KR101525933B1 - 착색 물질을 포함한 관상어용 착색제 및 이를 이용한 사료 및 어류 착색 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 포함하는 어류용 착색제에 관한 것으로, 상기 착색제를 어류용 사료에 첨가제로서 혼합하여 사료를 제조하여 급이하거나 사육액에 첨가하여 표피에 착색시켜서 어류를 단기간에 용이하게 착색시킬 수 있다.

Description

착색 물질을 포함한 관상어용 착색제 및 이를 이용한 사료 및 어류 착색 방법{COLORING AGENT FOR TROPICAL FISH COMPRISING COLORING MATERIALS, FEED USING THE SAME AND A METHOD FOR COLORING FISH}
본 발명은 착색 물질을 포함한 관상어용 착색제 및 이를 이용한 사료 및 어류 착색 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 포함하는 어류용 착색제, 상기 착색제를 어류용 사료에 첨가제로서 혼합하여 사료를 제조하여 급이하거나 사육액에 첨가하여 표피에 착색시키는 방법에 관한 것이다.
최근 생활수준의 향상과 함께 육상 애완동물뿐만 아니라 관상어에 대한 관심이 날로 높아가고 있다. 단순 취미생활에서 벗어나 체험학습 및 정서적 안정을 목적으로 하는 활동 인구가 증가하면서 다양한 종류의 관상어가 활발하게 유통되고 있다.
전통적으로 농·수산업의 경우 우량 품종의 선발 및 육종, 사양관리기술의 개선 등을 통해 생산성을 증가시켜 왔다. 그러나 이러한 방법만으로는 동물 자체의 유전적 한계성 때문에 더 이상 획기적인 성과를 기대하기 어렵다. 그러나 최근 유전자조작과 같은 급속한 유전공학기술의 발달은 재래식 유전형질 개선 방법이 안고 있는 동일 종 내 형질 및 유전자 변이 폭의 제한성, 오랜 연구기간의 소요와 같은 기술적 한계를 과거에 비해 훨씬 쉽고 단시간에 극복할 수 있는 길을 열어주었다. 국내에서도 유전자 이식을 통해 어류의 품종을 개량하려는 시도가 도입되어 육종에 응용함으로써 여러 종류의 형질전환어류를 개발하여 유전적 자원의 한계를 극복하고자 하는 노력이 있어 왔다.
하지만 유전자조작 기술에 의한 종의 개량은 환경 위해성의 문제로 인해 국내에 활발히 유통되지 못하고 있으며, 유통되기 위해서는 LMO 생물의 위해성 평가가 선행되어야 하는 실정이다. 따라서, 어류를 대상으로 하는 품종개량은 전통적인 육종 방법, 즉 선발육종 방법이 여전히 주를 이루고 있으며 중요한 의미를 갖는다. 그러나 이러한 전통적인 육종 방법은 확률 의존적이며 오랜 시간이 걸리며 종 자체가 갖는 유전자원의 한계를 극복하기 어렵기 때문에 이러한 문제점을 극복하기 위한 해결방안이 필요하다.
특히 관상어의 경우, 체형, 지느러미 모양, 크기 및 체색 등에 대한 수요자의 기호에 따라 다양한 품종이 개발되고 있으나 관상어라는 특성상 체색 형질이 상품가치를 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나로 평가받고 있다. 이에, 국내외의 다수 연구자들이 관상어를 대상으로 착색발현을 유도하기 위한 다양한 연구를 진행하고 있다.
일반적으로 어류의 체색 또는 육색의 변이를 위해 사용하는 기술 중 하나는 카로티노이드(carotinoid)와 같은 천연 색소를 포함한 사료 첨가제를 이용하여 착색하는 것이다. 현재 국내외적으로 카로티노이드가 풍부한 먹이 또는 제품으로서 스피룰리나, 클로렐라, 아스타크산틴이나, 제아키산틴, 루테인이 풍부한 사료를 공급함으로써 체내에 축적시킴으로써 발색의 변이, 유지, 또는 강화를 꾀하고 있다. 그 결과, 관상용 잉어의 경우, 현재까지 100여 가지 체색의 색상 변이를 보이는 품종들이 개발되어 왔다. 이외에도, 염료를 이용하여 표피에 직접 염색하거나 피하주사 방법을 통해 착색발현을 유도하는 기술이 일부 동남아 국가에서 시행되고 있다.
