KR101536820B1 - 생체외 이차원 혈관 생성 방법 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체외에서 2차원으로 혈관을 생성하는 방법에 관한 것으로, 혈관내피세포 및 중간엽세포를 3차원 공배양 하여 구체를 형성한 후, 이를 단층의 혈관평활근세포에 배양하여 관강을 형성하는 단계를 포함한다. 본원에 따른 방법에 의해 생성된 혈관은 면을 따라 형성되어 관찰 및 정량이 용이하여, 혈관생성을 조절하는 약물 개발에 용이하게 사용될 수 있다.

Description

생체외 이차원 혈관 생성 방법 및 그 용도 {In vitro method of generating blood vessels in 2D and its use}

본 발명은 생체외 2차원 혈관생성 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

혈관형성(vasculogenesis) 및 혈관신생(angiogenesis)을 포함하는 혈관생성 및 기능은 수많은 생리 및 병리학적 현상을 매개하는 중요한 과정으로, 전자는 이미 존재하는 혈관없이 혈관이 생성되는 것이고, 후자는 이미 존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 것이다 (Phng LK, et al. Dev Cell. 2009;16:196-208). 혈관생성과정은 유주(sprouting), 분지(branching), 관강(lumenized) 형성 및 주위세포(pericyte) 또는 평활근세포(smooth muscle cell(SMCs))의 점증(recruitment)에 의한 안정화가 포함되는 다양한 단계의 과정이다 (Phng LK, et al. Dev Cell. 2009;16:196-208).

당뇨병에 의한 실명, 암의 발생과 전이, 노인황반변성, 건선, 류마티스 관절염을 포함한 여러 질병이 혈관의 생성 및 기능에 대한 이상에 의한 발생 또는 악화되는 것으로 알려져 있다 (Group TDCaCTR. N Engl J Med. 1993;329:977-86; Nathan DM, et al. N Engl J Med. 2005;353:2643-53; Patel A, et al. N Engl J Med. 2008;358:2560-72).

따라서 이러한 과정의 기전을 이해하고 이를 조절하는 약물 및 치료법에 대한 연구가 요구된다. 그런데, 이런 혈관 관련 질병의 극복을 위한 기초연구와 신약 개발은 혈관의 생성과 기능, 그리고 병리학적 형상 등을 생체외에서 모사하는 실험 플랫폼의 구현을 필요로 한다.

한국 특허 출원 번호 제2012-0040613호에는 생체외 혈관 생성 장치에 대하여 개시하고 있는데, 이는 생체외에서 3차원으로 혈관을 생성하기 위한 장치 및 방법에 대한 것이다.

종래의 혈관 생성에 관한 연구 방법 또는 약물 실험 중 대표적이라 할수 있는 것은 반투과막(semi-permeable membrane) 위에 세포를 부착시켜 배양하는 시스템(Hidalgo IJ et al. Gatroenterology 96(3), 736-749, 1989)인데, 이는 시간과 노동력 그리고 비용이 많이 드는 단접이 있으며, 특히 생체 내에서 혈관이 가지는 3차원적 구조에 지나지 않으며 모사된 기능이 실제 혈관에 비해 제한적인 특성을 지니고 있는 것으로 알려져 있다. 실험용 쥐를 이용하여 쥐의 생체 내에서 혈관 내에 약물을 투여하고 약물을 테스트 하는 실험 방법(Salphati L et al. J. Pharm. Pharmacol. 53, 1007-1013, 2001)은 쥐를 해부하고 특정 장기를 판별하여 튜브를 연결하는 등 실험 과정이 복잡하고 시간과 비용이 많이 든다는 단점이 있었다. 이에 동물 실험을 하지 않고서도 in vitro 상에서 실제 생체 내 환경과 유사한 환경에서 혈관과 관련된 연구 또는 약물 테스트를 수행할 수 있도록 생체외에서 실제 혈관과 유사한 혈관을 생성하는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 생체외에서 혈관을 생성하기 위한, 2차원 생체외 혈관 생성 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 a) 혈관내피세포 또는 혈관내피전구세포 중 하나 이상 및 중간엽세포 또는 중간엽줄기세포 중 하나 이상을 제공하는 단계; b) 상기 두 종류의 세포를 3차원 공배양 하여 구체를 형성하는 단계; 및 c) 상기 구체를 단층의 중간엽세포에 배양하여 관강을 형성하는 단계를 포함하는 생체외 2차원 혈관 생성 방법을 제공한다.

본 일구현예에서 혈관 생성 과정의 관찰이 가능할 수 있도록 상기 혈관생성세포는 형광단백질을 발현하도록 변형된 것이 사용될 수 있다. 본원에 따른 방법에서 공배양은 세포외기질 예를 들면 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리 젤, 자가조립 펩타이드 젤, 폴리에틸렌글리콜 젤 또는 알지네이트 등을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 상기 단계 c)는 혈관생성인자의 존재 중에서 수행될 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 혈관내피세포는 생체조직, 일차 세포 배양물, 세포주 또는 줄기세포 유래의 것이 사용될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에 사용되는 중간엽세포는 중간엽줄기세포, 섬유모세포, 민무늬근육 또는 혈관평활근세포가 사용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서 관강은 혈관내피세포의 유주, 증식, 관형성, 관강형성 및 혈관 네트워크의 형성의 혈관생성의 전과정, 또는 혈관의 안정화 또는 퇴행, 성장 및 신생의 리모델링 현상을 포함한다.

