KR101537847B1 - 국화과 식물을 유효성분으로 포함하는 항산화제, 항염증제, 항암제 및 항비만제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본 발명은 천연 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용, 항염증용, 항암용 및 항비만용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 애스터 스파츌리폴리우스, 크리샙테뮴 모리폴리움, 크리샙테뮴 보리앨, 크리샙테뮴 인디컴, 코레옵시스 드루몬디 및 루벡키아 라시니아타 바 호텐시스로 구성된 군으로부터 선택되는 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 항염증용, 항암용 및 항비만용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 국화과 식물 추출물은 뛰어난 항산화 활성, 항염증 활성, 항암활성, 항비만 활성을 나타내어, 기존의 합성제제를 대체할 수 있는 천연 항산화제, 항염증제, 항암제, 항비만제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 천연 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제, 항염증제, 항암제 및 항비만제에 관한 것이다.
노화, 죽상동맥경화증, 감염, 비만 및 비만은 직접, 및 간접적으로 세포 손상과 관련이 있으며, 지질, 단백질, 효소, DNA 및 RNA의 손상은 활성산소종(ROS)에 의해 유발되며, 이 활성 산소종에는 과산화수소, 하이드록실 라디칼 및 슈퍼옥사이드 음이온이 있다(Hussain, S.P. et al., (2003). Nature Reviews Cancer, 3, 276-285; Fiorentino, A. et al., (2007). Bioorganic & Medicinal Chemstry Letters, 17, 636-639). 자유 라디칼은 단일 전자 또는 짝이 맞지 않는 전자에 속하는 불안정한 분자 또는 원자로 이루어져 있다. 그렇기 때문에 건강과 관련하여 해로운 영향을 줄 수 있는 합성 항산화제를 대체하기 위한 식품용 및 의약용 천연 항산화제를 찾기 위한 노력이 꾸준히 진행되었다(Rhee, S.J. et al., (2004). Journal of Microbiology and Biotechnology, 14, 715-721). 천연 항산화제는 자유 라디칼에 의한 심각한 세포 손상 또는 분자 손상으로부터 인체를 방어할 수 있으며, 다른 만성 질환으로 진행하는 것을 지연시켜 줄 수 있다(Yun, B.S. et al., (2000). Journal of Microbiology and Biotechnology, 10, 233-237).
한국에는 50개의 속, 213개의 종의 국화과 식물이 분포되어 있다(Lee, Y.N., 2006,, New Flora of Korea, Vol.II. Seoul, Korea: Kyo-Hak Publishing Co., Ltd.). 이 국화과 식물들은 많은 연구자들에 의해 건강 증진 효과가 있는 것으로 알려졌으며, 활성 성분도 분리되었다. 그 중 시게스벡키아 글라브레센스(Siegesbeckia glabrescens)의 활성성분은 항산화, 항알러지, 항고혈압, 항암 및 항염증 활성을 나타내며, 이는 골절, 사지마비(quadriplegia), 마비 및 편마비(hemiplegia)에 도움을 주는 것으로 밝혀졌다(Jun, S.Y. et al., (2006). Oncology Reports, 15, 1461-1467.; Kang, B.K. et al., (1997). Journal of Ethnopharmacology, 57, 73-79). 써슘 종(Cirsium sp)은 불안억제 및 유사분열 억제 활성이 있는 것으로 보고되었다(Grzycka, K., Krzaczek, T., & Milkowska, J. (1978). Annales Universitatis Mariae Curie Sk ł odowska, 33, 275-283). 카타무스 틴토리우스 L(Carthamus tinctorius L. (C. tinctorius, safflower))의 종자는 티로신 저해 활성을 갖고 있으며(Roh, J.S., Han, J.Y., Kim, J.H., & Hwang, J.K. (2004). Biological and Pharmaceutical Bulletin, 27, 1976-1978), 이의 페놀 화합물인 결합 세로토닌, 리그난 및 플라본은 에스트로겐 결핍 쥐에서 뼈의 형성을 촉진시키고, 골 소실을 감소시켜주며 혈장 HDL 콜레스테롤 레벨을 증가시키는 것으로 보고되었다(Park, Y.H. et al., (2002). Korean Journal of Physiology and Pharmacology, 6, 165-169; Roh, J.S. et al., (1999). Food Science and Biotechnology, 8, 88-92).
애스터 스파츌리폴리우스(Aster spathulifolius), 크리샙테뮴 모리폴리움(Chrysabthemum morifolium), 크리샙테뮴 보리앨(Chrysabthemum boreale), 크리샙세뮴 인디컴(Chrysabthemum indicum), 루벡키아 라시니아타 바 호텐시스(Rudbeckia laciniata var. hortensis) 및 코레옵시스 드룸몬디(Coreopsis drummondii)는 원예용 꽃으로 사용되었으며, 한의학에서 치료학적 목적으로도 사용되었다. 이들이 다양한 생물학적 활성을 나타냄에도 불구하고, 이들의 생물학적 활성을 증명할 수 있는 과학적인 데이터는 잘 알려져 있지 않다. 이에, 본 발명자들은 상기 6종의 국화과 식물에 대하여 항산화 활성 및 잠재적인 건강 증진 활성(예, 항염증, 항암 및 항비만 활성)을 밝혀내었다.
본 발명은 천연식물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항염증제, 항암제 및 항비만제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.
또한, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증제를 제공한다.
또한, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.
또한, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만제를 제공한다.
첫째, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.
둘째, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증제를 제공한다.
셋째, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.
넷째, 본 발명은 국화과 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만제를 제공한다.
본 발명의 항산화제, 항염증제, 항암제, 항비만제의 유효성분은 모두 국화과 식물 추출물로서 동일하여 이하 함께 기술한다.
본 발명의 국화과 식물 추출물은 다양한 국화과 식물이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 애스터 스파츌리포리우스(Aster spathulifolius), 코레옵시스 드루몬디(Coreopsis drummondii), 크리샙테뮴 모리폴리움(Chrysabthemum morifolium), 크리샙테뮴 보리앨(Chrysabthemum boreale), 크리샙테뮴 인디컴(Chrysabthemum indicum) 또는 루벡키아 라시니아타 바 호텐시스(Rudbeckia laciniata var . hortensis)이다.
본 발명의 국화과 식물 추출물은 상기 언급된 국화과 식물을 사용하여 다양한 용매를 사용하여 추출되며, 바람직하게는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, (c) 아세톤, (d) 헥산, (e) 에틸 아세테이트, (f) 헥산과 에틸 아세테이트의 혼합용매, (g) 클로로포름, (h) 1,3-부틸렌글리콜 및 (i) 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 사용하여 추출되며, 보다 바람직하게는 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 가장 바람직하게는 메탄올을 추출용매로 사용하여 추출된다.
