the edible crops of the East Indies. It is about 1m high and the leaves are thin and long. Rice is the main food of 40% of the world's population and more than 20 kinds of plants belong to the rice family. It is known that O. sativa is cultivated. Kidari disease, blast foliage, blight of blight of white blight, blight of stripe blight, bug bug (endoptera) and pest (moths moth, .
본 발명에서 용어, "RFLP(restriction fragment length polymorphism)"는 DNA를 유전자 절단 제한효소(restriction endonuclease)로 절단하였을 때, 절단된 유전자의 길이가 개인에 따라 다양하게 나타나는 현상을 말한다.The term " restriction fragment length polymorphism " (RFLP) in the present invention refers to a phenomenon in which the length of a cleaved gene varies depending on an individual when DNA is cleaved with a restriction endonuclease.
본 발명에서 용어, "SSR(Simple Sequence Repeat)"은 STR(Short Tandem Repeats)이라고도 하며, DNA 상에서 1 내지 6개의 염기가 반복되어 나타나는 서열을 말한다. 일반적으로 SSR 서열은 유전자 내에서 다양한 마커로 사용 가능하며, 특정 유전자의 복제 또는 결실에 관한 연구에 사용되기도 한다. 벼에서 다양한 유전적 마커로 사용할 수 있는 SSR은 약 2,000여 종류가 보고되어 있으며, SSR의 유전자 좌위를 이용하여 염색체 내의 특정 유전자의 위치를 확인하는데 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 벼에서 끝동매미충 저항성을 갖게 하는 Grh1 유전자의 염색체상의 위치 및 상기 유전자의 존재 유무를 확인하는데 SSR(RM18166, RM18171) 단편 및 Indel 15040을 마커로 사용하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 끝동매미충에 저항성을 갖는 벼 품종을 선별하기 위한 마커로 RM18166, RM18171(SSR 마커)과 Indel 15040으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편을 사용하였다. 본 발명의 RM18166, RM18171 SSR 마커 및 Indel 15040은 하기(표 1)와 같은 특성을 가진다.
The term "SSR (Simple Sequence Repeat) " in the present invention is also referred to as STR (Short Tandem Repeat), and refers to a sequence in which 1 to 6 bases are repeated on DNA. In general, SSR sequences can be used as a variety of markers in a gene and are also used in studies of replication or deletion of specific genes. There are about 2,000 species of SSRs that can be used as various genetic markers in rice. SSR gene loci can be used to identify specific gene loci in chromosomes. In one embodiment of the present invention, SSR (RM18166, RM18171) fragment and
크기Amplification product
size
(일품벼 기준)PCR amplification products using primers
(Based on standard)
:프라이머 세트
(서열번호 1/서열번호 2)SEQ ID NO: 7
: Primer set
(SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2)
:프라이머 세트
(서열번호 3/서열번호 4)SEQ ID NO: 8
: Primer set
(SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4)
:프라이머 세트
(서열번호 5/서열번호 6)SEQ ID NO: 9
: Primer set
(SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6)
< Indel 15040 마커는 LOC_Os05g15040 (NB-ARC domain containing protein) 유전자로부터 유래된 것으로써 일품벼 (Japonica 계열)와 신광벼 (Indica 계열)의 genomic DNA 염기서열 차이를 이용하여 제작한 것이다.>
The
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template, Quot; refers to a short nucleic acid sequence that functions as a point. The primer can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures.
본 발명에서는 본 발명의 SSR 및 Indel 마커 부위를 특이적으로 증폭하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성여부를 통해 끝동매미충 저항성 벼를 선별할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형가능하다. 본 발명자들은 벼에서 끝동매미충의 저항성을 갖는 품종을 선별하기 위한 방법으로 Grh1 유전자의 존재 여부를 확인할 수 있는 SSR 및 Indel 부위를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하였다. 구체적으로 상기 SSR 특이적 프라이머는 RM18166, RM18171과 Indel 마커 Indel 15040으로 구성되는 군으로부터 선택된 SSR 및 Indel 부위에 특이적으로 결합하며 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있고, 바람직하게 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 세트일 수 있으며, 더욱 바람직하게 서열번호 1 및 서열번호 2 프라이머 세트일 수 있다.
