KR101528580B1 - Method for evaluatig aquatic ecotoxicity usig the frond area of Spirodela polyrhiza germinated from turion - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 개구리밥의 잠아를 이용한 생태 독성 형가 방법 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 잠아로부터 발아된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 잠아로부터 발아된 개구리밥의 뿌리 길이를 이용한 수질 독성 평가 방법 등에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a method for assessing toxicity of a water quality based on the leaf area of frozen rice germinated from a latte or the root length of frozen rice germinated from a frozen rice, and the like.
인류의 활동과 산업의 발달로 새롭고 잠재적인 위해성을 지닌 화학물질이 생산되고 수서 생태계로 유입되고 있다. 현대화학의 발전은 알려진 유용한 화학물의 생산량을 높이는데 기여했을 뿐만 아니라 매일 1200 여종 가량의 새로운 물질도 만들어내고 있다. 물질의 이동과 변환이 급속하게 일어나는 수서 생태계의 특성상, 이러한 독성물질에 대한 위해성을 평가하고 법적인 대처를 취하는 노력이 이루어지지 않는다면 매년 수천 종의 화학물질을 함유한 산업폐수와 도시하수에 의해서 위기에 처하게 될 위험성에 노출되어 있다.With the development of human activities and industry, new and potentially harmful chemicals are being produced and entering the Suez ecosystem. The development of modern chemistry not only contributes to the production of known useful chemicals, but it also produces about 1,200 new substances every day. Unless efforts are made to evaluate the risks to these toxic substances and to take legal action, the nature of the Suseo ecosystem, where material movement and conversion occurs rapidly, is not enough to prevent crises by industrial wastewater and city sewage containing thousands of chemicals each year And is exposed to the risk that it will face.
하천 및 호소를 오염시키는 오염물질에는 산업체에서 유래하는 중금속과 VOCs, 농업용 제초제, 살충제 그리고 인구 밀집도시에서 방출되는 방대한 생활폐수에 함유된 질소와 인 화합물 등이 있는데 이러한 오염물질들에 의한 위해성을 평가하기 위해서 물리화학적인 방법과 생물학적인 방법이 있다. 물리화학적 방법으로는 가스 크로마토그래피(GC)법, 유도결합 플라즈마(inductively coupled plasma)를 이용하는 방법 등이 있다. 그러나 이러한 방법은 GC-MS(gas chromatography-mass spectroscopy), ICPMS(inductively coupled plasma-mass spectroscopy) 등 고가의 분석장비와 고도로 숙련된 분석요원을 필요로 하며, 각각의 독성물질에 따라 별도의 분석을 수행하여야 하는 문제가 있다. 또한 분석시간이 길고, 유입 독성물질의 성분을 알 수 없는 경우에는 분석하기 어려운 문제가 있으며, 시료를 장거리로 이동시킬 경우 시료 내 반응으로 성분 및 농도 변화가 유발될 수 있다는 문제점이 있다.Contaminants that pollute rivers and lakes include industrial heavy metals and VOCs, agricultural herbicides, pesticides, and nitrogen and phosphorous compounds in vast domestic wastewater from populated cities. There are physico-chemical and biological methods to do this. Examples of the physicochemical method include a gas chromatography (GC) method and an inductively coupled plasma method. However, these methods require expensive analytical equipments such as GC-MS (gas chromatography-mass spectroscopy) and ICPMS (inductively coupled plasma-mass spectroscopy) and highly skilled analytical personnel. There is a problem to be performed. In addition, when the analysis time is long and the components of the toxic substances are unknown, analysis is difficult. In addition, when the sample is transported over a long distance, there is a problem that the components and the concentration of the sample may be changed due to the reaction in the sample.
이 같은 제약점을 극복하기 위해 국제적으로 수중 미생물, 조류(algae), 수중 무척추 동물 및 수생 관속 식물 등 지표 생물을 이용한 오염 진단 방식에 대한 관심이 고조되어 최근 국제 사회에서 제정한 환경 규약을 보면 환경 독성을 평가하는데 있어서 지표 생물에 의한 독성평가 자료를 차용하고 있음을 알 수 있다. 이러한 지표 생물을 이용한 오염 진단방식은 종래에 생물체 내의 오염물질의 농도를 직접 측정하거나 서식처의 오염 등급별 서식종의 존재 여부로 판정하는 Bioindicator식 개념에서 현재는 생물 개체 또는 그 하위의 생물학적 조직 단위의 특성을 이용하여 오염물질을 진단하는 Biomonitor식 방법으로 진화하고 있다. 후자의 방법은 생물의 다양한 생리학적 변화를 통해 환경에 존재하는 단독 혹은 혼합 물질의 위해성을 정량화하거나 그 물질의 잠재적인 영향력을 평가할 수 있으므로 환경오염이 광역화되기 이전에 그 징후를 사전에 파악할 수 있고 생태학적 의미를 찾을 수 있다는 장점을 내포하고 있다.In order to overcome these limitations, international attention has been paid to the method of pollution diagnosis using surface organisms such as aquatic microorganisms, algae, underwater invertebrates and aquatic vascular plants. Recently, In evaluating the toxicity, it can be seen that the toxicity evaluation data by the indicator organism is borrowed. The method of pollution diagnosis using indicator organisms is based on the concept of bioindicator, which conventionally determines the concentration of pollutants in living organisms or judges the existence of species according to the pollution level of a habitat. Currently, the characteristic of biological organisms Which is a biomonitor method for the diagnosis of pollutants. The latter method can quantify the risk of individual or mixed substances present in the environment through various physiological changes of the organism or evaluate the potential influence of the substance, so that the signs can be grasped before the environmental pollution is wide-spread It has the advantage of finding an ecological meaning.
일반적으로 어류나 무척추 동물을 이용하는 경우에는 치사율, 움직임의 저해, 생물학적 특성 분석으로 판단하며, 미세조류를 이용하는 경우에는 성장저해로 측정한다. 물벼룩류(Daphnia)인 Daphnia magma와 Ceriodaphnia dubia 등은 환경 독성물질에 매우 민감하고 기르기 용이하며, 수명이 짧고 생체가 작으며, 많은 생체 수를 실험에 사용할 수 있어 통계적 분석이 가능하므로 대표적 실험생물로 이용되고 있다. 그러나 이러한 어류, 무척추 동물 또는 원생동물을 이용하는 수질 독성 평가 방법은 측정자의 전문성과 고가의 기기가 요구되고, 장시간이 소요되며, 민감도가 높지 않다는 문제가 있다.In general, when fish or invertebrates are used, it is judged by the mortality, the inhibition of movement, and the biological characteristic analysis. In the case of using microalgae, the growth inhibition is measured. Daphnia (Daphnia) Daphnia magma and Ceriodaphnia dubia are very sensitive to environmental toxic substances, easy to grow, have a short life span, are small in size and can be used for many experiments. . However, the method of evaluating the water toxicity using the fish, invertebrate or protozoa requires the expertise of the measurer and expensive equipment, takes a long time, and has a problem that the sensitivity is not high.
