KR101512976B1 - 애기장대 투인원 유전자 변이체 ka를 이용한 식물체의 배수성을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 상기 유전자들의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성을 조절하는 방법, 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 배수성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 배수성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 배수성 조절용 조성물에 관한 것으로, 본 발병은 애기장대 유래 투인원 유전자 변이체의 발현 조절을 통해 잠재적인 가치가 큰 배수성 식물을 육종하는 새로운 방법을 제시한다.

Description

애기장대 투인원 유전자 변이체 KA를 이용한 식물체의 배수성을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체{Method for controlling polyploidy of plant using AtTIO KA mutant and the plant thereof}

본 발명은 애기장대 투인원 유전자 변이체 KA를 이용한 식물체의 배수성을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성을 조절하는 방법, 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 배수성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 배수성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 배수성 조절용 조성물에 관한 것이다.

현화식물(flowering plant)은 화분발달과정을 통하여 중복수정에 필요한 두 개의 웅성배우자(정자세포, sperm cell)와 이들을 자성배우자(난자세포, egg cell)로 운반하는 기능을 하는 한 개의 영양세포(vegetative cell)로 구성되는 성숙화분(mature pollen)을 만든다. 3개의 세포로 구성된 비교적 단순한 구조인 웅성배우자체를 형성하는 생식세대는 식물의 생장기 중 매우 짧은 기간을 차지하나 종을 보존하고 번식하기 위해 바탕이 되는 중요한 과정이다.

화분발달은 순차적으로 일어나는 한번의 감수분열(meiosis)과 두번의 유사분열(mitosis)에 의해 진행된다. 우선 약(anther) 안에 형성된 2배체(diploid)인 화분모세포(pollen mother cell)가 감수분열을 거치면서 4개의 반수체(haploid)인 소포자 4분체(microspore tetrad)가 형성되고, 이후 칼로스 분해에 의해 유리되어 나온 소포자의 핵은 화분 생식극(generative pole)으로 이동한다. 극화된 소포자(polarised microspore)는 비대칭성 분열인 제1화분 유사분열(pollen mitosis I)을 통하여 영양세포(vegetative cell)와 생식세포(generative cell)가 된다. 이후 생식세포를 둘러싼 칼로스가 분해되면서 생식세포가 영양세포의 세포질 안으로 이동하여 '세포안의 세포(cell-within-a cell)'구조의 2세포 화분(bicellular pollen)이 된다. 생식세포는 제2화분 유사분열(pollen mitosis II)을 거치면서 2개의 웅성배우자를 만들고 영양세포는 더 이상의 세포분열능이 없는 대신 웅성배우자를 자성배우자체로 이동시키는 화분관(pollen tube)을 만든다. 이후 화분관을 통해 자성배우자체로 이동한 두 개의 웅성배우자 중 한 개는 반수체인 자성배우자와 수정하여 새로운 식물의 모태가 되는 2배체인 배아(embryo)가 되고, 다른 한 개의 웅성배우자는 2배체인 극핵세포(central cell)와 수정하여 배아에게 영양을 제공하는 3배체의 배젖(endosperm)으로 발달한다. 따라서 2배수체인 화분모세포에서 세 개의 반수체 세포로 이루어진 3세포 화분(tricellular pollen)이 만들어지고 자성배우자와 중복수정(double fertilization)을 하여 다시 2배체인 다음 세대의 동일한 식물체를 형성하는 것이다.

애기장대의 퓨즈드 키나아제인 투인원(TIO , TWO - IN - ONE) 유전자는 위에서 기술한 화분발달과정 중 제1화분 유사분열시 세포질분리가 교란되어 분열된 2개의 핵이 각각의 딸세포로 나뉘지 못하고 동일한 세포질 내에 공존하게 되는 변이체들을 동정하는 과정에서 최초로 발견되었다(Oh SA et al., 2005, Curr. Biol. 15:2107-2111). 애기장대 투인원 단백질은 총 1322개의 아미노산으로 이루어지며, 단백질 구조를 보면 크게 아미노 말단쪽의 키나아제 도메인과 카복실 말단쪽의 4개의 아르마딜로 반복 서열(ARM repeat)을 포함하는 도메인이 있다. 최근의 연구결과에 따르면 키나아제 도메인 혹은 아르마딜로 반복 도메인을 변형시키면 투인원의 정상적인 기능을 하지 못하는 것으로 나타났다(Oh SA et al., 2012, Plant J. 72:308-319). 이미 투인원 유전자가 화분발달과정 중 제1 유사분열, 체세포분열 및 자성배우자체의 유사분열 시에 요구된다는 것은 밝혀졌으나, 감수분열을 포함한 보다 광범위한 세포분열 혹은 식물발달 과정에서 어떤 기능을 하는지는 연구되어야 할 과제이다. 특히 투인원 유전자를 과발현시킬 경우 식물발달과정에 어떠한 영향을 초래하는 지는 연구된 바가 없다.

