KR101563148B1 - Microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma ray irradiation and uses thereof - Google Patents
Microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma ray irradiation and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR101563148B1 KR101563148B1 KR1020140058117A KR20140058117A KR101563148B1 KR 101563148 B1 KR101563148 B1 KR 101563148B1 KR 1020140058117 A KR1020140058117 A KR 1020140058117A KR 20140058117 A KR20140058117 A KR 20140058117A KR 101563148 B1 KR101563148 B1 KR 101563148B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- starch
- lipid
- crm001
- reinhardtii
- culture
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Abstract
Description
본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP), 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 바이오매스, 전분 및 지질 제조용 미생물 제제, 상기 변이체를 배양하여 바이오에너지 생산에 필요한 전분 및 지질 제조 방법 및 상기 변이체를 배양하여 생산된 전분 및 지질을 이용한 바이오에탄올 및 바이오디젤 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant having improved biomass, starch and lipid content by irradiation with gamma rays, and more particularly to a biomass, a starch and a lipid by gamma irradiation. Clamidomonas reinhardtii CrM001 with improved lipid content ( Chlamydomonas reinhardtii (KCTC12584BP), a microorganism preparation for producing biomass, starch and lipid containing the mutant or a culture thereof as an active ingredient, a method for producing starch and lipid necessary for bioenergy production by culturing the mutant, and culturing the mutant The present invention relates to a method for producing bio-ethanol and biodiesel using starch and lipids.
화석 연료 고갈과 화석 연료에 의해 발생하는 지구온난화 및 환경 파괴 등의 전 세계적인 문제가 발생하면서 화석 연료의 대안으로서의 바이오에너지, 생물 자원으로부터 얻어지는 재생 가능한 에너지 연구가 활발히 진행되고 있다. As global problems such as depletion of fossil fuels and fossil fuels cause global warming and environmental destruction, research on renewable energy from bioenergy and biological resources as an alternative to fossil fuels is actively under way.
바이오에너지가 사용되는 것은 크게 두 가지 형태를 띤다. 첫 번째 형태로, 바이오에탄올은 설탕 또는 전분에서 만들어진 탄수화물을 발효시켜 생성된 알코올로, 에탄올 연료 또는 휘발유 첨가제로 사용된다. 두 번째 형태의 바이오디젤은 오일 또는 지방으로부터 트랜스에스테르화(transesterification) 과정을 통해 생성되어, 디젤 연료 또는 디젤 첨가제로 사용된다. There are two main uses for bioenergy. In the first form, bioethanol is an alcohol produced by fermenting carbohydrates made from sugar or starch, and is used as an ethanol fuel or as a gasoline additive. The second form of biodiesel is produced from transesterification processes from oils or fats and is used as a diesel fuel or diesel additive.
상기 바이오에너지를 생성하는 바이오에너지원(바이오매스)은 농작물, 목재 또는 미세조류 등이 있다. 그 중 미세조류는 육상 자원을 이용하는 한계를 극복할 수 있고, 폐수를 이용할 수 있으며, 육상 자원(농작물)보다 작게는 5~10배 생산율이 높다는 등의 장점이 있다. The bio-energy source (biomass) for generating the bio-energy may be a crop, a wood or a micro-algae. Among them, microalgae can overcome the limitation of using land resources, can use wastewater, and has the advantages of 5 ~ 10 times higher production rate than land resources (crops).
따라서 세포당 전분 및 지질 함량이 높고 생장이 우수한 미세조류 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다. 미세조류의 전분 및 지질 함량의 증가는 바이오에너지 생산 비용 절감 및 생산 효율 향상에 중요하기 때문이다. 현재까지 지질을 고농도로 축적하는 미세조류는 일부에 한정되어 있으며, 최적의 온도 및 특정 배양조건에서 지질을 축적하는 것이 일반적이나, 최근 유전적 개량에 의한 지질생산성을 높이는 기술이 개발 중에 있다. 다른 한편으로, 전분함량이 높은 미세조류 종 탐색 및 미세조류 형질전환 기술을 이용한 전분 생산량 증대 및 전분 생합성 경로에 관한 연구가 이루어지고 있다(John, R.P.등, 2011, Bioresource Technology 102:186-193). Therefore, the development of microalgae with high starch and lipid content per cell and excellent growth has been actively carried out. The increase in the starch and lipid content of microalgae is important for reducing bio-energy production costs and improving production efficiency. To date, microalgae that accumulate lipid at high concentration are limited to some, and it is common to accumulate lipid under optimum temperature and specific culture conditions. Recently, however, a technology for improving lipid productivity by genetic improvement has been under development. On the other hand, studies on the production of starch and the pathway of starch biosynthesis have been conducted using microalgae species having high starch content and microalgae transformation technology (John, RP et al., 2011, Bioresource Technology 102: 186-193) .