다른 양태에서 본원은 또한 a) 혈관내피세포 및 중간엽세포를 제공하는 단계; b) 상기 두 종류의 세포를 3차원 공배양 하여 구체를 형성하는 단계; c) 상기 구체를 단층의 중간엽세포에 배양하여 관강을 형성하는 단계; d) 상기 c) 단계에서 시험물질을 처리하는 단계; 및 e) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 시험물질을 처리한 군에서 관강에 변화가 있는 경우, 이를 후보물질로 선별하는 본원에 따른 혈관 생성 방법을 이용한 혈관생성을 조절하는 물질을 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 스크리닝 방법에서 관강은 혈관내피세포의 유주, 증식, 관형성, 관강형성 및 혈관 네트워크의 형성의 혈관생성의 전과정, 또는 혈관의 안정화 또는 퇴행, 성장 및 신생의 리모델링을 포함한다.

본원에 따른 방법은 혈관생성의 이상 및/또는 혈관생성 조절 이상 등과 관련된 다양한 질환의 치료제 개발을 위해 사용될 수 있으며, 본원에 따른 일 구현예에서는 당뇨병성 혈관질환 예방 또는 치료용 약물 스크리닝에 사용되는 것인, 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 2차원적 생체외 혈관 생성 방법은 기존의 3차원 콜라겐 매트릭스모델과는 달리 필요한 경우 절편제작이나 추가 염색 없이 면역형광염색, 공초점 현미경 영상화 및 정량화 등을 통해 추가의 분석이 가능하다. 나아가 혈관생성을 담당하는 세포가 형광물질로 표지된 경우, 혈관 생성을 실시간으로 가시화할 수 있다.

본원에 따른 혈관 생성 방법은 간단한 조작으로, 혈관내피세포의 유주, 관형성, 관강형성 및 혈관 네트워크의 형성 과정 전체를 재현할 수 있어, 혈관 생성, 혈관 안정화 또는 퇴행에 관한 기전 연구가 가능하다.

또한 이러한 각 과정에 미치는 물질의 발굴의 통한 혈관생성을 촉진 또는 억제하는 물질의 개발이 가능하다. 예를 들면 약물 개발 과정에서 혈관 생성 촉진 및 억제 인자의 탐색 및 작용기전 규명과, 창상 치유조직 종양조직 및 당뇨병성 망막증 등 과 같은 혈관증 등에서의 병리학적 혈관 생성 분석에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본원에 따른 일 구현 예에서 녹색형광단백질을 발현하는 혈관내피세포의 현미경 사진이다.
도 2는 본원에 따른 일 구현예에서 혈관내피세포와 혈관평활근세포의 3차원 공배양을 통해 생성된 세포 구체 현미경 사진이다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따른 생체외 혈관생성 모델의 혈관생성에서 MSC 세포와의 공배양이 미치는 영향을 나타내는 결과이다 : a-c)는 구체를 3차원적 콜라겐 겔에서 7일 동안 배양하였다. a) HUVEC 구체는 안정한 관을 생성하지 않았다; b) MSC 구체는 관강 생성 없이 사방으로 퍼지는 세포 구조를 나타내었다; c) HUVEC + MSC 혼합 구체는 1 주일 이상 지속되는 혈관 생성 및 관강이 있는 관을 나타내었다; d) 콜라겐 겔 내의 혼합 구체로부터 나온 내피 의사 혈관의 관을 적색 필터를 사용하여 형광 현미경으로 직접적으로 가시화한 것이다. 스케일 바, 50㎛; e) YFP-HUVEC 관은 콜라겐 겔 내에서 CFP-MSC와 동축을 이루었다. 스케일 바 =50㎛; f) 일부 HUVEC 및 MSC(화살표)는 서로 접촉되어 있는 사상위족을 보여준다; g-k) HUVEC 주변의 MSC는 주변세포의 마커인 PDGFRβ를 발현하는 것을 보여준다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따른 생체외 2D 혈관생성 모델에서의 다단계 혈관생성 과정을 관찰한 결과이다: a) 커버글라스 하부디쉬의 단층의 혈관평활근 세포위에서 GFP-형질전환된 혈관내피세포와 표지되지 않은 혈관평활근 세포를 공배양한 1일째의 구체이다; b) 3일째 구체에서 혈관내피세포의 유주 과정을 보여준다; c) 6일째에 구체로부터 혈관내피세포의 관이 생성된 것이다; d) 추가의 염색없이 얻은 정단세포의 사상위족이다; e) 지주세포와 정단세포; f) 6일째에, 처리되지 않은 내피세포와 비교하여 볼 때 외인성 10ng/ml VEGF를 처리하였을 때 혈관 생성이 증강되어 나타났다; g) 파란색 원으로 표시된 두 개의 핵은 형성된 관의 다세포성을 보여주며, 인접한 내피세포사이에 다수의 공포(vacuole)(화살표)가 생성되었다; h) 생체외에서 내피세포에 의하여 모세혈관과 유사한 관강(lumen)이 생성되었다; ｉ) VE-cadherin(적색)은 다수의 내피세포가 서로 연결되어 하나의 관을 형성함을 나타낸다; j-k) 생체외 혈관생성의 동적 리모델링을 나타내며, 이는 48시간동안 동일한 현미경 필드에서 퇴행(점선), 성장(더 굵어짐) 및 새로운 생성을 포함한다; l-m) 타입 IV 콜라겐에 의해 염색된 기저막(basemment membrane)의 생성이 관찰된다; n) 생체외 모세혈관의 관강화된 네트워크의 생성을 나타낸다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 생체외 2D 혈관생성 모델에서, 고 글루코스로 유도된 비정상적 혈관생성을 특징화하여 나타낸 것이다:a-c) 정상적인 글루코스 농도와 비교하였을 때, 고 글루코스 농도일 때는 관의 직경이 더 좁아지고, 유주 및 분지가 증가한다는 것을 나타낸다(n = 3); d) 고 글루코스 농도에서 생체외 혈관생성시에 활발한 리모델링 과정(성장 및 퇴행)이 나타난다는 것을 보여준다. 화살표: 유주 성장, 화살표 머리: 유주 퇴행; e) 만니톨과는 반대로, 고 글루코스는 새로운 사상위족의 수를 증가시켰고, 유주를 퇴행시켰다는 것을 나타낸다(n=8); f) 만니톨 대조군에서의 안정한 지주세포와는 반대되는 고 글루코스 조건에서의 기저막(화살표)의 분해와 지주세포로부터 새로운 사상위족이 생겨난 것을 나타낸다. 고 글루코스 조건에서는 외인성 VEGF에 반응하여 튜브 길이 당 사상위족의 수가 유의하게 증가하였다(p = 0.026; n = 4); g) 상기 모델에서 혈관내피세포 및 혈관평활근세포에서의 세포 증강 및 이의 정량화를 측정하기 위한 Ki67 염색을 나타낸다(n = 4); h) 상기 모델에서 혈관내피세포 및 혈관평활근세포에서의 세포사멸 및 이의 정량화를 측정하기 위한 절단된 카스파아제-3 염색을 나타낸다(n = 4).
도 6은 본원의 일 구현예에 따른 생체외 2D 혈관생성 모델에 대한 글루코스 농도의 효과를 나타낸 것이다:
a) 정상 글루코스 조건에서 내피세포 및 평활근 세포 혼성 구체로부터의 혈관생성을 나타낸다; b) 고 글루코스 조건에서의 혈관생성에서는 짧은 길이의 관이 나타났다; c-d) 관의 총 길이 및 최대 관 면적에 대한 고 글루코스의 용량 효과를 나타낸 것이다. 15.6 mM의 글루코스에서, 비정상적 혈관생성에 대하여 실질적으로 용량 의존적 효과가 없었다(n=4).
도 7은 본원에 따른 방법에 포함된 각 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.