한편, 한국공개특허 제2012-0053210호에는 '물억새의 배수체 생산방법'이 개시되어 있고, 미국등록특허 제8383881호에는 '난초(orchid)의 다배체 식물을 생산하기 위한 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 애기장대 투인원 유전자 변이체 KA를 이용한 식물체의 배수성을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 애기장대 유래 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하고 생장시킨 결과, 형질전환 식물체에서 배수성이 증가되는 것을 관찰하였다. 이를 통하여 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자가 식물체의 배수성 조절을 가능하게 하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성(polyploidy)을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 배수성이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 배수성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명을 통해 애기장대 유래 투인원 단백질 변이체의 과발현 식물체에서 배수성이 증가되는 것을 확인하였다. 배수성 식물은 대사현상이 뛰어나고, 다양한 환경적 스트레스에 대한 적응력이 뛰어나며, 이종간 교배 성공율도 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명은 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 과발현을 통해 잠재적인 가치가 큰 배수성 식물을 육종하는 새로운 방법을 제시한다.

도 1은 애기장대 유래 투인원 유전자를 과발현시키기 위한 '유전자 발현 카세트'가 포함되어 있는 중간벡터이다.
도 2는 투인원 유전자를 과발현시킨 애기장대 형질전환체의 성숙화분을 DAPI 염색을 통해 핵을 염색한 후 현미경으로 관찰한 결과이다. (A)는 정상적인 애기장대의 성숙화분으로, 진하게 염색된 두 개의 핵은 두 개의 정자세포(S)의 핵을 나타내며 상대적으로 크고 연하게 염색된 한 개의 핵은 영양세포(V)의 핵이다. (B-G)는 투인원 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 식물체의 성숙화분이다. (H-M)은 배수성 정자세포를 생산한다고 이미 알려진 애기장대 tetraspore(tes) 변이체의 성숙화분을 동일한 방법으로 관찰한 결과이다. bar; 10㎛.
도 3은 형질전환 애기장대 식물체에서 투인원 단백질의 발현을 HA 태그에 대한 항체를 사용하여 확인한 웨스턴 블랏 결과(A)와, 형질전환 애기장대 각 라인별 5개체에서 관찰된 비정상 화분표현형의 결과를 수치화한 표(B)이다. con; HA 태그를 포함하고 있는 대장균 단백질로서 HA 항체에 대한 양성 대조군, 1~9; 형질전환 애기장대 식물체.
도 4는 정상 식물체(normal)와 투인원 과발현 식물체(abnormal)의 화분발달과정을 현미경으로 비교 관찰한 결과이다. TET; 감수분열 직후 소포자 사분체, EMS; 칼로스 분해 후 유리되어 나온 반수체 초기의 소포자, LMS; 후기 소포자, EBC; 제1화분 유사분열 직후 초기 2세포 화분, LBC; 생식세포가 영양세포의 세포질내로 이동한 후기의 2세포 화분세포, TC; 제2화분 유사분열 이후 3세포 화분, bar; 10㎛.
도 5는 형질전환 벡터들의 투인원 단백질부위를 나타낸 모식도(A)와, 각 형질전환 벡터들을 사용한 1 세대 형질전환체들의 화분표현형을 조사한 후 도 2와 같은 비정상적인 화분표현형을 포함하는 식물 개체들을 'tes-like plant'로 구분하여 백분율로 나타낸 그래프(B)와 형질전환 벡터에 포함된 HA 태그를 감지하는 항체를 사용하여 투인원 단백질 및 그 변이체 단백질들의 형질전환체 내에서의 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과(C)이다. K; 라이신, D; 아스파라트산, N; 아스파라긴, A; 알라닌, ARM repeats; 아르마딜로 반복 서열, proTIO-TF-dHA 및 TF; 정상적인 투인원 단백질, proTIO-KA-dHA 및 KA; 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 투인원 변이체, proTIO-DANA-dHA 및 DANA; 127번째 아미노산 아스파르트산(D)과 132번째 아미노산 아스파라긴(N)이 알라닌으로 치환된 투인원 변이체, proTIO-TFFT-dHA 및 TF-FT; 아미노산 서열 중 1175~1182번째의 Fax 모티프(FAIGNAAY)가 Fax 타겟(YGGAQGGW)으로 치환된 투인원 변이체, proTIO-TFFR-dHA 