KR101525919B1 - 자가면역 질환 예방 및 치료를 위한 ｔｎｆｒ２를 기반으로 하는 이중 항체 - Google Patents

자가면역 질환 예방 및 치료를 위한 ｔｎｆｒ２를 기반으로 하는 이중 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체 및 이를 포함하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

자가면역 질환 예방 및 치료를 위한 ＴＮＦＲ２를 기반으로 하는 이중 항체 {Bispecific antibody based on TNFR2 for preventing and traeating autoimmune disease}
본 발명은 IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체 및 이를 포함하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
면역이란 체내에 존재하는 외부 항원 물질을 인식 및 제거하여 외부 물질로부터 신체를 보호하는 작용을 말한다. 자가 면역 질환(autoimmune disease)이란 면역계가 개체 자신의 신체의 일부에 민감하게 되어 자기와 비-자기를 구분하는 능력에 결함이 생기면서 스스로 신체를 파괴하는 질환으로, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 크론병, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 및 전신 홍반성 낭창 등을 들 수 있다.
전 세계계적으로 자가 면역 질환이 증가하고 있으나, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 자가 면역 질환의 치료는 자가 면역 반응을 조절하고 신체의 손상된 면역기능을 회복시키는 것을 목적으로 이루어지며, 대표적으로는 면역 반응을 억제하기 위한 면역억제제를 사용한다. 현재 사용되는 면역억제제로는 코르티코스테로이드 약물인 프레드니손과 비스테로이드성 약물인 시클로포스파미드, 아자티오프린, 및 타크로리무스 등이 있다.
자가 면역 질환의 하나인 류마티스성 관절염은 전 세계 인구의 약 1%에 해당하는 2,100만 명이라는 높은 유병율에도 불구하고 아직까지 발병원인이 알려지지 않은 염증성 자가 면역성 질환이다. 이 질환은 주변 관절의 구조적 기형을 일으키며 연골 파괴 및 골 침식을 야기하는 지속적인 염증성 활막염을 나타내며, 관절의 염증 및 고통뿐만, 관절과 그 주위의 조직, 더불어 여러 장기에까지 침투하여 골다공증, 폐, 피부, 눈으로까지 침범되는 전신장기침범과 고통을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상인과 같은 생활을 불가능하게 한다.
류마티스성 관절염의 치료는 과거에는 생활습관의 개선이나, 수술, 또는 치료제의 복용으로 발병의 속도를 늦추거나 고통을 줄이거나, 감염을 억제 및 치료하는데 중점을 두며, 근래에 들어서는 항 TNF 길항제들의 개발로 인해 관절의 기능적인 회복과 심지어 완치를 목표로 치료하는 것이 가능하게 되었다.
종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현 사이토카인으로, 염증성 반응 및 면역 체계에서 중요한 역할을 담당하며, 골파괴 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 따라서, TNF 의 작용을 억제하기 위한 자가 면역 질환 치료제로서, TNF 신호 전달을 억제 하기 위해 TNF 리간드에 대한 단클론 항체 및 재조합 단백질이 개발되어 왔다. 인플릭시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept), 및 아달리무맙(adalimumab)은 대표적인 자가 면역 관절염 치료제로서 근 10년간 임상에서 높은 효능을 보이며 치료제로 사용되어 왔다.
이러한 항 TNF 치료제들은 높은 효능에도 불구하고 극복되어야 할 많은 문제들이 있다. 예를 들어, 치료의 부작용으로 TNF의 기작이 정지됨에 따라 면역체계에서 기능 이상으로 진균 혹은 세균의 감염의 위험이 높아지며, 특히 잠복 중인 폐결핵의 재발의 위험을 높인다. 류마티스 학회에 따르면, 항 TNF 치료제들을 투여받은 류마티스성 관절염 환자들의 경우, 기존의 치료제들을 받은 경우에 비해서 피부암이 발병될 가능성이 높다는 보고가 있다.
한편, 인터류킨(interleukin, IL)은 사이토카인의 한 종류로서, 적혈구 세포 사이의 화학 신호의 역할을 수행한다. 이 중 인터류킨-6 (IL-6)는 염증 질환, 자가 면역 질환 및 종양에서 비정상적으로 생성되는 것으로 확인되었으며 그러한 질병들의 발병기전에 관여하는 것으로 제시되었다
보다 구체적으로 IL-6의 비정상적인 발현은 심장점액종, 자궁암(Kishimoto 등, Ann. Rev. Immunol. 6: 485 (1988)), 다발성 골수종, 조직구종(histiocytomas) (Taga 등, J. Exp. Med. 166: 967 (1987)), 형질세포종(plasmacytoma), 형질세포이혼화증(dyscrasias), 백혈병 및 림프종을 포함하는 혈액관련 질병 (Kishimoto, Blood 74: 1 (1989); Taga 등, J. Exp. Med. 166: 967 (1987); 및 Klein, B. 등, Blood (1991) 78:1198-1204), 증식성 사구체신염, 다클론 B-세포 활성 상태, 알러지 질환, 류마티스성 관절염(Hirano 등, Eur. J. Immunol. 18: 1797 (1988)), 당뇨병(Campbell, I. L. 등, J. Clin. Invest., (1991) 87:739-742), 다발성 경화증, 패혈성 쇼크, 세균감염, 바이러스 감염, 골다공증(Roodman, G. D. 등, J. Clin. Invest. (1992) 89:46-52; 및 Jilka, R. L. 등, Science (1992) 257:88-91), AIDS를 포함하는 만성 면역결핍 및 자가 면역 결핍(Med. Immunol. 15: 195-201 (1988)), 및 염증성 장질환등의 만성 염증 질환 등 다양한 질병의 발병기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 기존 항 TNF 치료제로 사용되고 있는 단일 길항제가 가지고 있는 안전성과 효능성의 단점을 극복할 수 있는 새로운 자가 면역질환의 치료제를 개발하고자 연구한 결과, TNF-α 및 IL-6R 를 특이적으로 인식하며 이들에 대해 이중 길항 작용을 할 수 있는 이중특이적 항체를 제조하였으며, 상기 이중특이적 항체가 IL-6R 및 TNF-α에 대하여 높은 결합 친화도를 가지며 IL-6R 및 TNF-α의 작용을 억제함으로써 자가 면역 질환의 치료에 특히 우수한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 TNF-α 및 IL-6R 를 특이적으로 인식하며 이들에 대해 이중 길항 작용을 할 수 있는 이중특이적 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 이중특이적 항체를 포함하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 TNF-α 및 IL-6R 를 특이적으로 인식하며 이들에 대해 이중 길항 작용을 할 수 있는 이중특이적 항체에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 이중특이적 항체는,
(a) IL-6R(Interleukin-6 receptor)에 특이적인 단클론 항체, 및 (b) 상기 단클론 항체의 불변 영역의 C-말단에 연결된 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편을 포함하는
IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체이다.
