KR101555764B1 - 고분자 하이드로겔 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고분자 하이드로겔 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이오마커를 표적화 할 수 있고 개질되지 않은 음이온성 다당류 및 형광물질과 공유결합된 양이온성 고분자를 포함하는 근적외선 영역 활성화 영상진단용 고분자 하이드로겔 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

고분자 하이드로겔 복합체 및 이의 제조방법{Polymer hydrogel complex and method for the preparation thereof}
본 발명은 고분자 하이드로겔 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최초의 표적 항암제로서 글리벡이 개발된 이후, 분자 수준에서 목표로 하는 세포에만 치료제를 전달하는 방식의 표적 암 치료제들에 대한 연구가 암 환자의 생존율을 높이기 위한 신약으로서 개발의 중요성이 부각되고 있다. 이러한 표적 치료제는 정상 세포들 사이에서 암세포를 선별하여 공격하는 방식으로 치료제에 의해 성장이 저해되거나 세포 자체를 사멸시키는 방식 이외에도 암세포의 증식을 돕는 영양분 공급의 경로를 차단하여 치료 효과를 높이는 방식이 있으며, 기존의 치료제들이 정상 세포를 무차별적으로 공격하여 발생하는 부작용을 막을 수 있다는 점에서 큰 장점을 가지고 있다. 그러나 암 유발 유전자만을 공격하거나 암세포 성장과 관련된 신호 체계를 차단하는 형태의 표적 치료제 개발을 위해서는 암 치료의 근본적인 장애물인 재발과의 연관성을 갖는 잠재적인 표적으로서의 특정 단백질을 선별하여 해당 단백질에서만 치료 효과와 안정성을 갖는 적합한 조합을 설계하는 것이 중요하다.
암 줄기세포(Cancer stem cell)는 자가복제능력(self-renewal)과 분화능력(differentiation), 전이능력(metastasis)을 가지고 있으며, 이러한 암 줄기세포를 제어하기 위해서 바이오마커로 표적화하는 것이 중요하다[비특허문헌 1~2]. 그 중에서도 CD44는 히알루론산의 주수용체인 세포막의 당단백으로 암세포 중에서도 암줄기세포로 알려진 암 조직 내 세포의 표지단백질로 알려져 있으며 암세포의 부착 및 이동에 중요한 역할을 한다. Takaishi 등은 위암 세포주에서 CD44의 발현율이 높을수록 tumorigenecity나 항암제 저항성과 관련이 있는 것으로 보고하였으며, 이는 암 환자의 예후와도 상관 관계가 있는 것으로 알려진 바 있다[비특허문헌 3]. 그러므로 성공적으로 암을 치료하기 위해서는 암 줄기 세포를 식별해내기 위한 노력으로 바이오마커를 특이적으로 이미징하는 것이 암 진단과 암 환자의 예후에도 중요하다.
특히, 분자 단위 이미징 기술은 암 세포의 성질을 이해하는데 중요한 방법이며 효과적인 치료법을 제시하는데 그 역할이 있다. 또한, 암의 효과적인 치료를 위해 분자 수준에서 암세포의 특성을 분석할 수 있는 중요한 기술로서 이용되고 있다
최근, CD44를 발현하는 암 줄기세포를 이미징하거나 치료하기 위해 히알루론산(HA)을 개질한 다양한 입자들이 개발되어 왔다[비특허문헌 4~8]. 하지만, 고분자의 표면을 개질하기 위해서 다양한 물리화학적 표면개질 방법이 시도되고 있으나, 이는 담체의 물성을 저하시키거나 잔존 용매의 독성이 문제점으로 지적되고 있다.
L. Gutierrez-Gonzales, O. Inatomi, J. Burker and N. Wright, Curr Cancer Ther Rev, 2008, 4, 168-177. Y. Kim, K. Joo, J. Jin and D. Nam, Int J Stem Cells, 2009, 2, 109-114. S. Takaishi, T. Okumura, S. Tu, S. S. Wang, W. Shibata, R. Vigneshwaran, S. A. Gordon, Y. Shimada and T. C. Wang, Stem Cells, 2009, 27, 1006-1020. K. Meyer, Physiological Reviews, 1947, 27, 335-359. M. Kurisawa, J. E. Chung, Y. Y. Yang, S. J. Gao and H. Uyama, Chem Commun (Camb), 2005, 4312-4314. E. K. Lim, H. O. Kim, E. Jang, J. Park, K. Lee, J. S. Suh, Y. M. Huh and S. Haam, Biomaterials, 2011, 32, 7941-7950. B. P. Toole, Nature reviews. Cancer, 2004, 4, 528-539. R. Peach, D. Hollenbaugh, I. Stamenkovic and A. Aruffo, J Cell Biol 1993, 122, 257-264.
이에, 본 발명자들은 종래 암 치료제들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 생체 내에서 특정 바이오마커를 표적화할 수 있고, 개질되지 않은 음이온성 다당류와 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질과 공유결합시킨 양이온성 고분자를 전기적 상호작용을 통해 조밀하게 집적시킨 고분자 하이드로겔 나노복합체를 제조하여 이용할 경우, 생체 외와 생체 내에서도 표적화된 이미징 프로브로서의 기능을 하면서도 세포 독성 또한 낮음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다
따라서, 본 발명은 새로운 고분자 하이드로겔 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 음이온성 다당류; 및 형광물질이 공유결합된 양이온성 고분자를 포함하는 고분자 하이드로겔 복합체에 관한 것이다.