In the present invention, PCR and amplification using a sense and antisense primer that specifically amplify the SSR and Indel marker regions of the present invention can be used to select endemic hermit crab resistant rice through the production of a desired product. The PCR conditions, the lengths of the sense and antisense primers can be modified based on those known in the art. The present inventors have found that, as a method for selecting a variety having resistance to endopterotic flora in rice, Primers that can specifically amplify the SSR and Indel sites were used to confirm the presence of the gene. Specifically, the SSR-specific primer may be a primer that specifically binds to and amplifies SSR and Indel sites selected from the group consisting of RM18166, RM18171 and
본 발명의 일 실시예에서는 SSR 및 Indel 특이적 프라이머는 RM18166, RM18171 및 Indel 15040으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 SSR 및 Indel 부위에 특이적으로 결합 가능한 프라이머를 사용하여 통일형 품종 신광벼에서 유래된 근동질 유전자 계통과 교배된 F2 집단에서 Grh1의 유전자 지도를 작성하였다(도 1). 상기 유전자 지도에 의하면 Grh1유전자는 본 발명에서 마커로 사용한 SSR 마커 및 Indel 마커 중 RM18161 영역에서 Indel 15510 영역 사이에 존재한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 RM18166, RM18171 및 Indel 15040 마커가 끝동매미충 저항성 유전자를 갖는 개체나 계통을 효율적으로 선별할 수 있는 유용한 마커로 사용될 수 있음을 의미한다.
In one embodiment of the present invention, the SSR and Indel specific primers are primers that can specifically bind to one or more SSR and Indel sites selected from the group consisting of RM18166, RM18171 and
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a method for isolating genomic DNA from a rice sample, Amplifying the target sequence by using the separated genomic DNA as a template and performing amplification reaction using at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6; And detecting the amplification product. The present invention also provides a method for selecting endemic fungus resistant rice varieties.
본 발명에서 용어, "RM18166, RM18171 및 Indel 15040"은 상기에서 설명한 바와 같다. In the present invention, the terms "RM18166, RM18171 and
본 발명에서 용어, "검출"은 시료내의 끝동매미충 저항성 유전자의 존재여부를 확인하는데 사용되는 SSR 및 indel 마커인 RM18166, RM18171 및 Indel 15040의 존재유무를 확인하는 것을 말한다.In the present invention, the term "detection " refers to confirming the presence or absence of the SSR and indel markers RM18166, RM18171 and
본 발명에서 용어, "시료"는 끝동매미충에 감염될 수 있는 벼의 조직을 말하며, 뿌리, 잎, 줄기 또는 화기(꽃), 이삭을 포함하는 식물체의 조직에서 유래한 모든 기관 및 세포, 캘러스, 식물 조직의 선발, 배양 및 식물체의 재분화를 위해 형질전환된 조직을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "sample" in the present invention refers to a tissue of rice that can be infected with the endoptera, and includes all organs and cells derived from the tissues of plants including roots, leaves, stems or flowers, But are not limited to, transformed tissue for selection, cultivation and regeneration of plant tissue.
본 발명의 일 실시예에서는 끝동매미충 저항성 Grh1 유전자와 밀접하게 연관되어 있는 SSR 및 Indel 마커를 개발하고, 상기 개발된 마커를 이용하여 벼에서 끝동매미충 저항성 품종의 선별 효율을 검정한 결과, RM18166, RM18171 및 Indel 15040 마커가 끝동매미충 저항성 유전자와 밀접하게 연관되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 상기 마커들 중 RM18166의 경우 끝동매미충 저항성 품종을 선별하는데 아가로스 젤을 사용할 수 있어 특히 효율적임을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, SSR and Indel markers closely related to the endopterous fungus resistance-resistant Grh1 gene were developed and the screening efficiency of endemic fungus resistant varieties in rice was evaluated using the developed markers. As a result, RM18166, RM18171 And
구체적으로 상기 검출 방법은 (a) 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 6으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합 가능한 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 유전자 Grh1을 가진 벼 품종을 선발하는 방법일 수 있다.Specifically, the method comprises: (a) separating genomic DNA from a rice sample; (b) amplification reaction using a genomic DNA isolated in step (a) as a template and a primer set capable of specifically binding to one or more oligonucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6 or a fragment thereof And amplifying the target sequence; And (c) detecting the amplification product of step (b). The method of selecting a rice variety having the endomycetes resistance gene Grh1 may be used.
상기 단계 (a)는 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계로, 사용될 수 있는 시료의 예는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 용이하게 변형시켜 사용할 수 있다.
