KR101536683B1 - Mass production method of brazzein using transformed yeast for high level secretory expression of brazzein - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 브라제인 고효율 분비발현용 형질전환 효모 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a transgenic yeast for expressing high-efficiency secretion of brassin and a method for mass-producing brassin using the same.
브라제인은 펜타딘과 같이 서아프리카의 Pentadiplandra brazzeana Baillon이라는 열매로부터 추출한 감미 단백질이다. 오래전부터 서아프리카 원주민들이 브라제인을 섭취해 왔기 때문에 인체에 무해함이 증명되어 식품 첨가물로도 안전하게 이용될 수 있다. Brazane , like Pentadine, is a member of the Pentadiplandra It is a sweet protein extracted from the fruit of brazzeana Baillon . Native Americans of West Africa have been eating Brazain for a long time, so they can be safely used as food additives because they are proved to be harmless to humans.
브라제인은 서아프리카의 식물에서 유래한 단백질로 원료의 공급 및 추출이 어려워 재조합 단백질로의 발현계 작성이 필수적이다. 현재까지 브라제인의 연구가 진행되면서 다양한 브라제인 발현계가 만들어지고 이용되었다.Brazenger is a protein derived from plants in West Africa. It is difficult to supply and extract the raw material, so it is essential to prepare an expression system for the recombinant protein. To date, various studies have been made and used as a result of research by Brazane.
재조합 단백질 생산 균주로는 대장균이 가장 널리 이용된다. 원핵생물인 대장균은 빠른 성장속도와 더불어 높은 수율을 얻을 수 있으며, 배양과 유전자의 조작이 용이하다는 장점을 가진다. 하지만 이황화결합을 가진 단백질과 당수식 과정이 요구되는 단백질의 경우에는 대장균에서의 발현이 적합하지 않다(Demain and Vaishnav, 2009).Escherichia coli is the most widely used recombinant protein production strain. Escherichia coli, which is a prokaryotic organism, has the advantages of high growth rate and high yield, easy cultivation and easy manipulation of genes. However, in the case of proteins with disulfide bonds and proteins requiring glycosylation, expression in E. coli is not suitable (Demain and Vaishnav, 2009).
최초로 브라제인을 재조합 단백질로 생산하고자 하는 연구는 대장균을 통하여 이루어졌다(Assadi-Porter et al., 2000). 유전자 조작의 용이함으로 인하여 대장균을 통한 재조합 브라제인의 연구는 변이체 작성을 통한 브라제인의 특성 연구로 이어졌다(Assadi-Porter et al., 2000, Jin et al., 2003, Lee et al., 2010, Do et al., 2011, Yoon et al., 2011, Lee et al., 2012). 대장균을 통한 재조합 브라제인의 생산계는 유전자 및 단백질 조작의 용이함으로 인하여 변이체 연구에는 편리하지만 수득량이 매우 적다는 단점이 있으며, 브라제인은 구조 내에 4개의 이황화결합을 가지고 있어서 대장균 내에서는 그 구조가 제대로 형성되지 않기 때문에 추가적인 구조형성 과정이 요구된다(Assadi-Porter et al., 2000). 이 뿐만 아니라 대장균 생산계를 통하여 발현된 재조합 단백질은 식품첨가물로의 승인을 받기 어렵다.The first study to produce brijane as a recombinant protein was through Escherichia coli (Assadi-Porter et al ., 2000). Due to the ease of gene manipulation, recombinant blazein research through E. coli led to the study of blazein's characterization through mutagenesis (Assadi-Porter et al ., 2000, Jin et al ., 2003, Lee et al., 2010, Do et al ., 2011, Yoon et al., 2011, Lee et al ., 2012). Recombinant blazein through E. coli The recombinant blazein production system has a disadvantage in that it is convenient for studying mutants due to easy manipulation of genes and proteins, but has a disadvantage in that the yield is very small. The blazein has four disulfide bonds in its structure, Are not properly formed, additional structural formation processes are required (Assadi-Porter et al ., 2000). In addition, recombinant proteins expressed through E. coli production systems are difficult to obtain as food additives.
이후 재조합 브라제인의 생산은 상업적으로도 응용이 가능하도록 하는 방향으로 주로 연구가 이루어졌다. 브라제인의 상업적인 응용에는 식품으로의 안정성이 중요한 요소이기 때문에 GRAS(Generally recognized as safe)인 균주가 이용된다. 현재에는 유산균(lactic acid bacteria) Lactococcus lactis (Berlec et al., 2006, Berlec et al., 2007. Berlec et al., 2008)와 Lactobacillus spp. (Lb . paracasei, Lb . plantarum, Lb . reuteri)를 이용하여 재조합 브라제인을 발현시키는 연구(Lee et al., 2012)와 효모 Pichia pastoris (Poirer et al., 2012)와 Kluyveromyces lactis를 재조합 브라제인의 발현계로 이용한 연구(Jo et al., 2013)가 진행되었다.The production of recombinant blazein has been studied mainly for commercial application. Generally recognized as safe (GRAS) strains are used because the stability to food is an important factor in the commercial application of Brazane. Currently, the lactic acid bacteria Lactococcus lactis (Berlec et al ., 2006, Berlec et al ., 2007. Berlec et al ., 2008) and Lactobacillus spp. Studies of using the (Lb. Paracasei, Lb. Plantarum , Lb. Reuteri) expressing recombinant Brassica agent (Lee et al ., 2012) and yeast Pichia pastoris (Poirer et al ., 2012) and Kluyveromyces lactis as a recombinant bradykinin expression system (Jo et al ., 2013) was conducted.
재조합 브라제인의 발현에 이용된 유산균인 L. lactis와 Lb. spp.는 모두 GRAS 균주로 식품에 이용이 가능하지만 현재 발현계 구축의 초기단계에 있거나(Lee et al., 2012) 그 발현량이 1.65 mg/L로 매우 적다(Berelc et al., 2008). 이는 상업적으로 이용하기 위하여 요구되는 요소인 하나인 수율 면에서 비효율적이라고 할 수 있다.Lactic acid bacteria L. lactis and Lb. spp. are all GRAS strains and can be used for food, but their expression level is very low at 1.65 mg / L (Lee et al ., 2012) or at the early stage of current expression system construction (Berelc et al ., 2008). This can be said to be inefficient in terms of yield, one of the factors required for commercial use.
반면 효모 P. pastoris와 K. lactis를 이용한 재조합 브라제인의 발현계는 각각 90 mg/L와 108 mg/L로 매우 많은 양의 재조합 브라제인을 생산하였으며, 현재까지 구축된 재조합 브라제인 발현계 중 가장 높은 수율을 나타내며 GRAS 균주를 이용하여 식품으로의 상용화에 가장 적합하다고 할 수 있다.On the other hand, recombinant blazein expressions of yeast P. pastoris and K. lactis produced very large amounts of recombinant blazane at 90 mg / L and 108 mg / L, respectively. It is the most suitable for commercial use as food using GRAS strain.
이처럼 다양한 브라제인 발현계의 연구는 현재 높아지는 대체감미료의 요구에 따라 상업적으로 응용가능한 방향으로 진행되고 있다.
Studies of such a variety of Brazin expression systems are now being made commercially applicable in response to the increasing demand for alternative sweeteners.
이에, 본 발명자들은 선행연구로 구축된 브라제인 효모 발현계의 개량을 통하여 브라제인의 수율을 높이고자 하였다. 먼저, pKLAC2 발현벡터 내의 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터를 야생형의 LAC4 프로모터로 복구하여 브라제인의 발현량을 증가시키고자 하였다. 또한, in vivo 상에서 단백질의 이황화결합의 형성과 이성질화에 관여하는 단백질인 PDI 및/또는 ERO의 과발현으로 브라제인의 올바른 구조형성을 유도하여 균체 밖으로 배출되는 재조합 브라제인의 양을 증가시키고자 하였다. 그 결과, 브라제인의 발현량의 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors intend to improve the yield of brassin by improving the brassin yeast expression system constructed by the previous study. First, the LAC4 - PB Ⅰ promoter in the pKLAC2 expression vector was restored to the wild type LAC4 promoter to increase the expression level of bradine . Also, in We attempted to increase the amount of recombinant blazein excreted outside the cells by inducing the correct formation of blazein by overexpression of PDI and / or ERO, proteins involved in the formation and isomerization of disulfide bonds of proteins in vivo . As a result, the present invention was completed by confirming an increase in the expression amount of bradine.
따라서, 본 발명은 브라제인 고효율 분비발현용 형질전환 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for mass production of brassin using Kluyveromyces lactis and a method for producing the same.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은As means for solving the above problems,
브라제인 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 및 클루이베로마이세스 락티스 유래의 단백질 이황화결합 이성화효소(protein disulfide isomerase, PDI) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터;로 동시에 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 제공한다.
A recombinant expression vector containing a bradine gene; And a recombinant expression vector comprising a protein disulfide isomerase (PDI) gene derived from Kluyveromyces lactis . The present invention also provides Kluyveromyces lactis transformed with the recombinant expression vector.
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또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은Further, as another means for solving the above problems,
상기 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 이용한 브라제인 대량 생산 방법을 제공한다.
And a method for mass production of brassin using the transformed Kluyveromyces lactis .