본 발명의 국화과 식물 추출물에 함유된 주된 성분은 페놀과 플라보노이드이며, 이 성분들은 항산화 활성의 주된 마커이다.
식물내에 존재하는 페놀 화합물은 그 구조와 분자량이 다르다. 페놀 화합물의 페놀 하이드록실 그룹은 거대 분자, 즉 단백질과 쉽게 결합하는 성질이 있다. 전체 페놀 화합물은 플라보노이드 화합물이며, 이는 항산화, 항암 및 항염 활성에 있어서 중요한 역할을 한다(Kosmider, B. et al., (2004). Drug Development Research, 63, 200-211.).
본 발명에 따른 6종의 국화과 식물 추출물은 페놀과 플라보노이드 함량이 높아, DPPH 라디칼을 소거하고(도 2 참고), 높은 환원력을 가지며(도 3 참고), 세포외 산화질소(NO)를 제거 활성이 뛰어나(도 4 참고) 우수한 항산화 활성을 나타낸다.
또한, 염증 매개자 중 하나인 LPS-유도된 대식 세포로부터 NO의 합성을 감소시킴으로써(도 5 참고) 우수한 항염증 활성을 나타내고, 암 세포주의 생존력을 억제시켜줌으로써 우수한 항암 활성을 나타내며(표 1 내지 4 참고), 지방 생성을 억제하고 지방의 축적을 감소시킴으로써 우수한 비만 억제 활성을 나타낸다(표 5 참고).
본 발명의 국화과 식물 추출물은 항산화 활성을 나타낸다.
식물의 항산화 활성은 식물 내의 페놀과 플라보노이드 함량과 관련이 있다.
본 발명의 국화과 식물 추출물의 페놀과 플라보노이드 함량에 대해 설명하자면, 애스터 스파츌리포리우스(Aster spathulifolius), 코레옵시스 드루몬디(Coreopsis drummondii), 크리샙테뮴 모리폴리움(Chrysabthemum morifolium), 크리샙테뮴 보리앨(Chrysabthemum boreale), 크리샙테뮴 인디컴(Chrysabthemum indicum) 및 루벡키아 라시니아타 바 호텐시스(Rudbeckia laciniata var . hortensis)는 전체 페놀 함량이 평균 30-70 mg GAE/g dw이다(도 1 참고).
본 발명의 국화과 식물 추출물의 항산화 활성은 뛰어난 DPPH 라디칼 소거활성, Fe2 + 환원력, 세포외 산화질소(NO) 라디칼 소거 활성에 의해 뒷받침되며, 이는 식물 추출물 내에 함유된 전체 페놀/플라보노이드 함량 의존적인 결과를 보여주었다.
본 발명의 국화과 식물 추출물들은 모두 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내지만, 다음과 같은 순서의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸다; 크리샙테뮴 인디컴 > 크리샙테뮴 보리앨 > 크리샙테뮴 드루몬디 > 크리샙테뮴 모리폴리움 > 애스터 스파튤리폴리우스 > 루벡키아 라시니아타(도 2 참고).
200 μg/mL의 루벡키아 라시니아타(R. laciniata)는 LPS에 의해 촉진된 대식세포 세포의 NO 생산을 약 92.8% 억제시켰다. 비록 루벡키아 리시니아타의 전체 페놀/플라보노이드 함량과 항산화력은 다른 식물 성분과 비교하여 낮았지만, LPS-유도된 대식세포로부터 생합성되는 NO에 대해서는 월등히 우수한 NO 생합성 저해력을 나타내었다(도 4 참고).
식물 추출물의 항산화 활성은 그 식물에 존재하는 페놀로부터 기인한다. 페놀 화합물의 수소 공여 능력이 DPPH 라디칼을 억제하는데 필연적이다. 본 발명에서는 식물 추출물의 전체 페놀/플라보노이드 함량과 항산화 활성 사이에 매우 높은 관련성이 있음을 확인하였다. 실제로, 높은 플라보노이드 함량을 갖는 크리샙테뮴 인디컴과 크리샙테뮴 보리엘 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성과 환원력이 모두 높았다. 이는 크리샙테뮴 보리앨과 크리샙테뮴 인디컴 추출물이 전자 공여자를 배출하여 자유 라디칼과 반응해 이를 더욱 더 안정한 물질로 변화시켜 라디칼 체인 반응을 파괴하고, 해로운 라디칼 물질에 의해 유발되는 염증과 같은 증상을 완화시키는데 도움을 줄 수 있다.
급성 및 만성 염증에서의 세포와 조직의 손상은 활성화된 포식세포에 의해 생성되고 활성화되어 배출되는 ROS의 독성에 의해 기인되는 것으로 알려졌다(Leirisalo-Repo, M. et al., (1993). Inflammation, 17, 427-442). 포식세포 내에 있는 NADPH 옥시다아제는 숙주 방어 메커니즘에 있어서 주요한 슈퍼옥사이드 음이온의 생성에 필수적이다. 자유라디칼 소거 활성과 환원력은 슈퍼옥사이드 음이온을 제거하는데 필수적인 역할을 하며, 해로운 산화제와 자유라디칼로부터 세포의 산화환원 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다.
또한, 리덕톤(Reductones)의 존재를 나타내는 환원력은 수소 원자를 공여하고 자유 라디칼 체인을 끊음으로써 항산화 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Duh, P.D. (1998). Journal of the American Oil Chemists ’ Society, 75, 455-461). 리덕톤은 퍼옥사이드 전구체와 반응하여 퍼옥사이드의 생성을 억제한다(Guo, J., & Wang, M.H. (2007). Food Science and Biotechnology, 16, 55-61). 염증과 류마티스 관절염(RA)에 있어서, 세포의 환원력은 세포 내의 윤활막으로부터 분비되는 슈퍼옥사이드 음이온을 제거하며 관절 세포의 염증 반응을 억제시켜준다. 본 발명의 국화과 식물 추출물은 Fe2+ 환원력 실험에서 우수한 환원력을 나타내었다(도 3 참고).
본 발명의 국화과 식물 추출물은 항염증 활성을 나타낸다.
주요한 염증 매개자 중 하나인 NO는 관절에서의 염증 병리생리학과 관련이 있으며, 연골 분해대사에 있어서 중요한 역할을 한다. 전사 인자인 NF-κB, AP-1, 및 Jak-STAT 경로를 통한 염증 조절은 NO에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다(Korhonen, R. et al., (2005). Current Drug Targets - Inflammation & Allergy, 4, 471-479). 이러한 이유로, NO는 류마티스 관절염의 염증 진행에 있어서 가장 중요한 역할을 한다.