한편, 현재까지 등록된 카로테노이드계 착색제와 관련된 특허로는 기능성 사료 혹은 어류를 대상으로 하는 종래 기술로는 우렁쉥이 껍질색소를 이용한 연어류 육색용 인공착색제의 제조방법(10-1992-0001015), 아스탁잔틴 색소를 함유한 기능성 계란의 제조방법(10-1994-025235), 비타민 강화란 생산을 위한 양계사료(10-1997-0063560), 갑각류 또는 키틴 제조부산물로부터 색소를 분리하는 방법 및 이를 주원료로 하는 어류 또는 산란계용 착색제 조성물(10-2000-0074180), 공역 리놀레인산을 어류 지질 성분으로 전환시키면서 어류의 성장율을 동시에 개선시키기 위한 어류용 사료 및 그 용도(10-2007-0041685) 등이 공지되어 있다. 또한, 최근에는 비단잉어의 체색발현의 효과적인 재료원이 아스타크산틴임을 밝혀내어 고가의 스피루리나를 대체할 수 있다는 연구결과도 있었다(김이오, 사료에 첨가된 스피루리나, 클로렐라, 아스타크산틴이 비단잉어 치어의 체색과 성장에 미치는 영향, 부경대학교, 2008. 2).
그러나 다수의 연구 결과에도 불구하고, 여전히 수입 관상어가 관상어 시장의 거의 70% 이상을 점유하고 있으며, 사료에 첨가되는 색소도 거의 전량 수입에 의존하여 양식업체에 큰 부담이 되고 있으며, 관상어에 대한 체색 관련 요소들에 대한 체계적인 연구가 미흡한 실정이다. 따라서, 저비용이면서 단기간에 우수한 고부가가치 칼라관상어 품종을 개발할 수 있는 방법에 대한 연구가 시급한 상황이다.
본 발명자는 상기 문제점을 해결하기 위해, 어류의 체색에는 어류의 크기, 나이, 사료의 조성, 사료의 공급 기간, 착색제의 종류 및 농도, 유전적인 요인 등의 요소와 함께 서식환경적인 요인이 관여함을 인식하고, 이들 체색 관련 요소들에 대한 체계적인 실험 및 분석을 수행하였습니다. 그 결과, 종래에는 사용된 적이 없는 유용한 착색 물질을 개발하였고 이를 적절한 농도로 사료에 첨가시 어체의 성장에는 영향을 주지 않으면서도 우수한 착색효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였습니다. 본 발명의 착색 물질을 이용할 경우, 저비용이면서 단기간에 우수한 고부가가치 칼라관상어 품종을 개발할 수 있어서 국내에서 칼라관상어 생산기술로 실용화될 경우 관상어 수입 대체 효과는 물론 국내 관상어 사료 산업의 발전에 크게 기여할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 착색 물질로서 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 포함하는 어류용 착색제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 어류용 사료에 첨가제로서 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 혼합하여 사료를 제조하는 단계 및 상기 제조된 사료를 어류에 급이하는 단계를 포함하는, 어류 착색 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 어류용 사육수에 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 첨가하여 희석된 착색액을 만드는 단계 및 상기 착색액에 어류를 사육하여 표피에 착색시키는 단계를 포함하는, 어류 착색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 어류 체색의 착색 물질로서 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 포함하는 어류용 착색제를 제공한다.
상기 나일 블루 A는 주로 세포를 염색하는데 사용하는 푸른색의 형광성 염기성 물감인 나일 블루의 황산염을 말하며, 화학식은 C20H20N30)2SO4이다. 나일 블루 A는 또한 산 염기 지시약으로 사용되기도 한다. 본 발명의 착색제로서 어류 착색 효과를 나타내며 조직병변을 나타내지 않는 한 나일 블루 A의 유도체 또한 포함한다.