상기 바이오마커는 암 줄기세포, 심혈관 질환 또는 세포 성장인자의 바이오마커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 암 줄기세포의 바이오마커는 CD44, ESA, HER-2/neu, KRAS 또는 ER(estrogen receptor) 등일 수 있고, 심혈관 질환의 바이오마커는 C반응성단백(CRP), N말초프로B형나트륨이뇨펩타이드(N-BNP), 시스타틴C 또는 리포단백질관련 포스폴리파제2 (Lp-PLA2) 등일 수 있고, 상기 세포 성장인자의 바이오마커는 VEGF, FGF, PDGF 등일 수 있다.
본 발명에서 사용된 음이온성 다당류는 구체적으로, 히알루론산, 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose, CMC), 알지네이트(Alginates) 및 카르복시셀룰로오즈(carboxycellulose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 음이온성 다당류의 분자량은 500 내지 1500 kD 또는 750 내지 1250 kD일 수 있다. 이때, 분자량이 500 kD 미만이면 나노입자를 형성하는데 분자 자체의 응집이 어려워 수율이 감소하며 입자 내에 다당류가 불안정하게 고정되는 문제가 발생하며, 1,500 kD 초과하면 형성된 나노 입자의 점도가 커지게 되고, 이는 나노 입자의 안정성 문제를 일으킨다.
상기 형광물질은 근적외선에서 활성을 갖는 형광물질이 바람직하며, 구체적으로는 클로로톡신(Cy5.5), 시아닌(Cyanine)계열 형광분자, 로다민(Rodamine) 계열 형광분자, 알렉사(Alexa) 계열 형광분자, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광분자, FAM(5-carboxy fluorescein) 형광분자 및 텍사스 레드(Texas Red) 형광분자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 양이온성 고분자는 예를 들면, PEI(polyethyleneimine), PAH(poly(allylamine hydrochloride)), PDDA(poly(diallyldimethylammonium chloride), PLL(poly(lysine)) 및 PDADMA(poly(diallyldimethylammonium))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 양이온성 고분자의 분자량은 1 내지 80 kD, 10 내지 70 kD 또는 15 내지 50 kD일 수 있다. 이때, 양이온성 고분자의 분자량이 1 kD 미만이면 나노입자 형성 시 응집력의 문제가 발생하며, 80 kD 초과하면 형성된 나노 입자의 크기가 증가하여 입자의 안정성이 감소하며, 양이온성 고분자의 밀도와 분자량이 커질수록 세포 독성이 증가하는 문제가 있다.
본 발명에 따른 고분자 하이드로겔 복합체는 상기 음이온성 다당류와 형광물질과 결합된 양이온성 고분자가 분자간의 전기적 상호작용으로 집적된 구조를 가지며, 이때 음이온성 다당류와 음이온성 다당류와 양이온성 고분자는 1 : 2 내지 1 : 20의 몰비로 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나면 복합체의 입자 크기가 너무 커져 진단에 사용되는 경우 체외로 배출되기 까지 시간이 오래 걸리는 문제가 있다.
따라서, 본 발명의 고분자 하이드로겔 복합체의 평균 입자 크기는 200 nm 내지 600 nm, 바람직하게는 250 nm 내지 500 nm, 보다 바람직하게는 250 nm 내지 450 nm의 직경을 갖는 입자인 것이 적합하다. 면역시스템이 파괴된 암 조직에는 림프관의 기능을 제대로 수행하지 못하기 때문에 나노입자가 외부로 쉽게 배출되지 않아 암 조직에 오랜 기간 머물게 되는 EPR(Enhanced Permeability and retention) 효과라고 하며, 200 nm 미만에 해당하는 나노입자는 고효율의 EPR 효과를 보이나, 신생혈관이 적을 경우에는 EPR 효과에 따른 효과적인 약물전달을 기대하기 어렵다. 입자 크기가 너무 작으면 체내 안정성이 낮아 지속성이 짧고 암 조직에 대한 약물 축적 효과가 낮은 문제가 있고, 입자 크기가 너무 크면 상기에서 서술한 바와 같은 문제가 있다.
본 발명에 따른 복합체는 전기적 상호작용으로 집적된 고분자 복합체를 통해 목적하는 특정 바이오마커를 발현하는 세포주에서의 특이적인 영상화가 가능하다. 또한, 음이온의 다당류와 형광물질이 공유결합된 양이온성 고분자를 수용상에 분산시키는 것만으로도 자체적으로 구조체를 형성하는 전기적 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명자들은 특정 바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 생체적합성 음이온성 다당류와 조밀하게 집적시키면서 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질을 공유결합시킨 양이온성 고분자를 전기적 상호작용을 통해 섞어주기만 하면 쉽게 형성될 수 있는 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)를 만들어서 인비트로(in vitro)와 인비보(in vivo) 내에서 특정 바이오마커를 표적화하는 근적외선 영역 광학영상진단 평가를 통해 본 발명을 달성하였다.