및 -FR; 아미노산 서열 중 1175~1182번째의 Fax 모티프가 Fax 랜덤(LTFRDTTH)으로 치환된 투인원 변이체, proTIO-TFNT-dHA 및 -NT; 아미노산 서열 중 1213~1220번째의 Nag 모티프(NAAGALSN)가 Nag 타겟(QGGAGGDQ)으로 치환된 투인원 변이체, proTIO-TFNR-dHA 및 -NR; 아미노산 서열 중 1213~1220번째의 Nag 모티프가 Nag 랜덤(DTTRTMCD)으로 치환된 투인원 변이체, proTIO-TF△C-dHA 및 -△C; 1300~1322번째 아미노산이 결손된 투인원 변이체, proTIO-TFARM4-dHA 및 -ARM4; 카복실 말단의 4개의 아르마딜로 반복 서열(ARM)을 모두 포함하는 1~1279번째 아미노산 서열로 이루어진 투인원 변이체, proTIO-TFARM3-dHA 및 -ARM3; 카복실 말단의 3개의 아르마딜로 반복 서열을 포함하는 1~1224번째 아미노산 서열로 이루어진 투인원 변이체, proTIO-TFARM2-dHA 및 -ARM2; 카복실 말단의 2개의 아르마딜로 반복 서열을 포함하는 1~1185번째 아미노산 서열로 이루어진 투인원 변이체, proTIO-TFARM1-dHA 및 -ARM1; 카복실 말단의 1개의 아르마딜로 반복 서열을 포함하는 1~1141번째 아미노산 서열로 이루어진 투인원 변이체, proTIO-TFARM0-dHA 및 -ARM0; 카복실 말단쪽 4개의 아르마딜로 반복 서열이 모두 결손된 1~1095번째 아미노산 서열로 이루어진 투인원 변이체, proTIO-KIN-dHA 및 KIN; 아미노 말단의 키나아제 도메인으로 이루어진 투인원 변이체, proTIO-CL-dHA 및 CL; 아미노 말단의 키나아제 도메인이 결손된 302~1322번째 아미노산 서열로 이루어진 투인원 변이체. 상기 변이체들은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 투인원 단백질 기준으로 돌연변이 위치를 표시한 것임. (B)의 가로축 괄호 안 숫자는 화분표현형을 조사하는데 사용한 식물체의 개수.
도 6은 화분표현형 외에 배수성 식물들에서 공통적으로 나타나는 체세포 표현형을 확인한 결과이다. A; 정상 식물체 씨앗꼬투리, B; 배수성 식물 씨앗꼬투리, C; 정상 식물체 모용(trichome), D-F; 배수성 식물 모용, G; 정상 식물체 화기, H-J; 배수성 식물 화기. An; 약(anther), Pi; 암술(pistill), Se; 꽃받침(sepal).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성(polyploidy)을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 바람직하게는 상기 투인원 단백질 변이체 코딩 유전자를 과발현시켜 식물체의 배수성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 배수성이 조절된, 바람직하게는 증가된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 식물체에서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 무, 배추, 유채, 가는장대, 애기장대, 개갓냉이, 겨자, 고추냉이, 갓, 들갓, 장대나무, 꽃다지, 꽃무, 논냉이, 루타바가, 갈래꽃, 콜리플라워, 브로콜리, 양배추, 컬리플라워, 케일 등의 십자화과(Brassicaceae) 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 배수성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 상기 투인원 단백질 변이체는 상기 전술한 바와 같다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 애기장대 유래 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 배수성을 증가시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 투인원 유전자 식물 발현 벡터 제조

식물 발현 벡터의 제조는 기존에 제작한 proMSP1-TF-3XMyc 벡터(Honys et al., 2006, BMC Plant Biol. 6:31-39)를 바탕으로 제작하였다. 이 벡터는 상용화되어 있는 pBluescript를 바탕으로 하고 있으며, 제한효소 AscI과 NotI 사이에 투인원 프로모터(proTIO), NotI과 SpeI 사이에 투인원 cDNA(TIO cDNA), SpeI과 PacI 사이에 Nos 터미네이터를 포함한 이중(double) HA(dHA-Noster)가 삽입되었다(도 1). 상기와 같이 제조된 중간벡터로부터 AscI과 PacI 부위를 분리한 후 다시 바이너리벡터인 pER10의 AscI과 PacI 사이에 삽입하여 식물 형질전환용 벡터를 완성하였다.