과거 국제적으로 독성 연구에 사용되었던 생물종은 대부분의 경우 수서 척추동물 또는 무척추 동물이었지만 최근 들어 수서 생태계 내의 수생식물의 역할이 부각되어 수생식물을 이용한 독성 평가 방법에 대해 관심이 증가하고 있다. 수생식물은 수중 생태계의 1차 생산자로서 동식물 플랑크톤, 무척추동물 및 어류의 서식처가 되며, 많은 유기물질을 흡수정화하는 능력을 갖고 있다. 수생식물(hydrophytes)은 식물체의 여러 기관이 서식환경에 알맞게 변형되어 형태적으로 다양해지는 유연성을 지닌다. 일부 수생식물의 경우, 이들이 처한 특수한 수중환경에 적응하여 생존하기 위해 뿌리, 줄기, 잎 등의 기관을 형성하지 않는 매우 축소된 식물체로의 구조 변형이 일어난다.In recent years, the use of aquatic plants in aquatic ecosystems has been highlighted, and interest in methods for assessing toxicity using aquatic plants is increasing. Aquatic plants are the primary producers of aquatic ecosystems and are the habitats of plant and plankton, invertebrates and fish, and have the ability to absorb and purify many organic materials. Hydrophytes have the flexibility to become morphologically diverse by the transformation of the various organs of the plant to the habitat environment. Some aquatic plants undergo structural deformation into very shrunken plants that do not form roots, stems, leaves, and other organs to survive and adapt to the particular underwater environment they are in.
식물체가 극도로 축소된 개구리밥(Spirodela polyhriza)은 식물체 전체가 엽상체, 연결사, 뿌리의 3부분으로 이루어진 아주 작은 개체로 발달한다(Lee, 1996). 이들은 5~8 mm 크기의 부엽성 수생식물로 엽상체(frond)로 영양번식(reproductive reproduction)을 하여 식물체가 수일이내에 2배가 되는 매우 빠른 속도로 개체를 증식시킨다(Landolt, 1986; Appenroth, 2003). 수생식물이 생활환을 마칠 때에는 육상식물에서와 같이 종자를 형성하거나, 혹은 생장이 정지된 상태를 유지할 수 있는 특수한 구조를 형성하여 동절기 휴면상태에 들어간다. 다년생 초본식물인 개구리밥은 휴면구조로 겨울눈의 일종인 잠아(turion)를 형성하여 겨울철 휴면상태를 유지한다. 생장기간 동안 엽상체는 빠른 분열로 그 수를 늘리며 개체를 증식시켜 식물체 용적의 대부분을 차지하게 된다. 이러한 엽상체는 기온이 내려가기 시작하면 영양번식을 멈추고 엽육조직 내부에 잠아원기(turion primordium)를 형성한다(Kwak & Kim, 2008). 이후 잠아는 모엽상체(mother frond)에서 분리되어 물 밑에 가라 앉아 월동하고 다음 해 기온이 상승하기 시작하면 수면 위로 부상하여 새로운 식물체로 발달하는 생활환을 반복한다. 이들의 잠아에서는 휴면기 이후 기온상승으로 보호조직(vegetative sheath) 및 잠아 엽육조직 내에 싸여 있던 엽상체 원기(frond primordium)가 발아하여 엽상체가 기원한다. 기온하강 시 휴면상태를 유지하도록 하는 개구리밥 잠아의 이러한 특성으로 수생식물의 휴면 구조 형성 및 발달과정 추적 연구에 대표적인 모델시스템 종으로 제안된바 있다(Smart, 1996). 엽상체, 연결사 및 뿌리로만 구성된 매우 축소된 개구리밥의 식물체는 잠아 및 엽상체 원기를 엽상체 및 잠아조직 내에 미리 형성하여 휴면기 이후 신속하게 생장을 재개하거나 생장기에서 휴면상태로 바로 진입할 수 있는 구조적 특징을 지녀 축소된 식물체의 생활환 순환에 중요한 역할을 한다(Newton et al., 1978; Sibasaki & Oda, 1979; Kim & Kim, 2000; Reimann et al., 2007; Kwak & Kim, 2008).Extremely reduced plant populations ( Spirodela polyhriza ) develops into a very small individual consisting of three parts: lobes, connective roots, and roots (Lee, 1996). They are infertile aquatic plants of 5 to 8 mm in size, reproductive reproducting with frond, and multiply the plants at very high speeds, with the plants doubling in a few days (Landolt, 1986; Appenroth, 2003). When an aquatic plant finishes its life cycle, it forms a seed as in land plants, or it forms a special structure that can keep the growth stopped, and enters a dormancy in the winter season. A perennial herb plant, frog, is a dormant structure that forms a turion, a kind of winter snow, and maintains its dormancy in winter. During the growing period, the thalli increase rapidly by rapid division and multiply the individual to occupy most of the plant volume. These lobsters stop nutrient breeding and form turion primordium inside the leaf tissue when the temperature starts to fall (Kwak & Kim, 2008). Afterwards, the sleeping is separated from the mother frond and sinks to the bottom of the water. When the temperature starts to rise in the next year, it floats on the surface of the water and repeats the life cycle that develops as a new plant. In their sleep, vegetative sheath and frond primordium, which were enclosed in the lyophilized tissues, germinate due to the rise in temperature after the dormant period, resulting in the thallus. This characteristic of frogbill sleeping to maintain dormancy at the time of temperature drop has been proposed as a representative model system species in the study of the dormant structure formation and development process of aquatic plants (Smart, 1996). Extremely reduced frog rice plants consisting of only thallus, connective roots and roots have the structural features of resuming the sleeping and thyroid gland in the thighs and lining tissues, allowing them to resume their growth rapidly after the dormant period or directly into the dormant state (Kwak & Kim, 2008), which has a significant role in the circulation of life in reduced plants (Newton et al., 1978; Sibasaki & Oda, 1979; Kim & Kim, 2000;
본 발명은 이러한 배경하에 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 개구리밥의 엽상체로부터 분리된 잠아의 발아 특성을 이용한 신규 수질 독성 평가 방법을 제공하는데에 있다.It is an object of the present invention to provide a new method for evaluating the toxicity of water by using the germination characteristics of a latte separated from a thallus of frog.
또한, 본 발명의 다른 목적은 신규 수질 독성 평가 키트를 제공하는데에 있다.Another object of the present invention is to provide a novel water quality toxicity evaluation kit.