최근에는 미세조류 자체의 유전적인 변이를 유도하는 돌연변이 육종법을 이용한 새로운 균주 개발 연구가 진행되고 있다. 상기 연구는 인공적으로 방사선을 조사하거나 화학물질을 작용시켜 고빈도로 돌연변이를 유도시켜서 원하는 미세조류를 선발하는 것이다. 아직까지는 방사선 조사 또는 화학 물질에 의한 돌연변이 미세조류 육성에 대한 연구는 초기 단계라고 할 수 있다.In recent years, researches on the development of new strains using mutagenic breeding which induces genetic mutation of microalgae themselves are under way. The above-mentioned research is to select the desired microalgae by inducing mutation at a high frequency by artificially irradiating or irradiating with chemicals. So far, studies on the development of mutant microalgae by irradiation or chemicals have been in the early stages.
한국등록특허 제1246723호에는 '방사선 조사에 의해 지질 함량이 증가된 세네데스무스 디모르푸스 6G, 이의 생산 방법 및 상기 세네데스무스 디모르푸스 6G를 이용한 바이오 디젤의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0107258호에는 '전자빔을 이용한 미세조류의 돌연변이체 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이 변이체 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.Korean Patent No. 1246723 discloses a method for producing biodiesel using Senethesmus dymorphus 6G having increased lipid content by irradiation, a method for producing the same, and a method for producing biodiesel using Senethesmus dymorphus 6G, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2013-0107258 discloses a method for producing a mutant of microalgae using an electron beam. However, the microalgae clamidomas lane hard, which has improved biomass, starch and lipid content by irradiation with gamma rays, Thia mutants and their uses have not been disclosed.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 클라미도모나스 레인하드티아이에 감마선을 조사한 후 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증가된 미세조류 변이체를 선발하고, 변이체의 생장특성 분석 및 전분 및 지질 함량 검정을 통해 바이오에너지용 전분 및 지질 생산에 사용 가능한 변이 미세조류임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-described needs, and it is an object of the present invention to provide a method for selecting a microalgae mutant having increased biomass, starch and lipid content after irradiating gamma rays to Cladidomonas reinhardtii, Starch and lipid content of the starch and lipid of the present invention, the present inventors have completed the present invention.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention relates to a method of producing chlamydomonas reinhardtii ( Chlamydomonas reinhardtii) having improved biomass, starch and lipid content by gamma irradiation CrM001) mutant (KCTC12584BP).
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 바이오매스 제조용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for producing biomass comprising the mutant or a culture solution thereof as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 전분 제조용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for producing starch comprising the mutant or a culture solution thereof as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 지질 제조용 미생물 제제를 제공한다.The present invention also provides a microorganism preparation for lipid preparation comprising the mutant or a culture solution thereof as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 전분을 분리하는 것을 특징으로 하는 전분의 제조 방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for producing starch, wherein the mutant is cultured and the starch is separated from the culture.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a lipid characterized in that the mutant is cultured and the lipid is separated from the culture.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계 및 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing bio-ethanol comprising culturing the mutant, separating starch from the culture, and converting the separated starch into bio-ethanol.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계 및 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing biodiesel comprising culturing the mutant, separating starch from the culture, and converting the separated lipid to biodiesel.
본 발명은 기존의 클라미도모나스 레인하드티아이에 감마선을 조사하여 전분과 지질을 고농도로 축적하는 변이체를 개발하였으며, 상기 변이체는 바이오에너지 생산용 전분 및 지질 생산에 적합한 미세조류로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.The present invention has developed a mutant which accumulates starch and lipid at a high concentration by irradiating gamma rays to a conventional clamidomonas hardhadia, and said mutant is useful as a microalgae suitable for producing starch and lipid for bioenergy production do.
또한, 본 발명에 따른 전분 및 지질을 이용한 바이오에탄올 및 바이오디젤은 수송용 연료로 제공되거나 여러 가지 화학 제품 생산의 원료물질로 제공되어 석유 대체 화학물질 생산에 기여할 것이다. Also, the bioethanol and biodiesel using the starch and lipid according to the present invention will be provided as fuel for transportation or as a raw material for various chemical production, and will contribute to the production of petroleum substitute chemicals.