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본 발명은 상용화된 발현벡터인 pKLAC2의 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터 부위를 야생형의 LAC4 프로모터로 복원하여 브라제인의 발현량을 높이고자 하였으며, 이와 더불어 소포체에서 단백질의 구조 형성에 관여하는 단백질인 PDI와 ERO의 과발현을 이루어 브라제인의 올바른 구조 형성을 유도하여 체외배출량을 높이고자 하였다. 그 결과 LAC4 프로모터의 변화로 약 1.19배 발현량이 증가하였으며, PDI와 ERO 단백질의 과발현을 통해 1.46배 발현량이 증가하였다. LAC4 프로모터를 이용하며 PDI와 ERO가 함께 발현되는 균주의 경우, 최고 발현량이 기존 효모 발현 균주 대비 1.73배 증가한 결과를 나타냈다.The present invention aims to increase the expression level of bradylanin by restoring the LAC4 - PB Ⅰ promoter region of pKLAC2 , which is a commercialized expression vector, with the wild type LAC4 promoter. In addition, PDI and ERO Overexpression of bradykinin to induce the correct structure formation of bradine and to increase in vitro release. As a result, the expression level of the LAC4 promoter was increased by about 1.19 fold, and the expression level of PDI and ERO protein was increased by 1.46 fold. In the case of strain expressing PDI and ERO using LAC4 promoter, the highest expression level was 1.73 times higher than that of existing yeast expression strain.
이는 향후 미각 인식 메커니즘 연구에 이용 가능할 것이며, 추가적으로 식품첨가물로써 브라제인의 대량 생산에 본 발현계를 이용할 수 있어 그 효과가 매우 크다고 볼 수 있다.
This can be used to study the taste recognition mechanism in the future, and the effect of this expression system can be considered to be very high because the present expression system can be used for the mass production of bradine as a food additive.
도 1은 pKLAC2 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 des-pE1M-브라제인 및 브라제인 변이체의 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 브라제인 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 1개 이상의 발현 벡터를 상동 재조합에 의해 효모 균주 유전자에 도입(co-integration)한 시스템을 나타낸 것이다.
도 5는 공동 도입 시스템을 위한 모식도이다[(A) (pKLAC2-Gene A 및 pKLAC2-Gene B의 공동 도입. (B) 형질전환된 균주의 유전형 예 (Read et al., 2007)].
도 6은 다이제스티드 벡터(Digested vector) 및 증폭된 PDI 유전자와 LAC4 프로모터의 제한효소 처리 결과를 나타낸 것이다[레인 M: 분자량 마커(λ DNA / HindⅢ); 레인 1: HindⅢ and BamHⅠ에 의해 다이제스트된 pKLAC2 벡터; 레인 2: SnaBⅠ 및 XhoⅠ에 의해 다이제스트된 pKLAC2 벡터; 레인 3: HindⅢ 및 BamHⅠ에 의해 다이제스트된 PDI 유전자; 레인 4: SnaBⅠ 및 XhoⅠ에 의해 다이제스트된 LAC4 프로모터].
도 7은 효모 균주 K. lactis의 염색체에 브라제인 유전자의 삽입 여부 결과를 나타낸 것이다[레인 M: 분자량 마커 (1Kb plus ladder); 레인 1~8: 삽입된 브라제인 유전자 (인터그런트) 1~8].
도 8은 효모 균주 K. lactis의 염색체에 PDI 유전자의 삽입 여부 결과를 나타낸 것이다[레인 M: 분자량 마커 (λ DNA / HindⅢ); 레인 1~7: 삽입된 PDI 유전자 (인테그런트) 1~7.
도 9는 PDI 전사물 레벨 비교한 아가로즈 겔 전기영동 분석 결과이다[레인 M: 분자량 마커 (1kb ladder); 레인 1: PDI 유전자 도입 없이 GG799에 의해 전사된 mRNA 내 PDI; 레인 2: PDI 도입 유전자와 함께 GG799에 의해 전사된 mRNA 내 PDI].
도 10은 브라제인 발현 수준을 비교한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 결과이다[레인 M: 분자량 마커 (polypeptide marker); 레인 1: LAC4 - PB Ⅰ 프로모터에 의해 발현된 브라제인; 레인 2: LAC4 프로모터에 의해 발현된 브라제인].
도 11은 브라제인 발현 수준을 비교한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 결과이다[레인 M: 분자량 마커 (polypeptide marker); 레인 1: ER에서 단백질 접힘과 관련된 단백질의 과발현 없이 발현된 브라제인; 레인 2: PDI와 공동 발현된 브라제인; 레인 3: PDI 및 ERO와 공동 발현된 브라제인].
도 12는 브라제인 발현 수준을 비교한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 결과이다[레인 M: 분자량 마커 (polypeptide marker); 레인 1: ER에서 단백질 접힘과 관련된 단백질의 과발현 없이 LAC4 프로모터에 의해 발현된 브라제; 레인 2: 과발현 ERO와 함께 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터에 의해 과발현된 브라제인; 레인 3: PDI 없이 LAC4 프로모터에 의해 과발현된 브라제인; 레인 4: PDI 및 ERO와 함께 LAC4 프로모터에 의해 과발현된 브라제인].
도 13은 K. lactis. 내 브라제인을 비교한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영도 분석 결과이다[레인 M: 분자량 마커 (polypeptide marker); 레인 1: K. lactis 발현 브라제인 세포 용해물; 레인 2: PDI와 함께 K. lactis 공동 발현 브라제인 세포 용해물].
도 14는 K. lactis. 내에 브라제인이 다중 도입(multi-copy integration)된 정도를 실시간 PCR로 나타낸 결과이다Figure 1 shows the pKLAC2 expression vector.
Figure 2 shows the sequences of des- pE1M-brine and breeze variants.
Figure 3 shows a recombinant bradyine expression vector.
Figure 4 shows a system in which one or more expression vectors are co-integrated into a yeast strain gene by homologous recombination.
Figure 5 is a schematic diagram for a Co-introduction of the system [(A) (pKLAC2-Gene A and Gene B-co-introduction of pKLAC2. (B) transfected example genotype of the strain conversion (Read et al ., 2007).
FIG. 6 shows digested vector and restriction enzyme treatment of the amplified PDI gene and LAC4 promoter (lane M: molecular weight marker (? DNA / Hind III); Lane 1: pKLAC2 vector digested by Hind III and BamH I; Lane 2: SnaB Ⅰ and Xho Ⅰ pKLAC2 digest by the vector; Lane 3: PDI gene digested by Hind III and BamH I; Lane 4: LAC4 promoter digest by SnaB Ⅰ and Xho Ⅰ].
FIG. 7 shows the results of insertion of a bradine gene into the chromosome of the yeast strain K. lactis (Lane M: molecular weight marker (1 Kb plus ladder); Lanes 1-8: Inserted Brazenger genes (Intergent) 1-8].
Figure 8 shows the results of insertion of the PDI gene into the chromosome of the yeast strain K. lactis [Lane M: molecular weight marker (? DNA / Hind III);
Figure 9 is the result of agarose gel electrophoresis analysis comparing PDI transcript levels [Lane M: molecular weight marker (1 kb ladder); Lane 1: PDI in mRNA transcribed by GG799 without introducing PDI gene; Lane 2: PDI in mRNA transcribed by GG799 with the PDI transgene].
Figure 10 shows SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis comparing the levels of bradykinin expression [Lane M: polypeptide marker; Lane 1: bradane expressed by the LAC4 - PB I promoter; Lane 2: bradylanin expressed by the LAC4 promoter].
Figure 11 shows SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis comparing the levels of bradykinin expression [Lane M: polypeptide marker; Lane 1: bradine expressed without overexpression of proteins involved in protein folding in ER; Lane 2: bradine co-expressed with PDI; Lane 3: Brajane co-expressed with PDI and ERO].
Figure 12 shows SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis comparing bradykinin expression levels [Lane M: polypeptide marker; Lane 1: a brass expressed by the LAC4 promoter without overexpression of proteins involved in protein folding in the ER; Lane 2: blazane overexpressed by the LAC4 - PB I promoter with overexpression of ERO; Lane 3: LAC4 without PDI Blazane overexpressed by a promoter; Lane 4: With PDI and ERO LAC4 Brazier overexpressed by a promoter].
13 is K. lactis. SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis comparing the intramolecular bladder [lane M: polypeptide marker; Lane 1: K. lactis expressing brassin cell lysate; Lane 2: K. lactis co-expressing bradykinin cell lysate with PDI].
Fig. 14 is a photograph of K. lactis . And the degree of multi-copy integration of blazein in real-time PCR
본 발명은 브라제인 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 및 클루이베로마이세스 락티스 유래의 단백질 이황화결합 이성화효소(protein disulfide isomerase, PDI) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터;로 동시에 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant expression vector comprising a bradine gene; And a recombinant expression vector comprising a protein disulfide isomerase (PDI) gene derived from Kluyveromyces lactis . The present invention also relates to Kluyveromyces lactis transformed simultaneously.