본 발명의 발명자들은 생태 독성 평가를 위한 지표 물질로 개구리밥의 엽상체로부터 분리된 휴면상태의 잠아를 이용하고, 생태 독성 평가를 위한 파라미터로 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 뿌리 길이를 이용하는 경우 생태 독성, 특히 수질 독성 평가 시 소요 시간이 짧고 민감도가 우수하며 다양한 독성물질에 대한 평가가 가능하다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
The inventors of the present invention have found that when the dormant state of the frog separated from the foliage of the frog is used as an index substance for ecotoxicity evaluation and the leaf area or the root length of the frog is formed by germination of the frog as a parameter for evaluation of ecotoxicity The present inventors have confirmed that ecotoxicity, especially the evaluation of toxicity of water, is short, sensitivity is excellent, and various toxic substances can be evaluated. Thus, the present invention has been completed.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 배양용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; (b) 수체 샘플을 함유하는 배양용 용기에 개구리밥으로부터 분리된 잠아를 투입하는 단계; (c) 배양용 용기에 투입된 잠아를 배양하여 발아시키는 단계; 및 (d) 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이를 측정하는 단계를 포함하는 수질 독성 평가 방법을 제공한다. 이때, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 원수 및 희석 배수가 서로 다른 적어도 2개 이상의 희석 원수로 구성되고, 상기 희석 원수는 원수를 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양용 배지, 예를 들어 스테인버그 배지(Steinberg's medium) 또는 호그랜드 배지(Hoagland's medium)로 희석하여 제조되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 희석 원수는 반수 희석법에 의해 희석되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 수체 샘플은 원수의 대조군으로 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양용 배지, 예를 들어 스테인버그 배지(Steinberg's medium) 또는 호그랜드 배지(Hoagland's medium)를 더 포함하고, 상기 잠아의 배양용 배지는 바람직하게는 잠아의 발아를 저해하는 독성물질을 포함하지 않는 것이다. 또한, 상기 독성물질은 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 pH가 5~8로 조정되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 (b) 단계의 개구리밥으로부터 분리된 잠아는 바람직하게는 휴면 상태에 있는 것이다. 또한, 상기 (b) 단계의 개구리밥으로부터 분리된 잠아는 바람직하게는 냉장 조건에서 적어도 2개월 이상 보관된 것이다. 또한, 상기 (c) 단계의 배양시 배양 온도는 15~35℃이고, 광 조사량은 50~150 μ㏖ photon/㎡·s 이고, 배양 시간은 2~4일인 것이 바람직하다.In order to solve one object of the present invention, the present invention provides a method for producing a culture medium, comprising the steps of: (a) (b) injecting a louse separated from the frog into a culture container containing a water sample; (c) culturing the gill inserted into the culture container and germinating; And (d) measuring the leaf area of the frog or the root length of the frog formed by the germination of the frog formed by germination of the frog. At this time, the water sample of the step (a) is composed of at least two dilution raw water having different raw water and dilution multiples, and the diluted raw water is used as the raw water for the incubation of the submerged slice separated from the frog, for example, (Steinberg ' s medium or Hoagland ' s medium). It is preferable that the dilution raw water is diluted by a half-dilution method. In addition, the water sample further comprises a culture medium for incubation of the slug separated from the frog, for example, Steinberg's medium or Hoagland's medium as a control for the raw water, And preferably does not contain a toxic substance which inhibits the germination of sleeping. The toxic substance may be at least one selected from the group consisting of silver (Ag), aluminum, arsenic, cadmium, cobalt, chromium (Cr), copper (Cu) Iron, iron, mercury, nickel, lead, zinc, acetone, chloroform, dimethylsulfate, DMSO, Dimethyl sulfoxide, ethyl alcohol, formaldehyde, methanol, and phenol. [0028] The term " a " In addition, the water sample of the step (a) preferably has a pH of 5 to 8. In addition, the slug separated from the frog in step (b) is preferably in a dormant state. In addition, the slug separated from the frog in step (b) is preferably stored for at least 2 months under the refrigerated condition. It is preferable that the incubation temperature in the step (c) is in the range of 15 to 35 ° C, the irradiation amount is 50 to 150 μmol photon /
본 발명의 다른 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 개구리밥으로부터 분리된 휴면상태의 잠아를 포함하는 수질 독성 평가 키트를 제공한다. 이때, 상기 키트는 바람직하게는 잠아 배양용 용기, 수체 샘플 희석용 인공 배지 또는 독성물질 표준용액을 더 포함할 수 있다. 상기 표준 독성물질은 잠아의 발아를 저해하는 물질로서, 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 수체 샘플 희석용 인공 배지는 바람직하게는 스테인버그 배지(Steinberg's medium) 또는 호그랜드 배지(Hoagland's medium)이다.In order to solve the other object of the present invention, the present invention provides a water quality toxicity evaluation kit comprising a dormant state of sleep separated from frog. At this time, the kit may further include a container for incubation, a artificial medium for diluting a water sample, or a toxic substance standard solution. The standard toxic substance is a substance which inhibits the germination of a sleeping child and is composed of silver (Ag), aluminum, arsenic, cadmium (Cad), cobalt (Co), chromium (Cr) , Copper (Cu), iron (Fe), mercury (Hg), nickel (Ni), lead (Pb), zinc (Zn), acetone, chloroform And may be composed of at least one member selected from the group consisting of chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethyl alcohol, formaldehyde, methyl alcohol and phenol. In addition, the artificial medium for diluting the water sample is preferably Steinberg's medium or Hoagland's medium.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 수질 독성 평가를 위한 지표 물질로 개구리밥의 엽상체로부터 분리된 휴면상태의 잠아를 이용하고, 수질 독성 평가를 위한 파라미터로 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 뿌리 길이를 이용하기 때문에 수질 독성 판별 시간이 약 3일 정도만 소요되고, 수질 독성원에 대한 높은 민감성을 가지며, 다양한 독성물질에 의한 수질 오염의 평가가 가능하다.The method for evaluating the water toxicity according to the present invention uses a dormant sleeping louse isolated from the thrips of frog rice as an indicator substance for evaluating the water quality toxicity and measures the thallus area or root Because of the length, it takes about 3 days to determine the toxicity of the water. It has high sensitivity to the water toxicity source and it is possible to evaluate the water contamination by various toxic substances.
도 1은 독성물질인 은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 2는 독성물질인 카드뮴의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 3은 독성물질인 크롬의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 4는 독성물질인 구리의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 5는 독성물질인 수은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 독성물질인 은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 7은 독성물질인 카드뮴의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 8은 독성물질인 크롬의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 9는 독성물질인 구리의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 10은 독성물질인 수은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이다.FIG. 1 is a graph showing changes in the area of cytoplasmic area of frog rice formed by germination of a slug according to the concentration of silver, which is a poisonous substance. FIG. FIG. 3 shows changes in the area of cytoplasmic area of the frog prepared by germination of the frog according to the concentration of chromium which is a poisonous substance. FIG. 4 shows the change in the area of the frog rice formed by germination of the frog according to the concentration of copper, Fig. 5 shows changes in the area of cytoplasmic area of frog rice formed by the germination of the louse according to the concentration of mercury which is a toxic substance.