실시예 2. 제조된 식물 발현 벡터들을 이용한 애기장대 식물체 형질전환

상기 형질전환용 벡터를 대장균에서 증폭시키고, 이 벡터들은 다시 아그로박테리움 균주 GV3101로 옮겨졌으며, 상기 아그로박테리움 균주를 400㎖의 LB배지를 사용하여 28℃에서 배양한 후 애기장대(생태형 콜롬비아 타입)로 최종 형질전환하였다. 애기장대로의 형질전환은 꽃대 침지법(Clough and Bent, 1998, Plant J. 16:735-743)에 따라 수행하였다. 꽃대 침지법으로 형질전환시킨 해당식물(T0 식물)들을 생장실 조건에서 키운 후 종자를 수확(T1 종자)하고, 종자 소독과정을 거쳐 50㎍/㎖의 카나마이신 항생제를 포함한 MS 식물배지에서 항생제 저항성을 띠는 T1 식물체를 선발하였다. 선발된 식물체들은 토양으로 옮긴 후 생장실 조건으로 배양하였다. 꽃대가 올라오기 전인 발아 후 3-4주쯤 된 식물체에서 게놈 DNA를 추출하여 형질전환 T-DNA가 삽입된 형질전환체임을 확인하였다.

실시예 3. 형질전환 식물체의 화분표현형 관찰

T1 식물체가 개화하였을 때, 식물체 당 3개씩의 신선한 꽃들을 채취하여 250㎕의 DAPI 시약이 담긴 1.5㎖ 원심분리튜브에 담았다. 충분히 흔들어 약(anther)에 들어 있는 화분을 용액내로 추출시킨 후 소형 원심분리기를 사용하여 튜브의 바닥에 가라앉혔다. 피펫을 이용하여 2.5㎕ 정도의 화분 펠렛을 취한 후 현미경 관찰을 위한 슬라이드를 제작하였다. UV 형광현미경으로 DAPI 염색된 화분세포를 관찰하고 대략 300립 이상의 화분을 표현형별로 세었다.

그 결과, 투인원 유전자 과발현 애기장대 식물체의 성숙화분은 정상적인 애기장대(도 2A)와 비교하였을 때, 정자세포(노란색 S)의 수는 정상 성숙화분과 같이 2개이나 상대적으로 매우 크고 진하거나(도 2B), 4개 혹은 6개의 정자세포가 관찰되었다(도 2C-D). 또한 낮은 빈도이지만 도 2E-G와 같이 정자세포 없이 비정상 영양세포(노란색 V)의 것으로 보이는 흐릿한 두 개의 핵 혹은 융합한 것처럼 보이는 한 개의 핵이 관찰되기도 하였다. 대조군으로 사용한 tetraspore(tes) 변이체의 화분(도 2H-M)은 투인원 유전자 과발현 애기장대 식물체의 성숙화분과 매우 유사하게 비정상 화분표현형의 결과를 보였다.

실시예 4. 비정상 화분표현형과 투인원 유전자 발현의 상관도 조사

도 2에서 나타난 비정상 화분표현형과 투인원 유전자의 발현수준 간의 상관관계를 확인해 보았다. 우선 9개의 독립적인 T2 세대 라인들의 종자를 소독하여 카나마이신이 포함된 식물배지에 키운 후 이 항생제에 저항성을 보이는 식물체를 선발하고, 각 라인별로 다섯 식물체는 성숙화분의 표현형을 관찰하기 위하여 흙으로 옮겨 심은 후 생장실에서 키우고, 나머지로는 단백질을 추출하였다. 투인원 단백질의 발현수준을 확인하기 위해, 상기 추출한 단백질과 형질전환벡터에 포함되어 있는 HA 태그를 감지하는 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 또한 각 라인별로 성숙화분의 표현형을 관찰하였다.