본 발명에서는 한국에 존재하는 6종의 국화과 식물 추출물(본 발명의 유효성분)의 첨가에 의해 대식세포에 있는 LPS에 의해 유도된 나이트라이트의 양이 감소됨을 확인하였다(도 5 참고). NO 제거 및 NO 생성 억제 데이터와 함께, 루벡키아 라시니아타에 의해 NO 생성이 억제되는 결과는 LPS-유도된 대식세포에서 NO의 생성으르 억제하고 NO를 제거함으로써 이루어짐을 알 수 있다.
NO 생성과 iNOS 발현은 염증과 발암의 병리생리학과 관련이 있다. 조직에서의 iNOS의 조절은 염증을 치료하는데 가장 중요한 것으로 간주되었다. iNOS의 발현은 NF-κB의 발현증가와 밀접한 관련이 있는데, 이는 NF-κB 사이트가 iNOS 유전자의 프로모터 부위인 것으로 확인되었기 때문이다 (Prabhu, K.S. et al., Biochemical Journal, 366, 203-209). 전사 유발 인자인 NF-κB는 다양한 세포외 사이토카인, LPS 및 산화적 스트레스에 의해 활성화된다. 이를 통해, 본 발명의 국화과 식물 추출물이 iNOS mRNA 전사를 억제함으로써 NF-κB를 조절할 수 있음을 예측할 수 있다. 하기 실시예에서는 본 발명의 국화과 식물 추출물들의 NO 생성 억제 활성이 세포의 생존도에는 영향을 끼치지 않으면서, 화학적 NO 제거 및 iNOS 조절을 통해 이루어짐을 알 수 있다.
본 발명의 국화과 식물 추출물은 항암 활성을 나타낸다.
본 발명의 국화과 식물 추출물은 다양한 암세포에 대해 항암 활성을 나타내며, 보다 바람직하게는 자궁경부암, 유방암, 췌장암 및 난소암에 대해 항암 활성을 나타낸다.
본 발명의 국화과 식물 추출물을 인간 자궁경부암 세포 HeLa, 인간 유방암 세포 MCF7, 인간 췌장암(prostate) 세포 PC-3, 인간 난소암 세포 SK-OV-3에 처리한 후의 세포 생존도 분석에서 본 발명의 국화과 식물 추출물들은 세포 생존도를 억제시켰으며, 구체적으로는 애스터 스파튤리폴리우스와 크리샙테뮴 드루몬디 추출물은 HeLa 세포 생존도를 약 15-37.3% 저해하였으며, 크리샙테뮴 보리앨, 크리셉테뮴 인디컴 및 크리셉테뮴 모리폴리움을 200 μg/ml 농도로 처리했을때에는 MCF-7, HeLa, SK-OV-3 및 PC-3 세포주의 생존도를 약 47-63% 억제하였다(표 1 내지 표 4 참고).
본 발명의 국화과 식물 추출물은 항비만 활성을 나타낸다.
3T3-L1 지방 세포를 이용한 지방 축적도 및 지방 분해도 실험에서, 본 발명의 국화과 식물 추출물 모두 우수한 항비만 활성을 나타낸다다(표 5 참조). 그 중 크리샙테뮴 보리앨 추출물이 가장 우수한 항-비만 활성을 나타내며, 크리샙테뮴 모리폴리움과 코레옵시스 드루몬디는 지방 분해 촉진 및 지방 합성 억제 활성을 모두 나타내고, 크리샙테뮴 인디컴, 애스터 스파츌리폴우스와 루벡키아 라시니아타 추출물은 지방 축적 억제를 통해 항-비만 활성을 나타낸다.
본 발명의 국화과 식물 추출물은 뛰어난 항산화 활성, 항염증 활성, 항암 활성, 항비만 활성을 나타내어 기존의 합성제제의 단점을 극복한 천연 항산화제, 항염증제, 항암제, 항비만제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 전체 페놀 및 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다. 각 결과에 에러바는 생략하였으며, 표준 편차는 기호의 크기 보다는 작다.
도 2는 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 환원력을 나타낸 것이다. 각 결과에 에러바는 생략하였으며, 표준 편차는 기호의 크기 보다는 작다.
도 4는 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 세포-프리 시스템에서의 화학적 산화 질소(NO) 제거력을 나타낸 것이다. *p<0.05 vs. 대조군(소듐 니트로프루시드로만 처리한 군)
도 5는 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 LPS-유도된 대식 세포로부터 산화 질소 생성도 및 세포 생존도를 나타낸 것이다. 도면에서 라인으로 표시한 결과가 세포 생존도이며, 막대로 표시한 결과가 산화 질소 생성도이다. 각 결과에 에러바는 생략하였으며, 표준 편차는 기호의 크기 보다는 작다. *p<0.05 vs. 대조군
도 2는 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 환원력을 나타낸 것이다. 각 결과에 에러바는 생략하였으며, 표준 편차는 기호의 크기 보다는 작다.
도 4는 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 세포-프리 시스템에서의 화학적 산화 질소(NO) 제거력을 나타낸 것이다. *p<0.05 vs. 대조군(소듐 니트로프루시드로만 처리한 군)
도 5는 본 발명의 6종의 국화과 식물 추출물의 LPS-유도된 대식 세포로부터 산화 질소 생성도 및 세포 생존도를 나타낸 것이다. 도면에서 라인으로 표시한 결과가 세포 생존도이며, 막대로 표시한 결과가 산화 질소 생성도이다. 각 결과에 에러바는 생략하였으며, 표준 편차는 기호의 크기 보다는 작다. *p<0.05 vs. 대조군
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명에 대해서 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험물질 및 실험방법
(1) 사용한 시약 및 배지
디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO), MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), NG-모노메틸-L-아르기닌(L-NMMA), 디페닐-1-피크릴 하이드라질(DPPH), 아스코르브산, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 리포폴리사카라이드(LPS, Escherichia coli serotype 0127:B8), 폴린-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteu reagent), 인슐린, 덱사메타손, 3-이소부틸-1-메틸잔틴, 오일 레드 O, 및 파라포름알데히드는 시그마알드리치사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입한 것을 사용하였다.
세포배양 배지 및 시약들 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신, 및 트립신-EDTA는 GIBCO 제품(Invitrogen Inc., NY, USA)을 사용하였다.