FIG. 6 shows changes in root length of frog rice formed by germination of a slug according to the concentration of silver, which is a toxic substance, and FIG. 7 shows changes in root length of frog rice formed by germination of slug according to the concentration of the toxic substance cadmium FIG. 8 is a graph showing changes in the root length of the frog prepared by germination of the submersion according to the concentration of chromium, which is a toxic substance, and FIG. 9 is a graph showing changes in the root length of the frog And Fig. 10 shows changes in the root length of the frog prepared by germination of the submersion according to the concentration of mercury which is a toxic substance.
본 발명의 일 측면은 판별 시간이 짧고, 조작이 간단하며, 다양한 독성물질에 대해 높은 민감성을 가지는 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 수질 독성 평가 방법은 배양용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; 수체 샘플을 함유하는 배양용 용기에 개구리밥으로부터 분리된 잠아를 투입하는 단계; 배양용 용기에 투입된 잠아를 배양하여 발아시키는 단계; 및 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 개구리밥의 뿌리 길이를 측정하는 단계를 포함한다. 이하, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구성요소별로 나누어 설명한다.
One aspect of the present invention relates to a water toxicity evaluation method having a short discrimination time, a simple operation, and a high sensitivity to various toxic substances. The water toxicity evaluation method of the present invention comprises the steps of placing a water sample into a culture vessel ; Injecting a lump separated from the frog into a culture container containing a water sample; Culturing a gill inserted into a culture container and germinating; And measuring the leaf area of the frog or the root length of the frog or the frog formed by germination of the frog. Hereinafter, the method for evaluating the water toxicity according to the present invention will be described by dividing it into components.
수체Water body 샘플 Sample
수체(water body) 샘플은 물이 주요 부피를 차지하는 샘플을 말하는 것으로서, 본 발명에 따른 수체 샘플은 해수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지 용출수, 토양 용출수, 퇴적토 용출수 등에서 채취한 샘플을 포함한다.The water body sample refers to a sample in which water occupies a major volume. The water body sample according to the present invention is collected from seawater, a lake, a wastewater, discharged water, sewage, sludge leached water, soil leached water, Include one sample.
최초의 수체 샘플(이하, 원수)은 원수 이외에 원수를 인공 배지나 물과 같이 독성물질을 포함하지 않는 액체로 희석하여 적어도 2가지 이상, 바람직하게는 4가지 이상의 농도로 구배화시킨 희석 원수들로 구성되는 것이 바람직하다. 이때, 사용되는 희석 방법은 크게 제한되지 않으며, 일 예로 반수 희석법[100%(원수 자체), 50%(원수의 1/2 농도로 희석한 것), 25%(원수의 1/4 농도로 희석한 것), 12.5%(원수의 1/8 농도로 희석한 것), 6.25%(원수의 1/16 농도로 희석한 것)]이 있다. 원수를 희석하기 위한 액체는 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 발아를 저해하는 독성물질을 포함하지 않으면서 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양과 양립할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 물, 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양에 사용되는 배지 등이 있다. 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양에 사용되는 배지는 공지된 다양한 배지 등에서 선택되는 등, 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 일 예로 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 원활한 배양 및 발아를 고려할 때 스테인버그 배지(Steinberg's medium) 또는 호그랜드 배지(Hoagland's medium)인 것이 바람직하다.The first water sample (hereinafter referred to as "raw water") was prepared by diluting the raw water with a liquid not containing a toxic substance such as artificial pond or water and diluting it with at least two or more, preferably four or more concentrations. . In this case, the dilution method to be used is not particularly limited. For example, the dilution method used is, for example, a semi-dilution method [100% (raw water), 50% (diluted with 1/2 concentration of raw water), 25% ), 12.5% (diluted with 1/8 concentration of raw water), 6.25% (diluted with 1/16 concentration of raw water)]. The liquid for diluting the raw water is not limited in its kind as long as it is compatible with the cultivation of the slug isolated from the frog, without containing the toxic substance which inhibits germination of the slug separated from the frog, And a medium used for culturing the immersed slice. The type of medium used for culturing the subspecies isolated from frogs is not limited to a wide variety of known media and the like. For example, in consideration of smooth cultivation and germination of frogs separated from frogs, Steinberg's medium ) Or Hoagland's medium.
또한, 수체 샘플은 바람직하게는 원수의 대조군으로 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양에 사용되는 배지를 더 포함할 수 있는데, 상기 배지는 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 발아를 저해하는 독성물질을 포함하지 않는 것 바람직하다. 상기 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 발아를 저해하는 독성물질은 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 있다. 상기 대조군을 구성하는 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양용 배지는 공지된 다양한 배지 등에서 선택되는 등, 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 일 예로 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 원활한 배양 및 발아를 고려할 때 스테인버그 배지(Steinberg's medium) 또는 호그랜드 배지(Hoagland's medium)인 것이 바람직하다.In addition, the water sample may further comprise a medium used for culturing a slug separated from frog, preferably as a control for raw water, which does not contain a toxic substance that inhibits the germination of the slug separated from the frog desirable. The kind of the toxic substance which inhibits the germination of the immature frog separated from the frog is not limited to a wide range and is, for example, silver (Ag), aluminum, arsenic (As), cadmium (Cadmium) Co, Cobalt, Cr, Chromium, Copper, Iron, Mercury, Nickel, Pb, Selected from the group consisting of Zinc, acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethyl alcohol, formaldehyde, methanol and phenol. There is more than one kind. The culture medium for slug isolated from frog rice constituting the control group is selected from a variety of known media and the like, and the type thereof is not particularly limited. For example, in consideration of smooth cultivation and germination of slug isolated from frog, (Steinberg ' s medium or Hoagland ' s medium).
또한, 상기 원수, 희석 원수들 또는 원수의 대조군 등을 포함하는 수체 샘플은 배양용 용기에 넣어지기 전 또는 배양용 용기에 넣어진 후, 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 원활한 배양 및 발아를 고려할 때 필요한 경우 pH가 5~8, 바람직하게는 6~8이 되도록 조정되는 것이 바람직하다.
In addition, the water sample containing the raw water, the diluted raw water or the control water of the raw water is put into a container for culture before putting it in a container for culture or in a container for culture, and then it is necessary when considering the smooth cultivation and germination of the slit separated from the frog it is preferable that the pH is adjusted to 5 to 8, preferably 6 to 8.