본 발명의 이중특이적 항체의 대표적인 예시에 해당하는 항체 모식도는 도 12를 참고할 수 있다.
본원에서 용어, "이중특이적 항체 (bispecific antibody)"란 상이한 두 개 이상의 에피토프를 인식할 수 있는 항원 결합 부위를 동일 항체 분자 내에 가지는 항체를 말한다.
본원에서 용어, "가변 영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변 영역에는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.
본원에서 용어, "상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
바람직한 하나의 양태로서, 본 발명에서 이중특이적 항체를 구성하는 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
더욱 바람직하게, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 25 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 항 IL-6R 단클론 항체를, 본 명세서에서는 "A7"로 명명하기로 한다.
바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명에서 이중특이적 항체를 구성하는 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 7 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
더욱 바람직하게, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 27 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 항 IL-6R 단클론 항체를, 본 명세서에서는 "B10" 으로 명명하기로 한다.
바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명에서 이중특이적 항체를 구성하는 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 13 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
더욱 바람직하게, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 29 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 항 IL-6R 단클론 항체를, 본 명세서에서는 "D2"로 명명하기로 한다.
바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명에서 이중특이적 항체를 구성하는 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 19 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 20 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
더욱 바람직하게, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는, 서열번호 31 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 항 IL-6R 단클론 항체를, 본 명세서에서는 "F2"로 명명하기로 한다.
본 발명의 이중특이적 항체에 포함되는 불변 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, CH1, CH2 및 CH3 불변 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, CH2 및 CH3으로 이루어진 Fc 도메인 두 개가 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합으로 연결된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 이중특이적 항체는, 전체(whole) 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 항체에 포함되는 TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역을 포함하는 단편은, 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 33의 아미노산 서열 중 N말단으로부터 23번 내지 179번을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체에 포함되는 TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역을 포함하는 단편은 IL-6R에 특이적인 단클론 항체의 불변 영역의 C-말단에 연결된다.
바람직하게, 본 발명의 이중특이적 항체는 항 IL-6R 단클론 항체의 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역을 포함하는 단편을 각각 N 말단에서 C 말단 방향으로 연결한 DNA 컨스트럭트 (예를 들어, 실시예의 pNATABH) 및 항 IL-6R 단클론 항체의 경쇄 영역을 포함하는 DNA (예를 들어, 실시예의 pNATABL)를 세포에 공동 형질감염하여 유전자 재조합적으로 발현시켜 제작된 것일 수 있다. 이와 같이 제조된 이중특이적 항체를, 본 명세서 내에서 각각 "A7/TNFR2", "B10/TNFR2", "F2/TNFR2", 및 "D2/TNFR2" 로 명명하기로 한다.
바람직하게, 상기 TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역을 포함하는 단편은 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 직접 연결되거나 링커와 같은 연결자를 통해 연결될 수 있다. 본 발명에서 링커란 항 IL-6R 단클론 항체 및 TNFR2 를 연결하여 재조합 이중특이적 항체을 만드는 경우 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 결합시킨 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩티드를 말한다. 링커는 전체 생리학적 활성을 감소시키지 않으며 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 그 종류나 아미노산 개수는 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 아미노산 1개 내지 5개가 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 파아지 디스플레이 기술(phage display technology)을 이용하여 IL-6R 에 대한 결합 친화도가 높은 항 IL-6R 단클론 항체를 제조한 뒤, 상기 항체의 불변 영역의 C-말단에 TNFR2 를 융합시켜 이중특이적 항체를 제조하였다.
파아지 디스플레이 기술과 관련하여 사용되는 용어, "패닝(panning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
또한, 본원에서 용어, "결합 친화도" 란 항체와 항원이 특이적으로 결합을 형성하는 정도를 의미하며, 결합의 친화도는 용어 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 회합에 대한 속도 상수), kd(해리 상수), 및 Kd (kd/ka) 에 의해 정의될 수 있다.
결합 또는 특이적 결합은, 10-8 mol/l 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 mol/l 의 결합 친화성 (Kd) 을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 각각의 항원에 특이적으로 결합하며, 이의 결합 친화성 (Kd) 은 10-8 mol/l 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 mol/l으로 특이적이다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 재조합 기술로 IL-6R 항원을 수득하고, 상기 IL-6R 을 다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포로부터 제조한 라이브러리 파아지와 반응하여 패닝시킨 후, IL-6R 항원에 강하게 결합하는 모노 파아지 클론 6종을 스크리닝하였다. 상기 선별된 모노 파아지 클론들을 핑거프린팅으로 확인한 후, 각각의 서열을 분석하여 가변 영역 (VH 및 VL)의 CDR 영역을 확인하였다. 상기 가변 영역과 생식 계열(germ line) 항체군의 가변 영역의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 확인하고, 이들 각 모노 파아지 클론들을 IgG 로 전환하여 완전한 형태의 단클론 항체를 제조하였다.
또한, 이 중에서 STAT3 리포터 분석을 통하여 IL-6 에 대한 억제능이 우수한 4종의 단클론 항체를 선별한 후, 불변 영역 말단에 TNFR2 를 융합시킨 이중특이적 항체를 제조하였다. 본원에서는 이들 4종의 이중특이적 항체가 IL-6R 및 TNF-α 각각에 대하여 강한 결합을 가진다는 것을 확인하였으며, 이들을 A7/TNFR2, B10/TNFR2, D2/TNFR2 및 F2/TNFR2로 명명하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중특이적 항체를 포함하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "치료 및/또는 예방" 이란 IL-6R 및 TNF-α를 인식하는 이중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용함으로써 자가 면역 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 조성물은 자가 면역 질환을 일으키는 IL-6R 및 TNF-α의 작용을 억제할 수 있다.
본 발명에서 자가 면역 질환은 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 크론병, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 전신 홍반성 낭창 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 바람직하게는, 류마티스성 관절염이다.
본 발명의 IL-6R 및 TNF-α를 인식하는 이중특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.