(2) 세포 배양
생쥐 대식세포(RAW 264.7), 인간 자궁경부암 세포 HeLa, 인간 유방암 세포 MCF7, 인간 췌장암(prostate) 세포 PC-3, 및 섬유아세포 (fibroblast) 3T3-L1은 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)에 기탁된 세포를 사용하였다. 이 세포들은 10% FBS, 페니실린 (100 units/ml), 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)이 포함된 DMEM 배지에서 5% CO2가 공급되는 가습 배양기에서 37℃로 배양하였다. 계대배양을 하기 위해, 대식세포를 PBS(pH 7.4)로 린스하여 트립신 저해제를 포함하고 있는 혈청 잔여물을 모두 제거하였으며, 이를 0.53mM EDTA가 포함된 0.05% 트립신을 이용해 세포들을 떼어놓았다.
(3) 통계 분석
모든 실험 결과는 최소한 3개 실험 결과의 평균 ± 표준오차(S.D.)로 도출하였으며, 단일 분산분석법(ANOVA)을 수행하고, 개별적인 비교를 위해 Dunnett의 다중 비교 테스트 분석법을 수행하였다. 각 결과들은 P 값이 *p < 0.05일때 통계학적으로 유의한 것으로 판단하였다.
실시예
1. 국화과 식물 추출물의 제조
국화과에 속하는 식물인 애스터 스파츌리폴리우스(Aster spathulifolius, 바우처번호 KRIB 00020347), 크리샙테뮴 모리폴리움(Chrysabthemum morifolium, 기탁번호 132-009), 크리샙테뮴 보리앨(Chrysabthemum boreale, 바우처번호 KRIB 0015549), 크리샙테뮴 인디컴(Chrysabthemum indicum, 바우처번호 KRIB 0001744), 코레옵시스 드루몬디(Coreopsis drummondii, 기탁번호 132-009), 및 루벡키아 라시니아타 바 호텐시스(Rudbeckia laciniata var. hortensis, 바우처번호 KRIB 0000214)의 추출물은 식물 추출물 은행(PEB), 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), Daejeon, Korea)으로부터 얻은 것으로 사용하였다. 모든 국화과 식물은 PEB에 인증을 받았으며, PEB, KRIBB에 기탁하였다.
추출물은 다음과 같은 공정으로 추출하였다. 건조 및 파쇄한 상기 6종의 국화과 식물들을 각각 메탄올로 48시간 동안 실온에서 추출하였다. 추출물을 탈지면으로 필터하였으며, 감압하에서 감압농축기로 농축하였다. 각 식물 추출물을 DMSO에 녹여 100 mg/ml 농도가 되게 하였고, -20℃에서 보관하여 실험 재료로 사용하였다.
실시예
2. 전체 페놀 화합물과 전체 플라보노이드 함량의 측정
식물 추출물의 항산화 활성의 마커가 될수 있는 한가지는 페놀 성분의 함량을 측정하는 것이다.
전체 페놀 함량은 갈릭산을 표준 물질로 사용하여 폴린-시오칼토 방법(Folin-Ciocalteu method)에 따라 측정하였다(Oh, P. et al., (2004). Food Science and Biotechnology, 13, 781-789). 상기 실시예 1에서 추출한 국화과 식물 추출물들을 1N 폴린-시오칼토 시약 1 ml에 녹였다. 이 혼합액을 5분 동안 놓아둔 뒤 2 ml의 20% Na2CO3를 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 반응시키고 난 뒤, 혼합액을 8분 동안 원심분리 하여, 그 상등액을 흡광도측정기(SpectraMax M2, Molecular Devices Inc., USA)로 765 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
국화과 식물 추출물의 전체 페놀 함량은 mg 갈릭산 당량(gallic acid equivalent, GAE)/ g 건조중량으로 표시하였다. 전체 플라보노이드 함량의 측정은 변형된 다우드 색차계 방법(modified colorimetric Dowd method)를 이용하였다(Zhishen, J. et al., (1999). Food Chemistry, 64, 555-559). 적당량의 추출물을 1.25 ml의 증류수를 포함하는 테스트 튜브에 넣은뒤, 75 μl의 5% NaNO2를 넣어 이 혼합액을 5분 동안 놓아두었다. 그리고 난 뒤, 0.15 ml의 10% AlCl2. 6H2O를 첨가하였다. 6분 뒤에, 0.5 ml의 1 M NaOH를 첨가하고, 이 혼합액을 증류수 0.275 ml로 희석하였다. 곧바로 이 혼합액을 UV-흡광도측정기(SpectraMax M2, Molecular Devices Inc., USA)를 사용해 510 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 카테킨 표준 곡선과 비교하였다. 추출물의 전체 플라보노이드 함량은 mg 카테킨 당량(catechin equivalents, CE)/g 건조중량으로 표시하였다.
그 결과, 루벡키아 라시니아타 추출물은 전체 페놀 함량이 낮았지만(17.0 ± 3.14 mg GAE/g dw). 다른종의 식물 추출물은 전체 페놀 함량이 30-70 mg GAE/g dw였다(도 1). 이는 고형분 내에 페놀 성분이 약 3-12% 포함되어 있음을 보여준다.
루벡키아 라시니아타 추출물을 제외하고, 모든 식물 추출물은 전체 페놀 함량 중에 플라보노이드 함량이 60-82%였다(도 1). 그러나 루벡키아 라시니아타는 고형분 내 전체 페놀 성분이 1.7% 포함되어 있음에도 불구하고, 전체 페놀 성분의 30%가 전체 플라보노이드 화합물로 바뀐 것이다.
실시예
3. 항산화 활성-
DPPH
라디칼
저해 활성의 측정
상기 실시예 1에서 추출한 6종의 국화과 식물 추출물의 2-디페닐-1-피크릴하이드라질(DPPH) 프리 라디칼 소거 활성은 다음의 방법으로 측정하였다.
국화과 식물의 메탄올 추출물 0.2 ml을 4 ml의 메탄올에 넣은 뒤, DPPH 용액(1 mmol/L, 0.5 ml)을 첨가하였다. 이 혼합액을 15초 동안 볼텍싱하고, 실온에 30분 동안 놓아 둔뒤 UV-흡광도측정기(Agilent Technologies Inc., CA, USA)를 사용해 517 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
국화과 식물 추출물의 DPPH 라디칼을 억제하기 위한 IC50 값을 확인하기 위해 용량 의존적인 실험이 수행되었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 6종의 국화과 식물 추출물이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼에 대한 수소-공여 활성을 나타냄을 확인하였다(결과 미제시). 300 μg/mL 농도의 크리샙테뮴 인디컴을 처리했을때 IC50 값이 28.7 μg/mL로 나타나, 크리샙테뮴 인디컴이 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 300 μg/mL 농도의 크리샙테뮴 보리앨과 크리샙테뭄 모리폴리움을 처리했을때에는 잠재적인 DPPH 라디칼 소거 활성이 각각 87.3% 및 65.7%로 나타났다. 총 페놀/플라보노이드 함량이 가장 적었던 루벡키아 라시니아타 추출물은 낮은 라디칼 소거 활성(약 38.4%)을 나타내었다.