배양용 용기A culture container
배양용 용기는 수체 샘플 및 개구리밥으로부터 분리된 잠아를 수용하고, 이후 배양기에 넣어져 잠아를 배양하기 위한 것으로서, 그 형태는 크게 제한되지 않으며, 일 예로 웰 플레이트(Well plate), 삼각플라스크(Erlenmeyer flask) 등이 있다. 웰 플레이트는 적어도 6개 이상의 웰(Well)을 포함하는 것이 바람직한데, 1개의 웰에는 대조군으로서 독성물질을 포함하지 않는 인공 배지를 넣어 잠아를 배양하고, 나머지 5개의 웰에는 원수와 4개의 희석 원수들을 넣어 잠아를 배양한다. 또한, 웰 플레이트는 다양한 원수들의 수질 독성을 한번에 평가할 수 있는 측면을 고려할 때 더 바람직하게는 12개 이상의 웰, 가장 바람직하게는 24개 이상의 웰을 포함하는 것이 바람직하다. 삼각플라스크의 크기는 크게 제한 되지는 않으나 200㎖ 내지 100㎖인 것이 바람직하다.
The culture container is a container for storing a water sample and frozen rice separated from the frozen rice, and then putting it in an incubator to cultivate the frozen food. The shape of the culture container is not limited. For example, a well plate, Erlenmeyer flask ). It is preferable that the well plate includes at least six wells. In the wells, artificial medium containing no toxic substance is added as a control group to cultivate the embryo. In the remaining five wells, raw water and four dilution enemies Put the slices to incubate. Further, considering that the water plate toxicity of various raw water can be evaluated at one time, it is more preferable that the well plate includes at least 12 wells, most preferably at least 24 wells. The size of the Erlenmeyer flask is not particularly limited, but is preferably 200 ml to 100 ml.
개구리밥으로부터 분리된 잠아A frog separated from a frog
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 평가 지표 물질로 개구리밥으로부터 분리된 잠아를 이용한다. 이때, 상기 잠아는 구체적으로 개구리밥의 모엽상체에서 분리된 것이다. 본 발명에서 모엽상체는 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체에 대한 상대적인 개념이다. 본 발명에서 사용되는 개구리밥의 모엽상체에서 분리된 잠아는 휴면 상태를 유지하도록 냉장 조건(예를 들어 0~5℃)에서 보관되는 것이 바람직하다. 또한, 잠아는 일반적으로 냉장 조건과 같은 저온에서 보관될 때 원활한 발아를 위해 일정 시간의 경과를 필요로 한다. 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 발아를 유도한 후 나타나는 다양한 특성을 수질 평가를 위한 파라미터로 이용하는바, 본 발명에서 사용되는 개구리밥으로부터 분리된 잠아는 냉장 조건에서 적어도 2개월 이상 보관된 것이 바람직하고, 2개월 이상 내지 6개월 이하로 보관된 것이 더 바람직하다.
The method for evaluating the water toxicity according to the present invention uses a slug separated from frog rice as an evaluation index substance. At this time, the slug is specifically separated from the mother lobes of the frog. In the present invention, the mother lobes are relative concepts of the hypothalamus of the frog prepared by germination of the louse. The frozen slices separated from the mother lobes of the frozen rice used in the present invention are preferably stored under refrigeration conditions (for example, 0 to 5 ° C) to maintain a dormant state. In addition, when stored at a low temperature such as a refrigeration condition, it usually takes a certain time for smooth germination. The water quality toxicity evaluation method according to the present invention uses various characteristics after inducing germination of frog separated from frog rice as a parameter for water quality evaluation. The frog separated from frog rice used in the present invention is at least 2 months Or more, more preferably from 2 months to 6 months or less.
개구리밥으로부터 분리된 Frog 잠아의Sleepy 배양 culture
개구리밥으로부터 분리된 잠아 및 수체 샘플을 함유하는 배양용 용기는 배양기에 옮겨지고, 이후 소정 시간 동안 잠아가 배양된다. 이때, 배양 시간은 크게 제한되지 않으나 수질 독성 평가의 신뢰성을 확보하는 측면에서 적어도 2일 이상인 것이 바람직하고, 2~4일인 것이 더 바람직하며, 3~4일인 것이 가장 바람직하다. 또한, 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양시 광 조사량은 50~150 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 바람직하고, 75~150 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 더 바람직하며, 90~120 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 가장 바람직하다. 또한, 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양시 배양 온도는 15~35℃인 것이 바람직하고, 20~30℃인 것이 더 바람직하다.
The incubation vessel containing the submerged and water sample separated from the frog is transferred to an incubator and then incubated for a predetermined time. At this time, the culture time is not limited, but is preferably at least 2 days, more preferably from 2 to 4 days, most preferably from 3 to 4 days, from the viewpoint of securing the reliability of the evaluation of water quality toxicity. In addition, it is preferable that the amount of light irradiation is 50 to 150 mu mol photon / m < 2 > s, more preferably 75 to 150 mu mol photon / m < / M < 2 > The incubation temperature for incubation of frogs separated from frogs is preferably 15 to 35 ° C, more preferably 20 to 30 ° C.
잠아의Sleepy 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 뿌리 길이 측정 Measurement of leaf area or root length of frog prepared by germination
개구리밥으로부터 분리된 잠아를 수체 샘플이 담겨진 배양용 용기에 넣고 전술한 특정 배양 조건에서 약 72시간 동안 배양하면 잠아가 발아되면서 개구리밥의 자엽상체가 형성되고 뿌리가 생장한다. 배양이 완료된 후 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 뿌리 길이를 측정하고, 이로부터 수질 독성을 평가할 수 있다. 구체적으로, 수질 독성은 원수 및 희석 원수들에서 배양된 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적을 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적과 비교하여 평가된다. 또한, 수질 독성은 원수 및 희석 원수들에서 배양된 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 생장 길이를 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 생장 길이와 비교하여 평가될 수도 있다. 이때, 수질 독성에 대한 정량적인 값은 반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50) 내지 무영향 농도(No Observed Effect Concentration, NOEC) 값으로 표시된다.When a slit separated from frogs is placed in a culture container containing a water sample and cultured for 72 hours under the above-mentioned specific culture condition, the slit germinates and the hypothalamus of the frog is formed and the roots grow. After the cultivation is completed, the leaf area or the root length of the frog prepared by the germination of the slug can be measured and the water quality toxicity can be evaluated therefrom. Specifically, the water toxicity was evaluated by comparing the area of cytoplasm of frog rice formed by the germination of frozen rice cultivated in raw water and diluted raw water with that of frog rice formed by germination of frozen rice cultivated in a control group containing no toxic substance . In addition, the water toxicity was evaluated by comparing the root growth length of the frog prepared by the germination of the submerged root cultured in the raw water and the diluted seeds with the root growth length of the frog prepared by the germination of the submerged cultured in the control group containing no toxic substance . At this time, quantitative values for water quality toxicity are expressed as Half maximal effective concentration (EC 50 ) to No Observed Effect Concentration (NOEC) values.