또한 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 약, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 IL-6R 및 TNF-α를 인식하는 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가 면역 질환 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 IL-6R 및 TNF-α를 인식하는 이중특이적 항체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 바람직하게 상기 약학적 조성물의 투여량은 kg당 약 0.1 mg 내지 약 200 mg의 범위에서 사용될 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 이중특이적 항체는 자가 면역 질환과 관련된 IL-6R 및 TNF-α를 동시에 특이적으로 인식함으로써 이들의 작용을 억제하여, 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 항 IL-6R 단클론 항체 제조를 위한 IL-6R 항원의 제조를 나타낸 것이다. (A) 는 150mm dish에 pYK 604 벡터를 이용하여 IL-6R을 일시적으로 발현시켜 그 상층액에 분비된 IL-6R을 웨스턴으로 확인한 결과이다. 일시적 발현(transient transfection)시도 후 9일까지 정상적 발현되는 것을 확인할 수 있다. (B) 는 크로마토그래피를 통해 항원으로 사용된 IL-6R의 순도를 확인한 결과이며, (C)는 아질런트2100분석 프로그램을 통해 항원으로 사용된 IL-6R의 순도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 항 IL-6R 단클론 항체 제조를 위한 폴리 파아지 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 항 IL-6R 단클론 항체 제조를 위한 모노 파아지 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 모노 파아지 클론에 대한 핑거프린팅 결과를 나타낸다.
도 5는 IL-6R에 특이적으로 결합하는 6개 서로 다른 모노 파아지 클론을 단계적으로 희석해서 IL-6R에 대한 친화도가 어느 정도까지 보이는지 ELISA로 확인한 것으로, 희석 정도에 따라 결합력의 변화를 보였으나, 모두 높은 결합 친화도를 보였다.
도 6은 도 5에서의 결과 중 IL-6R full 단백질을 이용하여 파아지 클론을 선별 결과를 나타내며, 결과적으로 B10 의 결합력이 가장 높으며 D2, A7, A10, A3의 순서로 결합력을 보임을 알 수 있다.
도 7은 선별된 모노 파아지 클론들이 전체 IgG 형태로 전환되었음을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 것이다.
도 8은 모노 파아지 클론 A3, A7, A10 의 IgG 항체를 정제한 결과를 나타낸다.
도 9는 모노 파아지 클론 B10, D2, F2 의 IgG 항체를 정제한 결과를 나타낸다.
도 10은 항 IL-6R 단클론 항체 A3, A7, A10, B10, D2, F2 의 IL-6 에 대한 결합 친화도(Kd 값)를 나타낸 것이다.
도 11은 STAT3 리포터 분석을 통하여 항 IL-6R 단클론 항체 A3, A7, A10, B10, D2, F2 의 IL-6 억제능을 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명에서 제조한 항 IL-6R 단클론 항체의 구조와(좌), 이를 이용한 이중특이적 항체의 구조(우)를 나타낸다.
도 13은 항 IL-6R 항체 및 TNFR2 의 융합체 컨스트럭트의 제조 과정을 나타낸다.
도 14는 항 IL-6R 항체 및 TNFR2 의 융합체 컨스트럭트의 성공적인 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 항 IL-6R 항체 및 TNFR2 의 융합체 컨스트럭트의 성공적인 정제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 이중특이적 항체 A7/TNFR2, B10/TNFR2, D2/TNFR2 및 F2/TNFR2의 TNF-α대한 결합 친화도(Kd 값)를 나타낸 것이다.
도 17은 항 IL-6R 항체 (A7), sTNFR2 (soluble TNFR2) 단백질, 및 A7/TNFR2 이중특이적 항체가 각각 류마티스 관절염 활막세포(fibroblast-like synoviocytes, FLS)의 증식을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 항 IL-6R 항체 (A7), sTNFR2 단백질, 및 A7/TNFR2 이중특이적 항체가 각각 류마티스 관절염 활막세포(FLS)의 이동을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 항 IL-6R 항체 (A7), sTNFR2 단백질, 및 A7/TNFR2 이중특이적 항체가 각각 류마티스 관절염 활막세포(FLS)의 이동을 억제하는 효과를 수치로 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 콜라겐 유발성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 동물 모델에 항 IL-6R 항체 (A7) 5 mpk, sTNFR2 단백질 5 mpk, 및 A7/TNFR2 이중특이적 항체 3.25 mpk 및 2.15 mpk(L) 를 각각 복강 투여했을 때 각 동물에 대하여 발의 붓기 점수를 나타낸다. Wild type 은 정상 동물, CIA 는 콜라겐 유발성 관절염 동물을 의미한다.
도 21은 위의 각 동물 모델의 뒷발 관절의 조직 염색 결과를 나타낸 것이다. Wild type 은 정상 동물, CIA 는 콜라겐 유발성 관절염 동물을 의미한다.
도 22는 위의 각 동물 모델의 뒷발 관절의 염증 상태(A) 및 관절 이상소견(B)을 수치로 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항- IL -6R 단클론 항체의 제조
1-1. IL -6R 항원 단백질의 제조
IL-6R-Fc 항원을 만들기 위해 보유하고 있는 Human cDNA library를 이용하여 IL-6R에 대한 specific primer를 이용하여 PCR을 하여 확보 후 sequecing을 통해 confirm하였다. 그런 다음, 동물세포 발현 벡터 pYK 604에 클로닝하여 HEK293E cell에 형질감염하여 일시적 발현(transient transfection)을 유도한 후 세포를 배양 하였다. 형질감염 한 뒤 2일, 4일, 6일, 9일 까지 간격을 두고 배양 상층액을 확보하여 단백질 비드를 이용하여 정제를 하였다. QC data로 Protein agilent 230 kit을 이용하여 IL-6R 의 순도를 확인하고, gel migration을 확인하였다 (도 1).
1-2. 파아지 라이브러리의 제조
300 ml 2XYT(+Glucose, MgCL2, CM) 에 stock O.D 0.1이 되도록 넣어 final O.D 0.5~0.7 정도 키웠다. 이렇게 키운 뒤 헬퍼 파아지(Helper phage)를 MOI 20으로 감염시켰다. 이를 37℃에서 30 min간 제자리에 가만히 두었다가, 그 뒤에 10 min동안 shaking하였다. 이렇게 키운 solution을 4,500 rpm으로 15 min간 4℃조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하고 미디어를 300 ml 2XYT(+ MgCL2, CM, IPTG, Kan)으로 교체하여, 30℃에 overnight동안 키웠다. 다시 4,500 rpm으로 15 분동안 4℃에서 원심분리하여 PEG600 4%, NaCl 3% 에 상층액을 넣어 ice에서 1 hr동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 8,500 rpm으로 20 min간 원심분리하였다. 상등액 제거 후 phage를 5 min 간 말린 후 5 ml의 차가운 PBS에 녹여서 패닝에 사용하였다.