The step (a) is a step of isolating genomic DNA from a rice sample. Examples of samples that can be used are as described above, but are not limited thereto. A DNA extraction kit can be used as a method of isolating genomic DNA from a rice sample, and a method known in the art can be easily modified by those skilled in the art.
상기 단계 (b)는 단계 (a)에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 끝동매미충 저항성을 갖는 유전자 또는 그의 단편에 특이적으로 결합 가능한 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계이다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 구성되는 군으로부터 선택된 프라이머 세트를 사용하여 끝동매미충 저항성 유전자를 갖는 시료에서 상기 유전자를 증폭하는 반응을 수행하였다. 핵산 서열의 증폭 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Q복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 중합효소연쇄반응을 이용하여 서열번호 7 내지 9의 특정서열을 증폭하였다(표 3).The step (b) comprises amplifying the target sequence by performing amplification reaction using a genomic DNA isolated in step (a) as a template and using a primer set capable of specifically binding to a gene having endopterous fungus resistance or a fragment thereof . In one embodiment of the present invention, a primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 was used to amplify the gene in a sample having an endomycetes resistance gene. Methods for amplifying nucleic acid sequences include, but are not limited to, PCR, ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Any other suitable method for amplification of nucleic acid molecules known in the art or amplification through Q displacement or amplification with a Q replication enzyme can be used, and methods known in the art can be performed by a person skilled in the art as appropriate And can be used by modification. In one embodiment of the present invention, the specific sequences of SEQ ID NOS: 7 to 9 were amplified using polymerase chain reaction (Table 3).
또한, 상기 증폭된 핵산 서열은 검출 가능한 표지물질을 추가로 표지할 수 있다. 상기 표지 물질은 효소, 리간드, 발색물, 미소입자, 방사성 동위원소, 형광, 인광 물질로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, the amplified nucleic acid sequence may further be labeled with a detectable labeling substance. The labeling substance may be selected from the group consisting of an enzyme, a ligand, a coloring material, a microparticle, a radioactive isotope, a fluorescence, and a phosphorescent material, but is not limited thereto.
검출 표지자로 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타마제 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발색물질로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드, 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 37Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함하며, 형광 물질에는 Cy3, Cy5, 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red) 또는 비오틴을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Cy3 또는 Cy5를 프라이머의 5'-말단에 표지하고 PCR을 수행하였다.
Examples of the enzyme used as a detection marker include acetylcholinesterase, alkaline phosphatase,? -D-galactosidase, horseradish peroxidase,? -Lactamase and the like, and ligands include biotin derivatives and the like Gold, colored latex and the like, and the radioactive isotope includes 37 Co, 3 H, 125 I, 125 , and the like. Examples of the radioactive isotope include sodium dodecylbenzenesulfonate I-Bonton Hunter reagent and the like, and the fluorescent material includes Cy3, Cy5, fluororesin isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), Alexa 4,4-difluoro-4-boro-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY), Texas Red or biotin. In one embodiment of the present invention, Cy3 or Cy5 was labeled at the 5'-end of the primer and PCR was performed.
상기 단계 (c)는 단계 (b)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 유전자 Grh1을 가진 벼 품종을 선별하는 단계이다. 상기 증폭산물을 검출하는 방법은 증폭산물을 제한효소로 절단한 후, 절단 산물을 전기영동하여 검출할 수 있으며, 바람직하게 서열번호 7 내지 서열번호 9와 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 강도를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 통해 수행될 수 있다. 전기영동의 구체적인 예로는 자동 전기영동장치(칩 및 모세관 방식포함), 아크릴아마이드 겔, 고속액체크로마토그래피 (HPLC), 또는 아가로스 겔 전기영동일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
The step (c) is a step of selecting a rice variety having an endomycetes resistance gene Grh1 , which comprises detecting the amplification product of step (b). The amplification product can be detected by digesting the amplification product with a restriction enzyme and then detecting the cleavage product by electrophoresis. Preferably, the oligonucleotide is composed of an oligonucleotide having a complementary sequence to SEQ ID NOS: 7 to 9 Lt; RTI ID = 0.0 > oligonucleotides < / RTI > And detecting the hybridization intensity. Specific examples of electrophoresis include, but are not limited to, automated electrophoresis (including chip and capillary methods), acrylamide gel, high performance liquid chromatography (HPLC), or agarose gel electrophoresis.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 키트를 제공한다.In yet another embodiment, the present invention provides a kit comprising at least one primer set selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6; Restriction enzyme; And a reagent for carrying out an amplification reaction.