상기 로다민 B는 염기성 염료의 하나로서 로다민 B 및 그 유도체를 총칭하여 로다민이라 한다. 로다민 B는 금속 광택이 나는 녹색의 작은 결정 또는 적자색 가루이며, 물·에탄올·황산·아세톤 등에 녹고, 용제에 따라 각각 다른 색으로 변한다. 염산·수산화나트륨 용액에는 녹기 어렵다. 수용액은 적청색이며, 차가울 때는 형광을 발한다. 무명·레이온·종이잡화 등에 밝은 적자색(赤紫色)으로 염색하는데 특히 색깔이 아름답다. m-다이에틸아미노페놀을 프탈산 무수물과 용융 축합시켜, 염산을 작용하면 염산염으로서 얻어진다. 로다민 B의 유도체로는 로다민 B토너, 로다민 B레이크, 로다민 6G토너, 로다민 6G레이크 등 유기안료 외에, 로다민 G, 로다민 6 GCP 등의 염기성 염료가 있다. 본 발명의 착색제로서 어류 착색 효과를 나타내며 조직병변을 나타내지 않는 한 로다민 B의 유도체 또한 포함한다.
본 발명에서 어류는 관상어일 수 있다. 관상어는 금붕어 ·비단잉어 ·열대어일 수 있으며, 송사리류 ·태래어류 ·메기류 ·미꾸리류 ·카라신류 또한 포함한다. 뿐만 아니라, 물의 순환여과나 인공해수의 사용 등 새로운 사육방식에 따라 나비고기류 ·자리돔류 ·놀래기류 ·쥐치복류 등 산호초어류나 연안에 사는 해수어까지도 상기 관상어에 포함될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 제브라피쉬, 스마트라, 코리도라스, 블랙 테트라, 니그로 시크리트 등을 들 수 있으나 체색이나 무늬가 아름다워 감상용 또는 애완용으로 키울 수 있는 것들을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 알비노 관상어에 천연착색제로서 카로티노이드 계열을 사용한 결과, 4주 후 일부 개체에서 색상 변화가 관찰되었으나 그 정도가 크지 않았으며, 오히려 백색이 누렇게 퇴색되는 결과를 보였다. 이는 카로티노이드는 어체 자체가 갖고 있는 색상의 발현을 향상시킬 뿐, 알비노 관상어의 경우에는 어체의 색소 결핍으로 인해 카로티노이드에 의한 효과가 미미한 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 나일 블루 A(Nile Blue A) 및/또는 로다민 B(Rhodamin B)을 사료에 첨가하여 알비노 관상어에 급이한 결과, 농도가 증가할수록 체색 발현도가 높게 나타났으며 신장 및 간에 대한 조직학적 영향도 관찰되지 않았으며 활발한 운동성을 보이는 것으로 나타났다.
따라서, 상기 나일 블루 A(Nile Blue A) 및/또는 로다민 B(Rhodamin B)는 어류용 착색제로서 사료에 첨가하여 사용시, 어체의 성장에는 영향을 미치지 않으면서 단기간에 푸른색 또는 붉은 색의 매우 우수한 체색 변이를 나타내는 것으로 판단되었다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 어류용 사료에 첨가제로서 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 혼합하여 사료를 제조하는 단계 및 상기 제조된 사료를 어류에 급이하는 단계를 포함하는, 어류 착색 방법을 제공한다.
또다른 하나의 양태로서 어류용 사육수에 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 첨가하여 희석된 착색액을 만드는 단계 및 상기 착색액에 어류를 사육하여 표피에 착색시키는 단계를 포함하는, 어류 착색 방법을 제공한다.
상기 착색 방법 이외에도 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 직접 어류에 접종하여 표피에 착색하는 법(피하주사법)을 사용할 수 있다.
본 발명의 착색 물질을 이용할 경우, 저비용이면서 단기간에 우수한 고부가가치 칼라관상어 품종을 개발할 수 있어서 국내에서 칼라관상어 생산기술로 실용화될 경우 관상어 수입 대체 효과는 물론 국내 관상어 사료 산업의 발전에 크게 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실험을 위해 자체생산한 알비노 제브라피쉬, 알비노 스마트라, 알비노 코리도라스, 알비노 니그로 시크리트이다.