반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50)는 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 또는 뿌리 생장 길이가 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 또는 뿌리 생장 길이보다 50% 감소하는 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 단일 독성 물질의 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 원수의 희석률로 표시된다. 무영향 농도는 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 또는 뿌리 생장 길이가 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 또는 뿌리 생장 길이와 유의적 차이가 없는 수준으로 유지되는 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 반수 유효 농도와 마찬가지로 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 희석률로 표시된다. 한편, 반수 유효 농도의 크기와 커질수록 실제 수체 샘플의 독성은 상대적으로 작다는 것을 의미하기 때문에 반수 유효 농도를 실제 수체 샘플 독성으로 환산하기 위해 독성 단위(Toxic Unit, TU)을 다음과 같이 표시할 수 있다.The half-maximal effective concentration (EC 50 ) was calculated as the area of the cytoplasm of the frog or the root length of the frog formed by the germination of the frog. The leaf area of the frog formed by the germination of the frog cultured in the control group, Or a concentration of a water sample which is reduced by 50% of the root growth length, in the case of a water sample containing a single toxic substance, in the case of an unknown water indicated by a specific concentration of a single toxic substance and containing a plurality of toxic substances, Of the dilution rate. The no effect concentration was significantly different from the area of cytoplasmic area of the frog rice formed by the germination of the slug or the root growth length of the frog rice formed by the germination of the slug cultivated in the control group without the toxic substance Means the concentration of a bodily sample which is maintained at an undetectable level. As with the half effective concentration, in the case of a water sample containing a single toxic substance, in the case of an unknown water indicated by a specific concentration and containing a plurality of toxic substances, do. On the other hand, since it means that the larger the size of the half effective concentration and the larger the toxicity of the actual water sample is, the more toxic unit (Toxic Unit, TU) .
TU = 100/반수 유효 농도(%)
TU = 100 / half effective concentration (%)
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법의 용도Use of the method for evaluating the water toxicity according to the present invention
본 발명의 수질 독성 평가 방법으로 진단 가능한 독성 물질은 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc) 등과 같은 중금속 류가 있다. 또한, 본 발명의 수질 독성 평가 방법은 하수 및 폐수 오니를 투척하기 전에 생태계에 부정적인 영향을 끼치지 않도록 하기 위해서 취해야할 오니 희석 배수를 신속하게 결정하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종래의 화학적 분석 방식에 의존한 수질 오염 측정법에 내재된 문제점 중 미지의 독성 물질이 수체 내에 투입되었을 때 그것을 탐지해낼 수 없고, 더 나아가 화학적 분석에 의한 결과 수치만을 가지고는 실제 생태계에 끼칠 수 있는 수질 오염의 영향에 대해 전혀 예측할 수가 없다는 단점을 보완한 실용적인 기법이라고 할 수 있다.
Toxic substances that can be diagnosed by the method of the present invention include silver (Ag), aluminum (Al), arsenic (As), cadmium (Cad), cobalt A heavy metal such as chromium (Cr), copper (Cu), iron (Fe), mercury (Hg), nickel (Ni), lead (Pb) There is. The water quality toxicity assessment method of the present invention can also be useful for quickly determining the sludge dilution factor to be taken in order to prevent negative impacts on the ecosystem before throwing the sewage and wastewater sludge. The method of the present invention can not detect an unknown toxic substance in a water body when the toxic substance in the water pollution measurement method depending on the conventional chemical analysis method is introduced into the water body and further, Which can not be predicted at all by the effect of water pollution.
본 발명의 또 다른 측면은 판별 시간이 짧고, 조작이 간단하며, 다양한 독성물질에 대해 높은 민감성을 가지는 수질 독성 평가 방법을 구현할 수 있는 수질 독성 평가 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 개구리밥으로부터 분리된 휴면상태의 잠아를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 바람직하게는 잠아 배양용 용기, 수체 샘플 희석용 인공 배지 또는 독성물질 표준용액을 더 포함할 수 있다. 상기 잠아 배양용 용기는 수체 샘플 및 개구리밥으로부터 분리된 휴면상태의 잠아를 수용하고 잠아를 배양하기 위한 용기로서, 일 예로 웰 플레이트(Well plate), 삼각플라스크(Erlenmeyer flask) 등이 있다. 또한, 상기 수체 샘플 희석용 인공 배지는 원수로부터 희석 원수들을 제조하기 위해 사용되는 희석수로서, 일 예로 스테인버그 배지(Steinberg's medium) 또는 호그랜드 배지(Hoagland's medium) 등이 있다. 또한, 상기 독성물질 표준용액은 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 발아를 저해하는 물질을 미리 설정된 농도가 되게 제조한 것이다. 본 발명에서 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 발아를 저해하는 독성물질로는 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 또는 페놀(Phenol) 등이 있고, 독성물질 표준용액은 이들로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 독성물질 표준용액은 수체 샘플의 수질 독성을 평가하기 전에 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 상태, 즉 독성물질에 대한 반응 감응성 여부를 테스트하는데 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 독성물질 표준용액이 구리를 독성물질로 포함하는 용액인 경우, 다양한 구리 용액 및 대조군에서의 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 뿌리 생장 길이에 대한 데이터를 미리 확보한 후 이를 수질 독성 평가 키트와 함께 제공할 수 있다. 사용자는 구리 용액에 대해 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 또는 뿌리 생장 길이를 측정하고 이를 미리 제공된 데이터와 비교하여 개구리밥으로부터 분리된 잠아가 독성물질에 대해 정상적으로 반응하는지 여부를 판단하고, 일정 범위(예를 들어, 본래 반응 감응성의 80% 이상)의 반응 감응성을 보이는 경우 미지의 수체 샘플에 대한 수질 독성 평가를 진행할 수 있다.
Another aspect of the present invention relates to a water toxicity evaluation kit capable of realizing a water toxicity evaluation method having short discrimination time, simple operation, and high sensitivity to various toxic substances, Includes a dormant sleeping state separated from the frog. In addition, the water quality toxicity evaluation kit according to the present invention may further include a container for incubation, an artificial medium for diluting a water sample, or a toxic substance standard solution. The submerged culture container is a container for accommodating a sleeping state of a dormant state separated from a water sample and a frog, and cultivating the submerged fish. Examples of the container include a well plate, a Erlenmeyer flask, and the like. In addition, the artificial culture medium for diluting a water sample is diluted water used for producing diluted raw water from raw water, for example, Steinberg's medium or Hoagland's medium. In addition, the toxic substance standard solution is prepared so as to have a predetermined concentration of a substance inhibiting germination of the subspecies separated from the frog. In the present invention, poisonous substances which inhibit germination of frogs separated from frogs are silver (Ag), aluminum, arsenic (As), cadmium (Cad), cobalt (Co) Chromium, Copper, Iron, Hg, Nickel, Lead, Zinc, and Acetone are the main components of the system. , Chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethyl alcohol, formaldehyde, methyl alcohol or phenol, and toxic substance standard solutions are selected from them And may include one or more species. The toxic substance standard solution can be used to test the state of the immune system separated from the frog, that is, the response sensitivity to toxic substances, before evaluating the water toxicity of the water sample. Specifically, when the standard solution of the toxic substance according to the present invention is a solution containing copper as a toxic substance, data on the throat area or root growth length of the frog prepared by germination of the submerged in various copper solutions and the control group are obtained in advance Which can then be provided with a water quality toxicity assessment kit. The user measures the leaf area of the frog or the root growth length of the frog formed by the germination of the frog in a copper solution and judges whether or not the frog separated from the frog is normally reacting with the toxic substance by comparing with the data provided in advance, (For example, 80% or more of the original response sensitivity), the evaluation of the water quality of an unknown water sample can be carried out.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the following embodiments are intended to clearly illustrate the technical features of the present invention, and do not limit the scope of protection of the present invention.