1-3. 1차~3차 패닝 ( panning )
IL-6R full domain인 단백질 30 ug을 immunotube에 4℃에서 overnight동안 겹합시켜서 코팅하였다. PBS를 기본으로 만든 4% skim milk 3ml을 이용하여 상온에서 2 시간 동안 blocking하였다. 그 후 16% skim milk에 미리 준비된 phage 2ml을 첨가하여 상온에서 2 시간 동안 다시 blocking하였다. 1x PBST를 이용해서 2min씩 10번에 걸쳐 세척하였다. 100 mM TEA, 500 ul씩, 5 분간 2번에 나누어 elution하고 각각 250 ul 1 M Tris(pH7.5) 로 중성화시켰다. 이렇게 얻은 Elution fraction을 모아 titering에 사용할 것 100 ul 정도 남긴 후 final O.D 0.5~0.7된 XL1-blue 8ml을 넣어 infection 시키고, immunotube에도 2ml 넣어 infection시켰다. 이때 37℃에서 30 분간 infection 시키도록 하였다. Infection 된 cell을 모두 모아 4℃에서 4,500 rpm으로, 15 분간 원심분리한 뒤에 상층액을 버리고, 2ml 2XYT(+GLUCOSE, MgCl2) 넣어 cell suspension 후 square plate에 plating한 뒤에 37℃에 overnight동안 인큐베이션 하였다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, IL-6R에 대한 항체를 만들기 위해 A&RT에서 보유하고 있는 human Library를 M1 helper phage를 이용하여 phage form으로 만든 뒤 IL-6R에 결합시켜 나온 결과물을 1차 패닝 output으로 3.1 x 106을 얻었으며, 1차 패닝 결과물을 다시 phage form으로 만들어 IL-6R에 결합시켜 나온 결과물을 2차 패닝 output으로 1.69 x 107으로 enrich되는 것을 볼 수 있으며, 2차 패닝 output을 다시 phage form으로 만들어 IL-6R에 binding 시켜 나온 결과물을 3차 패닝 output으로 8.2 x 108으로 enrich되는 것을 확인할 수 있었다.
IL-6R full 1차 패닝 2차 패닝 3차 패닝
Input 8.5 x 1013 2.78 x 1013 2.3 x 1013
output 3.1 x 106 1.69 x 107 8.2 x 108
Washing #(PBST+PBS) 7 (5+2) 13(10+3) 23(20+3)
1-4. 폴리 파아지 ELISA 분석
Phage infection하여 얻은 상층액을 이용하여 각 5개씩 dilution하여 a-Myc, FC signal 과 비교하여 확인하고자 하였다. 먼저, 96 well plate에 IL-6R full 100 ng/well, a-Myc 100 ng/well, FC 100ng/well로 4℃에 overnight동안 코팅시켰다. 2% skim milk in 1X PBS 200 ul/well을 가지고 37℃에서 2 시간 동안 blocking하였다. 준비된 dilution phage를 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 두었다. ELISA washer를 이용하여 1xPBST로 세척한 뒤에 anti-M13-HRP를 1:2000의 농도로 37℃에서 1 시간 동안 결합한 뒤에 다시 세척 과정을 거치고 substrate OPD 를 이용하여 490nm에서 읽어 값을 사용하였다.
도 2는 폴리 파아지 ELISA 분석 결과로 IL-6R에 대한 specificity가 있는지를 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝한 세포를 phage form으로 만들어 IL-6R과의 결합 친화도 정도를 확인한 것이다. 대부분의 경우 라이브러리와 1st 에서는 거의 특이성을 찾기 힘들지만, 그 뒤에 반복적으로 수행되는 2차부터 signal이 강하게 나오는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, 2,3차 에서 IL-6R에 특이적인 항체가 존재하는 것을 확인 할 수 있다. A-myc과 Fc는 negative control로 사용하였다.
1-5. 모노 파아지 ELISA 분석
96 well plate에 3rd panning colony를 96개 picking하여 (2XYT-glucose-MgCl2-CM 1ml ) 이를 가지고 37℃에서 overnight동안 코팅하였다. 2XYT-glucose-MgCl2-CM 1ml 에 picking해서 키운 100ul를 O.D가 0.12일 때 37℃에서 3~4시간 동안 배양하였다. 마지막 OD가 0.5가 되도록 배양하였다. helper phage를 각 55ul 넣어준 10~30분 동안 37℃에 두었다. 4℃에서 3,500rpm으로 20분간 원심분리하여 미디어를 2XYT-IPTG-MgCl2-CM-Kan으로 갈아준 뒤에 30℃에서 overnight동안 키웠다. 4℃에서 3,500rpm으로 20min간 원심분리하여 그 상층액을 mono-ELAISA에 사용하였다. 96 well plate에 100ng/well로 IL-6R full와 a-Myc , FC를 각각 4℃에서 하루동안 코팅시켰다. 2% skim milk 에 1ⅹPBS 200ul/well로 37℃에서 2 시간 동안 blocking한 뒤에 위에서 얻은 phage 상층액을 가지고 한번 더 100ul 37℃에서 2 시간 동안 blocking하였다. 1ⅹPBS 를 가지고 ELISA washer를 이용해 세척한 뒤에 anti-M13-HRP를 1:2000농도로 37℃에서 50min간 결합시킨 뒤 한번 더 세척 작업을 거친 뒤에 substrate OPD를 사용 490 nm 로 읽어 그 값을 사용하였다.
도 3는 모노 파아지 ELISA 분석 결과로, 2차 panning out put과 3차 panning out put에서 colony를 선별하여 96개를 phage form으로 만든 다음 IL-6R에 대한 결합 친화도를 다시 한 번 확인한 것이다. 붉은 음영은 Fc에도 결합하기 때문에 제외를 시켰다. IL-6R은 Fc가 달려있으므로 phage가 비특이적으로 Fc에 결합하므로 제외하였다.
1-6. 모노 파아지 선별 및 핑거프린팅
Cell stock으로 보관중인 것 중에 1ul 사용하여 colony를 picking하였다. 이렇게 얻은 colony에 colony PCR 10 ul reation, colony PCR product 10 ul을 첨가하고 Bst NI 0.2 ul/20 ul reation을 넣어 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 뒤에 8% PAGE Gel을 만들어 loading 하여 전기영동하였다.
IL-6R에 결합 친화도가 좋은 phage form을 선별하여 핑거프린팅한 결과 모두 6종류의 서로 다른 phage form을 얻을 수 있었다 (도 4).
1-7. 선별된 모노 파아지 클론의 염기서열 분석
상기 실시예 1-6에서 확인된 6 종류의 모노 파아지 클론으로부터 DNA 를 추출하여 염기서열분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 SolGent에 의뢰를 하였으며, 분석방법은 automatic sequencr인 ABI 3730을 이용하였다. 그 결과, 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이 선별된 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 CDR 영역을 확인하였다. 상기 항체와 생식세포계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 확인한 결과, 중쇄의 경우 인간 생식세포계열 서열과 대략 87%에서 96%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 대략 90%에서 95%의 상동성을 보여주었다. 또한, 각각의 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서 사용되고 있는 폴리펩티드를 분석하였으며, 서로 서열이 다른 것을 확인하였다.