도 2는 Nile Blue A(하늘색 발현)를 염료로 이용하여 염료의 농도를 각각 0.25(%), 0.5%, 0.75%, 1.0%로 설정한 실험구를 나타낸다.
도 3은 Rhodamin B(붉은색 발현)를 염료로 이용하여 염료의 농도를 각각 0.25(%), 0.5%, 0.75%, 1.0%로 설정한 실험구를 나타낸다.
도 4는 착색 사료 급이 후 24시간 경과(A), 2주 경과(B) 후의 Nile Blue A에 의한 착색 양상을 나타낸 것이다.
도 5는 착색 사료 급이 후 1개월 후의 Nile Blue A에 의한 푸른색 발현을 보이는 알비노 제브라를 나타낸 것이다.
도 6은 착색 사료 급이 후 24시간 경과(A), 2주 경과(B) 후의 Rhodamin B에 의한 착색 양상을 나타낸 것이다.
도 7은 Rhodamin B에 의한 농도별 어체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 Rhodamin B에 의한 농도별 어체장 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 Nile Blue A에 의한 농도별 어체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 Nile Blue A에 의한 농도별 어체장 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 일반적인 제브라 피쉬의 횡단면 조직을 광학현미경으로 관찰한 것이다.
도 12는 Nile Blue A, Rhodamin B 처리 1개월 후의 신장 조직의 광학현미경 사진이다.
도 13은 Nile Blue A, Rhodamin B 처리 1개월 후의 간 조직의 광학현미경 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 알비노 관상어의 확보
1. 사육조건
기존 연구 시스템을 개선하여 대량 생산 체계를 구축한 후, 친어 구입으로 다양한 어종의 자체 생산을 가능하게 한 후 알비노 제브라피쉬, 알비노 스마트라, 알비노 코리도라스, 알비노 니그로 시크리트를 자체 생산하였다 (도 1 참조).
사육조건은 실험 전 사육을 위해 브라인슈림프(Artemia)와 인공사료(표 1)를 공급하였고, 항온실에서 14시간 낮과 10시간 밤의 광주기 조건 (14L:10D)을 조성하였다. 알비노 제브라물고기는 광온성이어서 생육 적온을 28℃에서 순환여과식 시스템에서 사육하였다. 먹이 공급은 대조군은 제외하고 각각의 일반사료에 각 실험구별로 착색제의 농도를 달리하여 오전(9시), 정오(12시), 오후(5시) 3차례에 걸쳐 사료를 공급하였다.
사료조성
사료성분 함량(%)
Proximate composition Crude protein (%)
Crude fat (%)
Crude fiber (%)
Crude ash (%)
P (%)
Ca (%)
50이상
7이상
4이하
15이하
2.7이하
1.1이상
실시예 2: 사료 첨가제에 의한 착색 효과
천연 착색제 및 인공 착색제를 사료에 첨가하여 착색 효과를 알아보기 위해, 천연 착색제로서 카로티노이드 계열인 β-Carotene, Lycopene, Canthaxanthin를 사용하고, 인공 착색제로서 Nile Blue A, Rhodamine B, Neutral Red를 사용하였다. 구체적인 재료 및 방법은 다음과 같다.
1. 천연착색제에 의한 착색효과
(1) 재료 및 방법
사료첨가제 조제 : 시판하고 있는 관상용 사료를 실험에 이용하였다 (표 1). 기본 사료에 β-Carotene, Lycopene, Canthaxanthin을 각각 사료 1kg당 0, 25, 50, 75, 100mg의 농도 조건으로 설정하였다. 착색제 혼합사료는 착색제를 물에 녹여서 스프레이를 사용하여 사료에 뿌려가면서 건조시켜 조제하였다. 조제된 혼합사료는 사용시까지 냉장보관하였다.