본 명세서에서 "고분자 하이드로겔 복합체"는 특정 바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 생체적합성 음이온성 다당류와 근적외선에서 활성을 갖는 형광물질을 공유결합시킨 양이온성 고분자를 전기적 상호작용을 통해 조밀하게 집적시킨 하이드로겔을 의미한다.
본 발명의 복합체는 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질을 포함하여 근적외선 영역에서 광학영산 진단이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 복합체는 암 조직 내 세포 중에서 예후에 악영향을 미치는 암 줄기세포의 표지단백질인 CD44를 표적화할 수 있는 복합체로서, 히알루론산을 포함하고 있어서 수용액에 잘 분산되고 수분을 잘 흡수하는 성질이 있어 겔 상태로 되고 이러한 친수성 특성과 우수한 생체적합성으로 의학분야에 많은 이용이 가능하다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 복합체에 근적외선 영역 활성화 형광물질과 결합되어 있으면서 전기적 상호작용으로 히알루론산을 입자화시키기 위해 사용된 고분자 폴리에틸렌이민이 200-1μM 이상(도 6의 세포독성 실험은 log scale로 그래프화한 것이고 linear scale에서의 실제 농도임)에서 갖는 세포독성을 생체적합성 고분자 히알루론산으로 대조군 대비 100%로 세포생존율을 높일 수 있다. 즉, 동일한 폴리에틸렌이민 농도에서 폴리에틸렌이민과 폴리에틸렌이민+히알루론산(NIRSH)의 세포 생존능을 비교하였을 때, 폴리에틸렌이민이 해당 농도에서 세포독성을 보이나 NIRSH는 같은 농도의 폴리에틸렌이민을 포함하여도 세포독성이 없는 (100%) 것으로 나타났다.
또한, 본 발명의 복합체는 근적외선 범위에서 활성을 갖는 형광물질을 결합시켰으므로 근적외선 파장 범위(600 내지 1100 nm의 파장 영역)에서 광학적 특성을 나타내, 암세포와 같은 표적 세포에서만 형광 신호 강도가 증가 흡광도가 증가하는 광학적 특성을 갖는다.
또한, 본 발명의 복합체에 특정 암세포 관련 바이오마커를 표적화하는 음이온성 다당류가 함유되어 있어 특정 암세포에만 선택적으로 표적할 수 있고, 근적외선 범위에서 활성을 가지는 형광물질을 사용함으로써 특정 암 세포만을 진단할 수 있게 된다.
본 발명은 또한, 바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 음이온성 다당류; 및 형광물질이 공유결합된 양이온성 고분자를 정전기적 인력을 통해 고분자 하이드로겔 복합체를 제조하는 방법을 포함하는 고분자 하이드로겔 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 바이오마커, 음이온성 다당류, 형광물질, 양이온성 고분자는 상기에서 정의된 바와 같다.
구체적으로, 형광물질과 양이온성 고분자를 용매에 녹여 형광물질이 공유결합된 양이온성 고분자 용액을 형성시키는 단계; 및
바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 음이온성 다당류를 상기 용액에 첨가하는 단계;를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 형광물질과 양이온성 고분자를 용매에 녹여 형광물질이 공유결합된 양이온성 고분자 용액을 형성시키는 단계(제 1 단계); 및
바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 음이온성 다당류를 상기 용액에 첨가하는 단계(제 2 단계);를 포함할 수 있다.
상기 형광물질이 공유결합된 양이온성 고분자 용액은 양이온성 고분자과 형광물질을 1 : 2 내지 1 : 10의 몰비로 혼합하여 용매에 녹여 제조할 수 있다. 상기 범위를 벗어나면 복합체의 입자 크기가 너무 커져 진단에 사용되는 경우 체외로 배출되기까지 시간이 오래 걸리는 문제가 있어 바람직하지 못하다.
상기 용매로는 친수성이 우수한 하이드로겔의 특성 상 PBS 또는 증류수 등이 바람직하나, 유기용매를 제외한 것이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 암 진단용 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명의 암 진단용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 암 진단용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 암 진단용 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 암 진단용 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 암 진단용 조영제를 포함할 수 있다. 특히, MRI 조영제가 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 영상 진단 프로브를 포함할 수 있다.
상기 프로브는 암과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 또는 자궁경부암 등을 진단하는데 이용될 수 있으므로, 암 진단을 위한 키트에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 고분자 하이드로겔 복합체는 바이오마커를 표적화할 수 있는 복합체로서 CD44를 발현하는 위암세포를 인지할 수 있는 분자 영상 능력과 생체적합성을 확인하였으며, 분자 간의 전기적 상호작용으로 집적된 구조에서 세포 독성 또한 낮아지는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 고분자 하이드로겔 복합체는 RNA 치료제, 항암제, 조영제와 같은 치료기능적인 물질을 담지하여 분자영상과 치료, 또는 분자영상과 자기 공명 영상과 같은 다기능성 나노복합체로서의 확대 역시 기대되는 영상 진단용 복합체로서 암 치료 발전에 기여할 것이라고 기대된다.