효모의 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 신호서열의 일종으로[Dominic Esposito et al., Protein Expression and Purification, 40(2): 424-428, 2005, J.J. Clare et al., Gene. 105: 205-212, 1991], 단백질이 효모 내에서 합성되면 소포체로 이동하여 정확한 이황화 결합을 유도하고, 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며 올바른 접힘을 유도한다. 이때, 시그널 펩티다제(signal peptidase)에 의해 신호서열 일부가 잘려나 가게 되며, 이후 골지체로 이동하여 Kex 펩티다제(Kex protease)에 의해 나머지 신호 서열이 모두 제거되고, 천연의 단백질 형태로 배지로 방출되게 된다. 상기 신호서열의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 알파-메이팅 신호서열, 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열, KT 신호서열[Tokunaga et al., Yeast, 13: 699--706, 1997), Saccharomyces cerevisiae pre-SUC2 신호서열(Bergkamp et al., Curr Genet, 21:365-370] 등이 알려져 있다.The alpha-mating signal sequence of yeast is a type of signal sequence [Dominic Esposito et al ., Protein Expression and Purification, 40 (2): 424-428, 2005, JJ Clare et al., Gene. 105: 205-212, 1991). When proteins are synthesized in yeast, they migrate to the endoplasmic reticulum to induce correct disulfide bonds, inhibit the formation of insoluble aggregates of proteins and induce correct folding. At this time, the signal peptide is partially cleaved by the signal peptidase, and then the signal sequence is cleaved. Then, the signal sequence is transferred to the Golgi, and the remaining signal sequence is removed by Kex protease. . Examples of the signal sequence is a Saccharomyces three Levy MY process jiae (Saccharomyces cerevisiae alpha-mating signal sequence, a clue veromassis lactis alpha-mating signal sequence, a KT signal sequence [Tokunaga et al ., Yeast, 13: 699-706, 1997), Saccharomyces cerevisiae pre-SUC2 signal sequence (Bergkamp et al ., Curr Genet, 21: 365-370).
상기 브라제인 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열을 포함할 수 있으며, 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열은 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 알파-메이팅 서열은 본 발명의 브라제인 뉴클레오티드 서열의 5' 상단에 단백질로의 번역 시 동일한 프레임을 가지도록 연결된다.The recombinant expression vector containing the bradyine gene may contain the Kluyveromyces lactis alpha-mating signal sequence, and the Cluyveromyces lactis alpha-mating signal sequence may include But is not limited to, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The alpha-mating sequence is linked so as to have the same frame upon translation into the protein at the 5 'end of the bradykinin nucleotide sequence of the present invention.
상기 브라제인 유전자는 야생형 브라제인 유전자(서열번호 2) 또는 브라제인 변이체 유전자일 수 있다. 본 발명에 있어서, 브라제인 유전자는 브라제인 주타입, 부타입, 변이체 모두의 유전자를 모두 포함할 수 있다.The bradine gene may be a wild type bradine gene (SEQ ID NO: 2) or a bradine mutant gene. In the present invention, a brassin gene may include all genes of the brassin main type, subtype, and mutant.
또한, 상기 재조합 발현벡터에 작동 유전자를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the recombinant expression vector may further include an operable gene.
본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA를 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.In the present invention, the term "recombinant expression vector" refers to a vector capable of expressing a target protein or a target RNA in a host cell, and a gene construct comprising an essential regulatory element operably linked to the expression of the gene insert It says.
상기 '작동 유전자'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 작동 유전자로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 효모 LAC 프로모터, GAL 프로모터(Rosaura Rodicio et al.,Microbiology 152 (2006), 2635-2649), KlADH4 프로모터(Michele Saliola et al., Appl Environ Microbiol. 1999 January; 65(1): 53-60), 말타아제/말토오스 퍼메아제 바이-디렉션널 프로모터(미국 특허 제6,596,513호), PGK1 프로모터(V. Melvydas et al., BIOLOGIJA, 4:1-4, 2006) 등이 있다. 이외에도 미국 특허 제227,326호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 프로모터는 LAC4 프로모터를 사용할 수 있다.The term 'operable gene' refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleic acid sequence operatively linked to a particular host cell. The term 'operably linked' means that one nucleic acid segment is linked to another nucleic acid segment And its function or expression is affected by other nucleic acid fragments. In addition, it may further comprise any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation. Examples of the operable gene include a constitutive promoter that induces expression of a target gene at all times or an inducible promoter that induces expression of a target gene at a specific position and timing. LAC Promoter, GAL promoter (Rosaura Rodicio et al ., Microbiology 152 (2006), 2635-2649), the KlADH4 promoter (Michele Saliola et al ., Appl Environ Microbiol. 1999 January; 65 (1): 53-60), the maltase / maltose permethase by-direction promoter (US Patent No. 6,596,513), the PGK1 promoter (V. Melvydas et al ., BIOLOGIJA, 4: 1-4, 2006). In addition, all of the promoters disclosed in U.S. Patent No. 227,326 and the like can be used. Preferably, the promoter may be a LAC4 promoter.
상기 브라제인 발현을 위한 재조합 발현벡터로 pKLAC2-브라제인, pKLAC2-브라제인::LAC4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 클루이베로마이세스 락티스 유래의 PDI 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 pKLAC2-PDI일 수 있다. The recombinant expression vector for expression of the bradykin may be, but is not limited to, pKLAC2-brane , pKLAC2-brane :: LAC4 . Also, the recombinant expression vector containing the PDI gene derived from the above-mentioned Kluyveromyces lactis may be pKLAC2-PDI.
상기 효모(클루이베로마이세스 락티스)는 상기 재조합 발현벡터로 통상의 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 이때 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 초산화 리튬(LiCH3COO)법, 염화 리튬(LiCl)법, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 운반 DNA 융합법(Carrier-DNA mediated fusion) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.The yeast (Kluyveromyces lactis) is transformed into the recombinant expression vector according to a conventional transformation method, wherein the transformation includes any method of introducing a nucleic acid into a host cell, As well as selecting standard techniques suitable for the host cell. These methods include electroporation, LiCH 3 COO, LiCl, PEG-mediated fusion, Carrier-DNA mediated fusion), and the like.
한편, 본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 브라제인 발현을 위한 숙주로 하고, 브라제인 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 및 클루이베로마이세스 락티스 유래의 단백질 이황화결합 이성화효소(protein disulfide isomerase, PDI) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터;로 동시에 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 배양하는 단계를 포함하는 브라제인의 대량 생산 방법을 포함한다.On the other hand, the present invention relates to a recombinant expression vector comprising a Kluyveromyces lactis as a host for expression of bradine , and a bradine gene; And a recombinant expression vector comprising a protein disulfide isomerase (PDI) gene derived from Kluyveromyces lactis , which comprises the step of culturing Kluyveromyces lactis Including the mass production method of Brazan.
이러한 본원발명에서의 브라제인의 발현은 젖당(lactose), 갈락토오스 (galactose), 글로코오스(glucose), 녹말(starch)과 같은 통상적인 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 화합물에 의해 이루어진다. 발현된 알파-메이팅(α-Mating) 신호서열을 포함하는 브라제인은 신호서열에 의해 효모의 소포체로 이동하게 되고, 효모의 시그널 펩티다제(signal peptidase)와 Kex 펩티다제(Kex peptidase)에 의해 신호서열이 제거되어 브라제인이 합성되게 된다. 따라서, 본 발명의 브라제인 발현 재조합 발현벡터를 포함하도록 형질전환된 효모는 브라제인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양될 수 있으며, 이는 질소 공급원으로 효모 추출물을 0.5 내지 5%, 펩톤을 0.5 내지 5%로 단독 또는 혼합하여 사용하고, 탄소 공급원 및 발현 유도제로 갈락토오스 1 내지 4%, 글루코오스 1 내지 4%, 젖당 1 내지 4% 및 전분 1 내지 4%로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 특히, 효모 추출물 0.5 내지 5%, 펩톤 0.5 내지 5% 및 갈락토오스 1 내지 4%를 포함하는 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다.The expression of the bradyin in the present invention is made by a compound that promotes the expression of a conventional inducible promoter such as lactose, galactose, glucose, and starch. The blazein, which contains the expressed alpha-mating signal sequence, is transferred to the yeast ER by the signal sequence, and the signal peptidase and Kex peptidase of yeast The signal sequence is removed and the blazein is synthesized. Thus, the yeast transformed to include the brassin-expressing recombinant expression vector of the present invention can be cultured under appropriate culture conditions and conditions to express the brassin-encoding polynucleotide, which is obtained by adding 0.5 to 5% yeast extract as a nitrogen source, , Peptone in an amount of 0.5 to 5%, and a carbon source and an inducing agent are selected from the group consisting of 1 to 4% of galactose, 1 to 4% of glucose, 1 to 4% of lactose and 1 to 4% of starch Or more can be used. In particular, it is more preferable to culture in a medium containing 0.5 to 5% of yeast extract, 0.5 to 5% of peptone and 1 to 4% of galactose.
ERO 유전자와 PDI 유전자는 원래 효모의 염색체 내에 존재하고 있다. 본 발명에서는 이 두 효소를 과발현시키기 위하여 PDI의 경우에는 발현벡터를 이용하여 PDI 유전자를 더 삽입함으로써 과발현하고, ERO의 경우는 DTT를 첨가하여 원래 염색체 내에 있는 ERO의 전사량을 높여 과발현한다. The ERO gene and the PDI gene are originally present in the chromosome of the yeast. In the present invention, in order to overexpress these two enzymes, PDI is overexpressed by further insertion of PDI gene using an expression vector, and in the case of ERO, DTT is added to overexpress ERO in the original chromosome.
PDI가 ER에서 브라제인의 이황화결합을 형성할 때, ERO(Endoplasmic reticulum oxidoreductin)가 함께 작용한다. ERO는 PDI를 산화시켜 브라제인의 정확한 폴딩(folding)을 이루어 체외배출량을 증가시킨다. 따라서 PDI만의 과발현으로 폴딩의 정도에 영향을 보는 것이 타당하지 않아 ERO의 과발현도 동반하여 발현양을 비교하는 것이 바람직하다. When PDI forms a disulfide bond of a bradine in the ER, an endoplasmic reticulum oxidoreductin (ERO) acts together. The ERO oxidizes the PDI to cause an accurate folding of the bradine to increase in vitro emissions. Therefore, it is not appropriate to influence the degree of folding due to overexpression of PDI alone. Therefore, it is desirable to compare the expression level with the overexpression of ERO.