클론명 중쇄 가변영역 (VH)
CDR1 CDR2 CDR3
A7 DYAMH
(서열번호 1)		 GVSWNSGTIAYVDSVKG
(서열번호 2)		 DFTYFYESSGYYAFDL
(서열번호 3)
B10 DYAMF
(서열번호 7)		 GINWNGNGIGYGDSVRG
(서열번호 8)		 PSLYGGNSEFDL
(서열번호 9)
D2 NYAIN
(서열번호 13)		 RIIPMLGTSDYAEKFQG
(서열번호 14)		 GPRYYGTDSYYLEK
(서열번호 15)
F2 NYYMH
(서열번호 19)		 IINPSGGNTGYAQKFQG
(서열번호 20)		 GLPWGENGLDV
(서열번호 21)
A3 EYAFH
(서열번호 38)		 DFTPAFGEGDTAQKFQG
(서열번호 39)		 ETASTY
(서열번호 40)
A10 DYAMH
(서열번호 44)		 VISGDDGTTHYADSVKG
(서열번호 45)		 DMYPYGDYGYLQH
(서열번호 46)
클론명 경쇄 가변영역 (VL)
CDR1 CDR2 CDR3
A7 TGTNSNIGAGYDVH
(서열번호 4)		 GNTNRPS
(서열번호 5)		 QSFDSSLT
(서열번호 6)
B10 TGPTIGAGYDVH
(서열번호 10)		 GNLNRPS
(서열번호 11)		 HTYDSSLS
(서열번호 12)
D2 TGPTIGAGYDVH
(서열번호 16)		 GNLNRPS
(서열번호 17)		 HTYDSSLS
(서열번호 18)
F2 TGSSSNIGAGYDVH
(서열번호 22)		 GDSDRPS
(서열번호 23)		 QSYDSSLS
(서열번호 24)
A3 TGPTIGAGYDVH
(서열번호 41)		 GNLNRPS
(서열번호 42)		 HTYDSSLS
(서열번호 43)
A10 RASQGISSYLA
(서열번호 47)		 AASTLQS
(서열번호 48)		 QQLNTYPL
(서열번호 49)
클론명 VH 상동성 VL 상동성 그룹 IL-6R full a-myc Fc Ratio
A03 VH1-69 252/288
(87.5%)		 V1-13 265/293
(90.4%)		 1 2.1076 0.2999 0.0418 7.027675892
A07 VH3-9 279/293
(95.2%)		 V1-13 279/293
(95.2%)		 2 2.4774 0.0797 0.0421 31.08406524
A10 VH3-43 270/295
(91.5%)		 L8 271/286
(94.8%)		 3 1.435 0.8478 0.095 1.692616183
6B10 VH3-9 260/287
(90.6%)		 V1-13 265/293
(90.4%)		 4 2.0979 0.1125 0.0406 18.648
D02 VH1-69 267/289
(92.4%)		 V1-13 265/293
(90.4%)		 5 2.3382 0.3031 0.0415 7.714285714
F02 VH1-46 286/295
(96.9%)		 V1-13 277/292
(94.9%)		 6 2.8567 0.2869 0.0405 9.957127919
1-8. IL-6R full , IL-6R FN3 - FN3 Ranking ELISA
도 5는 IL-6R에 특이적으로 결합하는 6개 서로 다른 모노 파아지 클론을 단계적으로 희석해서 IL-6R에 대한 친화도가 어느 정도까지 보이는지 ELISA로 확인한 것으로, 희석 정도에 따라 결합력의 변화를 보였으나, 모두 높은 결합 친화도를 보였다.
도 6은 도 5에서의 결과 중 IL-6R full 단백질을 이용하여 파아지 클론을 선별 결과를 나타내며, 결과적으로 B10 의 결합력이 가장 높으며 D2, A7, A10, A3의 순서로 결합력을 보임을 알 수 있다. F2가 가장 낮은 결합력을 보였다.
1-9. 전체 IgG 변환 분석
6개의 모노 파아지 클론을 전체 IgG 형태로 전환한 후 포유동물 세포에서 assemble이 잘 되는지 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다. A3가 약하게 assemble되지만 다른 5개는 모두 양호하게 assemble되고 발현 수준도 높은 것으로 나타났다 (도 7).
1-10. 항 IL -6R 단클론 항체의 정제
각 6개 항체에 대한 QC data로 Agilent 230Kit를 이용하여 정제 순도와 gel migration을 확인 하였다 (도 8 및 도 9).
실시예 2. 항- IL -6R 단클론 항체의 결합 친화도 분석
2-1. 항 IL -6R 단클론 항체의 Kd 값 측정
IL-6R 100ng/well의 조건으로 하룻동안 코팅하였다. 각 well에 2% skim milk 200ul를 이용해서 37℃로 2h동안 blocking하였다. 50nm부터 2배씩 dilution하여 100ul씩 결합하도록 37℃에서 2 시간 동안 두었다. 1xPBST로 3번 세척한 뒤에 anti-Fab-HRP을 1:4000의 농도로 100ul씩 37℃에서 1 시간 동안 결합시켰다. 다시 1xPBST로 3번 세척해준 뒤에 OPD 1tablet와 6ul H2O2를 PC buffer 10ml에 넣어 만든 뒤 이를 100ul씩 7min동안 상온에서 처리한 뒤에 NH2SO4 50ul로 반응을 멈추고 490nM로 읽었다.
하기 표 5는 IL-6R 희석 농도에 따른 각 항체의 Kd 값을 측정한 결과를 나타내며, 도 10은 이를 그래프로 바꾸어 표시한 것이다. 상기 결과들은 매우 적은 양의 (0.02441nM) IL-6R 단백질에 대해서도 A3, A7 그리고 F2가 매우 높은 결합력을 보여주고 있음을 나타낸다.