본원은 특정 세포의 배양을 통해 2차원으로 혈관생성의 전 과정을 재현할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 생체외 2차원 혈관 생성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 혈관내피세포 및 중간엽세포를 제공하는 단계; 상기 두 종류의 세포를 3차원 공배양 하여 구체를 형성하는 단계: 및 상기 구체를 단층의 중간엽세포에 배양하여 관강을 생성하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 혈관 생성 방법은 혈관형성 (vasculogenesis) 또는 혈관신생 (angiogenesis)을 통해 혈관을 생성할 수 있다.

본원의 따른 방법에서 혈관 생성에 직접 관여하는 세포는“혈관내피세포” 또는 “혈관내피전구세포”로, 이는 중간엽세포와의 공배양을 통해 혈관을 생성한다.

본원에서“혈관내피세포 (endothelial cell)”는 후술하는 중간엽세포 등과의 상호작용을 통해 본원의 방법에 따라 혈관을 생성할 수 있는 세포를 포함한다. 혈관내피세포는 다양한 유래로부터 수득될 수 있다. 예를 들면 성인의 경우, 각종 조직, 정맥 및 동맥, 태아의 경우 탯줄 및 정맥으로 수득될 수 있으며, 이러한 다양한 유래의 내피세포가 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면 인간태아정맥내피세포 (human umbilical vein endothelial cell), 인간미세혈관내피세포 (human microvascular endothelial cell), 인간뇌미세혈관내피세포 (human brain microvascular endothelial cell), 인간림프내피세포 (human lymphatic endothelial cell) 등 다양한 신체 부위에서 분리된 혈관내피세포가 사용될 수 있다. 또한 혈관내피세포는 배아줄기세포 또는 역분화 줄기세포의 분화 유도를 통해 형성된 것 일 수 있다.

또는 본원의 방법에는 혈관내피전구세포 (Endothelial Progenitor Cell)가 또한 사용될 수 있다. 혈관내피전구세포는 내피세포로 분화될 수 있는 세포로, 골수, 말초혈액, 지방, 근육, 신경 조직, 제대혈, 배상체 (embryonic body) 또는 분화중인 배아줄기세포 (Embryonic stem cell)로부터 공지된 방법을 이용하여 분리될 수 있다.