따라서, 상기 배양 시 ERO의 mRNA전사를 높여 ERO의 발현양을 증가시키는 이유로 배지에 DTT를 첨가하는 것이 보다 바람직하다.Therefore, it is more preferable to add DTT to the medium in order to increase the expression level of ERO by raising the mRNA transcription of ERO in the above culture.
즉, 본 발명은 PDI와 ERO을 과발현시켜 고효율의 브라제인을 발현시키는 방법을 포함할 수 있다.
That is, the present invention can include a method of overexpressing PDI and ERO to express highly efficient bradylanes.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following examples.
참조예Reference Example : 발현벡터 및 균주: Expression vector and strain
1) 효모의 1) of yeast 체외배출계를In vitro release system 이용하기 위한 발현벡터 Expression vector for use
효모의 단백질 체외배출계를 이용하기 위하여 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 단백질 체외배출 신호 서열(signal sequence)인 알파-메이팅 팩터(α-mating factor)의 신호 서열로부터 Kex cleavage site를 포함한 발현벡터인 pKLAC2를 이용하였으며 New England Biolabs(England)에서 구입하여 이용하였다. 발현벡터 내의 LAC4-PBⅠ 프로모터에 의해 전사조절이 이루어지며, amdS 유전자에 의해 발현되는 아세타미다아제(acetamidase)로 아세타마이드(acetamide)가 포함된 고체 배지에서 형질전환체의 선별이 가능하다(van Ooyen et al., 2005, Read et al., 2007)In order to utilize the protein in-vitro system of yeast, the Kex cleavage site was obtained from the signal sequence of the alpha-mating factor, which is the protein in vivo excretory signal sequence of Kluyveromyces lactis The expression vector pKLAC2 was used and purchased from New England Biolabs (England). Transcription is regulated by the LAC4-PBI promoter in the expression vector, and transfectants can be screened in a solid medium containing acetamide as the acetamidase expressed by the amdS gene ( van Ooyen et al ., 2005, Read et al ., 2007)
2) 2) 브라제인Brazane 발현을 위한 효모 균주 Yeast strains for expression
브라제인 유전자를 삽입하여 재조합 브라제인을 얻기 위해 이용한 효모 균주는 Kluyveomyces lactis GG799이며, New England Biolabs (England)로부터 구입하였다.The yeast strain used to obtain the recombinant blazein by insertion of the brassin gene was Kluyveomyces lactis GG799, purchased from New England Biolabs (England).
3) 재조합 플라스미드 작성을 위한 대장균 균주3) E. coli strains for preparing recombinant plasmids
재조합 브라제인이 삽입된 벡터의 작성은 E. coli DH5α에서 이루어졌으며, Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)와 Promega Corporation (Madison, WI, USA)으로부터 구입하였다.
Recombinant blazein inserted vectors were made in E. coli DH5α and purchased from Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) and Promega Corporation (Madison, Wis., USA).
[[ 실시예Example ]]
I. 실험 방법I. Experimental Method
1. One. 효모에서의Yeast 브라제인Brazane 발현을 위한 재조합 플라스미드 제작 Production of recombinant plasmids for expression
재조합 브라제인의 대량발현을 위하여 산업적으로 많이 이용되고 있는 효모 균주인 Kluyveromyces lactis를 브라제인을 생산하는 균주로 사용하였다. 이는 GRAS(Generally recognized as safe)로 규정되어 있어 향후 식품첨가물로서의 브라제인 생산에 이용될 수 있다는 장점을 지닌다.For the mass expression of recombinant blazein , Kluyveromyces , a widely used yeast strain, lactis was used as strain producing brijane . It is defined as GRAS (Generally recognized as safe) and has the advantage that it can be used for the production of brassin as a food additive in the future.
발현량 비교에 이용한 브라제인은 본 연구실에서 야생형 브라제인에 다중 변이를 적용하여 개발한 변이체로 야생형 브라제인 대비 약 2,000 배, 설탕 대비 약 285만 배 강한 단맛을 나타내는 K5R/H31R/E36D/E41K 4차변이체이다. 이를 K. lactis 내에서 발현시키기 위하여 Pentadiplandra brazzeana Baillon의 브라제인 DNA 서열을 기반으로 아미노산 서열에는 변화를 주지 않는 범위 내에서 K. lactis에 적합한 codon usage를 고려하여 디자인하고 DNA를 합성하여 이용하였다.Brajane, which was used for comparison of expression levels, was developed by applying multiple mutations to wild type bradine in our laboratory. It is K5R / H31R / E36D / E41K 4 which shows about 2,000 times higher than wild type bradine and about 2.85 million times stronger than sugar Car variant. In order to express this in K. lactis , Pentadiplandra Based on the brazzein DNA sequence of brazzeana Baillon , we designed and designed the codon usage suitable for K. lactis within the range that does not change the amino acid sequence.
균체 밖으로 재조합 브라제인이 분비되도록 하기 위하여, pKLAC2 벡터 내에 존재하는 알파-메이팅(α-mating) 신호서열과 신호서열을 절단하는 Kex cleavage site에 해당하는 유전자 서열을 이용하였으며 Kex cleavage site 이후에 합성한 브라제인의 유전자 서열을 삽입하여 올바르게 브라제인이 세포 밖으로 배출될 수 있도록 플라스미드를 설계하였다.In order to secrete recombinant bradylane out of the cells, the α-mating signal sequence in the pKLAC2 vector and the gene sequence corresponding to the Kex cleavage site, which cleaves the signal sequence, were used and synthesized after the Kex cleavage site The plasmid was designed so that the brassin gene sequence could be inserted and the brassin can be properly exported out of the cell.
1) One) 브라제인의Brazane's 과발현을 위한 재조합 플라스미드 제작 Production of recombinant plasmid for overexpression
LAC4 프로모터의 서열은 K. lactis 내의 LAC4 프로모터를 PCR로 증폭시켜 얻었으며, 그 후 양 말단과 pKLAC2[New England Biolab사(England)]를 제한효소로 처리한 후 라이게이션하여 플라스미드로 제작하였다. LAC4 프로모터는 제한효소 SnaBⅠ과 XhoⅠ로 절단하여 pKLAC2 벡터에 삽입하여 pKLAC2::LAC4를 Construction하였다[도 6 참조]. 이를 보관하여 pKLAC2-브라제인::LAC4 construction에 이용하였다. Construction된 벡터에 브라제인 유전자를 삽입하기 위해 XhoⅠ와 BamHⅠ로 절단하여 pKLAC2와 pKLAC2::LAC4에 삽입하였다.Sequence of the LAC4 promoter K. was amplified by the LAC4 promoter by PCR scored in lactis, were then made with both ends of the plasmid and ligated and then treated with pKLAC2 [New England Biolab Co. (England)] with a restriction enzyme. LAC4 promoter by cutting the vector with a restriction enzyme into the pKLAC2 SnaB Ⅰ and Xho Ⅰ was Construction of LAC4 pKLAC2 :: [see Figure 6]. This was retained and used in the construction of pKLAC2-brane :: LAC4 . To insert the blazein gene into the constructed vector, Xho I and BamH I were cut and inserted into pKLAC2 and pKLAC2 :: LAC4 .
2) 2) 브라제인의Brazane's 올바른 구조 형성을 위한 재조합 플라스미드 제작 Production of recombinant plasmid for proper structure formation
효모의 단백질 분비 발현계에서는 소포체 내에서 단백질의 구조가 형성된다. 이때 관여하는 단백질은 PDI(Protein disulfide isomerase)와 ERO(Endoplasmic reticulum oxidtion)가 있으며, PDI와 ERO의 발현량 조절로 단백질의 체외배출량이 증가할 수 있다(Lodi et al., 2005). 이에 PDI 유전자를 발현벡터 pKLAC2에 삽입하여 플라스미드로 제작하여 효모 발현균주로의 형질전환에 이용하였다. PDI 유전자는 K. lactis 내의 PDI 유전자를 PCR로 증폭시켜 얻었다. PDI 유전자 내에 Hind Ⅲ 사이트가 2개 존재하여 먼저 Sal Ⅰ로 절단 후 gel extraction하여 Hind Ⅲ와 BamH Ⅰ로 각각 절단[도 6 참조], 최종적으로 벡터와 PDI(Hind Ⅲ & Sal Ⅰ), PDI(Sal Ⅰ & BamH Ⅰ) 3개의 fragment를 동시에 라이게이션하여 pKLAC2-PDI 플라스미드를 제작하였다[도 3 참조]Protein secretion expression system of yeast forms a protein structure in the endoplasmic reticulum. Proteins involved in this process are PDI (protein disulfide isomerase) and ERO (endoplasmic reticulum oxidation), and the expression of PDI and ERO can be regulated to increase in vitro protein excretion (Lodi et al ., 2005). The PDI gene was inserted into the expression vector pKLAC2 and used as a plasmid for transformation into a yeast expression strain. The PDI gene was obtained by PCR amplification of the PDI gene in K. lactis . After cutting with Sal Ⅰ First, Hind Ⅲ site there are two in the PDI gene gel extraction and each cut into a Hind Ⅲ and BamH Ⅰ [see Figure 6], and finally Vector and PDI (Hind Ⅲ & Sal Ⅰ), PDI (Sal by the ⅰ & BamH ⅰ) of three fragment ligation was produced at the same time the pKLAC2-PDI plasmid [see Figure 3]
2. 2. 브라제인Brazane 효모 leaven 발현균주Expression strain 작성 write
브라제인의 효모 발현계 개량을 위하여 pKLAC2-브라제인, pKLAC2-브라제인::LAC4, pKLAC2-PDI 플라스미드를 각각 제작하였으며, 발현량 비교를 위하여 브라제인을 삽입한 균주, 브라제인과 LAC4를 삽입한 균주, 브라제인과 PDI를 삽입한 균주, pKLAC2-브라제인::LAC4와 pKLAC2-PDI 플라스미드를 동시에 형질전환하여 제작된 브라제인과 LAC4 , PDI를 삽입한 균주, 총 4가지의 형질전환된 브라제인 효모 발현균주를 제작하였다.PKLAC2- brazene , pKLAC2- brazene :: LAC4 , and pKLAC2-PDI plasmids were prepared for the improvement of the yeast expression system of Brazane . For the comparison of the expression levels, brazan-inserted strain, brazene and LAC4 were inserted Strain, a strain in which a blazein and a PDI were inserted, a blazein prepared by simultaneously transforming plasmids pKLAC2- blaze :: LAC4 and pKLAC2-PDI , a strain in which LAC4 and PDI were inserted, and a total of four transformed blazein Yeast expressing strains were prepared.