도 1은 감마선 조사에 의해 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이 변이체의 생장 속도를 나타내는 그래프이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 2는 TAP 기본 배지에서 15일간 배양한 후 찍은 세포의 사진을 나타낸 것이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 3은 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 4일간 배양한 세포 내부의 지질체(L) 및 전분체(S) 축적 정도를 투과전자현미경을 이용하여 비교한 사진이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 4는 TAP 기본 배지에서 7일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양한 세포를 요오드 용액으로 염색하여 전분 축적 정도를 비교한 사진이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 5는 TAP 기본 배지에서 7일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양한 세포의 전분 축적량을 정량적으로 분석한 것이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 6은 TAP 기본 배지에서 7일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2, 4, 8일간 각각 추가 배양한 세포의 총 지질 함량을 가스크로마토그래피를 사용하여 정량적으로 분석한 것이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).1 is a graph showing the growth rate of a microalgae clamidomonas hardhide mutant in which starch and lipid contents were increased by gamma irradiation (cc124; control, CrM001; mutant).
Figure 2 shows photographs of cells taken after 15 days of culture in TAP basal medium (cc124; control, CrM001; mutant).
Figure 3 compares the degree of accumulation of lipid (L) and starch (S) in the cells cultured in N-TAP medium lacking nitrogen for 4 days after 5 days of culture in TAP basic medium using transmission electron microscope It is a photograph (cc124; control, CrM001; mutant).
FIG. 4 is a photograph (cc124; control, CrM001; mutant) comparing the degree of starch accumulation by iodine staining of cells cultured for 2 days in nitrogen-deficient N-TAP medium for 7 days after culturing in TAP basic medium.
5 is a quantitative analysis (cc124; control, CrM001; mutant) of starch accumulation in cells cultured in TAP basic medium for 7 days and then cultured in N-TAP medium lacking nitrogen for 2 days.
FIG. 6 shows quantitative analysis of the total lipid content of cells cultured in TAP basic medium for 7 days and then cultured for 2, 4, and 8 days in nitrogen-deficient N-TAP medium, respectively, using gas chromatography (cc124 ; Control, CrM001; mutant).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a mutant of Chlamydomonas reinhardtii CrM001 (KCTC12584BP) in which biomass, starch and lipid content are enhanced by gamma irradiation.
상기 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001 변이체를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2014년 4월 25일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC12584BP).The above-mentioned biomass, starch and lipid-enhanced Clamidomonas reinhardtii CrM001 mutant were deposited on April 25, 2014 by the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) (Deposit No. KCTC12584BP).
상기 감마선은 흡수선량이 60~150 Gy(gray)가 되도록 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)에 조사할 수 있으며, 바람직하게는 감마선의 흡수선량이 80~120 Gy가 되도록 조사할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The gamma ray can be irradiated to the Chlamydomonas reinhardtii so that the absorbed dose is 60 to 150 Gy (gray), and preferably the irradiation dose of the gamma ray is 80 to 120 Gy, But is not limited thereto.
상기 전분 함량은 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 전분 함량에 비해 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 증진될 수 있다.The starch content may be 1.5 times or more, preferably 2 times or more as much as the starch content of the gamma-irradiated clamidomonas reinhardtii.
상기 지질 함량은 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 지질 함량에 비해 1.5배 이상, 바람직하게는 1.7배 이상 증진될 수 있다.The lipid content may be increased 1.5 times or more, preferably 1.7 times or more as much as the lipid content of non-irradiated gamma-irradiated Cladidomonas reinhardtii.
상기 변이체는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 세포 포화도에 비해 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상 세포 포화도가 증가될 수 있다. 본 발명에서 세포 포화도는 배양액 단위용적당 도달할 수 있는 최대의 세포밀도를 가리킨다.The mutant may increase the degree of cell saturation by 20% or more, preferably 30% or more, compared with the degree of cell saturation of the non-irradiated gamma-irradiated cladidomonas reinhardtii. In the present invention, the degree of cell saturation indicates the maximum cell density that can be reached per culture unit.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이체를 25℃의 온도에서 영양이 풍부한 배지에서 배양하였을 때 세포 포화도는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이에 비해 약 30% 정도 높으며, 세포 포화도에 도달한 이후에도 세포 수가 일정하게 유지될 수 있다. 증가된 세포포화도는 상기 변이체의 전분 생산성이 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이와 비교하여 약 2.6배, 지질 생산성은 약 2.2배 증가하였음을 나타낸다.In one embodiment of the present invention, when the mutant is cultured in a nutrient-rich medium at a temperature of 25 ° C, the degree of cell saturation is about 30% higher than that of the gamma-irradiated Cladidomonas reinhardtii, The number of cells can be kept constant after one. The increased degree of cell saturation indicates that the starch productivity of the mutant was increased about 2.6 times and the lipid productivity was about 2.2 times higher than that of the gamma-irradiated Clamidomonas reinhardtii.