본원의 방법에 사용되는 혈관내피세포 또는 혈관내피전구세포는 다양한 표지물질을 발현할 수 있다. 이러한 표지물질은 다양한 방법으로 검출가능한 물질로서, 상기 세포에 의해 생성되는 혈관 생성의 과정을 관찰하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 세포를 다른 세포와 구분할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본원에 따른 일 구현예에서는 형광현미경으로 관찰이 가능한 형광단백질이 사용되며, 한 종류는 물론 다른 파장을 갖는 복수개의 단백질이 사용될 수 있다. 본원에 따른 세포는 이러한 단백질을 발현할 수 있도록 형질전환되며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본원의 실시예에 기재된 방법을 참조할 수 있다. 예를 들면 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 예를 들면 바이러스 벡터, 예를 들면 pLentiLox 3.7(pLL3.7)이다. 형광단백질은 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 여기 파장에 따라 근적외, 적색, 오렌지, 엘루우그린, 그린, 시안, UV에 의해 여기가능한 그린 단백질이 포함되며, Nathan C Shaner et al., Nature Method, Vol.2, No.12 pp905-906에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 혈관내피세포는 중간엽세포 (Mesenchymal Cell) 또는 중간엽줄기세포 (Mesenchymal Stem Cell)과의 공배양을 통해 혈관을 생성한다.

중간엽세포는 이로 제한하는 것은 아니나 혈관내피세포와의 상호작용을 통해 혈관 생성에 필요한 생화학물질을 분비하여 혈관의 생성을 보조하는 세포로 다양한 기원의 골수유래, 진피유래, 혈액유래, 지방세포유래, 제대혈세포유래, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포 유래 등과 같은 다양한 유래의 중간엽줄기세포, 섬유모세포, 민무늬근육 또는 평활근세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 혈관내피세포의 유래의 맞춰 선택될 수 있다. 예를 들면 뇌 유래의 혈관내피세포의 경우, 성상세포, 아교세포, 주피세포 또는 섬유아세포가 사용될 수 있으며, 뇌혈관 이외의 혈관인 경우에는 섬유아세포 또는 평활근세포가 사용될 수 있다.

본원에 따른 혈관생성 방법에서 관강은 혈관내피세포의 유주, 증식, 관형성, 관강형성 및 혈관 네트워크의 형성의 혈관생성의 전과정을 포함하는 것이다. 아울러, 혈관의 안정화, 퇴행, 성장 및 신생의 리모델링 현상을 포함하는 것이다. 관형성은 내강이 없이 혈관세포가 뻗어 자라나가는 것을 의미하며 관강형성은 관형성이 된 곳에 내강이 형성되는 것이다.

본원에 따른 방법은 2차원 혈관생성을 위해 세포외기질을 추가로 포함할 수 있다. “세포외기질”은 예를 들어 콜라겐 젤(collagen gel), 피브린 젤(fibrin gel), 마트리젤(Matrigel), 자가조립 펩타이드 젤(self-assembled peptide gel), 폴리에틸렌글리콜 젤(polyethylene glycol gel) 및 알지네이트 젤 (alginate gel) 중 적어도 하나일 수 있으며, 본원의 일 실시예에서는 콜라겐 젤이 사용된다.

세포외 기질은 혈관 형성의 안정화에 기여할 수 있고, 본원의 방법에 사용되는 두 종류의 세포이외에, 세포외 기질이 혈관 형성에 미치는 영향 등의 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면 상기 세포외기질은 혈관생성, 혈관의 기능, 효과와 효능을 정량 측정하거나 혈관생성를 촉진 또는 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적을 위해, 약물(drug compound), 가용성인자(soluble factor), 불용성인자(insoluble factor), 생체분자(biomolecule), 단백질(protein), 나노소재(nanomaterial) 및 siRNA와 같은 핵산물질과 혼합하여 사용될 수 있다. 세포외기질은 구체를 중간엽세포 단층에 배양하는 과정에서 사용될 수 있으며, 예를 들면 구체를 중간엽세포의 단층에 배양을 시작하면서 구체와 중간엽세포 단층이 ?게 덮이도록 예를 들면 100μm 이내로 적용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서 상술한 혈관내피세포 및 중간엽세포는 구체를 형성하도록 예를 들면 부착을 방지하며 부유 배양에 사용되는 Methocult^TM (STEMCELL Technologies, Canada)와 같은 배지가 첨가된 배지에서 함께 부유배양 된다. 또한 구체의 형성 방법은 본원 실시예에 기재된 방법을 참조할 수 있으며, 구체에 포함되는 세포의 비는 혈관을 생성할 수 있는 한 크게 제한되지 않으며, 본원에 따른 일 구현예에서는 예를 들면 혈관내피세포 대 중간엽세포의 비가 약 1~3 대 1~3의 비율로 하여 제조되었으며, 다른 구현예에서는 1.5~2.5 대 1의 비율로 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에 의해 제조된 구체는 단층으로 배양된 중간엽세포의 상층에 배양된다. “단층 배양”은 세포를 체외배양조건 하에서 정치배양시 기질에 단층으로 펴서 증식시키는 배양법을 말한다. 세포는 2차원적으로 증식하여 용기의 바닥에 접촉되면 접촉 저지현상이 나타난다. 접촉 저지가 없는 세포주에서는 증식하여 세포가 서로 접촉하더라도 증식이 계속되어 세포가 겹쳐져 다층을 형성한다.