도 1은 CD44를 표적화하는 음전하 고분자인 히알루론산과 Cy5.5와 공유결합된 양전하 고분자인 폴리에틸렌이민의 전기적 상호작용을 통해 복합체를 형성하는 과정과 CD44를 표적화한 후 근적외선 영역에서 광학 영상 진단을 하게 되는 고분자 하이드로겔 복합체(Near-IR sensitive Supramolecular Hydrogel; NIRSH)를 간략히 도시한 것이다.
도 2는 히알루론산과 폴리에틸렌이민의 몰비율에 따른 복합체의 크기를 동적광산란 장비로 평가한 것(A)이다. 또한, 히알루론산과 Cy5.5가 공유결합된 폴리에틸렌이민의 몰비율 6.25에서 형성된 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)의 크기를 AFM(atomic force microscope)으로 평가한 것(B)으로 AFM 이미지와 AFM 이미지에서 산출된 높이와 넓이 값을 나타낸 것이다.
도 3은 히알루론산과 Cy5.5가 공유결합된 폴리에틸렌이민의 몰비율 6.25에서 형성된 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)의 특성을 퓨리에 변환 적외선분광기(FT-IR)와 암시야 현미경(Dark Field microscope)으로 각각 관찰한 것(A, B)과 겔 전기영동(Gel electrophoresis)으로 50 mV 전압에서 2시간 동안 분리한 결과(C)이다.
도 4는 히알루론산, 폴리에틸렌이민, Cy 5.5와 히알루론산과 Cy5.5가 공유결합된 폴리에틸렌이민의 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)의 몰 흡광도(A)와 몰 형광도(B)를 나타낸 것이다.
도 5는 두 개의 위암 세포주 MKN-45, MKN-28에 대한 CD44의 발현율을 FACS를 통해 평가한 것(A, B)이다.
도 6은 히알루론산과 폴리에틸렌이민 및 Cy5.5가 결합된 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)의 MKN-45 위암세포주에 대한 생존율에 대해 평가한 것이다.
도 7은 본 발명의 근적외선 영역에서 활성을 갖는 CD44 표적화가 가능한 진단 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)의 CD44 표적화능력을 CD44의 발현율에 차이를 보이는 두 위암 세포주 MKN-45, MKN-28를 이용하여 인비트로에서 평가한 것이다.
도 8은 본 발명의 근적외선 영역에서 활성을 갖는 CD44 표적화 고분자 하이드로겔 복합체(NIRSH)의 인비보 표적화능력을 평가하기 위해, CD44 고발현 위암세포주 MKN-45를 대퇴부에 심어서 만들어진 Balb/c 누드 마우스를 통해 정맥 내 주입 전과 주입 후(120분 경과)의 근적외선 영역 광학 영상(A)과 광학 영상 강도를 수치화한 것(B), 처리하지 않은 마우스와 처리 후 3시간째 추출한 간, 암 조직, 비장의 근적외선 영역 광학 영상(C), 추출한 암 조직을 염색시약으로 염색 후 관찰(D)한 것이다.
도 9는 본 발명의 근적외선 영역에서 활성을 갖는 CD44 표적화 나노복합체(NIRSH)의 인비보 표적화능력을 평가하기 위해, CD44 고발현 위암세포주 MKN-45를 위에 심어서 만들어진 Balb/c 누드 마우스를 통해 정맥 내 주입 전과 주입 후(90분 경과)의 근적외선 영역 광학 영상(A)과 광학 영상 강도를 수치화한 것(B), 처리하지 않은 마우스와 처리 후 3시간째 추출한 간, 암 조직, 비장의 근적외선 영역 광학 영상(C), 추출한 암 조직을 염색시약으로 염색 후 관찰(D)한 것이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 전기적 상호작용을 이용한 고분자 하이드로겔 복합체 제조.
분자량 25kD 폴리에틸렌이민 (Branched polyethyleneimine, Sigma-Aldrich, USA) 1.6nmol과 Cy5.5 mono N-hydroxysuccinimide (NHS) ester (Amersham, USA) 8.3nmol을 Phosphate buffered saline (PBS, 10mM, pH 6.5)에 녹인 후, 분자량 1,000kDa 히알루론산 (Hyaluronic acid, Yuhan Pharmaceutical Corporation, Korea)을 0.3nmol 첨가하여 복합체를 제조하였다. 얻어진 고분자 하이드로겔 복합체는 사용하기 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.
비교예 1: 전기적 상호작용을 이용한 고분자 하이드로겔 복합체 제조.
PEI (Sigma-Aldrich, USA)와 HA (Yuhan Parmaceutical Corporation, Korea)의 복합체의 몰 비율(PEI/HA)을 1.5625로 맞추고 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 하이드로겔 복합체를 제조하였다.
실시예 2: 전기적 상호작용을 이용한 고분자 하이드로겔 복합체 제조.
PEI (Sigma-Aldrich, USA)와 HA (Yuhan Parmaceutical Corporation, Korea)의 복합체의 몰 비율(PEI/HA)을 3.125로 맞추고 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 하이드로겔 복합체를 제조하였다.