미세조류는 바이오매스, 전분 및 지질 함량을 증진시키기 위해서 다양한 생물적 및 무생물적 스트레스를 가할 수 있다. Microalgae can add a variety of biological and inanimate stresses to enhance biomass, starch and lipid content.
본 발명의 상기 변이체는 영양 결핍 배양 조건에서 바이오매스, 전분 및 지질 함량을 증진할 수 있다. 바람직하게는 질소 결핍 배지에서 바이오매스, 전분 및 지질 함량을 증진할 수 있다.The mutants of the present invention can enhance biomass, starch and lipid content under nutrient deficient culture conditions. The biomass, starch and lipid content can be enhanced, preferably in a nitrogen deficient medium.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이체를 25℃의 온도에서 영양소가 풍부한 배지에서 세포 포화도에 도달할 때까지 5~7일간 배양한 후 질소가 결핍된 배지로 옮겨서 2일간 배양하여 전분 축적을 최대화시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.In one embodiment of the present invention, the mutant is cultured for 5 to 7 days in a nutrient-enriched medium at a temperature of 25 DEG C until the degree of saturation is reached, and then transferred to a nitrogen-deficient medium for 2 days to maximize starch accumulation But is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이체를 25℃의 온도에서 영양소가 풍부한 배지에서 세포 포화도에 도달할 때까지 5~7일간 배양한 후 질소가 결핍된 배지로 옮겨서 4~8일간 배양하여 지질 축적을 최대화시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.In one embodiment of the present invention, the mutant is cultured for 5 to 7 days in a nutrient-enriched medium at a temperature of 25 DEG C until the degree of cell saturation is reached, transferred to a nitrogen-deficient medium, and cultured for 4-8 days, But it is not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 바이오매스 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오매스의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. The present invention also provides a microorganism preparation for producing biomass comprising the mutant or a culture solution thereof as an active ingredient. The microbial formulation may be Chlamydomonas reinhardtii CrM001) mutant (KCTC12584BP) as an active ingredient, and can be effectively used for mass production of biomass.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 전분 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오에탄올의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. The present invention also provides a microorganism preparation for producing starch comprising the mutant or a culture solution thereof as an active ingredient. The microbial formulation may be Chlamydomonas reinhardtii CrM001) mutant (KCTC12584BP) as an active ingredient, and can be effectively used for mass production of bioethanol.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 지질 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오디젤의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. The present invention also provides a microorganism preparation for lipid preparation comprising the mutant or a culture solution thereof as an active ingredient. The microbial formulation may be Chlamydomonas reinhardtii CrM001) mutant (KCTC12584BP) as an active ingredient, and can be effectively used for mass production of biodiesel.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 전분을 분리하는 것을 특징으로 하는 전분의 제조 방법을 제공한다. 상기 변이체 배양액으로부터 전분을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 변이체는 전분체 형태로 전분을 축적하므로 추출 및 추출 후 공정을 최소화할 수 있는 장점이 있다. Further, the present invention provides a method for producing starch, wherein the mutant is cultured and the starch is separated from the culture. Any method known in the art can be used as a method for separating starch from the mutant culture fluid. The variant of the present invention has the advantage of minimizing the post-extraction and extraction process since it accumulates starch in the form of a powder.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다. 상기 변이체 배양액으로부터 지질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 변이체는 지질체 형태로 지질을 축적하므로 추출 및 추출 후 공정을 최소화할 수 있는 장점이 있다. The present invention also provides a method for producing a lipid characterized in that the mutant is cultured and the lipid is separated from the culture. Any method known in the art can be used as a method for separating lipids from the mutant culture fluid. The variant of the present invention has the advantage of minimizing the process after extraction and extraction because it accumulates lipid in lipid body form.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계 및 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조 방법을 제공한다. 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.In addition, the present invention provides a method for producing bio-ethanol comprising culturing the mutant, separating starch from the culture, and converting the separated starch into bio-ethanol. Any method known in the art can be used as a method for converting the separated starch to bioethanol.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계 및 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다. 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 상기 바이오디젤은 지방산메틸에스테르(FAME), 지방산에틸에스테르(FAEE) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The present invention also provides a method for producing biodiesel comprising culturing the mutant, separating lipid from the culture, and converting the separated lipid to biodiesel. Any method known in the art can be used as a method for converting the separated lipid into biodiesel. The biodiesel may be fatty acid methyl ester (FAME), fatty acid ethyl ester (FAEE) or the like, but is not limited thereto.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 감마선 조사 미세조류 변이체 선발 Example 1 Selection of Gamma Irradiation Microalgae Mutants
미세조류인 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)를 5일간 25℃의 TAP(Tris Acetate Phosphate) 배지에서 배양하여 감마선을 처리할 샘플을 준비하였다. 준비된 미세조류 세포를 원심분리기로 수집 후 상등액을 제거한 다음 1시간 동안 100 Gy 총 세기의 감마선에 노출시켰다. 노출된 미세조류 세포를 2일간 암 상태로 정치 배양한 후, TAP 고체 배지에 도말하여 다른 변이체들이 섞이지 않은 순수 변이체를 콜로니 형태로 선발하였다. 선발된 변이체를 질소가 결핍된 N-TAP 배지에 옮긴 후, 요오드용액을 가하여 색 변화를 관찰 후 전분 고축적 변이체를 선발하였다.