본원에 따른 방법은“혈관생성인자”를 추가로 포함할 수 있다. 혈관생성인자는 분자량 2,000~20,000인 혈관생성을 유도하는 내인성 인자를 말한다. 섬유모세포생장인자(FGF), 혈관내피세포생장인자(VEGF), 형질변화생장인자 β(TGTβ) 등을 포함한다.

본원의 방법에 사용되는 세포는 인간은 물론 인간 이외의 다양한 포유류 예를 들면 원숭이, 소, 돼지, 설취류 유래의 것이 사용될 수 있으며, 실험의 목적에 적합하게 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본원에 따른 방법은 2차원 혈관 생성을 구현할 수 있어, 혈관 생성 과정 중의 혈관내피세포를 살아있는 상태에서 실시간으로 관찰하는 것이 가능하다. 또한 3차원 혈관생성의 경우 3차원 매트릭스 때문에 추가의 면역 형광 염색, 공초점 현미경 영상화 및 정량화 분석에 어려움이 있으나, 본원의 2차원 혈관 생성방법에 의하면 이러한 문제점을 해결할 수 있다. 본원에 따른 방법의 개요는 도 7에 도식적으로 나타냈다.

다른 측면에서 본원은 본원의 방법을 혈관생성을 조절하는 물질의 스크리닝 방법 또 특정 질환의 혈관생성과 관련된 기전 규명으로서의 용도에 관한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 본원의 방법을 사용한 혈관생성 조절 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상기 스크리닝 방법은 a) 혈관내피세포 및 중간엽세포를 제공하는 단계; b) 상기 두 종류의 세포를 3차원 공배양 하여 구체를 형성하는 단계: c) 상기 구체를 단층의 혈관평활근세포에 배양하여 관강을 형성하는 단계; d) 상기 c) 단계에서 시험물질을 처리하는 단계; e) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 시험물질을 처리한 군에서 관강에 변화가 있는 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

스크리닝 방법에 사용되는 세포의 종류 및 구체 형성 등은 앞서 설명한 바를 참조한다. 본원에 따른 혈관생성 방법은 유주, 증식, 관형성, 관강형성 및 혈관 네트워크의 형성 과정 전체를 재현할 수 있으며, 관강은 이러한 혈관생성의 전과정을 포함하는 것이다. 아울러, 혈관의 안정화, 퇴행, 성장 및 신생의 리모델링 현상을 포함하는 것이다.

따라서, 처리한 물질이 혈관생성과정에서 미치는 구체적 영향을 판단할 수 있다. 상기 방법에서 변화란, 관강의 양태 변화 예를 들면 관강의 굵기와 길이, 억제 또는 촉진하는 것을 모두 포함하는 것으로, 약물의 구체적 치료효과에 따라 변화의 양태를 선택할 수 있을 것이다.

일 구현예에서 본원에 따른 스크리닝 방법은 당뇨병과 관련된 혈관질환 또는 당뇨병성 혈관질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝에 사용될 수 있다. 당뇨병과 관련된 혈관질환 또는 당뇨병성 혈관질환이란, 고혈당에 의해 야기되는 여러 가지 분자생물학적인 병인으로 인해 혈관 손상이 발생하는 질환이다. 미세 당뇨혈관병증과 대혈관병증으로 크게 구분될 수 있으며 미세 당뇨혈관병증은 당뇨 망막병증, 당뇨신병증, 당뇨신경병증을 포함하고, 대혈관병증은 말초동맥질환, 심장혈관질환, 뇌혈관질환을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, DCCT study group . N Engl J Med. 1993;329:977-86; Nathan DM, et al. N Engl J Med. 2005;353:2643-53; Patel A, et al. N Engl J Med. 2008;358:2560-72를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법이 세포외 기질을 포함하는 경우, 상기 세포외기질은 혈관생성, 혈관의 기능, 효과와 효능을 정량 측정하거나 혈관생성를 촉진 또는 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적을 위해, 약물(drug compound), 가용성인자(soluble factor), 불용성인자(insoluble factor), 생체분자(biomolecule), 단백질(protein), 나노소재(nanomaterial) 및 siRNA와 같은 핵산물질과 혼합하여 사용될 수 있다.

본원의 스크리닝 방법에 사용되는 시험물질은 관강의 변화를 유도할 것으로 기재되는 물질을 의미하며, 예를 들면 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 스크리닝 목적을 위해 저분자량의 화합물이 사용될 수 있으며, 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 농도와 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 관강의 변화를 가져오는 물질을 혈관생성을 촉진 또는 억제할 수 있는 후보물질로 선별한다. 예를 들면 대조군과 비교 약 99% 이하 감소 또는 증가, 약 95% 이하 감소 또는 증가, 약 90% 감소 또는 증가, 약 85% 감소 또는 증가, 약 80% 감소 또는 증가, 약 75% 감소 또는 증가, 약 70% 감소 또는 증가, 약 65% 이하 감소 또는 증가, 약 60% 이하 감소 또는 증가, 약 55% 감소 또는 증가, 약 50% 이하 감소 또는 증가, 약 45% 이하 감소 또는 증가를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

1. 인간 내피세포 및 평활근세포의 분리

인간 내피세포 및 평활근세포는 장간막(mesenteric) 및 위대망(gastroepiploic) 동맥에서 기존의 기술된 바와 같이 분리하였다 (Hoshi H, McKeehan WL. In Vitro Cell Dev Biol. 1986;22:51-6). 서울대학교 병원의 의학연구윤리심의위원회(institutional review board)에 의해 승인된 방법(IRB number: H-0910-006-295)에 따라 암으로 인해 절제한 위장의 동맥으로부터 세포를 분리하였다 .