이는 DPPH 라디칼 소거 활성이 총 페놀/플라보노이드 함량과 관련성이 있음을 보여준다. 결과를 종합해보면, 실험한 국화과 식물 추출물들은 다음과 같은 순서로 항산화 활성이 있었다; 크리샙테뮴 인디컴 > 크리샙테뮴 보리앨 > 크리샙테뮴 드루몬디 > 크리샙테뮴 모리폴리움 > 애스터 스파튤리폴리우스 > 루벡키아 라시니아타. 효과적인 생물학적 항산화제인 아스코르브산은 IC50 값이 9.37 μg/mL 이하로 나타났으며, 합성 항산화제인 BHT는 DPPH 라디칼을 소거하기 위한 IC50 값이 약 11.4 μg/mL로 나타나 낮은 농도에서도 라디칼 소거 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 하지만, 이는 합성 물질이기 때문에 식품에 사용하기에는 적합하지 않은 부작용을 많이 갖고 있다는 단점이 있어서, 많은 연구자들이 인간에게 해롭지 않으면서 식품에 사용하기 적합한 천연 항산화제를 찾기 위해 노력하고 있다.
실시예
4. 항산화 활성-환원력의 측정
국화과 식물 추출물의 환원력은 Fe3 + 환원도로 확인하였다. 실시예 1에서 추출한 식물 추출물을 2.5 ml의 0.2 M 포스페이트 버퍼 (pH 6.6)와 2.5 ml의 1% K3Fe(CN)6와 혼합하였다. 이 혼합액을 50℃에서 20분 동안 반응시켰다. 그리고 난 뒤, 2.5 ml의 10% 트리클로로아세트산을 첨가하여 2,090×g의 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 상등액 2.5 ml에 2.5 ml의 증류수와 0.5 ml의 0.1% FeCl3를 첨가하였다. 혼합액을 UV-흡광도측정기(Agilent Technologies Inc., CA, USA)를 사용해 700 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
국화과 식물 추출물의 환원력 결과는 도 3에 제시하였다. 국화과 식물의 환원력은 농도 의존적으로 증가하였다. 양성 대조군인 피로갈롤(18.75 μg/mL)은 700 nm에서의 흡광도 값이 0.348 ± 0.003이었으며, 6종의 국화과 식물 추출물(300 μg/mL)의 흡광도 값은 0.08-0.27 이었다.
또한, 환원력 커브에서는 크리샙테뮴 드루몬디 추출물에서 가장 높은 값(4.880E-4)을 나타내었으며, 루벡키아 라시니아타 추출물에서 가장 낮은 값(1.057E-4)을 나타내었다. 이 결과는 크리샙테뮴 드루몬디 추출물이 루벡키아 라시니아타 추출물에 비해 환원력이 4.61배나 더 높음을 보여준다.
실시예
5. 항산화 활성-
세포외
산화질소(
NO
)
라디칼
소거 활성의 측정
세포외 NO 라디칼 소거 활성은 변형된 프로토콜에 따라 확인하였다(Babu, B.H. et al., (2001). Fitoterapia, 72, 272-277). 소듐 니트로프루시드(Sodium nitroprusside)는 화학적 NO 공여자로서, 생리학적 pH와 같은 수소농도의 수용액에 있는 산소와 반응할때 NO를 생성하며, 이때 식물 추출물에 의한 NO 제거력은 그리스 반응(Griess reaction)으로 측정하였다.
소듐 니트로프루시드(10mM in PBS)를 포함하는 반응 혼합액(3 ml)을 25℃에서 150분 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응액 0.5 ml과 그리스 시약 0.5 ml을 혼합한 뒤, 생성된 크로모포어의 흡광도를 540 nm에서 측정하였다.
그 결과를 도 4에 제시하였다. 6종의 국화과 식물 추출물은 약 13-30%의 NO 제거력을 나타내었으며, 그 값은 농도 의존적으로 증가하였다. 애스터 스파튤리폴리우스와 크리샙테뮴 보리앨은 각각 화학적 NO 제거 활성이 29.4% 및 25.7%로 나타났다. 화학적 NO 제거 활성은 식물 추출물 내에 존재하는 전체 페놀/플라보노이드 함량과 관련성이 있음을 보여준다. 6종의 국화과 식물 추출물은 테스트한 농도(0-200 μg/mL)에서는 세포의 생존도에는 영향을 끼치지 않았다(결과 미제시).
실시예
6. 항염증 활성- 아질산염 합성 조절 분석(
Nitrite
assay
)
식물 추출물의 항-염증 활성을 확인하기 위해, 대식 세포를 LPS-유도 배양한 뒤, 식물 추출물이 세포에서 아질산염(NO) 합성을 조절할 수 있는지 여부를 측정하고, 세포 생존도에 어떠한 영향을 미치는지 세포 생존도 분석을 하여 확인하였다.
(1) 아질산염 합성 조절 분석
대식세포를 2×105 세포/웰 농도로 96-웰 세포 배양 플레이트에 분주하여 5% CO2가 공급되는 습윤 배양기에서 37℃에서 3-4시간 동안 배양하였다. 아질산염 생성을 촉진시키기 위해 배양한 세포에 LPS (1 μg/ml)를 처리하고, 식물 추출물을 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 대식세포로부터 생성된 아질산염는 아래와 같은 그리스 반응으로 측정하였다. 각 세포 상등액 100 μl를 100 μl의 그리스 시약(5% 포스포릭산에 용해한 1% 설파닐아마이드/ 증류수에 용해한 0.1% N-1-나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드)에 넣은뒤, 혼합액의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기(Emax, Molecular Devices Inc., USA)를 이용해 540 nm의 흡광도에서 측정하였다. 이 실험에서, iNOS 저해제인 L-NMMA 10 μM을 양성 대조군으로 사용하였다(Sutherland, H. et al., (2001). Nitric Oxide, 5, 475-481).