그 결과, 투인원 단백질이 가장 높은 수준으로 발현하고 있는 3번 라인에서는 다섯 식물체 모두가 높은 수준의 비정상적인 화분 표현형을 보였으며, 투인원 단백질이 감지되지 않는 1, 2, 6 및 7번 라인에서는 다섯 식물체 모두에서 비정상적인 화분 표현형이 관찰되지 않았다(도 3). 한편 중간 수준의 투인원 단백질 발현이 감지되는 4, 5, 8 및 9번 네 개의 라인에서는 한 개 또는 두 개의 식물체에서만 비정상적인 화분 표현형이 관찰되었다(도 3). 이의 결과를 통해 투인원 단백질의 과발현이 비정상적인 화분표현형에 영향을 미침을 알 수 있었다.

실시예 5. 형질전환 애기장대의 화분발달과정 확인

정상 식물체와 투인원 유전자가 과발현되는 형질전환 애기장대 식물체에서 화분발달과정을 비교 관찰하였다. 우선 발생단계가 다른 꽃봉우리를 고정액(Ethanol:Acetic acid 3:1)으로 처리한 후 해부현미경하에서 시기별로 분리하고 DAPI 시료로 핵을 염색하고 UV 형광현미경하에서 화분표현형을 관찰하였다.

도 4의 I와 J의 화살머리 표시는 후기 소포자(LMS) 시기에 관찰되는 발아공(germ pore)을 가리키는 것으로, 형질전환체는 정상 식물체에서 3개씩 규칙적으로 나타나는 발아공의 모습(도 4I)과 차이가 있는데, 3개보다 많은 수로 나타나거나(도 4J) 불규칙하게 비정상적인 모습으로 관찰되었다(도 4K 및 L). 한편, 도 4의 M-P의 화살머리 표시는 비대칭성인 제1 화분 유사분열 시 한쪽으로 치우쳐 커브형태로 나타나는 세포벽을 나타내는데, 정상 식물체와 형질전환체의 화분 모두에서 공통적으로 관찰되었다. 또한 제2 화분 유사분열도 대체적으로 정상적으로 나타난다는 것을 알 수 있었다(도 4U-X). 즉, 정상적인 식물체의 경우 감수 분열 후 반수체인 4개의 소포자 사분체가 생기는 것에 반해, 투인원 유전자 과발현 형질전환체에서는 감수분열 후 2배수 혹은 다배수성의 소포자가 만들어졌고, 이는 감수분열 과정에서 세포질 분리가 교란되어 나타나는 것임을 알 수 있었다.

실시예 6. 투인원 유전자 변이체를 이용한 애기장대 식물체 형질전환

투인원 cDNA 유전자 부위 중 일부가 치환 또는 결손된 변이체를 이용하여 상기와 같은 식물체의 배수성 증가여부를 확인하였다. 본 발명에 사용한 변이체는 아미노 말단 부위 키나아제 도메인의 일부 아미노산이 변형된 KA(35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환)와 DANA(127번째 아미노산 아스파르트산(D)과 132번째 아미노산 아스파라긴(N)이 알라닌으로 치환), 카복실 말단 부위 또는 아르마딜로 반복 도메인의 일부 아미노산들이 치환된 TFFT(1175~1182번째의 Fax 모티프(FAIGNAAY)가 Fax 타겟(YGGAQGGW)으로 치환), TFFR(Fax 모티프가 Fax 랜덤(LTFRDTTH)으로 치환), TFNT(1213~1220번째의 Nag 모티프(NAAGALSN)가 Nag 타겟(QGGAGGDQ)으로 치환) 및 TFNR(Nag 모티프가 Nag 랜덤(DTTRTMCD)으로 치환), 카복실 말단 부위 또는 아르마딜로 반복 도메인의 일부가 결손된 △C(1300~1322번째 아미노산이 결손), TFARM4(카복실 말단 4개의 아르마딜로 반복 서열을 모두 포함하는 1~1279번째 아미노산 서열로 이루어진 변이체), TFARM3(카복실 말단 3개의 아르마딜로 반복 서열을 포함하는 1~1224번째 아미노산 서열로 이루어진 변이체), TFARM2(카복실 말단 2개의 아르마딜로 반복 서열을 포함하는 1~1185번째 아미노산 서열로 이루어진 변이체), TFARM1(카복실 말단 1개의 아르마딜로 반복 서열을 포함하는 1~1141번째 아미노산 서열로 이루어진 변이체) 및 TFARM0(카복실 말단쪽 4개의 아르마딜로 반복 서열이 모두 결손) 그리고 아미노 말단 부위 키나아제 도메인만 포함되거나 제외시킨 KIN과 CL(도 5A)이다.