1) 효모 1) Yeast 발현균주Expression strain 내 of mine gDNAgDNA 로의 재조합 Recombination with DNADNA 삽입 insertion
효모 균주로의 재조합 유전자의 삽입은 homologue region에서의 재조합의 원리를 이용하며, 이를 위해 발현벡터에는 LAC4 프로모터의 5' 서열과 3' 서열이 양 말단에 존재하도록 Sac Ⅱ 제한효소로 절단하여 형질전환을 진행하였다(Van Ooyen et al., 2005)[도 4 참조].The insertion of the recombinant gene into the yeast strain utilizes the principle of recombination in the homologue region, in which the 5 ' and 3 ' sequences of the LAC4 promoter are contained in the expression vector Was cut with restriction enzymes Sac Ⅱ to be present at the terminal was carried out the transformation (Van Ooyen et al., 2005 ) [ Reference 4].
pKLAC2-브라제인, pKLAC2-브라제인::LAC4, pKLAC2-PDI 재조합 유전자를 Sac Ⅱ로 절단하여 선형화하여 고효율 형질전환법을 사용하여 클루이베로마이세스 락티스의 GG799 세포의 gDNA에 삽입하였다[도 5 참조]. The pKLAC2- brassin , pKLAC2- Brazene :: LAC4 , and pKLAC2-PDI recombinants were digested with Sac II and linearized and inserted into gDNA of GG799 cells of C. glutamicum using high-efficiency transformation method Reference].
형질전환은 다음과 같은 방법을 사용하였다.The following methods were used for transformation.
50 mL의 YPD 배지를 예열해 놓은 배양 플라스크에 넣고 미리 배양해 놓은 2.5×10 개의 GG799 세포를 접종하고 4시간 정도 배양하여 세포의 적정량이 최소 2×107개 이상이 되도록 하였다. 배양이 끝나면 배양액을 3000×g로 5분 동안 원심분리하여 GG799 세포를 집균하였다. 50 mL of YPD medium was placed in a pre-incubated culture flask and pre-cultured 2.5 x 10 GG799 cells were inoculated and cultured for about 4 hours to obtain a cell volume of at least 2 x 10 7 cells / well. When the culture was completed, the culture was centrifuged at 3000 × g for 5 minutes to collect GG799 cells.
상층액을 버리고 1 mL의 TE 버퍼로 균질화시키고, 이것을 마이크로 튜브에 옮기고 5000×g로 3분 동안 원심분리한 뒤, 상층액은 버리고 최종 부피가 1 mL가 되도록 형질전환용 혼합액을 넣고 혼합하여 다시 균질화시켰다. 이 같은 과정을 3번 반복한다.Discard the supernatant and homogenize it with 1 mL of TE buffer. Transfer it to a microtube. Centrifuge at 5000 × g for 3 minutes. Discard the supernatant and discard the supernatant. Add the transformation mixture to a final volume of 1 mL. Homogenized. Repeat this process three times.
5000×g로 3분 동안 원심분리한 뒤, 각각의 형질전환 튜브에 형질전환용 혼합액을 100 ㎕씩 넣고 혼합하여 세포를 다시 균질화시켰다. 30분간, 30℃에서 배양한 후, 42 ℃의 온욕조에서 15분 동안 열처리를 하고 나서 Ice에 1분 동안 식힌 후, 이 튜브를 3000rpm, 1분 동안 원심분리하여 형질전환용 혼합액을 제거하고 1 mL의 TE 버퍼를 넣고 집균체를 균질화하였다. 균질화한 용액을 5 mM의 아세트아미드를 함유하고 있는 고체 YCB 배지 위에 도포하였다. 96시간 가량 지나면 재조합 유전자가 성공적으로 삽입되어 아세트아미다아제 부분을 가지고 있는 콜로니가 자라났다. 이 콜로니만을 브라제인의 발현에 이용하였다. 모든 실험 과정은 불 주위가 무균 상태라는 가정 아래 Clean bench에서 진행하였다.After centrifugation at 5000 × g for 3 minutes, 100 μl of the transfusion mixture was added to each transformant tube, and the cells were homogenized again by mixing. After incubation for 30 minutes at 30 ° C, the mixture was heat-treated in a 42 ° C bath for 15 minutes, then cooled in ice for 1 minute, centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to remove the transformation mixture, mL TE buffer was added to homogenize the host cells. The homogenized solution was applied onto solid YCB medium containing 5 mM acetamide. After about 96 hours, the recombinant gene was successfully inserted and colonies with an acetamidase moiety grew. Only this colony was used for the expression of bradyin. All experiments were carried out on a clean bench under the assumption that the flame was aseptic.
2) 2) 브라제인Brazane 발현량 비교를 위한 효모 Yeast for comparison of expression level 발현균주Expression strain 선별 Selection
재조합 유전자를 homologous integration을 이용하여 도입할 경우, 다중 도입(multi-integration)과 동시 도입(co-integration)이 가능하다. 이 때문에 브라제인의 발현량 및 체외배출량을 비교하기 위해서는 발현균주 내로 삽입된 브라제인 유전자의 복제 수가 동일한 효모 발현균주를 택하여 실험을 진행하여야 한다. 브라제인 유전자 복제 수가 동일한 발현균주를 찾기 위해 형질전환체의 gDNA를 추출하여 실시간-PCR을 진행하였다.
When introducing recombinant genes using homologous integration, multi-integration and co-integration are possible. For this reason, in order to compare the amount of expression of bradylanin and the amount of excreted in vitro, the experiment should be conducted by selecting a yeast-expressing strain having the same number of copies of the bradine gene inserted into the expression bacterium. The gDNA of the transformant was extracted and subjected to real-time PCR in order to find an expression strain having the same number of bradine gene copies.
3. 재조합 3. Recombination 브라제인Brazane 발현량 비교 Comparison of expression level
개량된 효모 발현계의 브라제인 발현량을 비교하여 가장 높은 수율의 브라제인 발현계를 확립하고자 한다. 야생형의 LAC4 프로모터로 복구하여 브라제인을 과발현시킨 발현 균주와 PDI를 도입하여 브라제인의 올바른 구조형성을 유도한 발현균주를 각각 비교한 후, 둘 모두를 적용시킨 발현 균주 또한 발현량을 비교하였다.We attempted to establish the highest yield of brassin expression system by comparing the expression level of brassin in the improved yeast expression system. Expression of bacillus overexpression and restoration of expression of blazane by introducing PDI into bacillus were compared with wild type LAC4 promoter, and expression levels of both expression strains were also compared.
1) One) 브라제인Brazane 과발현 발현 균주 An overexpressing expression strain
LAC4 - PB Ⅰ 프로모터로 브라제인이 발현 유도되는 발현 균주와 야생형의 LAC4 프로모터로 브라제인이 발현 유도되는 발현 균주에서의 브라제인 발현을 위한 배양은 동일하게 진행하였다. 30 ℃에서 200 RPM으로 YPD 배지에서 16 시간 전배양하여 O.D.600 =1.2에 도달한 전배양액을 YPGal (pH 5.0) 배지의 최종 부피의 2%가 되도록 전 배양액을 접종하였으며, 접종 후 96 시간 배양하여 브라제인의 발현을 유도하였다. 이후 배양액을 7,000 RPM, 20 분, 4 ℃ 조건으로 원심분리한 후 균체는 버리고 상층액에서 브라제인의 발현량을 SDS-PAGE를 통하여 비교하였다. Cultures for expression of blazein were expressed in the same manner as for the expression of blazein by the LAC4 - PB I promoter and the expression of blazein by the wild - type LAC4 promoter. Were inoculated with the pre-culture a pre-culture has reached a OD 600 = 1.2 for 16 hours before the culture in YPD medium at 30 ℃ to 200 RPM so that the 2% of the final volume of YPGal (pH 5.0) medium, the 96 hour incubation after inoculation Expression of bradine was induced. Then, the culture was centrifuged at 7,000 rpm, 20 minutes, and 4 ° C, and the cells were discarded and the amount of bradine expressed in the supernatant was determined by SDS-PAGE.