처리기간 및 방법 : 각 실험구별 사료첨가제의 착색강도를 확인하기 위해 실험구별로 각각 10마리씩 배치한 후, 착색사료를 하루 3번(09:00, 12:00, 17:00)에 걸쳐 4주 동안 공급하였다. 사료 급이량은 어체의 식욕 정도를 관찰하면서 5분 이내에 완전 섭취가 가능할 정도로 급이하였다. 사료첨가제에 의한 착색 발현은 매일 마지막 급이 시간에 육안으로 확인 후 기록하였다.
본 실험에 사용된 천연 첨가제가 일반적으로 어체 성장과 면역 관련해서 긍정적인 역할을 한다고 알려져 있다. 하지만 대상 어종인 알비노 제브라 피쉬는 개체 크기가 작고 이미 성장이 완료된 성체를 사용한 관계로 의미가 없을 것으로 판단되며, 또한 착색 유도가 이루어지는 지에 대한 판단이 목적이므로 본 천연 첨가제에 의한 성장률(체장과 체중)은 평가하지 않았다.
(2) 착색 발현도
각각의 첨가제에 의한 착색 평가는 표피 색상 발현을 직접 유관분석을 통해 대조군과 비교하여 판단하였다. 매일 저녁 급이 시간을 기준으로 착색 유무를 관찰한 결과, 급이 후 2주 정도 되었을 때 농도 증가에 따라 각 그룹의 일부 개체에서 색상 변화가 미새하게 육안으로 관찰되었지만 대조군 내의 본래 가지고 있던 진한 색상의 알비노와의 뚜렷한 차이를 분간하기 어려울 정도였다. 또한 4주까지 처리한 실험군에서도 진척된 색상 변화가 육안으로 구분하기 어려운 정도의 색상 발현을 보였다. 카로티노이드는 어체 자체가 가지고 있는 색상의 발현을 향상시키게 된다. 그러나 백무지에게 카로티노이드를 함유한 먹이를 급여할 때 오히려 백색이 누렇게 퇴색되는 경우도 발생한다. 알비노 제브라의 경우는 어체의 색소 결핍으로 인해 이러한 카로티노이드에 의한 효과가 미미한 것으로 판단되었다.
2. Nile Blue A, Rhodamin B, Neutral red에 의한 착색 효과
(1) 재료 및 방법
Nile Blue A(하늘색 발현), Rhodamin B(붉은색 발현), Neutral Red(보라색 발현)을 염료로 이용하였다. 인공사료 100g에 대한 염료 희석량 0.25%을 기준으로 아래와 같이 실험구를 설정하였다.
- N-Blue A, Rhodamin B, Neutral Red에 대해 실험구별 염료의 농도를 각각 0.25(%), 0.5%, 0.75%, 1.0%로 설정하였다(도 2 및 도 3 참조).
- 혼합사료 조제 : 시판하고 있는 기본 열대어 사료(표 1)의 각 실험구 농도별로 염료 희석액 100㎖에 초산 0.7㎖가 섞인 혼합액을 스프레이를 이용하여 시판중인 인공사료 100g에 뿌리면서 골고루 섞어준다(표 2). 섞을 때는 사료를 넓게 펴고서 뿌린 염료 희석액이 사료와 함께 공기중에서 건조될 때까지 기다렸다가 또다시 섞는 과정을 되풀이하여 모든 희석액의 건조가 이루어짐을 확인한다. 건조된 혼합사료는 건조가에서 110℃로 90분 동안 완전 건조시켰다. 완전 건조된 혼합사료를 막자사발을 이용하여 물고기가 쉽게 먹을 수 있는 크기로 가루를 만들어서 습기가 없는 쳄버에 보관하면서 실험에 이용하였다.
Figure 112012101860126-pat00001
혼합사료 공급 : 사료는 하루 3차례에 걸쳐 물고기가 5분 안에 다 먹을 수 있을 정도로 충분히 공급하였다. 이후 바닥에 가라앉은 여분의 사료는 사육수의 혼탁을 방지하기 위해 사이폰을 이용하여 곧바로 제거해 주었다. 실험 기간은 사료 급이 후 5주까지 진행되었으며, 실험시작 24시간부터 매일 착색 정도를 유관평가 및 기록하였다. 또한 사료첨가제가 어체의 체중과 개체 크기에 미치는 영향을 파악하기 위해 실험 전과 실험 종료시점인 5주째에 체중과 체장을 측정하였다.