그 결과, 투인원 유전자를 포함하지 않는 빈 벡터(control)와 투인원 cDNA 유전자 부위 중 키나아제 도메인만 포함하는 형질전환체(KIN)를 제외한 모든 종의 형질전환체에서 유사한 수준으로 비정상적인 화분표현형을 포함하는 식물 개체들이 관찰되었다(도 5B). 또한 벡터에 포함된 HA 태그를 감지하는 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과 형질전환 식물체에서 투인원 변이체 단백질들이 확인되었다(도 5C). 이의 결과를 통해 투인원 유전자 변이체를 사용한 형질전환 식물체에서도 배수성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 형질전환 식물체의 체세포 표현형 관찰

화분표현형 외에 배수성 식물들에서 나타나는 체세포 표현형을 확인해 보았다. 그 결과, 씨앗꼬투리(silique)가 정상 식물체(도 6A)에 비해 짧고(도 6B), 잎의 표면에 있는 모용(trichome)이 정상인 경우 주로 3개의 가지이고 일부 4개의 가지로 나타나는 반면(도 6C), 배수성 식물에서는 모용의 상당수가 3개 이상의 가지로 나타났다(도 6D-F). 또한 화기의 크기가 정상(도 6G)에 비해 매우 크거나(도 6H), 구조가 변형된 경우 (도 6I 및 J)도 관찰되었다. (C-F)에서 빨간색 점은 4개의 가지, 노란색 점은 다섯 개의 가지를 갖는 모용(trichome)을 표시한 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for controlling polyploidy of plant using AtTIO KA mutant and the plant thereof <130> PN13218 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1322 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Gly Val Glu Asp Tyr His Val Ile Glu Leu Val Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Arg Lys Tyr Thr Gly Gln Thr Val 20 25 30 Ala Met Lys Phe Ile Met Lys Gln Gly Lys Thr Asp Lys Asp Ile His 35 40 45 Ser Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ile Leu Arg Lys Leu Lys His Glu Asn 50 55 60 Ile Ile Glu Met Leu Asp Ser Phe Glu Asn Ala Arg Glu Phe Cys Val 65 70 75 80 Val Thr Glu Phe Ala Gln Gly Glu Leu Phe Glu Ile Leu Glu Asp Asp 85 90 95 Lys Cys Leu Pro Glu Glu Gln Val Gln Ala Ile Ala Lys Gln Leu Val 100 105 110 Lys Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Asn Arg Ile Ile His Arg Asp Met 115 120 125 Lys Pro Gln Asn Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ser Val Val Lys Leu Cys 130 135 140 Asp Phe Gly Phe Ala Arg Ala Met Ser Thr Asn Thr Val Val Leu Arg 145 150 155 160 Ser Ile Lys Gly Thr Pro Leu Tyr Met Ala Pro Glu Leu Val Lys Glu 165 170 175 Gln Pro Tyr Asp Arg Thr Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Ile Leu 180 185 190 Tyr Glu Leu Tyr Val Gly Gln Pro Pro Phe Tyr Thr Asn Ser Val Tyr 195 200 205 Ala Leu Ile Arg His Ile Val Lys Asp Pro Val Lys Tyr Pro Asp Glu 210 215 220 Met Ser Thr Tyr Phe Lys Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Asn Lys Glu 225 230 235 240 Pro His Ser Arg Leu Thr Trp Pro Ala Leu Arg Glu His Pro Phe Val 245 250 255 Lys Glu Thr Gln Glu Glu Val Glu Ala Arg Glu Ile His Thr Ala Val 260 265 270 Val Asp Asn Lys Ala Ala Trp Met Leu Lys Gly Asn Gly Gly Gln Gln 275 280 285 Arg Asn Glu Lys Cys Asp Ser Val Thr Leu Val Glu Asp Met Ser Ala 290 295 300 Thr Lys Gly Leu Ala Asp Val Gln Ser Asp Met Lys Ser Ala Val Lys 305 310 315 320 Val Asn Ser Pro Pro Thr Glu Asp Phe Val Gly Phe Pro Thr Gln Glu 325 330 335 Glu Ile Lys Ser Ser Gly Asn Pro Thr Leu Asp Lys Leu Glu Asn Thr 340 345 350 Ser Arg Thr Val Lys Gly Ala Gln Val Ile Gly Glu Asn Asp