2) 2) 브라제인Brazane 구조 형성 발현 균주 Expression-forming strain
PDI의 과발현으로 브라제인의 올바른 구조 형성을 유도한 발현 균주의 브라제인 발현을 위한 배양도 동일하게 진행하였다. 30 ℃에서 200 RPM으로 YPD 배지에서 16 시간 전배양하여 O.D.600 =1.2 에 도달한 전배양액을 YPGal (pH 5.0) 배지의 최종 부피의 2%가 되도록 전 배양액을 접종하였으며, 접종 후 96 시간 배양하여 브라제인의 발현을 유도하였다. 이후 배양액을 7,000 RPM, 20 분, 4 ℃ 조건으로 원심분리한 후 상층액에서 브라제인의 발현량을 SDS-PAGE를 통하여 비교하였다. 원심분리한 균체는 파쇄하여 균체 내에 잔존하는 재조합 브라제인의 양을 비교하였다.The overexpression of PDI also led to the same culture for the expression of bradyin in the expression strain that induced the correct formation of the bradine. Were inoculated with the pre-culture a pre-culture has reached a OD 600 = 1.2 for 16 hours before the culture in YPD medium at 30 ℃ to 200 RPM so that the 2% of the final volume of YPGal (pH 5.0) medium, the 96 hour incubation after inoculation Expression of bradine was induced. After the culture was centrifuged at 7,000 rpm, 20 min, and 4 ° C, the expression level of bradine in the supernatant was compared by SDS-PAGE. The centrifuged cells were disrupted to compare the amount of recombinant blazein remaining in the cells.
3) 3) 브라제인Brazane 과발현 및 구조 형성 발현 균주 Overexpression and structure-forming expression strain
야생형의 LAC4 프로모터를 이용하며 PDI가 과발현되는 발현 균주의 브라제인 발현을 위한 배양도 동일하게 진행하였다. 30 ℃에서 200 RPM으로 YPD 배지에서 16 시간 전배양하여 O.D.600 =1.2에 도달한 전배양액을 YPGal (pH 5.0) 배지의 최종 부피의 2%가 되도록 전 배양액을 접종하였으며, 접종 후 96 시간 배양하여 브라제인의 발현을 유도하였다. 이후 배양액을 7,000 RPM, 20 분, 4 ℃ 조건으로 원심분리한 후 균체는 버리고 상층액에서 브라제인의 발현량을 SDS-PAGE를 통하여 비교하였다.
Cultivation for the expression of bradine of the expression strain in which PDI was overexpressed using the wild type LAC4 promoter proceeded in the same manner. Were inoculated with the pre-culture a pre-culture has reached a OD 600 = 1.2 for 16 hours before the culture in YPD medium at 30 ℃ to 200 RPM so that the 2% of the final volume of YPGal (pH 5.0) medium, the 96 hour incubation after inoculation Expression of bradine was induced. Then, the culture was centrifuged at 7,000 rpm, 20 minutes, and 4 ° C, and the cells were discarded and the amount of bradine expressed in the supernatant was determined by SDS-PAGE.
4. 재조합 4. Recombination 브라제인의Brazane's 정제 refine
발현된 브라제인의 정확한 수득량을 구하고, 이후 실험과정에 이용하기 위하여 순수한 브라제인을 얻고자 정제과정을 진행하였다.The exact yield of the expressed bradylane was determined, and the purification process was performed to obtain a pure bradyane for use in the subsequent experimental procedure.
1) 재조합 1) Recombination 브라제인의Brazane's 정제 refine
브라제인의 대량 발현을 유도한 pKLAC2-브라제인/GG799 배양액을 7,000 rpm, 4℃, 20 분간 원심분리하여 균체와 상층액를 분리하였다 목적 단백질인 브라제인은 균 밖으로 배출되므로 균체는 버리고 상층액을 분리하여 취하였다. 분리한 상층액을 아세트산으로 pH 4.0으로 pH 값을 조절한 뒤 카르복시메틸셀룰로오스 양이온 교환수지 컬럼을 통해 정제하였다. 100 mL 용량의 CM 컬럼을 이용하였으며 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.0)으로 균일화시킨 후 정제에 이용하였다. pH 값을 조절한 상층액을 1 mL/min의 속도로 컬럼에 통과시켜 단백질을 흡착시켰다. 이 후 제대로 흡착되지 않은 단백질을 제거하기 위하여 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.0)으로 세척하였다. 100 mM의 NaCl이 포함된 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.0)을 이용하여 불필요한 단백질들을 제거하였으며 그 용액의 O.D.280 값을 측정하여 브라제인 외의 단백질이 제거된 것을 확인하였다. 브라제인의 용출을 위하여 400 mM NaCl이 포함된 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.0)을 1 mL/min의 속도로 용출시켜 1 mL 간격으로 분획을 얻었다. 각 분획들의 O.D.280 측정과 SDS-PAGE를 통하여 브라제인이 용출된 분획만을 모아 동결 건조하였다.The cells were separated from the supernatant by centrifugation at 7,000 rpm at 4 ° C for 20 min. The blazein, which is the target protein, is released outside the bacteria, so the cells are discarded and the supernatant is separated Respectively. The separated supernatant was adjusted to pH 4.0 with acetic acid and then purified through a carboxymethylcellulose cation exchange resin column. A 100-mL CM column was used and homogenized with 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) and used for purification. The pH of the supernatant was adjusted at a rate of 1 mL / min through a column to adsorb the protein. Afterwards, it was washed with 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) to remove proteins that were not adsorbed properly. Unnecessary proteins were removed using a 50 mM sodium acetate buffer solution (pH 4.0) containing 100 mM NaCl. OD 280 value of the solution was measured to confirm that proteins other than the brassin were removed. For elution of the brassin, 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) containing 400 mM NaCl was eluted at a rate of 1 mL / min to obtain fractions at 1 mL intervals. Each fraction was subjected to OD 280 measurement and SDS-PAGE to collect only the fractions eluted with the brassin and lyophilized.
2) 정제된 2) refined 브라제인의Brazane's 확인 및 정량 Identification and Quantification
정제된 단백질의 순수도는 SDS-PAGE와 HPLC를 통해 확인하였으며 단백질 정량은 Scope et al. (1974)의 방법을 이용하였다. 브라제인은 트립토판(tryptophane)이 포함되지 않은 단백질이므로 단백질의 농도는 UV/VIS Spectrophotometer를 이용하여 205 nm와 280 nm에서의 O.D.를 측정하여 계산하였다. 브라제인의 흡광계수(ε205)는 205 nm와 280 nm에서 용액의 흡광도를 측정하여 다음 수학식 1에 따라 계산하였으며 이를 기반으로 브라제인의 농도를 결정하였다.Purity of the purified protein was confirmed by SDS-PAGE and HPLC, and protein quantification was performed using Scope et al . (1974) was used. Since bradylane is a protein not containing tryptophane, the protein concentration was calculated by measuring the OD at 205 nm and 280 nm using a UV / VIS spectrophotometer. The extinction coefficient (? 205 ) of blazane was determined by measuring the absorbance of the solution at 205 nm and 280 nm according to the following equation (1), and the concentration of blazane was determined based on this.
[수학식 1][Equation 1]
ε2051.0 mg/mL = 27.0 + 120 (A280/A205)竜205 1.0 mg / mL = 27.0 + 120 (A 280 / A 205 )
IIII . . 결 과result
1. One. 효모에서의Yeast 브라제인Brazane 발현을 위한 재조합 플라스미드 제작 Production of recombinant plasmids for expression
효모에 재조합 브라제인 유전자를 삽입하기 위하여 pKLAC2 발현벡터에 브라제인 유전자를 삽입한 pKLAC2- 브라제인 플라스미드를 제작하였고, 과발현을 위한 LAC4 프로모터로 복구된 pKLAC2-브라제인::LAC4 플라스미드와 PDI 단백질의 발현을 위한 pKLAC2-PDI 플라스미드를 제작하여 총 3개의 재조합 플라스미드를 제작하였다.To insert a recombinant blazein gene into yeast, a pKLAC2-brassin plasmid in which a blazein gene was inserted into a pKLAC2 expression vector was constructed, and the expression of pKLAC2- blazein :: LAC4 plasmid and PDI protein recovered by the LAC4 promoter for overexpression PKLAC2-PDI plasmid was constructed for the production of recombinant plasmids.
1) One) 브라제인의Brazane's 과발현을 위한 재조합 플라스미드 제작 Production of recombinant plasmid for overexpression
상용화된 발현벡터인 pKLAC2의 변형된 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터를 야생형의 LAC4 프로모터로 복구하고자 한다. LAC4 프로모터의 서열은 K. lactis 내의 LAC4 프로모터를 PCR로 증폭시킨 후 양 말단과 pKLAC2를 제한효소로 처리한 후 라이게이션하여 pKLAC2-브라제인::LAC4 플라스미드를 제작하였다[도 3 참조].We intend to restore the modified LAC4 - PB Ⅰ promoter of pKLAC2 , a commercialized expression vector, to the wild type LAC4 promoter. Sequence of the LAC4 promoter was prepared pKLAC2- bra :: Jane LAC4 plasmid was treated with restriction enzyme at both ends and the pKLAC2 then amplifies the LAC4 promoter in K. lactis by PCR and ligated Lai [see Figure 3].