구체적으로 혈관 표면을 씻어내고 지방 또는 연결 조직은 차가운 PBS에서 제거한 후 25-게이지 카테터를 삽입하였다. 관강(lumen)의 내부는 차가운 PBS로 세척하고 0.1% 타입 II 콜라게나아제(Gibco, Carlsbad, CA, USA)로 채웠다. 10분간 37℃에서 배양한 후, 내피 세포 성장 배지인 EGM-2MV 배지 (Lonza, Belgium) 2ml로 플러쉬(flush)하여 내피 세포를 모은 후 1.5% 젤라틴(Sigma, USA)으로 코팅된 배양 디쉬에 추가하였다. 이어 콜라게나아제 용액으로 배양하고 배지로 플러쉬하는 과정을 5회 반복 하였다. 내피 세포를 제거한 후, 나머지 조직을 조각으로 잘라 PBS내 5% 콜라게나아제를 교반 인큐베이터에서 37℃에서 4시간동안 처리한 후, 이를 70- ㎛ 셀 스트레이너를 통과시켜 여과하였다(BD, USA). 이어 세포를 800g에서 원심분리하여 모은 후, 10% FBS를 함유하는 저농도 글루코스 DMEM (Gibco, USA)에 재현탁한 후 0.1% 젤라틴 코팅된 디쉬에 플레이트하였다.

골수 단핵세포(BMCs)는 건강한 지원자의 골수 추출물로부터 농도-구배 원심분리를 통해 분리하였다 (Schachinger V, et al., N Engl J Med. 2006;355:1210-21.) 인간 제대동맥 내피 세포(HUVEC, Human Umbilical Endothelial Cell)는 론자(Lonza)에서 구입하였다.

2. 렌티바이러스를 이용한 혈관내피세포의 녹색형광단백질로의 표지

세포 양태를 실시간으로 가시화하기 위하여, 렌티바이러스에 기초한 형질전환을 사용하였다 (Rubinson DA et al. Nat Genet. 2003;33:401-6). 렌티바이러스 벡터는 증강된 녹색 형광 단백질(Green Fluorescen Protein, GFP), 노란색 형광 단백질(YFP) 및 시안 형광 단백질(CFP, Clontech, USA)을 발현하는 유전자를 가지고 있다.

스크램블된 염기 서열 5′-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3′를 대조군으로 사용하였다. 패키지 벡터를 가진 렌티바이러스 컨스트럭트를 폴리에틸렌이민으로 293T 세포에 동시-감염시켰고 (Polyscience, Warrington, PA, USA), 48시간 후에 렌티바이러스 파티클을 함유하는 상층액을 수집하였다. 형질전환을 위해 바이러스 상층액을 세포에 2회 적용하였다. 형질 전환 효율은 내피세포에 98% 이상이었다.

혈관내피세포의 경우, 녹색형광단백질을 발현하는 렌티바이러스가 포함된 배양액과 혈관내피세포 배양액을 3:7 부피비로 섞은 배양액에 배양하였다. 24시간 후 혈관내피세포 배양액인 EGM-2MV (Lonza) 교체한 후 48시간 더 배양하였다. 결과는 도 1 참조.

3. 혈관내피세포와 혈관평활근세포의 3차원 공배양을 통한 하이브리드 구체 형성

구체 내 혈관(vessel)-유사 구조물의 질을 최적화하기 위하여, 구체 당 총 세포수 (1 × 10³ 에서 1 × 10⁴까지 범위) 및 내피세포/평활근세포를 1:1, 2:1,3:1 또는 1:2 비율과 같은 다양한 조건하에서 실험을 수행하였다. 정량화 실험을 위하여 내피세포:평활근세포 비가 3:1로 구체당 4,000개로 세포수를 고정하였다.

혼성 구체를 제조하기 위하여, GFP-형질 전환된 내피세포와 표지되지 않은 평활근세포 혼합물 (3X10³ 개의 혈관내피세포와 1X10³ 개의 혈관평활근세포)을 MethoCult와 EGM 배지 (Lonza)를 2:8의 부피비로 혼합한 배양액 100㎕에 현탁하고 V자 모양 바닥의 96-웰 플레이트(Nunc, Penfield, NY, USA) 추가하여 48시간동안 배양하여 구체 형성을 유도하였다. 결과는 도 2 참조.

혈관내피세포 대신에 HUVEC을 사용하는 경우, 위와 동일하나 3000개의 HUVEC 세포를 사용하였다.

4. 인비트로 2D 혈관 생성

48시간 후에 구체를 수확하여 콜라겐 겔(Chemicon,USA) 또는 얇은 바닥 디쉬(thin-bottom dish)(μ-Dish, Ibidi, Planegg/Martinsried, Germany)의 SMC 단층세포에서 3일간 배양하였다. EGM 배지를 격일 간격으로 교체하였다. 7일 동안 유지하였다. 결과는 도 3 참조.