1. One. 스테인버그Steinberg 배지( badge( SteinbergSteinberg mediummedium ))
표 1은 본 발명의 실시예에서 사용된 인공 배지인 스테인버그 배지에 포함되는 성분과 농도를 나타낸 것이다. 표 1에 나타나는 바와 같이 인공 배지는 총 5개의 스톡 용액(Stock solution)을 포함하며, 각각의 스톡 용액은 개구리밥의 배양에 필요한 무기 성분 내지 유기 성분을 포함하는 용액으로 구성된다. 또한, 스테인버그 배지의 pH는 7±0.2 수준이다.Table 1 shows the components and concentrations contained in the stain bug medium used as the artificial medium used in the examples of the present invention. As shown in Table 1, the artificial medium contains a total of 5 stock solutions, and each stock solution is composed of a solution containing an inorganic component or an organic component necessary for culturing the frog. The pH of the Stainberg medium is 7 ± 0.2.
성분의 종류Constituting the stock solution
Types of Ingredients
부피(㎖/ℓ)The stock solution per liter of artificial medium
Volume (ml / l)
2. 독성물질 표준용액의 제조2. Preparation of toxic substance standard solutions
단일 금속류 독성물질로 각각 은(Ag), 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 구리(Cu) 및 수은(Hg)을 각각 포함하는 독성물질 표준용액을 준비하였다. 또한, 독성물질 표준용액을 반수 희석법에 의해 Steinberg 배지로 희석하여 초기 농도의 50%, 25%, 12.5%, 6.25%로 희석된 독성물질 표준용액을 준비하였다. 이때, 독성물질 표준용액 및 희석된 독성물질 표준용액의 pH는 1M 염산용액이나 1M 수산화나트륨 용액을 사용하여 7±0.2로 조정한 것이다.
A toxic substance standard solution containing silver (Ag), cadmium (Cd), chromium (Cr), copper (Cu) and mercury (Hg) was prepared as a single metal toxic substance. In addition, a toxic substance standard solution was diluted with a Steinberg medium by a half-dilution method to prepare a toxic substance standard solution diluted to 50%, 25%, 12.5%, and 6.25% of the initial concentration. At this time, the pH of the toxic substance standard solution and diluted toxic substance standard solution is adjusted to 7 ± 0.2 using 1M hydrochloric acid solution or 1M sodium hydroxide solution.
3. 독성물질 표준용액 상에서 개구리밥으로부터 분리된 3. Separated from the frog in the toxic substance standard solution 잠아의Sleepy 배양 culture
24웰 플레이트의 웰에 대조군 용액, 독성물질 표준용액 및 희석된 독성물질 표준용액을 각각 3㎖씩 넣고, 여기에 개구리밥으로부터 분리된 잠아를 웰 당 1개씩 넣었다. 이때, 잠아는 성숙한 국내산 개구리밥 개체의 모엽상체에서 분리된 것을 채취한 후 빛을 차단한 조건에서 약 2개월 이상 4℃에서 냉장보관한 것을 사용하였다. 이후, 웰의 뚜껑을 덮고 파라필름으로 웰 주변을 감아 밀봉하였다. 이후, 24웰 플레이트를 배양기에 옮겨 넣고, 90~100 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량(광 주기는 24시간 연속광 조건임) 및 25℃의 온도에서 72시간 동안 배양하였다. 동일한 조건의 실험을 총 3회 반복하였다.
To each well of a 24-well plate, 3 ml of each of the control solution, the toxic substance standard solution and the diluted toxic substance standard solution was added to each well, and one slice separated from the frog was added to each well. At this time, the slime was separated from the mother lobes of the mature domestic frog populations and stored in a refrigerator at 4 ° C for 2 months or more under the condition of blocking light. Then, the lid of the well was covered, and the periphery of the well was wrapped with a parafilm and sealed. The 24-well plate was then transferred to an incubator and incubated for 72 hours at a light dose of 90-100 mu mol photon / m < 2 > s (light period was 24 hours continuous light condition) The experiment under the same condition was repeated three times in total.
4. 4. 짐아의Jim's 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적 및 뿌리 생장 길이 The leaf area and roots growth length of frog prepared by germination 측정Measure
배양 개시 후 약 48시간이 경과하면 잠아가 표면으로 떠오르고 72시간이 경과하면 잠아의 발아에 의해 개구리밥의 자엽상체가 형성되고 뿌리가 생장한다. 배양 개시 후 72시간이 경과하였을 때 각 웰에서 발아된 잠아를 꺼낸 후 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 사진을 촬영하였다. 이후, 영상분석 프로그램을 이용하여 촬영한 사진 속의 개구리밥 자엽상체 면적 및 뿌리 생장 길이를 측정하였다.When about 48 hours have elapsed after the initiation of incubation, the submerged surface floats to the surface. When 72 hours have elapsed, the submerged thorns of the frog bud are formed by the germination of the submerged root and the root is grown. When 72 hours had elapsed after the initiation of the incubation, the germinated germinated in each well was taken out and placed on a slide glass and photographed. Then, the area of the foliage of the frog and the root growth length in the photographs were measured using the image analysis program.
도 1은 독성물질인 은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 2는 독성물질인 카드뮴의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 3은 독성물질인 크롬의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 4는 독성물질인 구리의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이고, 도 5는 독성물질인 수은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화를 나타낸 것이다.FIG. 1 is a graph showing changes in the area of cytoplasmic area of frog rice formed by germination of a slug according to the concentration of silver, which is a poisonous substance. FIG. FIG. 3 shows changes in the area of cytoplasmic area of the frog prepared by germination of the frog according to the concentration of chromium which is a poisonous substance. FIG. 4 shows the change in the area of the frog rice formed by germination of the frog according to the concentration of copper, Fig. 5 shows changes in the area of cytoplasmic area of frog rice formed by the germination of the louse according to the concentration of mercury which is a toxic substance.
또한, 도 6은 독성물질인 은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 7은 독성물질인 카드뮴의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 8은 독성물질인 크롬의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 9는 독성물질인 구리의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이고, 도 10은 독성물질인 수은의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화를 나타낸 것이다.
