KR101512223B1 - 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제를 제공한다. 펜톡시필린은 종양에서 콜라겐 합성을 저해함으로써 항암제의 분배 또는 암세포의 감수성을 증가시켜 향상된 항암치료 효과를 제공한다.

Description

펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제{anti-cancer adjuvant comprising pentoxifylline}

본 발명은 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제에 관한 것이다.

펜톡시필린(3,7-디하이드로-3,7-디메틸-1-(5-옥소헥실)-1H-퓨린-2,6-디온)은 손상된 적혈구의 변형능을 개선시키고 혈소판 응집을 억제하며 혈액의 점도를 저하시켜 혈액의 유동성을 개선시킴으로써 혈류가 손상된 부위의 혈액순환을 개선시키는 약물이다. 이는 미국특허 제 3,422,107호에 개시되어 있으며, 순환 장애 (허혈 및 뇌졸증, 어지러움, 두통 및 건망증 등 뇌동맥 경화증), 눈의 혈류 순환 장애, 말초 동맥 순환 장애 (간헐성파행, 휴식 시 동통, 당뇨병성 혈관병증, 위축증 및 혈관신경병증)등의 치료에 널리 사용되고 있다.

펜톡시필린은 다른 생물학적 표적에 대한 활성뿐만 아니라 포스포다이에스터라제(PDE; 문헌[Meskini, N et al,. Biochem. Pharm. 1994, 47(5): 781-788] 참조)의 억제제로서도 활성을 갖는 것으로 알려져 있지만, 임상적 효과를 일으키는 정확한 작용 양식은 알려져 있지 않다. 펜톡시필린은 혈액 점도를 낮추고 적혈구 유연성을 향상시키는 혈액 점도 저하 효과(hemorheologic effects)를 통해 혈류 특성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 펜톡시필린은 또한 백혈구 가변형성(deformability)을 증가시키고 호중구 유착 및 활성을 억제한다. (http://www.fda.gov/cder/foi/nda/99/74962_Pentoxifylline_prntlbl.pdf에서 펜톡시필린에 관한 FDA 라벨 참조). 혈액점도 저하 특성을 향상시키는 것에 더하여, 펜톡시필린은 또한 항염증(anti-inflammatory) 및 항섬유증(anti-fibrotic) 특성을 갖는 것으로 여겨지고 있다.

한편, 종양 치료에 있어서 종양의 세포간질 (extracellular matrix) 이 항암제 등의 접근을 막아 항암제의 치료효과를 감소시키는 원인이 됨이 알려져 있다. 이러한 세포간질은 주로 연결조직인 콜라겐으로 되어있으며, 제2고조파 발생 (secondary-harmonic generation; SHG) 이라는 영상기법을 사용하여 만들어낸 마우스에 이식된 종양의 영상을 통해 콜라겐의 양과 형태를 나타내는 고해상도의 3차 영상을 통하여 콜라겐 수치가 종양의 투과성과 연관 있다는 사실이 알려져 있다. 따라서, 항암제의 치료효과를 높이기 위해서는 종양의 콜라겐 합성을 억제하여 항암제의 종양세포로의 침투를 증가시키는 것이 필요하다.

펜톡시필린이 종양 내 콜라겐 합성을 저해하여 항암제의 치료효과를 향상시킬 수 있다는 점에 대해서는 아직까지 알려진 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 펜톡시필린의 종양에서 콜라겐 합성 저해 효과를 이용하여 펜톡시필린과 항암제를 병용함으로써 향상된 항암치료 효과를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펜톡시필린의 항암치료 보조제로서의 용도, 펜톡시필린을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 항암치료 효과 증진 방법 및 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 펜톡시필린과 항암제를 동시 또는 순차적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 항암치료 보조제일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 항암제는 대사길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 항암 항생제, 식물유래 알칼로이드, 항체 항암제 또는 분자표적 항암제일 수 있고, 예를 들어, 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라실, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다라빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페플로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 항암제는 나노입자 형태로 제조된 것일 것 있고, 예를 들어 리포좀(liposome) 제제일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 펜톡시필린을 먼저 투여한 후에 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 항암치료 보조제일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 암은 췌장암, 간암, 유방암, 폐암, 위암, 직장암, 담낭암, 난소암, 방광암, 대장암, 임파종, 뇌암, 자궁암, 전립선암 및 악성흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항암치료 보조제일 수 있다.

본 발명에 따르면 펜톡시필린을 항암제와 병용함으로써 종양에서 콜라겐 합성을 저해하여 항암제 분배 또는 암세포의 감수성을 증가시켜, 항암제의 치료효과를 향상시킬 수 있다.