실시예 3: 전기적 상호작용을 이용한 고분자 하이드로겔 복합체 제조.
PEI (Sigma-Aldrich, USA)와 HA (Yuhan Parmaceutical Corporation, Korea)의 복합체의 몰 비율(PEI/HA)을 6.25로 맞추고 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 하이드로겔 복합체를 제조하였다.
실시예 4: 전기적 상호작용을 이용한 고분자 하이드로겔 복합체 제조.
PEI (Sigma-Aldrich, USA)와 HA (Yuhan Parmaceutical Corporation, Korea)의 복합체의 몰 비율(PEI/HA)을 12.5로 맞추고 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 하이드로겔 복합체를 제조하였다.
비교예 2: 전기적 상호작용을 이용한 고분자 하이드로겔 복합체 제조.
PEI (Sigma-Aldrich, USA)와 HA (Yuhan Parmaceutical Corporation, Korea)의 복합체의 몰 비율(PEI/HA)을 25로 맞추고 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 하이드로겔 복합체를 제조하였다.
실험예 1: 고분자 하이드로겔 복합체의 입자 크기 확인
도 2는 비교예 1~2, 실시예 2~4로부터 제조된 고분자 하이드로겔 복합체의 특성을 분석한 것으로, 도 2의 A는 PEI와 HA의 몰 비율에 따른 크기(Size)를 동적광산란 (Dynamic Light Scattering, ELS-Z, OTSUKA electronics, Japan) 장비로 측정한 것이다. 또한 도 2의 B는 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope, Multimode V, Veeco)으로 상기 고분자 복합체의 표면과 캔틸레버(cantilever)라고 불리는 탐침 간의 원자력 차이를 통해 복합체의 형태를 관찰한 것이다.
도 2로부터, 실시예 3에서 제조된 복합체가 가장 집적된 형태로 형성되었음을 확인할 수 있으며, 도 2의 B에서도 300~400 nm (362.2 : 43.3 nm)의 직경을 갖는다는 사실을 알 수 있다.
실험예 2: 고분자 하이드로겔 복합체의 안정성 확인
도 3은 실시예 3으로부터 제조된 하이드로겔 복합체의 결합 상태를 확인하기 위해 퓨리에 변환 적외선분광기 (FT-IR)와 암시야 현미경 (Dark Field microscope, BX51, Olympus)으로 각각 관찰한 것으로, 도 3의 A는 퓨리에 변환 적외선 분광기를 이용하여 PEI, HA, PEI/HA 복합체의 구조 특징을 파악한 것이다. 도 3의 B는 상기 고분자 복합체를 촬영한 암시야 현미경 사진이다.
도 3의 C는 겔 전기영동으로 50 mV 전압에서 2시간 동안 분리한 결과이다. 분자량 25kD 폴리에틸렌이민(Branched polyethyleneimine, Sigma-Aldrich, USA) 1.6nmol과 Cy5.5 mono N-hydroxysuccinimide (NHS) ester (Amersham, USA) 8.3nmol을 결합한 Cy5.5-PEI가 대조군으로 사용되었다.
겔 전기영동 결과를 통해 NIRSH는 PEI의 방출이 없는 것이 확인되었고, 전기 복합과정으로도 수용상에서 안정적인 복합체가 형성되었음을 확인하였다.
실험예 3: 고분자 하이드로겔 복합체의 광학적 특성 분석
도 4는 복합체 형성에 사용된 PEI, Cy5.5, PEI-Cy5.5, PEI-Cy5.5-HA(NIRSH) 에 대한 흡광 그래프와 형광 그래프이다. 도 4의 A는 흡광 그래프로 PEI-Cy5.5의 경우에 Cy5.5-NHS가 665 nm에서 나타내는 흡광도 보다 약 2배 높은 값을 나타내는 것을 확인하였다.
PEI-Cy5.5 복합체에 HA를 결합한 NIRSH(PEI-Cy5.5-HA)에서는 Cy5.5-NHS의 흡광도 보다 약 4배 높은 값을 나타내는 것을 확인하였고, 이는 상대 이온성 고분자 (counter ionic polymer)와 강하게 상호작용한 결과임을 나타낸다.
도 4의 B는 생체 내 이미징을 위해 고분자 하이드로겔 복합체가 665 nm 파장의 빛을 흡수하고 693 nm 파장의 빛을 방출하는 것을 확인하여 정량화한 결과이다.
실험예 4: 형광 유세포 분석( Fluorescence Activated Cell Sorting , FACS ) 방법을 이용한 MKN -45 세포주에서의 CD44 발현 정도 평가
MKN-45 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다. MKN-45 세포주는 위암 세포주로서, 10% 소태아 혈청 (GIBCO, USA)와 1% 항생/항진균제(antibiotic-antimycotic)를 포함하는 RPMI 1640 (GIBCO, USA)에서 배양하였다.