2) 2) 브라제인의Brazane's 올바른 구조 형성을 위한 재조합 플라스미드 제작 Production of recombinant plasmid for proper structure formation
효모의 단백질 발현계에서는 소포체 내에서 단백질의 구조형성(folding)이 이루어진다. PDI와 ERO의 발현량 조절로 단백질의 체외배출량이 증가할 수 있다. 이에 PDI 유전자를 발현벡터에 삽입한 플라스미드를 제작하여 효모 균주로의 형질전환에 이용하였다. PDI 유전자는 GG799 내에 존재하는 PDI 단백질을 이용하기 위하여 GG799내의 PDI 유전자를 PCR로 증폭시켜 얻었다. 양 말단과 pKLAC2를 제한효소로 처리한 후 라이게이션하여 pKLAC2-PDI 플라스미드를 제작하였다[도 3 참조].In yeast protein expression system, folding of protein occurs in the endoplasmic reticulum. Control of expression levels of PDI and ERO may increase the in vitro release of proteins. A plasmid in which the PDI gene was inserted into an expression vector was prepared and used for transformation into a yeast strain. The PDI gene was obtained by PCR amplification of the PDI gene in GG799 to use the PDI protein present in GG799. Both ends and pKLAC2 were treated with restriction enzymes and ligated to produce pKLAC2-PDI plasmid (see FIG. 3).
2. 2. 브라제인Brazane 효모 leaven 발현균주Expression strain 작성 write
브라제인의 효모 발현계 개량을 위하여 pKLAC2-브라제인, pKLAC2-브라제인::LAC4, pKLAC2-PDI 플라스미드를 각각 제작하였으며, 발현량 비교를 위하여 브라제인을 삽입한 균주, 브라제인과 LAC4를 삽입한 균주, 브라제인과 PDI를 삽입한 균주, 브라제인과 LAC4 , PDI를 삽입한 균주, 총 4가지의 형질전환된 브라제인 효모 발현 균주를 제작하였다.PKLAC2- brazene , pKLAC2- brazene :: LAC4 , and pKLAC2-PDI plasmids were prepared for the improvement of the yeast expression system of Brazane . For the comparison of the expression levels, brazan-inserted strain, brazene and LAC4 were inserted Strains expressing Brassin and PDI, strains containing Brassin and LAC4 , and strains containing PDI were constructed.
1) 유전자 다중 도입(1) gene multiplex introduction ( multimulti -- integratedintegrated ) 효모 발현 균주 선별) Yeast Expression Strain Selection
K. lactis의 도입 시스템은 유전자의 다중 도입(multi-copy integration)이 가능하기 때문에, 다중으로 유전자가 삽입될 경우 단일 도입(single-copy integration)의 경우에 비하여 재조합 단백질의 발현량이 증가하게 된다[도 14 참조]. 이로 인한 균주별 발현량을 통제하고 더 많은 발현을 유도하고자, 유전자 복제 수를 확인하고 가장 높은 복제 수를 가진 발현 균주를 선별하여 연구에 이용하였다[도 14 참조]. Since the introduction system of K. lactis is capable of multi-copy integration of genes, when the gene is inserted in multiple, the amount of recombinant protein is increased compared to the case of single-copy integration [ 14). In order to control the expression level of each strain and to induce more expression, the number of gene copies was confirmed and an expression strain having the highest copy number was selected and used in the study (see FIG. 14).
2) 유전자 동시 도입(2) Simultaneous gene transfer ( coco -- integratedintegrated ) 효모 발현 균주 선별) Yeast Expression Strain Selection
K. lactis 내에 PDI의 발현을 유도하여 재조합 브라제인의 제대로 된 구조형성을 이루어 체외배출량을 증가시키고자 하였다. GG799 균주 내에 재조합 브라제인 유전자와 PDI 유전자가 동시에 삽입된 발현 균주를 선별하고자 gDNA를 추출하여 PCR을 통하여 삽입된 브라제인 유전자[도 7 참조]와 PDI 유전자를 확인하였으며[도 8 참조], 두 유전자가 동시에 도입된 효모 발현 균주를 선별하여 연구에 이용하였다.The expression of PDI in K. lactis was induced to increase the in vitro excretion of the recombinant blazein. In order to screen for expression strains in which the recombinant blazein gene and the PDI gene were simultaneously inserted in the GG799 strain, gDNA was extracted and confirmed by insertion of the inserted bradine gene (see Fig. 7) and the PDI gene (see Fig. 8) Were selected and used for the study.
3. 재조합 3. Recombination 브라제인Brazane 발현량 비교 Comparison of expression level
브라제인 효모발현계의 발현량 비교를 위하여 브라제인을 발현시켜 mRNA의 전사량을 확인하였으며, 재조합 브라제인의 발현량을 비교하고자 정제과정을 거쳐 최종적인 브라제인 수율을 얻었다.In order to compare the expression level of the blazein yeast expression system, the amount of mRNA transcript was expressed by expressing blazein, and the final blazein yield was obtained through a purification process to compare the amount of expression of the recombinant blazein.
1) One) 브라제인Brazane 과발현 발현 균주 An overexpressing expression strain
재조합 브라제인 과발현을 유도하기 위하여 LAC4 프로모터를 이용한 균주를 기존의 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터를 이용한 균주와 같은 조건으로 재조합 브라제인을 발현시킨 후 밀도를 비교(densitometry)하여 발현량을 비교하였다. mRNA의 전사량을 비교한 결과, 기존의 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터를 이용한 균주에 비하여 LAC4 프로모터를 이용한 균주의 재조합 브라제인 발현량이 약 1.19배 증가한 결과를 나타내며[도 10 참조], 최종적으로 재조합 브라제인의 수율 또한 약 1.19배 증가하였다[도 10 참조].To induce recombinant bradykinin overexpression, recombinant bradylanes were expressed in LAC4 promoter in the same conditions as the strain using the conventional LAC4 - PB Ⅰ promoter, and the expression levels were compared by densitometry. As a result of comparing the transcription amount of mRNA, the recombinant blazein expression level of the strain using the LAC4 promoter was increased by about 1.19 times as compared with the strain using the existing LAC4 - PB I promoter [see FIG. 10] Was also increased by about 1.19 times (see Fig. 10).
2) 2) 브라제인Brazane 구조 형성 발현 균주 Expression-forming strain
재조합 브라제인의 올바른 구조를 형성하여 체외배출량을 증가시키고자 PDI 유전자를 삽입하여 브라제인과 더불어 발현시켰으며, 추가적으로 ERO의 발현을 유도하기 위하여 DTT를 첨가하였으며 기존의 효모발현계와 발현량을 비교하였다. mRNA의 전사량을 비교한 결과 재조합 브라제인의 발현량은 차이를 나타내지 않았다. 하지만 최종적인 재조합 브라제인의 수율을 비교하여 보면 PDI 유전자를 발현시킨 균주는 기존의 발현 균주에 비하여 재조합 브라제인의 수율이 약 1.33 배 증가하였으며[도 11 참조], 이에 DTT를 첨가하여 ERO의 발현을 유도한 발현 균주는 기존 발현 균주보다 약 1.46 배 발현량이 증가하였다[도 11 참조].In order to increase the in vitro excretion of the recombinant bradylanin, the PDI gene was inserted and expressed with bradine. In addition, DTT was added to induce the expression of ERO, and the expression level was compared with that of the existing yeast expression system Respectively. As a result of comparing the transcription amount of mRNA, there was no difference in the expression amount of recombinant bradine. However, when comparing the yield of the final recombinant blazein, the yield of the recombinant blazein was increased by about 1.33 times as compared with that of the existing expression strain of the strain expressing the PDI gene [see FIG. 11] Induced expression increased about 1.46 fold more than the existing expression strain (see FIG. 11).
PDI와 ERO에 의한 재조합 브라제인의 배출량이 증가한 것을 확인하기 위하여 균체 내의 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 균체 내의 재조합 브라제인의 잔여량을 비교하였다. 그 결과, 균체 내에 잔존하는 브라제인의 양이 PDI와 ERO를 첨가하였을 때 약 76%로 감소되었다[도 13 참조].In order to confirm that the recombinant blazein was increased by PDI and ERO, the amount of recombinant blazein in the cells was compared by SDS-PAGE. As a result, the amount of brassain remaining in the cells was reduced to about 76% when PDI and ERO were added (see FIG. 13).
3) 3) 브라제인Brazane 과발현 및 구조형성 발현 균주 Overexpression and structure-forming expression strain
재조합 브라제인의 수율을 증가시키는 각기 다른 원리인 발현량과 체외배출량을 동시에 증가시키고자 위하여 LAC4 프로모터를 이용하며 PDI 유전자가 삽입된 균주를 제작하였다. 이후 각 발현 균주에서 재조합 브라제인을 발현시킨 후 기존의 발현계와 발현량을 비교하였다. 그 결과, LAC4 프로모터를 이용하여 브라제인의 과발현을 유도하고 PDI을 발현시킨 균주의 경우 mRNA의 전사량을 비교한 결과 기본 발현 균주에 비하여 약 1.40배 발현량이 증가하였고, 이에 DTT를 첨가하여 ERO의 발현을 유도한 균주는 기존 발현 균주보다 1.60배 mRNA 전사량이 증가한 결과를 보였다.
To increase the yield of recombinant bradykinin , which is a different principle, to increase both the amount of excretion and the amount of in vitro excretion, a strain containing the PDI gene was constructed using the LAC4 promoter. After expression of the recombinant blazein in each expression strain, expression levels of the recombinant blazein were compared with those of the existing expression system. As a result, in the case of strain expressing bradine overexpression using the LAC4 promoter and comparing the transcription amount of mRNA in the case of the strain expressing PDI, the amount of expression increased about 1.40 times as compared with that of the basic expression strain, and DTT was added to the ERO The expression level of the strain was 1.60 times higher than that of the conventional strain.