A microalgae, Chlamydomonas reinhardtii , was cultured in a TAP (Tris Acetate Phosphate) medium at 25 ° C for 5 days to prepare a sample to be treated with the gamma rays. The prepared microalgae cells were collected by a centrifuge, and the supernatant was removed, and then exposed to a gamma ray of 100 Gy total intensity for 1 hour. The exposed microalgae cells were cultured for 2 days in a dark state, and then plated on a TAP solid medium, and a pure mutant that did not contain other mutants was selected as a colony. The selected mutants were transferred to nitrogen-deficient N-TAP medium, and iodine solution was added thereto to observe the color change, and starch-rich mutants were selected.
실시예 2. 미세조류 변이체 생장 특성 및 세포 형태 분석Example 2. Growth characteristics of microalgae and cell morphology analysis
50ml TAP 배지에 OD750 0.1로 대조구(cc124) 및 변이체(CrM001)를 각각 접종하여 매 24시간마다 OD750을 측정하였다. 대조구(cc124)는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이를 가리킨다. 접종 후 배양 3일째까지 대조구와 비교하여 다소 느린 성장속도를 보였다. 그러나 배양 4일째 대조구의 최대 포화도 수준과 비슷한 OD750 1.35를 보였으며, 이후 계속 생장을 유지하여 배양 6일째 최대 포화도 OD750 1.85를 나타내었다. 대조구의 최대 세포포화도는 5일째 OD750 1.45를 나타내고 이후 노화로 인하여 세포포화도가 감소하는 것이 관찰되었으나, 변이체는 6일째 최대 세포포화도 OD750 1.85를 나타내었다(도 1). 이 결과는 변이체의 세포포화도가 대조구보다 약 30% 정도 높으며, 이러한 결과는 대조구와 비교하여 더 많은 바이오매스 생산이 가능하다는 것을 나타낸다. OD 750 was measured every 24 hours by inoculating control (cc124) and mutant (CrM001) in 50 ml TAP medium with OD 750 0.1. Control (cc124) refers to a clemimonas lane hard taii that did not irradiate gamma rays. After the inoculation, the growth rate was slightly slower than that of the control until 3 days after the inoculation. However, on the 4th day of culture, OD 750 1.35, which is similar to the maximum saturation level of the control, was observed. After that, the growth was maintained and the maximum saturation OD 750 of 1.85 was obtained on the 6th day of culture. The maximum cell saturation of the control group was OD 750 1.45 at 5 days and then decreased in cell saturation due to aging. However, the mutant showed a maximum cell saturation OD 750 of 1.85 at 6 days (Fig. 1). This result indicates that the degree of cell saturation of the mutant is about 30% higher than that of the control, and this result shows that more biomass production is possible than the control.
TAP 배지에서 15일간 배양하여 세포가 노화기로 접어든 상태의 세포를 현미경으로 관찰하였다. 변이체의 경우 대조구에 비교하여 분열중인 세포가 관찰되었으며(도 2), 이러한 결과는 변이체가 대조구에 비하여 고밀도로 증식할 수 있다는 것을 의미한다.
TAP medium for 15 days, and cells with the cells folded into the aging period were observed under a microscope. In the case of mutants, disrupted cells were observed compared to the control (Fig. 2), which means that the mutants can grow at a higher density than the control.