실시예 3의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율을 비교하기 위한 과정으로 형광 유세포 분석기법을 통해 사용된 세포주에서 목표가 될 CD44의 발현율을 평가하였다. MKN-45 세포주를 100 mm 세포 배양 접시에 1 x 106개씩 분주(seeding)하고 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하였다. 배양 접시에서 세포가 60-70% 정도 균일하게 성장했을 때 배양 접시 안의 배지를 제거하고 1% 항생/항진균제(antibiotic-antimycotic)를 포함하는 PBS(10 mM, pH 6.5)으로 2회 세척한 후, 세포가 배양 접시에서 떨어지도록(detach) TrypLE express(GIBCO, USA)를 3 mL 첨가하였다. 3분간 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 배양한 다음 피펫팅(pipetting)하여 배양 배지와 혼합한 후 세포를 수집하여 원심 분리기에서 1100 rpm, 3 분간 원심분리 하였다. 트리판 블루 염색법을 통해 세포 수를 세어 1 X 105 개씩 나누어 CD44 항체(CD44-antibody conjugated with fluorescent isocyanate, cell signaling technology, USA)를 첨가하지 않은 대조군과 CD44 항체를 첨가한 실험군으로 나눈 후, 비특이적 단백 반응을 막기 위해 블로킹(blocking) 용액으로 세척한 후, CD44 항체를 첨가하여 30 분간 반응시킨 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 CD44 발현 정도를 분석하였다.
도 5의 A는 CD44를 표적으로 하는 항체를 처리한 경우 MKN-45에서 타겟 바이오 마커인 CD44의 발현 정도를 비교한 것으로, 대조군과 비교하였을 때 CD44의 발현이 89.48%로 높은 것으로 확인되었다. 도 5의 A로부터, 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체가 MKN-45 세포에서 높은 표적 효율을 나타낼 것을 알 수 있다.
실험예 5: 형광 유세포 분석 ( Fluorescence Activated Cell Sorting , FACS ) 방법을 이용한 MKN -28 세포주에서의 CD44 발현 정도 평가
MKN-28 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다. MKN-28 세포주는 위암 세포주로서, 10% 소태아 혈청(GIBCO, USA)와 1% 항생/항진균제(antibiotic-antimycotic)를 포함하는 RPMI 1640(GIBCO, USA)에서 배양하였다.
실시예 3의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율을 CD44 발현율에 따라 비교하기 위한 과정으로 형광 유세포 분석기법을 통해 사용된 세포주에서 목표가 될 CD44의 발현율을 평가하였다. MKN-28 세포주를 100 mm 세포 배양 접시에 1 x 106개씩 분주(seeding)하고 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 3일 간 배양하였다. 배양 접시에서 세포가 60-70% 정도 균일하게 성장했을 때 배양 접시 안의 배지를 제거하고 1% 항생/항진균제(antibiotic-antimycotic)를 포함하는 PBS(10 mM, pH 6.5)으로 2회 세척한 후, 세포가 배양 접시에서 떨어지도록(detach) TrypLE express(GIBCO, USA)를 3 mL 첨가하였다. 3분간 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 배양한 다음 피펫팅(pipetting)하여 배양 배지와 혼합한 후 세포를 수집하여 원심 분리기에서 1100 rpm, 3 분간 원심분리 하였다. 트리판 블루 염색법을 통해 세포 수를 세어 1 X 105 개씩 나누어 CD44 항체(CD44-antibody conjugated with fluorescent isocyanate, cell signaling technology, USA)를 첨가하지 않은 대조군과 CD44 항체를 첨가한 실험군으로 나눈 후, 비특이적 단백 반응을 막기 위해 블로킹 용액으로 세척한 후, CD44 항체를 첨가하여 30 분간 반응시킨 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 형광 유세포 분석기인 FACSCalibur(Beckman Dickson)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 CD44 발현 정도를 분석하였다.
도 5의 B는 CD44를 표적으로 하는 항체를 처리한 경우 MKN-28에서 타겟 바이오 마커인 CD44의 발현 정도를 비교한 것으로, 대조군과 비교하였을 때 CD44의 발현이 1.58%로 낮은 것으로 확인되었다. 도 5의 A로부터, 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체가 MKN-28 세포에서 낮은 표적 효율을 나타낼 것을 알 수 있다.
실험예 6: MKN -45 세포주에서의 고분자 복합체에 의한 세포 독성 평가
히알루론산과 PEI 양이온성 고분자 하이드로겔 복합체의 세포 독성에 관한 평가를 하기 위하여, 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.
사람 위암 세포주인 MKN-45 세포주에 히알루론산을 농도 별로 처리한 경우, 폴리에틸렌이민을 농도 별로 처리한 경우, 실시예 3에서 제조한 고분자 하이드로겔 복합체를 농도 별로 처리한 경우를 대상으로 세포 독성을 평가하였다.
독성 평가 방법으로는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-di-phenyl tetrazolium bromide) 방법을 사용하였다. 세포를 웰 당 1 X 104 cell이 되도록 96 well에 분주(seeding)하고 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 히알루론산, 폴리에틸렌이민, 실시예 4에서 제조한 고분자 하이드로겔 복합체를 농도 별로 각각 첨가하였다. 24 시간 경과 후 MTT 분석 키트(Roche, Cell proliferation Kit 1, 670 nm of absorbance)를 이용하여 MTT1 용액을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음, MTT 2 용액을 100 ? 첨가한 후에 엘라이져 리더(ELISA reader)를 이용하여 670 nm에서 그 흡광도를 측정하였다.