FIG. 6 shows changes in the root length of the frog prepared by germination of the slug according to the concentration of silver, which is a toxic substance. FIG. 7 shows changes in the root length of the frog prepared by germination of the slug according to the concentration of the toxic substance cadmium FIG. 8 shows the root length change of frog rice formed by the germination of the molasses depending on the concentration of chromium which is a toxic substance, FIG. 9 shows the root length of frog rice formed by germination of the molasses according to the concentration of copper, FIG. 10 shows changes in the root length of frog rice formed by the germination of the subspecies according to the concentration of mercury which is a toxic substance.
5. 단일 금속류 독성물질의 수질 독성 평가5. Assessment of water toxicity of single metal toxic substances
도 1 내지 도 5에 도시된 독성물질의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적 변화 또는 도 6 내지 도 10에 도시된 독성물질의 농도에 따른 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이 변화로부터 단일 금속류 독성물질 각각의 반수 유효 농도(EC50) 내지 무영향 농도(NOEC)를 계산하였다. 이때 EC50 값은 점예측기법(point estimation techniques)을 써서 계산하였고, NOEC 값은 Dunnett 과정과 같은 가설 검정 방법을 써서 계산하였다.The root of the frog, formed by the germination of the frog according to the change in the area of the self-lobular body of the frog, formed by the germination of the frog, according to the concentration of the toxic substance shown in Figs. 1 to 5 or the concentration of the toxic substance shown in Figs. From the change in length, the half effective concentration (EC 50 ) to no effect concentration (NOEC) of each of the single metal toxicity substances was calculated. The EC 50 values were calculated using point estimation techniques, and the NOEC values were calculated using hypothesis testing methods such as the Dunnett procedure.
표 2는 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적과 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이를 수질 독성 평가를 위한 기준 파라미터로 준으로 하였을 때의 단일 금속류 독성물질 각각의 반수 유효 농도(EC50) 내지 무영향 농도(NOEC)를 나타낸 것이다.Table 2 shows the half-effective concentration (EC) of each single metal toxic substance when the leaf area of the frog rice formed by the germination of the slug and the root length of the frog prepared by the germination of the slug were taken as reference parameters for evaluating the water quality toxicity 50 ) to no effect concentration (NOEC).
표 2에서 보이는 바와 같이 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 뿌리 길이를 수질 독성 평가를 위한 기준 파라미터로 하였을 때 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 자엽상체 면적을 최대 양자수율(Fv/Fm)을 수질 독성 평가를 위한 기준 파라미터로 하였을 때보다 단일 금속류 독성물질에 대해 반응 민감성이 높은 것으로 나타났다.
As shown in Table 2, when the root length of frog prepared by the germination of submerged poultry was used as a reference parameter for evaluation of water quality toxicity, the maximum quantum yield (Fv / Fm) It was found that the sensitivity of the single metal toxicity substance was higher than that of the standardized parameter.
상기의 실시예에서는 비록 성분과 농도가 특정된 독성 물질에 의한 수질 독성을 평가하였으나, 미지의 독성 물질을 포함하는 수체 샘플에 변형되어 실시될 수 있고, 그때의 EC50 값이나, NOEC 값을 통해 미지의 독성 물질이 수질에 미치는 영향을 파악할 수 있음은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.
Although the water toxicity of a toxic substance identified by a component and a concentration is evaluated in the above example, it can be modified and applied to a water sample including an unknown toxic substance, and the EC 50 value or the NOEC value at that time It will be apparent to those skilled in the art that the effect of unknown toxic substances on water quality can be known to those skilled in the art.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 특정 실시 형태로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. Accordingly, the scope of protection of the present invention is not limited to the specific embodiments but should be construed as including all embodiments belonging to the claims attached hereto.
Claims (12)
(b) 수체 샘플을 함유하는 배양용 용기에 개구리밥으로부터 분리된 잠아를 투입하는 단계;
(c) 배양용 용기에 투입된 잠아를 배양하여 발아시키는 단계; 및
(d) 잠아의 발아에 의해 형성된 개구리밥의 엽상체 면적을 측정하는 단계를 포함하는 수질 독성 평가 방법.
(a) placing a water sample in a culture vessel;
(b) injecting a louse separated from the frog into a culture container containing a water sample;
(c) culturing the gill inserted into the culture container and germinating; And
(d) measuring the leaf area of the frozen rice formed by germination of the slipped fish.
상기 희석 원수는 원수를 개구리밥으로부터 분리된 잠아의 배양용 배지로 희석하여 제조된 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
The method according to claim 1, wherein the water sample of step (a) is composed of at least two dilution raw water having different raw water and dilution multiples,
Wherein the dilution raw water is prepared by diluting the raw water with a medium for incubation of a slime separated from frog.
3. The method according to claim 2, wherein the dilution raw water is diluted by a half-dilution method.
상기 배지는 잠아의 발아를 저해하는 독성물질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
3. The method according to claim 2, wherein the water sample further comprises a culture medium for incubation of a slug separated from frog rice as a control for raw water,
Wherein the medium does not contain a toxic substance that inhibits germination of the immature child.
The method of claim 4, wherein the toxic material is selected from the group consisting of Ag, Al, Arsenic, Cadmium, Co, Cobalt, Cr, Chromium, Copper, Iron, Hg, Nickel, Lead, Zinc, Acetone, Chloroform, Dimethyl, and the like. Characterized by comprising at least one selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide (DMSO), ethyl alcohol, formaldehyde, methyl alcohol and phenol. .
The method according to claim 1, wherein the water sample of step (a) is adjusted to a pH of 5 to 8.
The method according to claim 1, wherein the slug separated from the frog in step (b) is in a dormant state.
The method according to claim 1, wherein the slug isolated from the frog in step (b) is stored for at least 2 months under refrigerated condition.
The method according to claim 1, wherein the culturing temperature in step (c) is in the range of 15 to 35 ° C, the irradiation amount is 50 to 150 μmol photon / m 2 · s, and the culturing time is 2 to 4 days. Toxicity assessment method.
A water quality toxicity evaluation kit comprising a sleeping dormant separated from frog.
상기 독성물질은 잠아의 발아를 저해하는 물질로서, 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 키트.
11. The method of claim 10, wherein the kit further comprises a submerged culture vessel, an artificial medium for diluting a water sample, or a toxic substance standard solution,
The poisonous substance is a substance which inhibits germination of a sleeping child, and it is a substance which inhibits the germination of a sleeping child, such as silver (Ag), aluminum, arsenic, cadmium, cobalt, chromium, Copper, Iron, Hg, Mercury, Nickel, Lead, Zinc, Acetone, Chloroform, Chloroform, ), At least one member selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide (DMSO), ethyl alcohol, formaldehyde, methanol and phenol. Toxicity assessment kit.
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