본 발명에서 용어, "끝동매미충 저항성" 및 "검출"은 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the terms "endoptera resistance" and "detection" are as described above.
본 발명의 키트는 끝동매미충 저항성 유전자의 존재를 확인할 수 있는 SSR 및 Indel의 존재 유무를 확인하여 끝동매미충 저항성 벼를 선별할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 SSR 및 Indel의 유무를 측정하기 위한 프라이머, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 상기 SSR의 존재 유무를 측정하기 위한 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 키트일 수 있다.The kit of the present invention can identify the endosperm-resistant rice paddies by confirming the presence or absence of SSR and Indel which can confirm the presence of the endomycetes resistance gene. The kit of the present invention may include primers, probes for measuring the presence or absence of SSR and indel, as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method. Specifically, in the present invention, the kit for measuring the presence or absence of the SSR may be a kit comprising at least one set of primers including a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
본 발명에서 상기 SSR의 존재 유무를 측정하기 위한 키트는 SSR 및 Indel이 전사부위에 포함되는 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.In the present invention, the kit for measuring the presence or absence of the SSR may be a kit containing essential elements necessary for carrying out the RT-PCR when SSR and Indel are included in the transcription site. In addition to each primer pair specific to the marker gene, the RT-PCR kit also contains enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC- Water (DEPC-water), sterile water, and the like.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 끝동매미충 저항성 유전자 유무를 확인하기 위한 키트일 수 있다. 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이 칩은 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 서열번호 7 내지 9과 상보적 서열을 가지는 프로브 올리고뉴클레오티드를 이용하여 마이크로어레이 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭 (piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법 또는 핀 (pin) 형태의 스폿터 (spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란 (amino-silane), 폴리-L-라이신 (poly-Llysine) 및 알데히드 (aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
In addition, the kit of the present invention may be a kit for confirming the presence or absence of the endomycetes resistance gene including essential elements necessary for performing the microarray chip. The microarray chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof. The microarray chip of the present invention can be easily manufactured by a manufacturing method commonly used in the art. In order to prepare a microarray chip, microarray micropipetting using a piezo electric method is carried out in order to immobilize the microarray chip on a substrate using a probe oligonucleotide having a complementary sequence as shown in SEQ ID NOS: ) Method or a method using a pin-type spotter, but the present invention is not limited thereto. The substrate of the microarray chip is preferably coated with an activator selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine and aldehyde, but is not limited thereto . In addition, the substrate is preferably selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon film, and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 끝동매미충 저항성 개체를 선발하는 방법을 이용하면, 끝동매미충 저항성 유전자의 위치와 아주 밀접하게 연관된 마커를 이용하여 효율적으로 끝동매미충 저항성 및 감수성 개체를 구분할 수 있다.
According to the present invention, it is possible to efficiently distinguish endomycetes resistance and susceptibility by using a marker closely related to the position of the endomycetes resistance gene.
도 1은 Grh1 유전자 영역의 정밀지도를 보여주는 그림이다. 벼 5번 염색체 7.79-10.68 Mbp 사이에 위치하는 RM18141, RM18142, RM18147, RM18148, RM18154, RM18160, RM18161, RM516, RM18171, Indel 15040, Indel 15510, RM18177, Indel 15600, Indel 15720, RM6082, RM5844, RM7409 및 RM249 마커를 사용하여 Grh1 유전자 정밀지도를 작성하였다. 유전자 정밀지도에 의하면 Grh1 유전자는 RM18161 영역에서 Indel 15510 영역사이에 존재한다는 사실을 확인하였다.
도 2는 일품/YR24353-60-2-1 F2계통 개체별 저항성 및 감수성 대립 유전자 유형(allele type) 분석을 위한 PCR 생성물을 4% 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과이다. R: 저항성 대립유전자, S: 감수성 대립유전자.Figure 1 is a diagram showing a precise map of the Grh1 gene region. The
FIG. 2 shows the result of electrophoresis of a PCR product for analysis of resistance and susceptibility allele type by a single product / YR24353-60-2-1 F 2 system on a 4% acrylamide gel. R: resistance allele, S: susceptibility allele.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 더욱 자세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것을 아니다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실시예Example 1: 끝동매미충 생물검정을 위한 식물 재료 1: Plant material for endemic lepidoptera
끝동매미충 저항성 유전자 Grh1을 가진 신광벼를 공여친으로 사용하고 감수성 반복친을 일품벼로 4회 역교배하여 육성한 저항성 근동질 유전자계통 YR24353-60-2-1을 육성하였으며, 일품벼를 모본으로 하고 저항성 근동질 계통 YR24353-60-2-1을 부본으로 하여 육성된 F2 집단을 이용하여 생물검정, 유전분석 및 분자마커와 연관분석을 수행하였다.