도 6은 히알루론산, 폴리에틸렌이민과 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체에 대한 위암 세포주인 MKN-45 세포주에서 세포독성 실험을 수행한 결과로, 폴리에틸렌이민이 히알루론산에 비하여 큰 세포 독성을 나타내었고, 반면 실시예 3에서 히알루론산과 폴리에틸렌이민의 결합으로 이루어진 고분자 하이드로겔 복합체는 적은 세포 독성을 나타내었다. 따라서, 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체가 낮은 독성을 나타내는 것은 폴리에틸렌이민이 유발하는 세포독성이 히알루론산과의 복합체를 이루면서 저해된다는 것을 알 수 있다.
실험예 7: MKN -45 세포주에서의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율 평가
본 발명의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율을 관찰하였다.
MKN-45 세포주를 실험 전날 4 웰 플레이트에 웰 당 5 X 104 개씩 분주(seeding)하고 각 플레이트의 세포가 60-70% 정도 균일하게 성장했을 때, 플레이트 안의 배지를 제거하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 로 15분 동안 고정하였다. 실시예 1과 동일한 방법으로 실시예 3의 복합체를 제조하고 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 4 시간 동안 배양하였다. PBS(10 mM, pH 6.5)으로 3 회 세척하여 세포에 결합하지 않은 물질을 제거해 주고, 훼히스트 염색 시약(Hoechst33342, Molecular Probes.)으로 세포 내 핵을 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, LSM700, Carl Zeiss)으로 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율을 관찰하였다.
도 7의 A는 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체 처리시의 공초점 현미경 사진으로, Cy5.5 형광으로부터 MKN-45 세포 주변에 붉은 색 영역이 나타나는 것을 확인하였다. 도 7의 A로부터 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체가 CD44 발현율이 높은 사람 위암 세포주인 MKN-45에서 높은 표적 효율을 나타낸다는 사실을 알 수 있다.
실험예 8: MKN -28 세포주에서의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율 평가
실시예 3의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율을 관찰하였다. MKN-28 세포주를 실험 전날 4 웰 플레이트에 웰당 5 X 104 개씩 분주(seeding)하고 각 플레이트의 세포가 60-70% 정도 균일하게 성장했을 때, 플레이트 안의 배지를 제거하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 15분 동안 고정하였다. 실시예 1과 동일한 방법으로 실시예 3의 복합체를 제조하고 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 4 시간 동안 배양하였다. PBS(10mM, pH 6.5)으로 3 회 세척하여 세포에 결합하지 않은 물질을 제거해 주고, 훼히스트 염색 시약(Hoechst33342, Molecular Probes.)으로 세포 내 핵을 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, LSM700, Carl Zeiss)으로 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율을 관찰하였다.
도 7의 A는 실시예 4에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체 처리시의 공초점 현미경 사진으로, MKN-28 세포에서는 Cy5.5 형광으로부터 붉은 색 영역이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 도 7의 B로부터 실시예 3에서 제조된 고분자 하이드로겔 복합체가 CD44 발현율이 낮은 사람 위암 세포주인 MKN-28에서는 낮은 표적 효율을 나타낸다는 사실을 알 수 있다.
실험예 9: 이소성 이종이식 위암 동물 모델에서의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율 및 이미징 능력 평가
실시예 3의 고분자 하이드로겔 복합체의 생체 내 모델에서의 표적 효율 및 근적외선 영역에서의 이미징 능력을 평가하기 위하여 사람 위암 세포를 이종이식(xenograft)한 동물 모델을 사용하였다.
한 마우스 당 1 X 107 개로 수집한 MKN-45 세포를 6 주령의 BALB/c nude male 마우스의 근위대퇴부(proximal thigh)에 이식하여 이소성(heterotopic) 이종이식 마우스 모델을 제작하였다.
MKN-45 세포주를 이식하여 30 일 경과 후, 실시예 3으로부터 제조된 고분자 하이드로겔 복합체를 꼬리 혈관 정맥 내 주사(intravenous tail vein injection)하고 광학 이미징 장비(Optical imager, eXplore Optix MX)로 근적외선 이미지를 촬영하였다.
도 8은 이소성 이종이식 마우스 모델에 실시예 3으로부터 제조된 고분자 하이드로겔 복합체를 꼬리 혈관 정맥 주사하고 생체 내(in vivo)와 생체 외(ex vivo)에서 종양과 대조군으로 사용된 다른 장기에서의 형광 신호 강도를 나타낸 결과이다. 도 8의 A는 실시예 3 처리 전(pre-injection)과 실시예 3 처리 후 120 분 경과한 종양 부위를 광학 이미징 장비로 촬영한 것으로, 실시예 3 처리 후에 종양 부위에서 근적외선 형광 신호 강도가 높아지는 것을 확인하였다. 도 8의 B는 도 8의 A에서 종양 부위의 근적외선 형광 신호 강도를 정량화 한 것이다. 도 8의 C는 대조군(Non-treatment)과 실시예 3 처리군(NIRSHs) 마우스의 간, 종양, 췌장을 분리하여 생체 외 환경에서 촬영한 근적외선 형광 이미지로 종양에서만 특이적으로 형광 신호 강도가 증가하는 것을 확인하였다. 도 8의 D는 종양 조직 병리검사(H&E 염색법)를 통해 이소성 이종이식 마우스 모델에서 위암 세포의 존재를 확인하였다. 도 8로부터 이소성 이종이식 마우스 모델에서 본 발명의 고분자 하이드로겔 복합체가 종양 부위에서 표적 능력을 나타내며 근적외선 영역에서의 이미징 능력을 보이는 것을 알 수 있다.