클론명 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5625 0.78125 0.39063 0.19531 0.09766 0.04883 0.02441 kd value
A3 2.781 2.2787 1.8467 1.4486 1.1317 0.857 0.6503 0.5904 0.5249 0.4996 0.4894 0.5156 3.5x10-9
(R2:0.83)
A7 3.0994 2.8431 2.5795 2.1338 1.6383 1.1682 0.7819 0.6175 0.5464 0.4973 0.4983 0.5145 2.3x10-9
(R2:0.93)
A10 2.5724 2.2591 1.8109 1.4725 1.1259 0.8664 0.6497 0.5731 0.5022 0.4599 0.4693 0.4952 2.93x10-9
(R2:0.85)
B10 2.0937 1.7787 1.3939 1.0362 0.761 0.6069 0.5 0.4762 0.4289 0.4619 0.4508 0.4679 4.3x10-9
(R2:0.75)
D2 2.3833 1.9404 1.4694 0.9809 0.7194 0.5843 0.4786 0.4732 0.4688 0.4498 0.4514 0.4486 7.5x10-9
(R2:0.8)
F2 2.9947 2.8868 2.9209 2.7102 2.7158 2.433 1.9001 1.4102 1.0056 0.7428 0.5836 0.535 3.5x10-10
(R2:0.98)
2-2. STAT3 -리포터 분석에 의한 IL -6 억제능 테스트
만들어진 항-IL-6R 단클론 항체의 기능을 확인하기 위하여 STAT3-리포터 어세이를 수행하였다. STAT3의 발현 유전자에 lucifrerase가 붙어있는 리포터 유전자를 지속적으로 발현하는 세포주를 설정하여, 이 세포주에 IL-6를 50ng/well의 용량으로 대조군을 제외한 모든 조건에 처리하였다. 그 뒤에 각 조건에 맞게 준비된 anti-IL-6R을 종류별로 각각 0.001ug, 0.01ug, 0.1ug, 1ug/well의 조건으로 처리하여 IL-6에 의해 유도되었던 신호가 anti-IL-6R에 의해 얼마나 저해 되었는지를 측정하였다. 준비된 세포에 각 사이토카인과 항체를 처리한뒤 24시간을 인큐베이션하였다. 그 뒤에 lucifease substrate를 각 세포에 처리하여 발색을 유도한 뒤에 이 발색을 측정하여 발현 정도를 확인하였다.
실험 결과, A7, B10, D2 및 F2 항 IL-6R 항체가 IL-6 의 시그널을 억제하는 효과를 보였다. 이 중에서 A7과 F2가 억제 효과가 다른 것에 비해 우수하였으므로(도 11), 이들 항체를 TNFR2 와 융합시키기로 결정하였다.
실시예 3. 이중특이적 항체( bi - specific antibody )의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 항 IL-6R 단클론 항체를 이용하여 IL-6R 및 TNFR2 를 특이적으로 인식할 수 있는 이중특이적 항체(bispecific antibody)를 제조하였다. 도 12는 본 발명에서 제조한 항 IL-6R 단클론 항체의 구조와(좌), 이를 이용한 이중특이적 항체의 구조(우)를 나타낸다. 구체적인 제작 과정은 다음과 같다.
구체적으로, 이중특이적 항체인 Anti-IL-6R/TNFR2(각각 A7/TNFR2, B10/TNFR2, F2/TNFR2, D2/TNFR2로 명명)는 Anti-IL-6R Heavy chain(HC) (A7, B10, F2, D2)의 C-term 말단에 Opti-TNFR2의 세포외 영역을 융합하여 만들었으며, 이중특이적 항체 단백질을 얻기 위해 Heavy chain(HC) mammalian expression vector인 pNATABH에 삽입(insertion)할 수 있도록 하기 위해 PCR 기법으로 A7 heavy chain+ TNFR2 (서열번호 34), B10 heavy chain+ TNFR2(서열번호 35), F2 heavy chain+ TNFR2(서열번호 36), D2 heavy chain+ TNFR2(서열번호 37) 를 융합한 다음 각각 제한효소SfiI(#R033S, Enzynomics, korea) 및 NheI(#R016M, Enzynomics, korea) 로 자른 다음, Agarose(#9002-18-0, BIO BASIC INC, USA) gel에 loading을 한 다음, Gel Purification kit(#1014876, QIAGEN, USA)을 이용하여 벡터에 삽입할 insert를 확보하였다. T4 DNA ligase(#M001S, Enzynomics, korea)를 이용하여 ligation을 수행하였다. 제한효소 반응과 Ligation 반응 다음과 같은 조건 하에서 동일하게 수행되었다.
제한효소 반응은 1ug DNA를 자르는데, 1ul SfiI(10unit) 과 1ul NheI과 5ul 10x reaction buffer를 혼합한 후 멸균증류수를 넣어 총 부피가 50ul 되게 하여 37℃온탕기에서 6시간동안 반응을 시킨 다음 agarose gel로부터 분리 정제를 수행하였다. 그리고, Ligation은 벡터와 insert 비율을 1:3으로 하여 50ng 벡터에 150ng insert를 1ul Ligase(10unit)과 1ul 10x reaction buffer를 혼합하여, 16℃에서 16hr이상 incubation과정을 거쳐 확보하였다.
확보한 ligates를 E. coli cell에 형질전환을 시켜, 나온 colony를 sequencing을 통해pNATABH Heavy chain발현 vector에 올바르게 삽입된, clone을 확보하여, midi prep(#740 410.100, MACHERY-NAGEL, Germany)을 수행 하였다.
또한, Light chain(HC) mammalian expression vector인 pNATABL에 삽입(insertion)할 수 있도록 하기 위해 PCR 기법으로 A7 Light chain, B10 Light chain, F2 Light chain, D2 Light chain을 증폭한 다음 각각 SfiI(#R033S, Enzynomics, korea), BglII(#R010M, Enzynomics, korea)이라는 제한효소로 자른 다음, Agarose(#9002-18-0, BIO BASIC INC, USA) gel에 loading을 한 다음, Gel Purification kit(#1014876, QIAGEN, USA)을 이용하여 벡터에 삽입할 insert를 확보하였다. T4 DNA ligase(#M001S, Enzynomics, korea)를 이용하여 ligation을 수행하였다. 제한효소 반응과 Ligation 반응 다음과 같은 조건하에서 동일하게 수행되었다.
제한효소 반응은 1ug DNA를 자르는데, 1ul SfiI(10unit) 과 1ul BglII와 5ul 10x reaction buffer를 혼합한 후 멸균증류수를 넣어 총 부피가 50ul 되게 하여 37℃온탕기에서 6시간동안 반응을 시킨 다음 agarose gel로부터 분리 정제를 수행하였다. 그리고, Ligation은 벡터와 insert 비율을 1:3으로 하여 50ng 벡터에 150ng insert를 1ul Ligase(10unit)과 1ul 10x reaction buffer를 혼합하여, 16℃에서 16hr이상 incubation과정을 거쳐 확보하였다.
확보한 ligates를 E. coli cell에 형질전환을 시켜, 나온 colony를 sequencing을 통해pNATABL Light chain발현 vector에 올바르게 삽입된, clone을 확보하여, midi prep(#740 410.100, MACHERY-NAGEL, Germany)을 수행 하였다.
이중특이적 항체 단백질 확보를 위해 Heavy chain vector와 Light chain vector를 각각 3:7 ratio로 mammalian cell인 293E에 Co-transfection을 통해 Anti-IL-6R/ TNFR2의 발현률을 확인하고, 대량으로 배양을 하여 융합항체인Anti-IL-6R(A7, B10, F2, D2)/ TNFR2 단백질들을 확보하였다.