YK24353-60-2-1 was cultivated as a resistant endogenous gene system YK24353-60-2-1, which was cultivated by reverse transplantation of four susceptible repetitive strains with Shinkwang rice, Bioassay, genetic analysis and association analysis with molecular markers were performed using the F 2 population fostered with the myxoid lineage YR24353-60-2-1.
실시예Example 2: 끝동매미충 저항성 생물검정 조건 확립 2: Establishment of endophytic bacterium-resistant biology test condition
끝동매미충 저항성 검정 조건으로서는 지름 약 3.5cm, 길이 약 20cm 정도의 유리시험관에 4엽기의 일품/YR25353-60-2-1 F2 계통의 유묘를 넣고 2령 유충을 5마리 접종하여 온실에서 7일후에 끝동매미충의 죽은 충과 살아있는 충의 마리수를 세어 저항성 여부를 판단하였다 (표 2).As the test conditions for the endomycetes resistance test, seedlings of a four-leaf / YR25353-60-2-1 F 2 strain were placed in a glass test tube having a diameter of about 3.5 cm and a length of about 20 cm, and 5 second instar larvae were inoculated. (Table 2). The number of dead lobsters and dead lobsters were counted.
YR24353-60-2-1
Ilpumbyeo / YRIlpumbyeo /
YR24353-60-2-1
실시예Example
3: 끝동매미충 저항성 3: Endoptera resistance
연관마커Association marker
RM18166RM18166
, ,
RM18171RM18171
및 And
Indel
자포니카 및 인디카 게놈 database(http://www.gramene.org)를 이용하여 RM18166, RM18171, 및 Indel 15040의 위치와 염기서열을 조사하고 PCR 증폭용 프라이머를 제작하였다 (표 3).
The positions and nucleotide sequences of RM18166, RM18171, and
실시예Example
4: 끝동매미충의 4:
연관마커인Association markers
RM18166RM18166
, ,
RM18171RM18171
, ,
Indel
상기 실시예 3에서 제작한 SSR 및 Indel 마커 RM18166, RM18171, Indel 15040을 이용하여 끝동매미충 저항성 선발에 효율적인 유전형질 분석이 가능한지 검증하기 위하여 PCR를 수행하였다.
PCR was carried out to verify the efficient genetic characterization of the endomycetes resistance screening using SSR and Indel markers RM18166, RM18171 and
4-1. 식물재료4-1. Plant material
일품벼와 신광벼의 교배를 통해 육성한 일품/YR24353-60-2-1 F2계통의 239개 종자를 1차로 파종하여 생물검정 후 저항성 분리비를 확인하였으며 일품/YR24353-60-2-1 F2계통의 1,000개 종자를 2차로 파종하여 생물검정 후 RM18166, RM18171, Indel 15040의 끝동매미충 저항성 선발 효율을 검정하는데 사용하였다.
One product cultivated through the crossing of Yuril and Yinwang rice / YR24353-60-2-1 F 2 strain of 239 seeds were first sowed to confirm the resistance separation ratio after the bioassay. A product / YR24353-60-2-1 F 2 A total of 1,000 seeds were sown in the second line and used to test the resistance to the endomycetes resistance of RM18166, RM18171 and
4-2. 4-2. 유묘로부터From seedlings DNADNA 추출 extraction
본 발명에서 끝동매미충의 생물검정용으로 사용된 일품/YR25353-60-2-1 F2계통의 1차로 239개체 및 2차로 1,000개체로부터 DNA 추출을 수행하였다. 끝동매미충의 생물검정이 끝난 4엽기 유모의 잎에서 0.2 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 mL과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1 시간 반응시킨다. 10,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고, isopropanol 300 ㎕를 첨가 후 잘 섞은 후 -80 ℃에서 30 분 반응시킨다. 20,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70% ethanol를 넣고 가볍게 씻어준 후 30 분 건조한다. DNA 추출버퍼(10 mM NH4OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가 후 잘 섞어준다. 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액 100 ㎕를 새 튜브에 넣는다. 이렇게 추출한 DNA를 이용하여 본 발명에 관련된 실험을 수행하였다.