그 결과, 모든 실험한 국화과 식물 추출물은 테스트한 농도 범위에서 용량-의존적으로 LPS-유도된 나이트라이드 생성을 억제하였다(도 5). 또한, NG 모노메틸-라기닌 모노아세테이트(L-NMMA, 100 μM)는 선택적인 NOS 차단제 중의 하나인데(Sutherland et al., 2001), 양성 대조군에 비해 나이트라이드 생성을 유의적으로 억제함을 확인하였다(약 83.6%, 결과 미제시). 루벡키아 라시니아타(200 μg/mL)는 LPS-유도된 대식세포로부터 NO 생성을 약 92.8%(IC50=49μg/mL) 억제시켰으며, NMMA 처리한 것 보다 훨씬 우수하였다. 또한, 애스터 스파튤리폴리우스, 크리샙테뮴 모리폴리움 및 크리샙테뮴 보리앨은 200 μg/mL 농도에서 NO 생성을 각각 42, 18.5 및 38.9% 억제시켰다. 크리샙테뮴 인디컴은 LPS-유도된 대식 세포에서 NO 생성을 64.1% 억제시켰다(IC50=177μg/mL).
주요한 염증 매개자 중 하나인 NO는 관절에서의 염증 병리생리학과 관련이 있으며, 연골 분해대사에 있어서 중요한 역할을 한다. 전사 인자인 NF-κB, AP-1, 및 Jak-STAT 경로를 통한 염증 조절은 NO에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다(Korhonen, R. et al., (2005). Current Drug Targets - Inflammation & Allergy, 4, 471-479). 이러한 이유로, NO는 류마티스 관절염의 염증 진행에 있어서 가장 중요한 역할을 한다.
본 실험 결과에서는 대식세포에 있는 LPS에 의해 유도된 나이트라이트의 양이 한국에 존재하는 6종의 국화과 식물 추출물의 첨가에 의해 감소됨을 보여준다. NO 제거 및 NO 생성 억제 데이터와 함께, 루벡키아 라시니아타에 의해 NO 생성이 억제되는 결과는 LPS-유도된 대식세포에서 NO의 생성으르 억제하고 NO를 제거함으로써 이루어짐을 알 수 있다.
NO 생성과 iNOS 발현은 염증과 발암의 병리생리학과 관련이 있다. 조직에서의 iNOS의 조절은 염증을 치료하는데 가장 중요한 것으로 간주되었다. iNOS의 발현은 NF-κB의 발현증가와 밀접한 관련이 있는데, 이는 NF-κB 사이트가 iNOS 유전자의 프로모터 부위인 것으로 확인되었기 때문이다 (Prabhu, K.S. et al., Biochemical Journal, 366, 203-209). 전사 유발 인자인 NF-κB는 다양한 세포외 사이토카인, LPS 및 산화적 스트레스에 의해 활성화된다. 이를 통해, 국화과 식물 추출물이 iNOS mRNA 전사를 억제함으로써 NF-κB를 조절할 수 있음을 예측할 수 있다. 본 실험 결과에서는 식물 추출물들의 NO 생성 억제 활성이 세포의 생존도에는 영향을 끼치지 않으면서, 화학적 NO 제거 및 iNOS 조절을 통해 이루어짐을 알 수 있다.
(2) 세포 생존력 분석
세포 생존력은 MTT 분석법을 이용하여 확인하였다. 대식세포를 1×105 세포/웰 농도로 96-웰 세포 배양 플레이트(Corning Inc., USA)에 분주하여 37℃에서 3-4시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 식물 추출물을 농도별로 처리하였다. 24시간 동안 배양하고 난 뒤, MTT 용액을 0.5 mg/ml 농도로 모든 웰에 첨가한 뒤 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 플레이트에 있는 모든 배양액을 버리고 난 뒤, 100 μl의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 모든 웰에 첨가하였다. 그리고 난 뒤 플레이트를 쉐이킹하면서 5분 동안 실온에 놓아 두어 포르마잔(formazan)이 완전히 분해되도록 하였다. MTT 포르마잔은 UV-흡광도측정 리더기(Emax, Molecular Devices Inc., USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존력은 미처리 세포에 대한 식물 추출물 처리 세포의 흡광도 비율(퍼센트)로 확인하였다
그 결과, 본 발명의 국화과 식물 추출물을 처리하여도 세포 생존력이 감소되지 않음을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예
8. 항암 활성-암세포 생존력 분석(
Cell
viability
assay
)
암 세포주들로서, MCF-7(인간 유방암세포), HeLa(인간 자궁경부암 세포), SK-OV-3(난소암 세포), 및 PC-3(인간 췌장암 세포) 세포주 각각을 1×105 세포수/웰 농도로 96웰 세포 배양 플레이트(Corning Inc., USA)에 분주하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 식물 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 난 뒤, 국화과 식물 추출물에 대한 암세포주의 생존도를 MTT 분석법으로 분석하였으며, 이 분석은 상기 항염증 활성에서 사용한 MTT 분석법과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과를 표 1 내지 표 4에 나타내었다.