실시예 3. 요오드용액 반응을 통한 전분 과축적 변이체의 전분 축적 확인Example 3. Confirmation of starch accumulation of starch and accumulation mutant through iodine solution reaction
대조구(cc124) 및 변이체(CrM001)를 각각 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양 후 요오드용액을 첨가하여 세포의 색 변화를 관찰하였다. 변이체(CrM001)의 색 변화가 대조구보다 진한 갈색을 나타내는 것을 확인하였다(도 4). 이 결과는 변이체의 전분함량이 대조구보다 높다는 것을 의미한다.
The control (cc124) and mutant (CrM001) were cultured in TAP basic medium for 5 days, followed by incubation in nitrogen-deficient N-TAP medium for 2 days, followed by addition of iodine solution. It was confirmed that the color change of the mutant (CrM001) was darker than the control (Fig. 4). This result means that the starch content of the mutant is higher than that of the control.
실시예 4. 투과전자현미경(Example 4. Transmission electron microscope ( TEMTEM )을 이용한 세포 내부 ) Inside the cell 전분체Pre-powder 및 And 지질체Lipid body 축적 정도 및 세포 형태 관찰 Accumulation and observation of cell morphology
대조구(cc124)를 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 4일간 배양 후 TEM 분석을 수행하였다. 그 결과 변이체(CrM001)의 지질체 및 전분체가 대조구와 비교하여 월등히 많다는 것을 확인하였다(도 3). 이 결과는 변이체에서 전분 함량뿐만 아니라 지질 축적도 대조구보다 높다는 것을 의미한다.
The control (cc124) was cultured in TAP basic medium for 5 days and then cultured in N-TAP medium lacking nitrogen for 4 days, followed by TEM analysis. As a result, it was confirmed that the lipid and starch of the mutant (CrM001) were significantly higher than the control (Fig. 3). This result implies that not only starch content but also lipid accumulation is higher in the mutant than in the control.
실시예 5. 미세조류 변이체의 전분 축적량의 정량적 분석Example 5. Quantitative analysis of starch accumulation of microalgae variants
대조구(cc124)와 변이체(CrM001)의 전분 축적량을 분석하기 위하여 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양 후 세포를 건조시켜 분석을 수행하였다. 생물체의 전분함량 분석을 위하여 Starch assay kit (시그마, 미국)을 이용한 정량적 분석방법이 사용되고 있다. 따라서 본 실시예에서는 고전분 변이체의 전분함량을 측정하기 위하여 Starch assay kit (시그마, 미국)을 사용하여 분석을 수행하였다. 전분 분리를 위하여 총 20 mg의 건조 샘플을 사용하여 수행하였고 추출법은 Starch assay kit의 제조사가 제공하는 사용자매뉴얼을 사용하였다. 변이체의 전분량은 건조중량의 약 32%로 대조구에 비교하여 약 2배 높게 관찰되었다(도 5). 이 결과는 변이체(CrM001)가 바이오에탄올용 전분생산에 활용 가능하다는 것을 의미한다.
For the analysis of starch accumulation in the control (cc124) and mutant (CrM001), the cells were cultured in TAP basic medium for 5 days and then cultured in N-TAP medium lacking nitrogen for 2 days. Quantitative analysis using Starch assay kit (Sigma, USA) has been used to analyze the starch content of organisms. Thus, in this example, the starch assay kit (Sigma, USA) was used to analyze the starch content of high-valued mutants. A total of 20 mg of dry sample was used for starch separation. The extraction procedure was carried out using the user manual provided by the manufacturer of the Starch assay kit. The total amount of the mutant was about 32% of the dry weight, which was about twice as high as that of the control (FIG. 5). This result implies that the variant (CrM001) is available for the production of starch for bioethanol.
실시예 6. 미세조류 변이체의 지방산 분석Example 6. Fatty acid analysis of microalgae variants
대조구(cc124)와 변이체(CrM001)의 지질 축적량을 분석하기 위하여 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 배양하여 2일, 4일, 8일간 배양 후 세포를 건조시켜 분석을 수행하였다. 지방산은 Sasser(Sasser, 1990, Methods in Phytobacteriology;199-210) 방법에 따라 전체 지질을 분리하고 GC로 분석하였다. 그 결과 지방산 함량이 대조구에서는 초기 13%에서 증가하여 2일째에 약 20%까지 증가한 후 유지되었다. 그러나 변이체는 초기 약 15%에서 8일째까지 계속 증가하였으며 최고 30%까지 축적되었다(도 6). 이 결과는 변이체는 대조구에 비해 지방산 함량이 약 1.7배 증가하였음을 의미한다.In order to analyze the lipid accumulation of the control (cc124) and mutant (CrM001), the cells were cultured in TAP basic medium for 5 days, then cultured in N-TAP medium lacking nitrogen, and cultured for 2 days, 4 days and 8 days. Respectively. Fatty acids were isolated from whole lipids according to the method of Sasser (Sasser, 1990, Methods in Phytobacteriology; 199-210) and analyzed by GC. As a result, the fatty acid content increased from the initial 13% at the control and increased to about 20% at the second day. However, mutants continued to increase from the initial about 15% to the eighth day and accumulated up to 30% (Fig. 6). This result means that the fatty acid content of the mutant increased about 1.7 times as compared with the control.