실험예 10: 동소성 이종이식 위암 동물 모델에서의 고분자 하이드로겔 복합체의 표적 효율 및 이미징 능력 평가
실시예 3의 고분자 하이드로겔 복합체가 생체모방형 모델(Bio-mimicking model)에서도 표적 효율 및 근적외선 영역에서의 이미징 능력을 보이는 가를 평가하기 위하여 한 마우스 당 1 X 107 개로 수집한 MKN-45 세포를 6 주령의 BALB/c nude male 마우스의 위벽(stomach wall)에 이식한 동소성(orthotopic) 이종이식 마우스 모델을 제작하였다. MKN-45 세포주를 이식하여 10 일 경과 후, 실시예 3으로부터 제조된 고분자 하이드로겔 복합체를 꼬리 혈관 정맥 내 주사(intravenous tail vein injection)하고 광학 이미징 장비(Optical imager, eXplore Optix MX)로 근적외선 이미지를 촬영하였다.
도 9는 동소성 이종이식 마우스 모델에 실시예 3으로부터 제조된 고분자 하이드로겔 복합체를 꼬리 혈관 정맥 주사하고 생체 내(in vivo)와 생체 외(ex vivo)에서 종양과 대조군으로 사용된 다른 장기에서의 형광 신호 강도를 나타낸 결과이다. 도 9의 A는 실시예 3 처리 전(pre-injection)과 실시예 3 처리 후 90 분 경과한 종양 부위를 광학 이미징 장비로 촬영한 것으로, 실시예 3 처리 후에 종양 부위에서 근적외선 형광 신호 강도가 높아지는 것을 확인하였다. 도 9의 B는 도 9의 A에서 종양 부위의 근적외선 형광 신호 강도를 정량화 한 것이다. 도 9의 C는 대조군(Non-treatment)과 실시예 3 처리군(NIRSHs) 마우스의 간, 종양, 췌장을 분리하여 생체 외 환경에서 촬영한 근적외선 형광 이미지로 종양에서만 특이적으로 형광 신호 강도가 증가하는 것을 확인하였다. 도 9의 D는 종양 조직 병리검사(H&E 염색법)를 통해 동소성 이종이식 마우스 모델에서 위암 세포의 존재를 확인하였다.

Claims (18)

  1. 암 줄기세포 관련 바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 히알루론산; 및 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질이 공유결합된 PEI(polyethyleneimine)를 포함하는 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 암 줄기세포 관련 바이오마커는 CD44, ESA, HER-2/neu, KRAS, 또는 ER(estrogen receptor)인 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 개질되지 않은 히알루론산은 분자량이 500 내지 1500 kD인 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질은 클로로톡신(Cy5.5), 시아닌(Cyanine) 형광분자, 로다민(Rodamine) 형광분자, 알렉사(Alexa) 형광분자, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광분자, FAM(5-carboxy fluorescein) 형광분자 및 텍사스 레드(Texas Red) 형광분자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 고분자 하이드로겔 복합체.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 PEI는 분자량이 1 내지 80 kD인 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 개질되지 않은 히알루론산과 PEI는 1 : 2 내지 1 : 20의 몰비로 포함되는 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자 하이드로겔 복합체의 평균 입자 크기는 200 내지 600 nm인 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. PEI와 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질을 1 : 2 내지 1 : 10의 몰비로 혼합하여 PBS(phosphate buffer saline) 또는 증류수에 녹여 근적외선 영역에서 활성을 갖는 형광물질이 공유결합된 PEI 용액을 형성시키는 단계(제 1 단계); 및
    암 줄기세포 관련 바이오마커를 표적화할 수 있는 개질되지 않은 히알루론산을 상기 용액에 첨가하는 단계(제 2 단계);
    를 포함하는 암 진단용 고분자 하이드로겔 복합체의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1 항의 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 암 진단용 조성물.
  17. 제 1 항의 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 조영제.
  18. 제 1 항의 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 영상 진단 프로브.
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KR101901986B1 (ko) * 2016-11-18 2018-09-27 서울대학교산학협력단 암세포의 선택적 형광 표지를 위한 나노전달체 및 그 제조방법
KR102048269B1 (ko) * 2018-01-17 2020-01-08 재단법인대구경북과학기술원 점토 제조용 수화젤, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 점토
KR20200043114A (ko) * 2018-10-17 2020-04-27 고려대학교 세종산학협력단 헵신을 표적으로 하는 디펩티드 기반의 근적외선 이미징 프로브, 이를 포함하는 전이성 암 진단의 근적외선 이미징용 조성물 및 전이성 암 예방과 치료를 위한 약학 조성물

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