In the present invention, DNA extraction was carried out from 239 individuals in the first line and 1,000 individuals in the second line of the YR25353-60-2-1 F 2 line, which was used for the biology test of the endoptera. (0.2 mM) was added to the leaves of the four-leaf-nursing moths after the biopsy of the endoptera, and the cells were disrupted using liquid nitrogen. 1.5 mL, and incubate at 60 ° C for 1 hour. Centrifuge at 10,000 × g for 10 minutes, add 400 μl of the supernatant into a new tube, add 300 μl of isopropanol, mix well and react at -80 ° C for 30 minutes. Centrifuge at 20,000 x g for 10 minutes to remove the supernatant, add 70% ethanol, gently rinse and dry for 30 minutes. Add 150 μl of DNA extraction buffer (10 mM NH 4 OAC, 0.25 mM EDTA) and mix well. After reacting at 60 ° C for 1 hour, centrifuge at 10,000 × g for 10 minutes, and add 100 μl of the supernatant into a new tube. Experiments related to the present invention were carried out using DNA thus extracted.
4-3. 일품/4-3. course/ YR24353YR24353 -60-2-1 F-60-2-1 F 22 계통 개체별 저항성 및 Resistance by lineage and alleleallele typetype 분석을 위한 For analysis PCRPCR
상기한 과정에서 이용된 일품/YR24353-60-2-1 F2계통 총 1,239개체, 일품벼 및 신광벼에서 추출한 게놈 DNA의 PCR 증폭의 반응 방법 및 조건은 하기와 같다. PCR 반응 방법으로 DNA는 각 50 ng을 사용하였으며, SSR 마커 프라이머쌍은 각각 10 pmol를 사용하였으며, PCR 증폭에 관련하여 폴리머라제 및 PCR 완충액이 혼합되어 있는 premix(Cat. No. G2002, (주) 제넷바이오)를 사용하여 PCR을 수행하였다.Methods and conditions for PCR amplification of the genomic DNA extracted from 1,239 whole plants, Y. japonica and Shin-Kwang Rice, which were used in the above-mentioned process / YR24353-60-2-1 F 2 system, were as follows. PCR was performed using 50 ng of DNA and 10 pmol of SSR marker primer pairs, respectively. PCR amplification was performed using a premix (Cat. No. G2002, Inc., Japan) containing polymerase and PCR buffer, Genet Bio) was used for PCR.
PCR 증폭 조건으로는 추출된 각 계통의 50 ng의 게놈 DNA를 이용하여 30 ㎕의 부피 (100 pM의 각 프라이머, 200 μM 각각의 dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 0.5 U Taq 중합효소) 조건에서 94.5 ℃, 5 분, 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분, 40 번 반복 반응한 후 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 반응한 후 증폭된 생산물은 3 % 아가로스 겔(agarose gel)에 EtBr 0.5 ㎍/ml를 넣고 UV 상에서 확인하였다.
As PCR amplification conditions, 50 ng of genomic DNA of each strain was used and 30 μl volume (100 pM of each primer, 200 μM of each dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl 2 , 50 mM The reaction was repeated at 94.5 ° C for 5 minutes, at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, at 72 ° C for 1 minute, and at 40 ° C for 10 minutes at 72 ° C in the presence of KCl, 0.1% Triton X-100 and 0.5 U Taq polymerase. After the reaction for a minute, the amplified product was confirmed by UV in a 3% agarose gel containing 0.5 μg / ml of EtBr.