혈관생성인자로 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)를 포함하여 배양하는 경우 VEGF(PeproTech, USA)를 구체의 단층 배양한 혈관평활근세포 상층 배양 과정에서 10ng/ml 농도로 첨가하여 7일동안 배양하였다.

글루코스의 존재 중에서 배양하는 경우 글루코스는 5.6, 15.6, 25.6, 35.6 mM 각각의 농도로 구체의 단층 배양한 혈관평활근세포 또는 중간엽세포 상층 배양과정에서 7일 동안 처리하였다.

5. 공초점 형광 현미경 분석

현미경은 LSM 710, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)를 사용하였으며, Zen2008 software (Zeiss)으로 처리하였다. 물 또는 오일에 잠긴 대물렌즈 사용 (40×, 또는 63×, 1.4 numerical aperture, 0.8 μm 두께에 맞춘 핀홀: 각 채널에 1 airy unit). 3차원으로 재구성된 이미지를 가시화하기 위하여, 20㎛ 두께의 Z-스택(stack)을 얻었다. 다이오드 405 nm, 멀티-아르곤 488 nm, HeNe 543 nm 및 HeNe 633 nm 레이저 라인을 사용하였으며, 서로다른 형광물질(fluorophore) 간의 간섭을 피하기 위하여 분리된 레이저 여기 (excitation) 시스템을 사용하여 연속적으로 이미지를 얻었다.

6. 정량화 및 통계 분석

빛, 콘트라스트 및 배율을 동일한 조건 하에서 비교 분석을 위하여 이미지를 만들어냈다. 혼합된 구체 모델의 혈관 생성 면적을 Image J software (http://rsbweb.nih.gov/ij/)로 자동으로 측정하였다. 생성된 관의 길이를 계산하기 위하여, 생성된 관을 따라 이미지에 라인을 그렸고, 라인의 길이를 상기 소프트웨어로 측정하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 표현하였다. 실험 그룹사이의 연속적인 변수의 차이는 GraphPad Prism 5 (GraphPad software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 Student's t-테스트로 분석하였다.

실시예 1. 중간엽 세포 공배양이 내피세포에 의한 혈관생성에 미치는 영향

HUVEC를 20% Methocult를 함유하는 EGM 배지에서 배양 후 코니칼-바텀 96-웰 플레이트에서 배양 후 콜라겐에서 연속 배양하여 HUVEC 구체를 제조하였을 경우, HUVEC 구체는 24 - 48시간부터 생기기 시작하였으나, 그 후에 3차원 콜라겐 겔에서 혈관 유사 구조물은 안정하게 형성되지는 못했다 (도 3의 a). 구체를 골수 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 사용하여 만들었을 경우에도 이들 또한 3-차원 겔에서 관강을 형성하지 않았다 (도 3의 b). 이와는 반대로, HUVEC 및 MSC를 공배양했을 때, 안정한 모세혈관 유사 구조물이 3차원 겔에서 5 내지 7일 이상 기간 동안 관찰되었다 (도 3의 c).

추가의 염색 과정 없이 실시간으로 혈관 생성을 가시화하기 위하여, YFP-발현 및 CFP-발현 렌티바이러스를 HUVEC 및 MSC에 각각 형질 전환시켰다. 내피 정단 및 지주 세포(stalk cell)가 성장으로 특징되는 혈관 성장(vascular growth)이 입증되었다(도 3의 d). 혈관 성장은 MSC와 공배양하는 경우 가능하였다 (도 3의 e 및 f). 일부 MSC는 EC 주위에 사상위족(filopodia)을 확장하였으며 주위세포(pericyte) 마커인 PDGF 리셉터 베타를 발현하였다 (도 3의 g-k). MSC 말초 혈액에서 얻은 메소혈관모세포(mesoangioblast) 또는 SMC로 대체될 수 있다 (Koyanagi M, et al. Circ Res. 2010;106:1290-302.) 이러한 결과는 생체외에서 혈관생성 모델의 확립에 중간엽계열의 세포와의 공배양이 필수적임을 나타낸다, 아울러 관 생성 후에 자살 유전자를 전달하여 간사이클로비르(ganciclovir)로 처리함으로써 MSC를 고갈시켰을 때, 관 구조물이 붕괴되는 것을 발견하였다 (결과 나타내지 않음).

실시예 2. 구체 세포를 이용한 2차원 인비트로 혈관생성

기존 3차원 메트릭스 혈관생성의 경우 추가로 면역형광 염색, 공초점 현미경 이미징 및 정량화를 수행하는 것이 어려웠다. 이의 해결을 위해 본 실험에서는 커버글라스-바텀 디쉬에서 배양된 SMC 단층상에서 표지되지 않은 SMC와 GFP-형질전환된 EC 구체를 공배양하였다. 그 결과 추가의 염색없이 신생 뮤린 망막에서 관찰되는 혈관 생성의 다단계 과정을 관찰하였다(도 4). 구체적으로 내피 세포는 구체로부터 생겨나서(도 4의 a-b) 내피 관이 생성되었다(도 4의 c). 많은 사상위족을 가진 EC (도 4의 d)인 정단세포를 앞쪽 끝에 두고, 혈관이 생성되게 하였고 그 후 지주세포가 뒤따랐다(도 4의 e). 처리되지 않은 EC와 비교하여 보면 외인성 VEGF 처리에 의해 EC에서 생체외 혈관 생성이 증가하였다(도 4의 c 및 f).