Claims (14)
(2) 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계; 및
(3) 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조 방법.(1) preparing a culture medium comprising the cultured Clamidomonas reinhardtii CrM001 of any one of claims 1 to 7;
(2) separating starch from the culture liquid; And
(3) converting the separated starch to bio-ethanol.
(2) 상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
(3) 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법.(1) preparing a culture medium comprising the cultured Clamidomonas reinhardtii CrM001 of any one of claims 1 to 7;
(2) separating lipid from the culture liquid; And
(3) converting the separated lipid to biodiesel.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140058117A KR101563148B1 (en) | 2014-05-15 | 2014-05-15 | Microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma ray irradiation and uses thereof |
| PCT/KR2014/009607 WO2015174588A1 (en) | 2014-05-15 | 2014-10-14 | Microalgae chlamydomonas reinhardtii variant having increased contents of biomass, starch, and lipid through gamma irradiation, and a use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140058117A KR101563148B1 (en) | 2014-05-15 | 2014-05-15 | Microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma ray irradiation and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101563148B1 true KR101563148B1 (en) | 2015-10-26 |
Family
ID=54428249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140058117A KR101563148B1 (en) | 2014-05-15 | 2014-05-15 | Microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma ray irradiation and uses thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101563148B1 (en) |
| WO (1) | WO2015174588A1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101796950B1 (en) * | 2015-12-29 | 2017-11-13 | 한국원자력연구원 | Microalgae mutant for bioethanol production |
| KR20180040471A (en) * | 2016-10-12 | 2018-04-20 | 고려대학교 산학협력단 | Microalgal with Improved Phototactic Response and Photosynthetic Efficiency |
| US10709152B2 (en) | 2016-04-22 | 2020-07-14 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University | Chlamydomonas mutants produced using RGEN RNP and method for preparing pigment using the same |
| KR20220157164A (en) * | 2021-05-20 | 2022-11-29 | 전남대학교산학협력단 | Method for preparing nitrogen source depletion stress-resistant microorganism into which 2-amino-3-carboxymuconate-6-semialdehyde decarboxylase presumed gene is introduced and method for manufacturing lipid using the same |
| KR20240021527A (en) | 2022-08-10 | 2024-02-19 | 한국원자력연구원 | Method for promoting growth activity of microalgae using ionizing radiation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9290782B2 (en) * | 2011-03-25 | 2016-03-22 | Colorado School Of Mines | Modified algae for improved biofuel productivity |
| KR101246723B1 (en) * | 2011-05-13 | 2013-03-26 | 한국원자력연구원 | A mutant Scenedesmus dimorphus 6G having increased lipid content and preparation method thereof, and the production of bio-diesel from the mutant mutant Scenedesmus dimorphus 6G |
| KR101521594B1 (en) * | 2012-03-21 | 2015-05-19 | 신라대학교 산학협력단 | A method of preparing microalgae mutant by electron beam |
| KR101496783B1 (en) * | 2014-01-02 | 2015-02-27 | 경북대학교 산학협력단 | Novel Microalgae Chlamydomonas reinhardtii KNUA021 and method for producing fatty alcohol and fatty acid from the same |
-
2014
- 2014-05-15 KR KR1020140058117A patent/KR101563148B1/en active IP Right Grant
- 2014-10-14 WO PCT/KR2014/009607 patent/WO2015174588A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EUKARYOTIC CELL, Vol.9, No.8, pp. 1251-1261 (2010) |
| JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol.174, No.11, pp.3612-3620 (1992) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101796950B1 (en) * | 2015-12-29 | 2017-11-13 | 한국원자력연구원 | Microalgae mutant for bioethanol production |
| US10709152B2 (en) | 2016-04-22 | 2020-07-14 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University | Chlamydomonas mutants produced using RGEN RNP and method for preparing pigment using the same |
| US10973246B2 (en) | 2016-04-22 | 2021-04-13 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University | Chlamydomonas mutants produced using RGEN RNP and method for preparing pigment using the same |