| 농도 (μg/ml) |
크리샙테뮴 보리앨 |
크리샙테뮴 인디컴 |
크리샙테뮴 모리폴리움 |
애스터 스파튤리폴리우스 |
코레옵시스 드루몬디 |
루벡키아 라시니아타 |
| 0 | 100.00±9.90 | 100.00±8.05 | 100.00±9.41 | 100.00±7.69 | 100.00±8.72 | 100.00±4.95 |
| 10 | 114.77±7.74 | 105.16±7.66 | 84.22±8.38 | 104.35±8.13 | 107.73±3.96 | 86.33±7.44 |
| 50 | 82.70±7.69 | 75.31±6.09 | 78.63±5.51 | 76.10±7.00 | 85.08±4.87 | 90.43±6.80 |
| 100 | 72.13±4.63 | 52.80±3.17 | 63.83±6.46 | 70.13±4.03 | 83.74±6.74 | 92.63±8.57 |
| 200 | 54.45±3.27 | 38.07±5.22 | 51.46±4.26 | 65.24±6.33 | 76.33±4.14 | 84.52±7.62 |
| 농도 (μg/ml) |
크리샙테뮴 보리앨 |
크리샙테뮴 인디컴 |
크리샙테뮴 모리폴리움 |
애스터 스파튤리폴리우스 |
코레옵시스 드루몬디 |
루벡키아 라시니아타 |
| 0 | 100.00±8.26 | 100.00±5.33 | 100.00±5.22 | 100.00±6.23 | 100.00±7.63 | 100.00±5.63 |
| 10 | 108.62±4.53 | 92.83±5.74 | 76.32±8.63 | 110.33±8.63 | 112.13±5.24 | 90.32±6.33 |
| 50 | 75.63±3.15 | 82.72±4.92 | 70.01±7.60 | 88.53±6.02 | 88.53±4.36 | 91.23±7.20 |
| 100 | 56.53±4.85 | 62.53±6.33 | 54.13±6.30 | 80.52±5.12 | 71.44±3.80 | 85.13±6.32 |
| 200 | 48.43±5.56 | 47.53±5.24 | 39.62±5.02 | 40.23±5.24 | 63.64±3.66 | 90.05±4.46 |
| 농도 (μg/ml) |
크리샙테뮴 보리앨 |
크리샙테뮴 인디컴 |
크리샙테뮴 모리폴리움 |
애스터 스파튤리폴리우스 |
코레옵시스 드루몬디 |
루벡키아 라시니아타 |
| 0 | 100.00±8.25 | 100.00±8.16 | 100.00±9.63 | 100.00±8.62 | 100.00±3.32 | 100.00±9.63 |
| 10 | 95.22±5.23 | 82.67±8.24 | 92.45±5.74 | 105.73±8.65 | 106.72±5.94 | 98.52±8.13 |
| 50 | 82.80±6.39 | 76.73±5.33 | 76.51±7.53 | 92.51±5.01 | 95.63±8.24 | 95.24±8.87 |
| 100 | 68.84±5.99 | 65.43±4.02 | 50.22±6.32 | 82.43±4.22 | 96.72±5.44 | 90.84±7.57 |
| 200 | 52.66±5.69 | 41.94±3.33 | 37.09±5.60 | 76.53±6.32 | 85.04±4.83 | 98.53±7.40 |
| 농도 (μg/ml) |
크리샙테뮴 보리앨 |
크리샙테뮴 인디컴 |
크리샙테뮴 모리폴리움 |
애스터 스파튤리폴리우스 |
코레옵시스 드루몬디 |
루벡키아 라시니아타 |
| 0 | 100.00±3.02 | 100.00±8.36 | 100.00±7.20 | 100.00±2.33 | 100.00±7.80 | 100.00±5.62 |
| 10 | 86.32±4.12 | 76.33±6.33 | 80.12±6.32 | 87.43±9.25 | 92.81±8.26 | 105.33±4.27 |
| 50 | 71.63±4.25 | 65.86±5.93 | 72.43±6.13 | 80.62±5.97 | 104.04±5.33 | 94.56±6.30 |
| 100 | 50.03±6.33 | 59.65±4.36 | 65.66±4.30 | 79.52±4.40 | 88.71±6.134 | 90.43±5.90 |
| 200 | 48.52±5.85 | 36.93±3.63 | 48.91±4.81 | 68.30±4.54 | 85.43±4.21 | 91.24±4.86 |
상기 표 1 내지 표 4의 결과는 미처리 세포 생존도에 대한 식물 추출물 처리 세포의 생존도를 퍼센트로 나타낸 것이다.
상기 표 1 내지 표 4의 결과에 따르면, 크리샙테뮴 보리앨, 크리샙테뮴 인디컴 및 크리샙테뮴 모리폴리움은 애스터 스파튤리폴리우스, 크리샙테뮴 드루몬디 및 루벡키아 라시니아타에 비해 MCF-7(표 1), HeLa(표 2), SK-OV-3(표 3), 및 PC-3(표 4) 세포주에 대해 세포 생존도 억제력이 상대적으로 우수하였다. 애스터 스파튤리폴리우스와 크리샙테뮴 드루몬디가 HeLa 세포 생존도를 약 15-37.3% 저해하는 것을 제외하고, 루벡키아 라시니아타는 세포 성장에 전혀 영향을 끼치지 않았다. 크리샙테뮴 보리앨, 크리셉테뮴 인디컴 및 크리셉테뮴 모리폴리움을 200 μg/ml 농도로 처리했을때에는 MCF-7, HeLa, SK-OV-3 및 PC-3 세포주의 생존도를 약 47-63% 억제하였다.
실시예
9.
항비만
활성
(1) 지방축적도 분석(
lipid
accumulation
)
본 발명의 국화과 식물 추출물의 항비만 활성을 확인하기 위해 3T3-L1 지방 세포를 이용하여 지방 축적도를 분석하였다. 실험 방법은 다음과 같다.
3T3-L1 세포를 48웰 플레이트에 분주하여 플레이트가 완전히 밀집되게 배양이 되고 난 뒤 2일 동안 더 배양을 하였다. 10% FBS, MDI 시약(0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴, 0.5 μM 덱사메타손, 10 μg/ml 인슐린)이 포함된 DMEM 배지에서 3T3-L1 세포를 36시간 동안 배양하게 되면, 2일 후-밀집배양 지방세포 3T3-L1으로 분화된다(이때를 지정일 0이라고 한다). 배양후, 상기 배지를 10% FBS 및 10 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM 배지로 2일마다 교체하여 주었다.
축적된 지방 세포를 확인하기 위해 오일 레드 O 염색(Oil red O staining)을 수행하였다. 상기 식물 추출물 처리가 완료된 지방세포를 PBS로 세척한 뒤 3.7% 파라포름알데히드에 넣어 10분 동안 고정처리하였다. 그리고, 분화된 지방세포의 지방 축적도를 평가하기 위해 오일 레드 O 염색액(0.2% 오일 레드 O-이소프로판올 용액과 물의 3:3 혼합액)을 세포에 처리하여 실온에서 1시간 동안 놓아 두었으며, 정제수로 세척하였다. 오일 레드 O의 흡수량을 정량하기 위해, 세포를 이소프로판올에 용해시키고, 흡광도측정기(M2, Microplate Reader, Molecular Device)를 사용해 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2) 지방 분해도 분석(
lipolysis
)
본 발명의 국화과 식물 추출물의 항비만 활성을 지방 분해도로 확인하였으며, 이는 지방 세포로부터 분비되는 글리세롤을 측정하여 확인하였다.
분화된 3T3-L1 지방세포에 다양한 농도의 국화과 식물 추출물을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 그리고 난 뒤, 배양 플레이트의 배지를 마이크로 튜브에 옮겨담고, 10분 동안 70℃로 가열하여 세포로부터 배출된 모든 효소의 활성을 불활성화시켰다. 배지 내에 포함되어 있는 자유 글리세롤은 글리세롤 분석 키트(Sigma)를 사용하여 540 nm에서 흡광도측정기로 측정하였다. 다양한 자유 글리세롤의 농도를 비교하기 위해, 각 샘플을 브래드포드 단백질 분석기로 측정한 전체 단백질 레벨로 교정하였다.