Lys Ala 355 360 365 Leu Asp Leu Val Leu Leu Ser Leu Glu Arg Phe Ser Lys Ser Pro Asp 370 375 380 Ser Lys Arg Asp Lys Asp Val Ala Cys Ser Val Gln Ser Leu Arg Ile 385 390 395 400 Ile Ser Asn Leu Val Ala Thr Arg Ala Ile Val Ser Val Gly Leu Ile 405 410 415 Glu Lys Ile Thr Cys Ala Leu Leu Asp Phe Thr Asp Ala Leu Val Gly 420 425 430 Met Lys Ser Pro Glu Phe Asn Asn Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ser Val 435 440 445 Thr Lys Asn Leu Val Gly His Val Glu Gly Asn Asn Ile His Ser Ser 450 455 460 Tyr Ile Arg His Trp Thr Lys Val Val Glu Ile Phe Ile Gln Val Val 465 470 475 480 Arg Trp Glu Glu Glu Gly Thr Gly Arg Ile Ile Tyr Glu Ala Cys Ser 485 490 495 Cys Ile Thr Thr Met Leu Ser Arg Val Ala Gln Asp Leu Lys Ser Ser 500 505 510 Thr Pro Asp Ser Val Ser Lys Gln Ile Leu Glu His Ala Asn Met Ser 515 520 525 Arg Ile Val Asp His Leu Cys Leu Cys Leu Ala Ser Ser Gly Ser Ser 530 535 540 Leu Thr Ser Gly Ser Ser Gln Met Leu Ala Ala Ala Cys Glu Ala Cys 545 550 555 560 Arg Ala Ile Trp Ile Leu Ile Asp Thr Ser Glu Thr Phe Phe Lys Asn 565 570 575 Asp Asp Val Asn Ile Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gln Asn Arg Leu Ser 580 585 590 Gln His Asp Ile Gly Asn Ser Glu Trp Gly Pro Leu Ser Glu Lys Leu 595 600 605 Val Asp Thr Val Thr Arg Ala Tyr Leu Arg Ser Lys His Val Gln Val 610 615 620 Ala Val Gly His Cys Leu His Gln Arg Val Glu Ala Pro Leu Val Ser 625 630 635 640 Ala Ile Gln Leu Leu Ser Arg Cys Cys Leu His Asn Gly Ile Leu Pro 645 650 655 Ser Met Leu Cys Gly Leu Pro Ser Ser Leu Pro Ile Thr Thr Val Val 660 665 670 Ser Gly Gly Glu Asp Gly Thr Val Ile Ser Glu Ile Phe Ser Ile Leu 675 680 685 Ser Tyr Ala Thr Leu Ser Ser Lys Asp Gln Gln Thr Gly Glu Lys Asp 690 695 700 Asn Phe Glu Gly Arg Leu Asn Asn Leu Val Phe His Ser Cys Leu Met 705 710 715 720 Leu Ala Thr Val Ala Gln Cys Leu Lys Leu Thr Gly Arg Asn Ser Val 725 730 735 Leu Leu Met Leu Thr Thr Ser Pro Lys Lys His Gln His Arg Leu Ser 740 745 750 Ala Ile Ala Asn His Ile Ala Ser Asp Asp Lys Ile Glu Ala Ser Leu 755 760 765 Gln Asn His Ser Ala Ser Ala Met Leu Ala Leu Ala Ser Ile Leu Ala 770 775 780 Leu Glu Lys Gly Ser Ser Ala Gly Ser Ser Val Ser Glu Leu Val Val 785 790 795 800 Ser Leu Ile Pro Arg Ala Thr Lys Leu Cys Tyr His Leu Arg Pro Met 805 810 815 Pro Ser Asn Glu Gly Glu Val Ile Ser His Ser Ala Asn Tyr Ala Lys 820 825 830 Trp His Gly Leu Leu Asp Gly Cys Ile Gly Leu Leu Glu Ser Arg Leu 835 840 845 Lys Trp Gly Gly Pro Leu Ala Val Gln Gln Leu Ile Ala Ser Gly Thr 850 855 860 Pro Leu Leu Leu Ile Asn Leu Leu Ala Gly Lys Leu Ser Asn Ala Ser 865 870 875 880 Pro Glu Asp Ile Lys Lys Thr Ser Asn Arg Ile Gly Leu Ser Pro Ile 885 890 895 Gly Val Val Trp Thr Ile Ser Ser Ile Cys His Cys Leu Ser Gly Gly 900 905 910 Thr Thr Phe Arg Gln Val Leu Val Lys Ile Glu Thr Met Lys Leu Ile 915 920 925 Thr Cys Leu Leu Ser Asp Ala His Ile Lys Leu Val Lys