성숙되어 감에 따라 다수의 공포(vacuole)가 생겨났고 모세혈관 유사 관강이 VE-cadherin에 의해 서로서로 연결된 인접한 EC사이에 나타냈다(도 4의 g-i). 동적 리모델링이 관찰되었는데, 이에는 퇴행, 성장 및 새로 출현한 혈관생성을 포함한다(도 4의 j-k). 안정화된 관은 타입 IV 콜라겐으로 이루어진 기저 막에 의해 지지되었다(도 4의 l-m). 리모델링 과정에서 연결이 만들어지고 그 후 모세혈관의 네트워크가 생성되었다(도 4의 n).

실시예 3 인비트로 혈관 생성 모델의 용도: 글루코스가 혈관생성에 미치는 영향 분석

인간 혈관 생성의 다단계 과정에서 고 글루코스 농도의 영향을 평가하였다. 글루코스 농도를 변화시켜(5.6, 15.6, 25.6, 및 35.6 mM) 구체를 배양할 때, 정상 이상의 글루코스 농도에서는 모두 구체에서 나온 유주 관의 면적 및 총 튜브 길이가 감소하였다(도 5의 a-d, 6의 a -d). 연속적 실험에서는 고 글루코스 농도는 25.6mM로 고정시켰다. 정상 글루코스 농도일 때와 비교하여보면, 고 글루코스 농도에서 더 작은 지름을 가진 관와 더 많은 분지를 가진 유주 관이 더 생성되었다(도 5 a-c). 72시간동안 동일한 현미경 필드에서 이미 생성된 관의 리모델링 과정을 지속적으로 모니터하였더니, 25.6mM 만니톨에서의 내피 관이 지속적으로 성장하여 새로운 혈관을 생성하였고(도 5의 d, 화살표). 반면 25.6mM 글루코스에서는 더 가늘어지고, 퇴행하여 최종적으로는 연결이 끊어졌다(도 5의 d, 화살표 머리). 고 글루코스 상태 하의 내피 튜브에서, 정상 글루코스 상태 하의 대조군 샘플보다 새로운 사상위족이 더 많이 생성하였으며 사상위족은 대조군보다 더 많이 퇴행하였다는 것을 이미지 정량화를 통하여 증명하였다(도 6의 f). 이 모델에서 내피세포 및 평활근세포의 증가 또는 사멸은 10일째에 고 글루코스와 대조군 만니톨 조건 사이에 서로 유사하였다(도 5의 g-h).

이러한 결과는 본원에 따른 생체외 모델은 혈관생성 및 혈관 리모델링의 생리학적 병리학적 매카니즘을 연구하는데 유용한 도구가 될 수 있으며, 아울러 혈관생성과정의 기전 및/또는 이의 조절에 관여하는 물질의 스크리닝, 질환의 증상이 혈관생성에 미치는 영향 등의 연구에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 포함된다.

Claims (11)

1. a) 혈관내피세포 또는 혈관내피전구세포; 및 중간엽세포 또는 중간엽줄기세포를 제공하는 단계;
   b) 상기 혈관내피세포 또는 혈관내피전구세포 중 어느 하나와 상기 중간엽세포 또는 중간엽줄기세포 중 어느 하나를 3차원 공배양하여 구체를 형성하는 단계; 및
   c) 상기 구체를 단층의 중간엽세포에 배양하여 관강을 형성하는 단계를 포함하는 생체외 2차원 혈관 생성 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관내피세포 또는 혈관내피전구세포는 형광단백질을 발현하는 것인, 생체외 2차원 혈관 생성 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 공배양은 세포외기질을 추가로 포함하는 것인, 생체외 2차원 혈관 생성 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 세포외기질이 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리 젤, 자가조립 펩타이드 젤, 폴리에틸렌글리콜 젤 또는 알지네이트인, 생체외 2차원 혈관 생성 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 c)는 혈관생성인자의 존재 중에서 수행되는 것인, 생체외 2차원 혈관 생성 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관내피세포는 생체조직, 일차 세포 배양물, 세포주 또는 줄기세포 유래인 것인, 생체외 2차원 혈관 생성 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 중간엽세포는 중간엽줄기세포, 섬유모세포, 민무늬근육 또는 혈관평활근세포인, 생체외 2차원 혈관생성 방법.
   
8. 삭제
9. 하기의 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 혈관 생성 방법을 이용한 혈관생성을 조절하는 물질의 스크리닝 방법:
   a) 혈관내피세포 및 중간엽세포를 제공하는 단계;
   b) 상기 두 종류의 세포를 3차원 공배양 하여 구체를 형성하는 단계;
   c) 상기 구체를 단층의 중간엽세포에 배양하여 관강을 형성하는 단계;
   d) 상기 c) 단계에서 시험물질을 처리하는 단계; 및
   e) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 시험물질을 처리한 군에서 관강에 변화가 있는 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계.
   
10. 삭제
11. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 당뇨병성 혈관질환 예방 또는 치료용 약물 스크리닝에 사용되는 것인, 스크리닝 방법.

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