(3) 지방
축적도와
지방분해도의
결과
상기, 지방축적도와 지방분해도 결과를 표 5에 나타내었다.
| 국화과 식물 추출물 | 농도(μg/ml) | 지방분해도 | 지방축적도 |
| 프리 라디칼 분비 (MDI 대조군대비 %) |
세포내 지방 축적도 (MDI 대조군 대비 %) |
||
| 크리샙테뮴 보리앨 |
10 | 167.94±12.91 | 94.2±2.8 |
| 50 | 180.52±26.61 | 80.3±18.8 | |
| 100 | 162±14.34 | 37.2±1.8 | |
| 200 | 독성있음 | 독성있음 | |
| 크리샙테뮴 인디컴 |
10 | 107.35±10.95 | 80.2±12.3 |
| 50 | 106.03±11.42 | 73.0±3.7 | |
| 100 | 94.05±34.74 | 52.7±11.2 | |
| 200 | 독성있음 | 독성있음 | |
| 크리샙테뮴 모리폴리움 |
10 | 158±3.68 | 71.8±10.4 |
| 50 | 151.45±18.49 | 43.9±5.8 | |
| 100 | 159.77±4.95 | 39.6±4.0 | |
| 200 | 161.23±5.79 | 독성있음 | |
| 애스터 스파튤리폴리우스 |
10 | 116.02±8.74 | 77.9±1.6 |
| 50 | 117.71±12.86 | 63.0±14.3 | |
| 100 | 110.59±14.52 | 독성있음 | |
| 200 | 독성있음 | 독성있음 | |
| 코레옵시스 드루몬디 |
10 | 161.47±9.01 | 119.7±15.5 |
| 50 | 161.18±2.79 | 70.0±16.8 | |
| 100 | 156.52±1.95 | 43.3±7.8 | |
| 200 | 112.06±1.15 | 47.9±5.5 | |
| 루벡키아 라시니아타 |
10 | 113.52±5.72 | 107.7±16.6 |
| 50 | 108.82±14.39 | 43.9±5.8 | |
| 100 | 116.8±4.05 | 39.6±4.0 | |
| 200 | 86.81±8.75 | 독성있음 |
* 상기 표에서, 프리 라디칼 분비도는 MDI-처리한 그룹(대조군)에 대한 %로 표시한 것이다. 크리샙태뮴 보리앨, 애스터 스파튤리폴리우스 및 코레옵시스 드루몬디의 MDI-처리 대조군 값은 100±14.88%(119.9±17.81 μg/ml의 프리 글리세롤이 배지에 분비되었음) 이었다. 그리고, 크리샙테뮴 인디컴, 크리샙테뮴 모리폴리움 및 루벡키아 라시니아타의 MDI-처리 대조군 값은 100±5.44%(143.06±7.78 μg/ml의 프리 글리세롤이 배지에 분비되었음) 이었다.
* 상기 표에서 세포내 지방 축적도는 MDI-처리한 대조군이 100±10.0%였다.
* 상기 표에서 (독성있음)이라고 표시한 것은 식물 추출물을 처리한 세포가 세포 배양 플레이트로부터 떨어졌기 때문에, 프리 글리세롤 분비량과 세포내 지방 축적이 검출되지 않았다.
크리샙테뮴 보리앨 추출물을 10, 50 및 100 μg/ml 농도로 3T3-L1 지방세포에 처리하였을때, 배양 배지 내에 분비되는 자유 글리세롤 분비량으로 확인되는 세포내 지방 분해는 대조군과 비교해 상기 각 농도별로 167, 180 및 162% 증가하였으며, 크리샙테뮴 보리앨 추출물이 상대적으로 지방 분해도가 우수함을 확인할 수 있었다. 크리샙테뮴 보리앨 추출물을 10, 50 및 100 μg/ml 농도로 처리했을때 MDI 시약 대조그룹과 비교해 3T3-L1 지방세포에 축적된 지방은 각각 94.2, 80.3 및 37.2%로 감소하였다.
본 실험에서, 크리샙테뮴 보리앨 추출물은 실험한 6종의 국화과 식물 추출물 중에서 가장 우수한 항-비만 활성을 나타내었다. 크리샙테뮴 인디컴 추출물은 배지 내에 글리세롤 분비량의 증가가 관찰되지는 않았지만, 오일 레드 O 염색에서 확인한 지방 축적이 처리한 농도 의존적으로 감소되는 것으로 확인되었다.
크리샙테뮴 모리폴리움 추출물을 10, 50 및 100 μg/ml 농도로 처리했을때에는 지방 분해 활성이 각각 158, 151 및 159%로 나타났고, 지방 축적이 각각 71.8, 43.9 및 39.6% 억제되었다.
크리샙테뮴 드루몬디 추출물은 10, 50 및 100 μg/ml 농도로 처리했을때 MDI 시약 대조군과 비교해 지방분해를 각각 161, 161 및 156% 촉진시켰다. 3T3-L1 지방 세포에서의 지방 합성은 각 용량별로 119.7, 70.0 및 43.3% 감소되었다.
애스터 스파튤리폴리우스 추출물은 3T3-L1 지방세포 분화 동안 오직 지방 축적만을 억제시켰다.
루벡키아 라시니아타 추출물은 3T3-L1 지방세포에서의 지방 축적을 억제하였지만, 지방 분해 활성은 없었다.
항-비만 활성에서, 크리샙테뮴 보리앨, 크리샙테뮴 모리폴리움 및 크리샙테뮴 드루몬디 추출물은 MDI 시약 대조군과 비교해 지방분해를 약 150-160% 촉진시켰으며, 3T3-L1 지방 세포의 분화 동안 지방의 축적을 약 70% 억제시켰다. 이를 통해 크리샙테뮴 보리앨, 크리샙테뮴 모리폴리움 및 크리샙테뮴 드루몬디 추출물은 3T3-L1 지방 세포에서 지방 분해를 촉진하고 지방 합성을 감소시키는 작용을 함을 확인 할 수 있었다.
크리샙테뮴 인디컴, 애스터 스파튤리폴리우스 및 루벡키아 라시니아타 추출물은 3T3-L1 지방세포에서 지방 합성을 약 40-60% 억제시켜 항-비만 활성을 나타내었다.
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- 코레옵시스 드루몬디(Coreopsis drummondii) 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 항비만용 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 코레옵시스 드루몬디(Coreopsis drummondii) 추출물은 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, (c) 아세톤, (d) 헥산, (e) 에틸 아세테이트, (f) 헥산과 에틸 아세테이트의 혼합용매, (g) 클로로포름, (h) 1,3-부틸렌글리콜 및 (i) 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.
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