Ser Trp Gly 930 935 940 Gly Pro Gly Gly Gly Lys Asp Gly Val Arg Glu Thr Ile Asn Val Ile 945 950 955 960 Ile Asp Leu Leu Ala Phe Pro Phe Val Ala Leu Gln Ser Gln Pro Gly 965 970 975 Ser Leu Ser Ala Thr Ala Ser Val Asn Ser Gly Phe Ile Leu Asn Ile 980 985 990 Gly Ser Pro Gly Val Arg Val Cys Met Glu Asp Arg Asp Leu Leu Lys 995 1000 1005 Ala Ile Glu Glu Asp Met Asp Lys Tyr Ile Ile Val Leu Leu Glu Val 1010 1015 1020 Gly Val Pro Ser Leu Ile Leu Arg Cys Leu Asp His Leu Glu Leu Lys 1025 1030 1035 1040 Asp Leu Val Arg Pro Val Ala Phe Leu Ala Lys Met Val Gly Arg Pro 1045 1050 1055 Arg Leu Ala Val Asp Leu Val Ser Lys Gly Leu Leu Asp Pro Asn Arg 1060 1065 1070 Met Lys Lys Leu Leu Asn Gln Ser Ser Pro Arg Glu Val Ile Leu Asp 1075 1080 1085 Ile Leu Met Ile Ile Ser Asp Leu Ser Arg Met Asp Lys Ala Phe Tyr 1090 1095 1100 Lys Tyr Ile Gly Glu Ala Ser Val Leu Gln Pro Leu Lys Glu Tyr Leu 1105 1110 1115 1120 Thr His Val Asp Pro Asn Ile Arg Ala Lys Ala Cys Ser Ala Leu Gly 1125 1130 1135 Asn Met Cys Arg His Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Glu His 1140 1145 1150 Gln Ile Ile Gly Leu Leu Ile Asp Arg Cys Ala Asp Pro Asp Lys Arg 1155 1160 1165 Thr Gln Lys Phe Ala Cys Phe Ala Ile Gly Asn Ala Ala Tyr His Asn 1170 1175 1180 Asp Thr Leu Tyr Glu Glu Leu Arg Arg Ser Ile Thr Gln Leu Ala Asn 1185 1190 1195 1200 Val Leu Thr Thr Ala Glu Glu Asp Lys Thr Lys Ala Asn Ala Ala Gly 1205 1210 1215 Ala Leu Ser Asn Leu Val Arg Asn Ser Asn Lys Leu Cys Glu Asp Ile 1220 1225 1230 Val Ser Lys Gly Ala Leu Gln Thr Leu Leu Arg Leu Val Ala Asp Cys 1235 1240 1245 Ser Thr Leu Ala Leu Asn Pro Ser Lys Lys Glu Thr Ala Ser Glu Ser 1250 1255 1260 Pro Leu Lys Ile Ala Leu Phe Ser Leu Ala Lys Met Cys Ser Asn His 1265 1270 1275 1280 Gln Ile Cys Arg Gln Phe Val Lys Ser Ser Glu Leu Phe Pro Val Ile 1285 1290 1295 Ala Arg Leu Lys Gln Ser Pro Glu Ala Asn Ile Ala His Tyr Ala Ser 1300 1305 1310 Val Ile Val Ala Lys Val Ser Gly Glu Ser 1315 1320

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 배수성(polyploidy)을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 상기 투인원 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 식물체의 배수성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
4. 삭제
5. 제3항의 방법에 의해 제조된 배수성이 증가된 형질전환 식물체.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
8. 제7항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 십자화과(Brassicaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
9. 제5항에 따른 식물체의 종자.
10. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 라이신(K)이 알라닌(A)으로 치환된 애기장대 유래 투인원(AtTIO, Arabidopsis thaliana TWO-IN-ONE) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 배수성 증가용 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체의 배수성 증가용 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 십자화과(Brassicaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 식물체의 배수성 증가용 조성물.

Images