(2) 착색 발현도
N-Blue를 혼합하여 만든 사료첨가제 실험그룹의 경우, N-Blue에 의한 색상 발현이 처음 사료를 급이 후 5~6시간 후부터 착색이 이루어지기 시작하였다. 24시간 경과 후의 색상 발현은 농도가 증가할수록 발현도가 높게 나타나는 경향을 보였다. 0.25%와 0.5% 그룹에 비해 0.75%, 1.0% 실험군에서 물고기의 체색이 하늘색으로 더 선명하게 착색이 되었다(도 4의 (A) 참조). 이후 어체의 착색강도는 지속적으로 높게 유지되었으며 1주 후부터는 모든 그룹에서 착색강도가 높게 나타나 낮은 농도 그룹과 높은 농도 그룹간의 큰 차이는 보이지 않았다(도 4의 (B) 참조). 알비노 제브라는 착색 사료 급이 후 1개월 경과후 N-Blue에 의해 푸른색 발현을 보였다. 또한 1개월 이상 첨가제를 급이한 모든 그룹에서 활발한 운동성을 보여주었다(도 5 참조).
Rhodamin B를 혼합하여 만든 사료첨가제 실험그룹에서는 Rhodamin B에 의한 붉은색 색상이 Nile Blue에서 보다 훨씬 빠르고 뚜렷하게 착색되는 결과를 보였다. 처음 사료를 급이 후 2시간 후부터 착색이 이루어지기 시작했다. 24시간 경과 후의 색상 발현은 농도가 증가할수록 발현도가 높게 나타났나 0.25%와 0.5% 그룹에 비해 0.75%, 1.0% 실험군에서 물고기의 체색이 진한 분홍색으로 선명하게 착색이 되었다(그림8). 이후 어체의 착색강도는 지속적으로 높게 유지되었다. 하지만 10일 전후부터는 0.75%와 1.0% 그룹의 물고기들은 사료를 잘 먹지 않는 등 행동에 변화가 보이기 시작하였다. 또한 2주째부터는 0.75%, 1.0% 그룹에서 어체의 착색도가 약해지기 시작하였다. 반면 0.25%와 0.5%의 실험군에서는 꾸준히 착색이 유지되어 발현됨이 관찰되었다(그림9). 이러한 결과는 Rhodamin B가 첨가된 사료의 섭취량이 고농도에서 줄어들면서 이로 인해 착색 강도가 낮아지는 것으로 여겨질 수 있다.
하지만 Neutral Red 실험그룹의 경우는 Rhodamin B과 Nile Blue 실험그룹과는 달리 전체 처리 기간에 걸쳐 모든 농도 그룹에서 어체 표피에서 착색이 이루어지지는 않았다.
실시예 3: 사료 첨가제가 어체에 미치는 영향
1. 어체의 체중과 개체 크기에 미치는 영향
본 발명에서 사료 첨가제로서 개발한 인공착색제 N-Blue A, Rhodamin B가 어체의 체중과 개체 크기에 미치는 영향을 파악하기 위해, 실험 시작 전과 실험 종료시점인 5주째에서의 체중과 체장의 변화를 관찰하였다.
한편, 본 발명에서 모든 실험 결과의 통계 처리는 SigmaStat version 3.1 (Jandel Scientific, San Rafael, CA)를 이용하여 ANOVA-test에 의해 실시하였으며 P-value 0.05 이하를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
실험군 물고기의 성장률에 대한 분석 결과, 대조군과 비교했을 때 N-Blue와 Rhodamin B의 모든 그룹의 체장과 체중에 있어서 유의한 차이는 나타나지 않은 것으로 관찰되었다(p>0.05)(도 7 내지 도 10 참조).
특히 Rhodamin B의 경우, 1주 후부터 사료섭취량이 떨어지는 양상을 보이고 2주 때부터는 착색도가 떨어졌던 0.75%, 1.0% 그룹에서도 성장률에 있어서 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 따라서 실험기간인 5주 동안의 각 실험군의 첨가제에 의한 성장률에 대한 영향은 없는 것으로 판단되었다. 또한 실험기간 동안 모든 실험그룹에서 사료첨가제의 영향으로 인한 개체 폐사는 관찰되지 않았다.