실시예 4. 이중특이적 항체의 결합 친화도 분석
ELISA 플레이트(#439454, Nunc, Denmark)를 이용하여 웰 당 100 ng의 TNF-α(#C001-1MG, enzynomics, Korea)로 코팅을 하였다. 코팅은 4℃에서 오버나잇으로 수행하였다. 코팅이 완료된 ELISA 플레이트에 PBS 200 ㎕에 4% Skim milk(#232100, Difco, France)를 넣은 용액을 넣고, 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 상온에서 대략 1시간 블로킹(blocking: 4% skim milk /1xPBS)시켰다. 블로킹이 끝나면 ELISA 플레이트에서 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 제거하고, 각각의 정제된 단백질을 1% skim milk를 PBS에 섞은 용액 100 ㎕에 100 nM로 준비한 뒤, 이를 1/4의 희석농도로 순차희석(serial dilution)을 한 다음 상온에서 대략 2시간 반응시켰다. 그 다음, 200 ㎕ PBST로 플레이트를 5회 세척을 해주고 2 ㎕의 2차 항체(secondary antibody)인 anti-Human Fc-HRP(#31413, Thermo, USA)를 1% skim milk가 함유된 4 ㎖의 PBS에 섞은 다음, ELISA 플레이트에 한 웰당 200㎕씩 넣어 준 다음 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, ELISA 플레이트의 2차 항체를 제거한 후, 200 ㎕의 PBS로 5회 세척해주고 한 웰당 10 ㎕의 과산화수소 용액(H2O2,#H1009-100ML, Sigma, USA)과 10 ㎖의 PC버퍼(5.1g Citric acid monohydrate, 7.3g Sodium phosphate/L (pH5.0)) 그리고 OPD 정제(#P8787-100TAB Sigma USA) 1개를 혼합하여 총 100 ㎕의 부피로 만든 반응액을 넣어준다. 반응액을 넣은 다음, 상온의 어두운 상태에서 10분간 반응시킨 뒤, 발색을 확인하고, 반응을 중단시키는 STOP buffer를 한 웰당 50 ㎕씩 넣어 반응을 종료시키고, ELISA 리더 (reader)에서 490 nm의 파장에서 Kd 값을 측정하였다. TNF-α 리간드는 각 단백질과 낮은 Kd 값을 보임으로써, 높은 결합력을 확인할 수 있었다. Anti-IL-6R/ TNFR2항체4종에 대해서도 TNF-a와의 결합능력을 확인했을 때 각각 7.8x10-11M, 7.2x10-10M, 4.3x10-10M, 6x10-10M로 TNFR2 를 단독으로 처리한 경우와 거의 유사함을 보여주었다.
항체 항원
IL-6R		 항원
TNF-α
A7 2.3nM -
B10 4.3nM -
D2 7.5nM -
F2 0.35nM -
TNFR2 - 0.068 nM
A7/TNFR2 2.3nM 0.078 nM
B10/TNFR2 4.3nM 0.72nM
D2/TNFR2 7.5nM 0.60nM
F2/TNFR2 0.35nM 0.43nM
실험예 1. 류마티스 관절염 활막세포의 증식 억제 효과
류마티스 관절염 환자에게서 얻은 섬유모세포 포양의 활막세포(fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 일차 배양 (primary cell culture)하여 키운 뒤 60mm 배양접시에 각각 동수의 세포를 분주하여 배양하였다. 이렇게 준비한 세포들에 관절염과 유사환경을 유도하기 위하여, FBS가 없는 DMEM에 IL-6(200ng/ml), IL-6R(200ng/ml) 및 TNF-alpha(20ng/ml) 를 처리하여 FLS가 관절염과 유사한 상황에서 자랄수 있도록 하였다.
다음으로, 실시예 3에서 준비한 A7/TNFR2 이중특이적 항체와, 그 모체가 되는 A7 항체 단독 및 sTNFR2 단백질 단독을, 각각 위에서 배양한 FLS 에 처리하고, 배양 이틀 뒤에 각 처리된 세포를 CCK8 분석 키트(CK04, DOJINDO Laboratories) 를 이용하여 살아있는 세포만 염색되도록 하여 세포의 성장율을 비교하였다. A7 항체 단독과 sTNFR2 단독의 경우 1.25ug과 2.5ug을 사용하였고, 이와 동일한 농도의 각각의 단백질이 존재할수 있도록 A7/TNFR2 이중특이적 항체의 경우 1.575, 3.75ug을 사용하였다.
그 결과, A7 항체와 sTNFR2 단백질을 각각 처리한 것 역시 FLS의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있으나, 이들을 각각 단독으로 처리한 경우보다 A7/TNFR2 이중특이적 항체를 처리한 경우 세포 증식 억제 효과가 더욱 우수하게 나타났으며 농도 의존적으로 매우 효과적으로 이러한 성장을 억제하는 것을 확인하였다 (도 17). 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체가 관절염 세포 증식을 억제함으로써 관절염의 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 2. 류마티스 관절염 활막세포의 이동 저해 효과
류마티스 관절염 환자에게서 얻은 섬유모세포 포양의 활막세포(fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 일차 배양 (primary cell culture)하여 키운뒤 60mm 배양접시에 각각 동수의 세포를 분주하여 배양하였다. 현미경으로 관찰하면서 동일한 위치에 동일한 크기의 팁을 사용하여 잘 자란 세포의 표면을 긁어내어 상처를 일으켰다. 이렇게 준비한 세포들에 관절염과 유사환경을 유도하기 위하여, FBS가 없는 DMEM에 IL-6(200ng/ml), IL-6R(200ng/ml) 및 TNF-alpha(20ng/ml) 를 처리하여 FLS가 관절염과 유사한 상황에서 자랄수 있도록 하였다.
다음으로, 실시예 3에서 준비한 A7/TNFR2 이중특이적 항체와, 그 모체가 되는 A7 항체 단독 및 sTNFR2 단백질 단독을, 각각 100ug/ml 씩 위에서 배양한 FLS 에 처리하고, 16시간 이후에 각 세포가 상처난 곳을 향해 얼마나 이동(migration)했는지를 현미경으로 관찰하고 사진으로 찍어 빈 공간만을 프로그램을 이용하여 면적으로 환산하여 그 수치를 비교하였다. 실험은 37℃ incubation 조건으로 실험하였다.