| US10980252B2 (en) | 2016-04-22 | 2021-04-20 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University | Chlamydomonas mutants produced using RGEN RNP and method for preparing pigment using the same |
| KR20180040471A (en) * | 2016-10-12 | 2018-04-20 | 고려대학교 산학협력단 | Microalgal with Improved Phototactic Response and Photosynthetic Efficiency |
| KR101872401B1 (en) * | 2016-10-12 | 2018-06-28 | 고려대학교 산학협력단 | Microalgal with Improved Phototactic Response and Photosynthetic Efficiency |
| KR20220157164A (en) * | 2021-05-20 | 2022-11-29 | 전남대학교산학협력단 | Method for preparing nitrogen source depletion stress-resistant microorganism into which 2-amino-3-carboxymuconate-6-semialdehyde decarboxylase presumed gene is introduced and method for manufacturing lipid using the same |
| KR102575345B1 (en) | 2021-05-20 | 2023-09-06 | 전남대학교산학협력단 | Method for preparing nitrogen source depletion stress-resistant microorganism into which 2-amino-3-carboxymuconate-6-semialdehyde decarboxylase presumed gene is introduced and method for manufacturing lipid using the same |
| KR20240021527A (en) | 2022-08-10 | 2024-02-19 | 한국원자력연구원 | Method for promoting growth activity of microalgae using ionizing radiation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015174588A1 (en) | 2015-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feng et al. | Lipid accumulation and growth of Chlorella zofingiensis in flat plate photobioreactors outdoors | |
| Feng et al. | Lipid accumulation and growth characteristics of Chlorella zofingiensis under different nitrate and phosphate concentrations | |
| Widjaja et al. | Study of increasing lipid production from fresh water microalgae Chlorella vulgaris | |
| JP6329940B2 (en) | Euglena microalgae, polysaccharide manufacturing method, and organic compound manufacturing method | |
| EP2668259B1 (en) | Process for production of microalgae, cyanobacteria and metabolites thereof | |
| US8986962B2 (en) | Organism co-culture in the production of biofuels | |
| US9725745B2 (en) | Process for biodiesel production from a yeast strain | |
| KR101563148B1 (en) | Microalgae Chlamydomonas reinhardtii mutant with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma ray irradiation and uses thereof | |
| US20110054027A1 (en) | Production of biofuel from tissue culture sources | |
| Kumar et al. | Micro-algal lipids: A potential source of biodiesel | |
| Heidari et al. | Effect of culture age and initial inoculum size on lipid accumulation and productivity in a hybrid cultivation system of Chlorella vulgaris | |
| KR101424852B1 (en) | Chlorella vulgaris CV-16 producing biodiesel, and method for producing biodiesel using the strain | |
| US20140242641A1 (en) | Method for obtaining an open phototrophic culture with improved storage compound production capacity | |
| KR101424853B1 (en) | Chlorella vulgaris CV-18 producing biodiesel, and method for producing biodiesel using the strain | |
| Shafiq | Biodiesel production by oleaginous fungi before and after exposing of UV light | |
| Viswanath et al. | Biodiesel production potential of wastewater microalgae Chlorella sp. under photoautotrophic and heterotrophic growth conditions | |
| Bajwa et al. | Optimization of environmental growth parameters for biodiesel producing bacteria Rhodococcus opacus using response surface methodology | |
| KR101672407B1 (en) | radiated microalgae mutant for bio-energy production | |
| Prabakaran et al. | Lipid extraction and CO2 mitigation by microalgae | |
| Widyaningrum et al. | Screening and identification indigenous yeast from neera Siwalan for bioethanol production | |
| Gropoșilă-Constantinescu et al. | Production of microbial lipids by Yarrowia lipolytica | |
| ŞİMŞEK et al. | The Effect of Waste Molasses on the Growth and the Amount of Lipid and Protein of Chlorella vulgaris | |
| KR101424316B1 (en) | Scenedesmus sp. M003 producing biodiesel, and method for producing biodiesel using the strain | |
| Sivakaminathan | Biomass and lipid production from heterotrophic and mixotrophic fed-batch cultivations of microalgae Chlorella protothecoides using glycerol | |
| Khaleel et al. | Isolation and diagnosis of SCO-producing bacteria and improved optimal production conditions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190909 Year of fee payment: 5 |