도 1A는 마우스 모델에서 펜톡시필린, 젬시타빈, 펜톡시필린+젬시타빈 처리시 종양 크기 감소 효과를 확인한 결과를 보여주고, 도 1B는 각 경우에 있어서 체중의 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 2A는 펜톡시필린, 식염수, 독소루비신, 독소루비신 리포좀의 처리 스케줄을 나타낸다. 도 2B는 펜톡시필린을 2주간 전처리한 후 독소루비린 처리 후의 종양 성장 억제효과 및 도 2C는 독소루비신 리포좀을 처리한 후의 종양성장 억제효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3A는 펜톡시필린 처리 후 종양 조직 중에 독소루비신(항암제, 붉은색) 및 독소루비신 리포좀의 분포가 증가함을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도면 내의 C 또는 M은 종양 절편의 중심 또는 주변 지역을 의미한다. 도 3B는 독소루비신, 독소루비신 리포좀 및 혈관(CD31)의 퍼센트 분포면적을 나타낸 그래프이다.
도 4A 및 도 4B는 펜톡시필린 처리 후 마우스 종양 조직 중 콜라겐(초록색)의 감소를 확인한 결과이고 도 4C는 콜라겐의 mRNA 발현의 감소를 확인한 결과를 보여준다.
도 5A는 펜톡시필린 처리 후 마우스 종양조직 중에 존재하는 섬유화 작용 관련 인자들(a-SMA, CTGF)의 발현 감소 및 도 5B는 이들 인자의 mRNA 발현의 감소를 확인한 결과를 보여주고 도 5C는 활성 TGF-β1 및 총 TGF-β1 수준을 확인한 ELISA 결과를 보여준다.
도 6A는 이종이식 Capan-1에서 MT1-MMP의 퍼센트 면적 및 도 6B는 mRNA 발현 정도에 미치는 펜톡시필린의 영향을 보여준다.
도 7은 펜톡시필린이 섬유화 관련 인자들, α-SMA, CTGF 및 TGF-β1에 미치는 영향을 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제를 제공한다.

펜톡시필린은 C₁₃H₁₈N₄O₃ 의 화학식을 갖는 분자량이 278.31인 화합물이며 일반명칭은 1-(5-옥소헥실)-3,7-디메틸잔틴이다. 펜톡시필린은 메틸잔틴 유도체로 카페인과 유사한 구조를 갖는다.

본 발명자들은, 종양 내에 존재하는 콜라겐은 항암제의 침투와 효능을 감소시키는데 펜톡시필린이 섬유화작용 관련 인자들(a-SMA, STGF)의 발현을 감소시켜 종양에서의 이러한 콜라겐 합성을 저해함으로써 항암제의 종양세포 내 분배를 증가시키거나 암세포의 감수성을 증가시키는 작용을 한다는 점을 밝혔다. 따라서 펜톡시필린을 항암치료 보조제로 사용하면, 항암제의 효능을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조할 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항암치료 보조제는 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 항암치료 보조제로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 항암치료 보조제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항암치료 보조제는 경구 또는 비경구 투여를 위한 제제 일 수 있다. 예를 들어, 경구제제는 캡슐제, 정제, 피복정, 서방정, 과립제, 산제, 시럽, 현탁제, 유제, 즙, 에어로졸, 좌제일 수 있고, 비경구제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 일 수 있다. 비경구제제의 경우에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 직장, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

경구 투여를 위한 제제의 경우, 허용 가능한 약제학적 담체는 희석제, 방부제, 결합제, 윤활제, 붕괴제, 팽윤제, 충진제, 안정화제 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 담체는 또한 가소제, 색소, 색료, 안정화제 및 유동화제를 포함할 수 있는 코팅 조성물의 모든 성분들을 포함할 수 있다. 적합한 코팅 물질의 예로는 세룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 세룰로오스, 히드록시프로필 메틸세룰로오스, 히드록시프로필 메틸세룰로오스 프탈레이트 및 히드록시프로필 메틸세룰로오스 아세테이트 석시네이트와 같은 세룰로오스 중합체; 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 아크릴산 중합체 및 공중합체, 및 메타크릴수지, 제인, 셀락 및 다당류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 상기 코팅 물질은 가소제, 색소, 색료, 유동화제, 안정화제, 다공 형성제 및 계면활성제와 같은 통상적인 담체를 함유할 수 있다. 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제는 희석제, 결합제, 윤활제, 붕괴제, 색료, 안정화제 및 계면활성제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