그 결과, A7 항체와 sTNFR2 단백질을 각각 처리한 것 역시 FLS의 이동을 억제하는 것을 확인할 수 있으나, 이들을 각각 단독으로 처리한 경우보다 A7/TNFR2 이중특이적 항체를 처리한 경우 세포 이동 억제 효과가 더욱 우수하게 나타났으며 농도 의존적으로 매우 효과적으로 이러한 성장을 억제하는 것을 확인하였다 (도 18 및 도 19). 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체가 관절염 세포의 이동을 억제함으로써 관절염의 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 3. 류마티스 관절염 동물 모델에서의 치료 효과
3-1. 발의 부종 정도 확인
7주령의 DBA1/J 쥐에게 Mouse monoclonal anti-type II collagen 5 clone antibody cocktail kit(chondrex 53010)을 매뉴얼대로 사용하여, 류마티스 관절염 동물 모델을 구축하였다. 6mg의 5-clone cocktail 을 복강 내 투여하고, 이로부터 3일 후에 25-50㎍의 LPS를 복강 내 투여하여 질병 모델을 구축하였다. 위의 콜라겐 유발성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 동물 모델에 주 3회에 걸쳐 복강 내 투여를 하여 실험을 진행하였다. A7 항체와 sTNFR2 단백질 각각은 5 mpk 로 복강 내 투여하였고 이와 동일한 용량의 발현양을 구성하기 위해 A7/TNFR2 이중특이적 항체의 경우 6.5mpk가 필요함을 확인하여 A7/TNFR2 이중특이적 항체의 우수성을 보여주기 위해 3.25 mpk와 2.15 mpk(L) 로 투여하였다.
각 동물에 대하여 발의 붓기 정도를 측정하여 도 20에 나타내었다. 쥐의 각 발관절의 붓기를 0~4점으로 점수로 환산하여 매긴 뒤 이를 합산하여 수치로 바꾸었으며, 점수가 높을수록 질병이 매우 심각함을 의미한다. 정상군 (Wild type)에 비해 질병군 (CIA)의 경우 류마티스 관절염이 유도되어 발의 붓기가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, A7/TNFR2 이중특이적 항체를 투여한 경우, A7 항체와 sTNFR2 단백질 각각을 사용한 경우와 동등한 또는 그 이상의 관절염 호전 효과를 나타내었으며, 특히 A7 항체와 sTNFR2 단백질 각각보다 낮은 용량을 투여한 경우(A7/TNFR (L))에도 우수한 관절염 호전 효과를 나타내었다.
3-2. 조직염색을 통한 염증 완화 확인
실험예 3-1에서 사용된 쥐를 희생하여 뒷발 관절을 채취하여 조직 염색을 수행하였다. H&E 염색의 경우 Xylene Ⅰ과 xylene Ⅱ 에서 15분 탈파라핀(deparaffin)과정을 거쳐 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 (hydration 함수) 순으로 각각 5분씩 통과시켰다. 그리고 수돗물에서 5분간 세척하였다. Harris hematoxylin (Sigma-Aldrich HHS32)으로 10분간 염색한 후 수돗물로 충분히 세척한 뒤 1%HCl에 2-3회 Dipping하고, 0.2% ammonia water에서 2-3회 Dipping 하였다. 또한 Eosin(Sigma-Aldrich HT110132)으로 1분 30초간 염색 후 세척하였다. 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올 (dehydration 탈수) 순으로 통과시킨 후 Xylene에 담가 봉입(mounting)하였다. Safranin O 염색의 경우는 동일 과정을 수행하고 염색약만 다른 것을 이용하였다. 이 때에는 Weigert's iron hematoxylin(Sigma-Aldrich HT1079-1SET)와 Fast green(FCF, Sigma-Aldrich F7252-5G)로 5분간 염색하였다. 1% 아세트산에 2-3회 Dipping하고 Safranin o(Sigma-Aldrich S2255-25G) 5분간 염색한 후 수돗물에서 세척하였다. 그 후 동일한 봉입과정을 수행하였다.
또한, 염색 후 염색결과를 수치, 정량화하기 위해 각 실험군을 선정하여 각각의 관절의 염증상태와 이상소견등을 수치 정량화 하여 그래프로 나타내었다.
그 결과를 도 21 및 도 22에 나타내었다. 이를 살펴보면, 질병군(CIA)의 조직에서는 뼈파괴가 일어나고 조직이 침윤하여 관절이 붓는 현상을 관찰할 수 있으며, A7 단독 또는 sTNFR2 단독을 처리한 경우 조직 상태가 호전되어 있으며, 특히 A7/TNFR2 이중특이적 항체 처리군의 조직에서는 정상군처럼 호전되어 정상적인 뼈와 조직의 형태를 이루고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, A7/TNFR2 이중특이적 항체의 경우 앞선 실험의 발의 붓기 점수 (RA score)와 동일한 경향성을 나타내어, A7 항체와 sTNFR2 단백질 각각을 사용한 경우와 동등한 또는 그 이상의 관절염 호전 효과를 나타내었으며, 특히 A7 항체와 sTNFR2 단백질 각각보다 낮은 용량으로 투여한 경우에도 우수한 관절염 호전 효과를 나타내었다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Bispecific antibody based on TNFR2 for preventing and treating autoimmune disease <130> DPP20131631KR <150> KR10-2012-0050441 <151> 2012-05-11 <160> 49 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of A7 heavy chain variable region <400> 1 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of A7 heavy chain variable region <400> 2 Gly Val Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of A7 heavy chain variable region <400> 3 Asp Phe Thr Tyr Phe Tyr Glu Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of A7 light chain variable region <400> 4 Thr Gly Thr Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 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A3 light chain variable region <400> 43 His Thr Tyr Asp Ser Ser Leu Ser 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of A10 heavy chain variable region <400> 44 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of A10 heavy chain variable region <400> 45 Val Ile Ser Gly Asp Asp Gly Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of A10 heavy chain variable region <400> 46 Asp Met Tyr Pro Tyr Gly Asp Tyr Gly Tyr Leu Gln His 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of A10 light chain variable region <400> 47 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of A10 light chain variable region <400> 48 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of A10 light chain variable region <400> 49 Gln Gln Leu Asn Thr Tyr Pro Leu 1 5

Claims (13)

  1. (a) IL-6R(Interleukin-6 receptor)에 특이적인 단클론 항체, 및
    (b) 상기 단클론 항체의 불변 영역의 C-말단에 연결된 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편을 포함하는,
    IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체로서,
    상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는,
    서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체;
    서열번호 7 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체; 및
    서열번호 13 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체
    로 이루어진 군에서 선택되는 단클론 항체이고,
    상기 TNFR2 단백질 또는 상기 TNFR2 의 세포외 영역을 포함하는 단편은, 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 서열번호 33의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 23번 내지 179번을 포함하는 폴리펩타이드인,
    IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는 서열번호 25 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인,
    IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는 서열번호 27 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인,
    IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 IL-6R에 특이적인 단클론 항체는 서열번호 29 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인,
    IL-6R 및 TNF-α에 특이적인 이중특이적 항체.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항, 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 포함하는 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 크론병, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군 또는 전신 홍반성 낭창인 조성물.
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