실시예Example 5: 일품/ 5: Dishes / YR24353YR24353 -60-2-1 F-60-2-1 F 22 계통의 끝동매미충 생물검정 결과와 유전자형 일치성 확인Identification of genotypic congruency with endmute biology test results
상기에 기술한 방법으로 일품/YR24353-60-2-1 F2계통 239개체에의 끝동매미충 저항성 생물검정 결과와 SSR 및 Indel 마커를 이용한 PCR 생산물의 유전자형을 비교한 결과 RM18166, RM516, RM 18171 및 Indel 15040 마커의 조환가가 0.00 %로 동일하게 낮고, RM18166, RM516, RM 18171 및 Indel 15040 마커는 끝동매미충 저항성 유전자와 연관되어 있음을 확인하였다.By the method described in the dish / YR24353-60-2-1 F 2 Comparison of the genotypes of the PCR products using the kkeutdong maemichung resistance bioassay results and the SSR and Indel marker of the object system 239 RM18166, RM516, RM 18171 and
상기에 기술한 방법으로 일품/YR24353-60-2-1 F2계통 1,000개체에의 끝동매미충 저항성 생물검정을 실시한 후 아가로스젤로 쉽게 판별할 수 있는 RM18147과 RM516 및 RM5844 마커를 이용하여 저항성 영역이라고 추정되는 영역에 재조환된 개체를 5종 (F2-216, F2-801, F2-975, F2-980, F2-253)을 선발하였다. 이 중 F2-252 개체는 생물검정에서는 감수성을 보였지만 유전자형은 헤테로였다.Using the above-described method, a single-product / YR24353-60-2-1 F 2 strain was subjected to endemic bacterium resistance biochemistry on 1,000 individuals, and then RM18147 and RM516 and RM5844 markers, which can be easily discriminated by agarose gel, (F2-216, F2-801, F2-975, F2-980, and F2-253) were recom- mended in the area estimated to be inferred. Of these, F2-252 individuals were susceptible to bioassays but heterozygous.
이 결과를 바탕으로 하여 끝동매미충 저항성 유전자 (Grh1)와 더욱더 정밀한 유전자 지도를 작성하기 위해서 3종 (Indel 15720, Indel 15600, Indel 15040)을 개발한 후 RM18147과 RM5844 마커 사이에 존재하는 13개의 마커 (RM18148, RM18154, RM18160, RM18161, RM18166, RM516, RM18171, Indel 15040, Indel 15510, RM18177, Indel 15600, Indel 15720, RM6082)를 이용하여 5종에 대하여 유전자형을 분석하였다. 또한 F2-980의 후대계통을 전개하여 상기의 방법으로 생물검정 및 유전자형을 분석하여 정밀 유전자 지도를 완성하였다 (도1).Based on these results, three markers (Indel 15720, Indel 15600, Indel 15040) were developed to produce a more accurate gene map with the endomycete resistance gene (Grh1) and 13 markers between RM18147 and RM5844 markers Genotypes were analyzed for five species using the following primers: RM18148, RM18154, RM18160, RM18161, RM18166, RM516, RM18171,
완성된 정밀 유전자 지도에 따르면 RM18166, RM18171 및 Indel 15040 마커는 끝동매미충과 아주 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다.The completed precision genetic map confirms that the RM18166, RM18171 and
3종의 마커 중 RM18171과 Indel 15040 마커는 아크릴아마이드겔에서만 다형성을 확인할 수 있었으며 RM18166은 증폭산물의 길이가 아크릴아마이드 겔과 아가로스 겔 모두 다형성 확인이 가능하였다 (도 2).
Of the three markers, RM18171 and
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for selecting green rice leafhopper-resistant variety containing Grh1 gene comprising DNA marker RM18166, RM18171, and Indel 15040 <130> PA130497KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18166 primer <400> 1 tacctagcac cattaacggt aagc 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18166 primer <400> 2 aagctcgaag cttgaatgag c 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18171 primer <400> 3 gcttaagcag ctgtgagatt tgagc 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18171 primer <400> 4 attcagggat gagcttgtct tgg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel15040 primer <400> 5 ctctctccat gctctcattc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel15040 primer <400> 6 gattgggaaa taatggtgaa 20 <210> 7 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18166 PCR product <400> 7 tacctagcac cattaacggt aagcaggaga ggggggcaca ttaggagcac cccatgatga 60 tcaaacgatc tatcgatttg gattcaatga aaaagaatac aaagaagctt aatgaataac 120 ataatatata tatatatata tatatatata tctcaatata ccagcaagtt ttaattacta 180 gtaactgaca tagccatata tgtagggctg tcaactagct gagcttgagc gagattgctt 240 gtctgagctc gagctcggta tagactcgag tcgagctcga gccgagcctc gtcaagtctc 300 gagtttttag tcaggctcat gctcagctca ttcaagcttc gagctt 346 <210> 8 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18171 PCR product <400> 8 gcttaagcag ctgtgagatt tgagcctaaa tgatatctcg agttaaatct tgttacttat 