2. 조직학적 변화
본 발명에서 인공착색제로 사용할 경우 N-Blue A, Rhodamin B가 어체에 미치는 영향을 조직학적 측면에서 살펴보기 위해, 각각 기관들을 대조군을 포함한 각 실험구별 암수를 개체를 횡단하여 조직을 관찰하였다. 표본은 Bouin's solution에 24시간 고정한 다음, paraffin 절편법으로 3 ~ 5um 두께의 연속절편을 만들었으며, 핵과 세포질의 구분을 위해 Hansen's hematoxylin 과 0.5(%) eosin으로 이중 염색한 다음 광학현미경하에서 각각의 기관들을 관찰하여 조직병변 유무를 판정하였다.
구체적으로, 착색제로 인한 각각 조직들(아가미, 신장, 간, 장, 암수생식소, 근육)의 조직병변 유무를 판단하기 위해 실험 종료시점인 5주째에 대조군을 포함한 각 실험구별 암수를 개체에 대해 횡단조직 표본을 제작하여 관찰하였다. 각 실험구의 표본은 핵과 세포질의 구분을 위해 Hansen's hematoxylin 과 0.5% eosin으로 이중 염색한 다음 광학현미경하에서 각각의 기관들을 관찰하여 병변 유무를 판정하였다. 어체의 주요 기관조직의 위치를 파악하기 위해 일차적으로 어체 전체를 횡단하였으며, 횡단면 위치는 아가미부, 식도부, 배지느러부, 뒷지러미부의 연속절편을 만든 후 광학현미경하에서 관찰하였다.
대조군 검경 결과를 바탕으로 Nile Blue와 Rhodamin B의 1.0% 실험군의 실험 후 5주째 어체로부터 조직표본을 작성하여 조직을 판독하였다. 검경 결과, 대조군과 비교시 Nile Blue와 Rhodamin B 처리군의 아가미, 생식소(정소, 난소), 장 조직 병변은 관찰되지 않았다.
신장조직의 경우도 대조군과 Nile Blue 실험군, Rhodamin B 실험군을 비교시 특별한 조직학적 차이가 없는 것으로 나타났다(도 12 참조)
간조직의 현미경 소견에서도, 대조군과 Nile Blue 실험군 사이에 뚜렷한 차이는 없는 것으로 판단되었다. 그러나 Rhodamin B 실험군의 경우 간세포내 염색성이 매우 basophilic하게 염색되어 나타났다. 대조군의 간조직에서는 세포크기가 크고 투명하며 핵에서 염색질(chromatin)을 뚜렷하게 구별할 수 있으나, Rhodamin B 실험군의 경우 세포의 크기가 위축(atrophy)되고 진하며, 핵이 농축(pyknotic nuclei)된 것으로 보아 Rhodamin B의 지속적인 섭취로 인해 세포 기능에 영향을 주는 것으로 판단된다(도 13 참조). 이는 실험과정 중 관찰된 행동학적 저하, 즉 첨가제사료 섭취 후 1주일 후부터 0.75(%), 1.0(%) 그룹에서 나타나는 식욕저하와 2주 후에 나타나는 피부 착색도의 저하와도 밀접한 관련이 있는 것으로 보여진다.

Claims (5)

  1. 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 포함하는 관상어용 착색제.
  2. 삭제
  3. 제1항의 관상어용 착색제를 포함하는 관상어용 사료.
  4. 관상어용 사료에 첨가제로서 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 혼합하여 사료를 제조하는 단계 및
    상기 제조된 사료를 관상어에 급이하는 단계를 포함하는, 관상어 착색 방법.
  5. 관상어용 사육수에 나일 블루 A(Nile Blue A) 및 로다민 B(Rhodamin B) 중 1종 이상 또는 이들의 유도체를 첨가하여 희석된 착색액을 만드는 단계 및
    상기 착색액에서 관상어를 사육하여 표피에 착색시키는 단계를 포함하는, 관상어 착색 방법.
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