IIIIII . 고찰. Review
재조합 단백질 연구에 널리 쓰이는 균주인 대장균에서 브라제인을 발현하였지만 그 수율이 3-4 mg/L로 낮으며, 정제 후 in vitro 상에서의 추가적인 구조형성(refolding) 과정이 요구되고, in vitro 상에서 구조형성을 하는 경우에는 잘못된 구조를 가진(misfolded) 재조합 브라제인이 만들어지기 때문에 효율이 낮다는 단점을 가지고 있다. 이에 브라제인의 연구와 식품으로서의 응용성을 확장하기 위하여 발현량이 많으며 식품으로 이용 가능한 효모 균주인 K. lactis를 이용한 재조합 브라제인 발현계를 구축하여 최대 108 mg/L의 수율로 브라제인을 얻었다(Jo et al., 2013).Was that the yield is as low as 3-4 mg / L although expressing Brassica agent in a widely used strain for recombinant protein studies in E. coli, purified and then in an additional refolding process in vitro is required, and in When the structure is formed in vitro , there is a disadvantage that the efficiency is low because a misfolded recombinant blazein is produced. Thus, in order to expand the applicability of bradylane to food, a recombinant bradykinin expression system using K. lactis , a yeast strain that has a high expression level and can be used as a food, was constructed to obtain bradine at a maximum yield of 108 mg / L Jo et al ., 2013).
본 발명자들은 인간의 미각 인식 메커니즘의 규명을 위한 단맛 수용체 연구도 동시에 진행 중에 있는데, 인체 단맛 수용체와 브라제인의 상호작용 연구를 위하여 X-선 결정구조 분석 등의 단백질의 고차구조 분석을 이용하고자 한다. 고차구조 분석 실험에는 다량의 시료가 필요하기에 더 높은 수율의 발현계를 구축하고자 본 발명을 계획하였고, 추가적으로 브라제인을 식품으로써 이용할 때에 생산을 위한 발현계로도 응용 가능하도록 연구를 진행하였다.The present inventors are also studying a sweet taste receptor for identifying the taste recognition mechanism of human beings at the same time. In order to study the interaction between the human sweet taste receptor and bradine, high-order structural analysis of proteins such as X-ray crystal structure analysis is used . The present invention was planned to construct a higher yielding expression system because a large amount of sample is required for the high-order structural analysis. In addition, the present invention was applied to an expression system for production when using bradylane as a food.
브라제인은 감미 단백질 중 가장 작은 크기를 가지지만 그 구조 내에 4개의 이황화결합을 가지고 있어서 열 및 pH의 변화에 매우 안정하다(Ming and Hellekant, 1994). 이러한 브라제인의 특징은 식품으로의 응용 가능성을 높이는 한편 재조합 단백질로의 발현에 있어 잘못된 구조를 형성할 확률도 함께 높이게 된다(Demain and Vaishnav, 2009). 진핵생물에서 발현되는 단백질의 구조형성(folding)은 소포체(Endoplasmic reticulum)에서 이루어지며, 다양한 관련 단백질이 관여하여 발현되는 단백질이 올바른 구조를 이루게 된다(Gruber et al., 2006). 본 발명에 이용되는 발현계는 신호서열을 이용하여 체외배출을 유도하므로 단백질이 올바른 구조를 지니지 않으면 체외배출되지 않기 때문에 in vivo 상에서의 구조형성 과정이 매우 중요하다(Wittrup, 1995). 특히 이황화결합 형성에 관여하는 단백질로는 PDI(Protein disulfidebond isomerase)와 ERO(Endoplasmic reticulum oxidoreductin)가 있다.Brazene is the smallest of the sweetness proteins, but has four disulfide bonds in its structure, which is very stable to changes in heat and pH (Ming and Hellekant, 1994). These characteristics of the blazein increase the likelihood of application to food as well as the possibility of forming a false structure in recombinant protein expression (Demain and Vaishnav, 2009). The folding of proteins expressed in eukaryotes is carried out in the endoplasmic reticulum, and the proteins expressed by the involvement of various related proteins have the correct structure (Gruber et al ., 2006). Because of expression system to be used in the present invention it is not so induce in vitro discharge using a signal sequence, if the protein is not bear the correct emission structure in vitro Structural formation processes in vivo are very important (Wittrup, 1995). Proteins involved in disulfide bond formation are PDI (Protein disulfide isomerase) and ERO (Endoplasmic reticulum oxidoreductin).
이와 더불어 기존의 효모 발현벡터로는 상용화된 pKLAC2 벡터를 이용하여 LAC4-PBⅠ 프로모터로 발현을 유도하였다. 야생형 LAC4 프로모터는 효모 균주로의 도입 전, 대장균 내에서 재조합 발현벡터의 증폭을 방해하기 ?문에 유전자 조작의 용이성을 위하여 LAC4 - PB I 프로모터로 변형하였다. 하지만 효모 균주에서는 강력한 프로모터인 야생형 LAC4 프로모터로 복귀하여 발현양의 증대를 기대할 수 있다.In addition, expression was induced by the LAC4-PBI promoter using a commercially available pKLAC2 vector as a conventional yeast expression vector. The wild type LAC4 promoter was transformed into the LAC4 - PB I promoter for ease of gene manipulation since it inhibited the amplification of the recombinant expression vector in E. coli prior to introduction into the yeast strain. However, in the yeast strain, it is expected to return to the wild type LAC4 promoter, which is a strong promoter, to increase the expression amount.
기존의 재조합 브라제인의 효모 발현계에 이를 모두 적용하여 발현계의 개량을 진행하였으며, 최종적으로 기존 효모 발현계 대비 1.73배의 수율 증가를 이루었다. pKLAC2 발현벡터 내의 LAC4 - PB Ⅰ 프로모터를 야생형의 LAC4 프로모터로 복구하였을 경우에는 mRNA의 전사량 증가를 통하여 수율이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, PDI와 ERO의 과발현을 통하여 발현 균주에서 체외로 재조합 단백질이 배출되는 양을 증가한 것을 균체 내에 남아 있는 재조합 브라제인의 양을 비교하여 확인할 수 있었다. 최종적으로 본 발명을 통하여 기존의 발현계와 비교하여 1.73배 발현량이 증가한 결과를 보였다.The expression system was improved by applying all of them to the yeast expression system of the existing recombinant blazein, and the yield was 1.73 times as high as that of the yeast expression system. When the LAC4 - PB Ⅰ promoter in the pKLAC2 expression vector was recovered by the wild - type LAC4 promoter, it was confirmed that the yield was increased by increasing the amount of mRNA transfected. Through the overexpression of PDI and ERO, expression of the recombinant protein The amount of the recombinant blazein remaining in the cells was confirmed by comparing the amount of the recombinant blazein. Finally, through the present invention, the expression level was increased by 1.73 times as compared with the conventional expression system.
본 발명자들은 현재 야생형 브라제인과 다양한 브라제인을 작성하여 보유하고 있다. 모든 브라제인 변이체가 효모 발현계를 통하여 발현ㆍ정제 과정을 거쳐야 올바른 구조를 형성한 재조합 브라제인을 얻을 수 있으며, 이를 구조 분석 등의 후속 연구에 이용할 수 있다. 이에 본 발명을 통하여 개량된 효모 발현계를 이용할 것이며, 모든 변이체에 적용하여 제대로 된 구조을 이룬 브라제인을 높은 수율로 얻을 수 있다.
The present inventors have now created and held wild type and various types of brane. All of the blazein mutants are subjected to expression and purification processes through a yeast expression system to obtain a recombinant blazein having the correct structure, which can be used for subsequent studies such as structural analysis. Thus, the improved yeast expression system will be used in the present invention, and it can be applied to all variants to obtain a properly formed brassin in high yield.
[참고문헌][references]
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Claims (9)
A recombinant expression vector comprising a bradine gene and a LAC4 promoter; And a recombinant expression vector comprising a protein disulfide isomerase (PDI) gene derived from Kluyveromyces lactis ; and Kluyveromyces lactis , which is co-transformed with Kluyveromyces lactis .
상기 브라제인 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열을 포함하는 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis).
The method according to claim 1,
The recombinant expression vector comprising the bradine gene is a transformed Kluyveromyces lactis comprising the Kluyveromyces lactis alpha-mating signal sequence.
상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 서열번호 1로 표시되는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis).
3. The method of claim 2,
The Kluyveromyces lactis alpha-mating signal sequence is Kluyveromyces lactis as shown in SEQ ID NO: 1.
A recombinant expression vector comprising Kluyveromyces lactis as a host for expression of bradine and comprising a bradine gene and a LAC4 promoter; And a recombinant expression vector comprising a protein disulfide isomerase (PDI) gene derived from Kluyveromyces lactis , which comprises the step of culturing Kluyveromyces lactis The mass production method of Brazan.
상기 배양 시 ERO(Endoplasmic reticulum oxidoreductin)의 과발현을 위해 배지에 DTT를 첨가하는 브라제인의 대량 생산 방법.
8. The method of claim 7,
A method for mass production of bradyin by adding DTT to the medium for overexpression of ERO (Endoplasmic reticulum oxidoreductin) during the culture.
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| KR20080039879A (en) * | 2005-10-24 | 2008-05-07 | 주식회사 벡손 | Method for preparing soluble and active recombinant proteins using pdi as a fusion partner |
| KR20120090019A (en) * | 2012-07-09 | 2012-08-16 | 중앙대학교 산학협력단 | Recombinant expression vector for expression of brazzein and mass production method of brazzein using the same |
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