60 tttcaagtat tataccacaa gagggagaag caaaagcctc acctcatgga gagaggagcg 120 gcgtggctac attcactatg aaaggctttg agcaatagac aggattaacc gaattcggtc 180 ttgccttttc ctaataacaa ttcattcctt gagttttgac tagccaaatt ttgactgaat 240 gcgcacccgt agacaggaat caattatatt accaatttat ttactatggc aatgtaacta 300 aacactttct ctgaaagttt cctgcatgct tggaaccaag aatatatata tatatatata 360 tatatagctg ttagagaaac attgatccca attgctgtaa gtagaagtac atcactgaaa 420 cacatgttca acagaacaat ttccaagaca agctcatccc tgaat 465 <210> 9 <211> 244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel15040 PCR product <400> 9 ctctctccat gctctcattc aaatcctcaa aataagtccg gagcaccctt agttccctca 60 gtaggcccag ctcattcaca aacttcatcg tagacttcgt agtatcatca acagcagcag 120 catcatcatc atcatcaaca gaagcagcat cgtcatcata aacagcagca gcaggctcta 180 tccaaagctc ttgcaatgag gtcaacttac cgatcaaacc aatcttcacc attatttccc 240 aatc 244 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for selecting green rice leafhopper-resistant variety containing Grh1 gene comprising DNA marker RM18166, RM18171, and Indel 15040 <130> PA130497KR <160> 9 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18166 primer <400> 1 tacctagcac cattaacggt aagc 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18166 primer <400> 2 aagctcgaag cttgaatgag c 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18171 primer <400> 3 gcttaagcag ctgtgagatt tgagc 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18171 primer <400> 4 attcagggat gagcttgtct tgg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel 15040 primer <400> 5 ctctctccat gctctcattc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel 15040 primer <400> 6 gattgggaaa taatggtgaa 20 <210> 7 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18166 PCR product <400> 7 tacctagcac cattaacggt aagcaggaga ggggggcaca ttaggagcac cccatgatga 60 tcaaacgatc tatcgatttg gattcaatga aaaagaatac aaagaagctt aatgaataac 120 ataatatata tatatatata tatatatata tctcaatata ccagcaagtt ttaattacta 180 gtaactgaca tagccatata tgtagggctg tcaactagct gagcttgagc gagattgctt 240 gtctgagctc gagctcggta tagactcgag tcgagctcga gccgagcctc gtcaagtctc 300 gagtttttag tcaggctcat gctcagctca ttcaagcttc gagctt 346 <210> 8 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM18171 PCR product <400> 8 gcttaagcag ctgtgagatt tgagcctaaa tgatatctcg agttaaatct tgttacttat 60 tttcaagtat tataccacaa gagggagaag caaaagcctc acctcatgga gagaggagcg 120 gcgtggctac attcactatg aaaggctttg agcaatagac aggattaacc gaattcggtc 180 ttgccttttc ctaataacaa ttcattcctt gagttttgac tagccaaatt ttgactgaat 240 gcgcacccgt agacaggaat caattatatt accaatttat ttactatggc aatgtaacta 300 aacactttct ctgaaagttt cctgcatgct tggaaccaag aatatatata tatatatata 360 tatatagctg ttagagaaac attgatccca attgctgtaa gtagaagtac atcactgaaa 420 cacatgttca acagaacaat ttccaagaca agctcatccc tgaat 465 <210> 9 <211> 244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel 15040 PCR product <400> 9 ctctctccat gctctcattc aaatcctcaa aataagtccg gagcaccctt agttccctca 60 gtaggcccag ctcattcaca aacttcatcg tagacttcgt agtatcatca acagcagcag 120 catcatcatc atcatcaaca gaagcagcat cgtcatcata aacagcagca gcaggctcta 180 tccaaagctc ttgcaatgag gtcaacttac cgatcaaacc aatcttcacc attatttccc 240 aatc 244
Claims (12)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 방법.Isolating the genomic DNA from the rice sample;
Using the separated genomic DNA as a template, an amplification reaction was performed using a primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2, a primer set consisting of SEQ ID NOS: 3 and 4, and a primer set consisting of SEQ ID NOS: 5 and 6, / RTI > And
And detecting said amplification product. ≪ Desc / Clms Page number 19 >
12. The selection kit according to claim 11, wherein the reagent for carrying out the amplification reaction comprises a DNA polymerase, dNTPs, and a reaction buffer.
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