희석제는 일반적으로 고체 투여 형태의 부피를 증가시키는 데 필요하며, 이로써 정제의 압축 또는 비드 및 과립의 형성을 위한 입자 크기가 제공된다. 적합한 희석제는, 이칼슘 포스페이트 이수화물, 황산칼슘, 락토스, 수크로스, 만니톨, 소비톨, 세룰로오스, 미결정질 세룰로오스, 카올린, 염화나트륨, 건조 전분, 가수분해된 전분, 전호화 전분, 이산화규소, 산화티탄, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 분말화된 슈거를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 결합제는 고체 투여 제형에 접착 특성을 부여하여 정제 또는 비드 또는 과립이 투여 형태로 조성된 후에도 손상되지 않은 채로 존재하는 것을 보장하기 위해 사용된다. 적합한 결합 물질은, 전분, 전호화 전분, 젤라틴, 당(수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 락토스 및 소비톨을 포함하는), 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 아카시아, 트래거컨트, 알긴산나트륨과 같은 천연 및 합성 검, 히드록시프로필메틸세룰로오스, 히드록시프로필세룰로오스, 에틸세룰로오스, 및 비검(veegum)을 포함한 세룰로오스, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메트아크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리아크릴산/폴리메타크릴산 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 중합체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

윤활제는 정제 제조를 용이하게 하기 위해 사용된다. 적합한 윤활제의 예는, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세롤 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 탈크 및 미네랄 오일을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

붕괴제는 투여 후 투여 형태의 붕괴 또는 부서짐을 용이하게 하기 위해 사용되며, 일반적으로, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 카복시메틸 전분, 나트륨 카복시메틸세룰로오스, 히드록시프로필 세룰로오스, 전호화 전분, 점토, 세룰로오스, 알기닌, 검 또는 가교 결합된 PVP와 같은 가교-결합된 중합체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

안정화제는 예로 산화 반응을 포함한 약물 분해 반응을 억제하거나 지연시키기 위해 사용된다. 적합한 안정화제는, 항산화제, 부틸화된 히드록시톨루렌(BHT), 아스코르브산, 이의 염 및 에스테르; 비타민 E, 토코페롤 및 이의 염; 나트륨 메타바이설파이트와 같은 설파이트; 시스테인 및 이의 유도체; 구연산; 프로필 갈레이트, 및 부틸화된 히드록시아니솔(BHA)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

캡슐, 정제, 용액 및 현탁액과 같은 경구 투여 제형은 조절된 방출을 갖도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 화합물들 및 임의로 하나 이상의 추가적 활성 성분들이 나노 입자, 마이크로 입자, 및 이의 조합으로 제제화되어, 연질 또는 경질 젤라틴 또는 비-젤라틴 캡슐로 캡슐화되거나 분산 매질 내 분산되어 경구 현탁액 또는 시럽을 형성할 수 있다. 상기 입자들은 약물 및 조절된 방출 중합체 또는 매트릭스로 형성될 수 있다. 또는, 상기 약물 입자들은 완성된 투여 형태로 혼입되기 전에 하나 이상의 조절된 방출 코팅제로 피복될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 수성 조성물로 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 조성물은 주사가능한 제형, 예를 들어, 용액 또는 현탁액; 마이크로 또는 나노입자와 같이 주사 전에 재구성 매질의 추가시 용액 또는 현탁액으로 제조되도록 사용하기에 적합한 고체 형태; 유중수(w/o) 에멀젼, 수중유(o/w) 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 이의 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 에멀좀으로 제조될 수 있다.

담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 하나 이상의 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜), 오일(예: 식물성 오일(예: 땅콩유, 옥수수유, 참기름 등)), 및 이의 조합을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 레시틴과 같은 코팅물을 사용하거나 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 또는 계면활성제를 사용함으로써 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 또한, 설탕 또는 염(예: 염화나트륨)의 등장화제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

활성 화합물들의 유리 산 또는 유리 염기 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서의 용액 또는 분산액은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 적절히 혼합된 물 또는 다른 용매 또는 분산 매질 중에 제조될 수 있다. 부형제는 예를 들어, 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 조절제 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

적합한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 표면 활성제일 수 있다. 적합한 음이온성 계면활성제는, 카복실레이트, 설포네이트 및 설페이트 이온을 함유하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온성 계면활성제의 예는 나트륨 도데실벤젠 설포네이트와 같은 장쇄 알킬 설포네이트 및 알킬 아릴 설포네이트의 나트륨, 칼륨, 암모늄; 나트륨 도데실벤젠 설포네이트와 같은 디알킬 나트륨 설포석시네이트; 나트륨 비스-(2-에틸티옥실)-설포석시네이트 와 같은 디알킬 나트륨 설포석시네이트; 및 나트륨 라우릴 설페이트와 같은 알킬 설페이트를 포함한다. 양이온성 계면활성제는 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 브롬화세트리모늄, 스테아릴 디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민과 같은 4차 암모늄 화합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비이온성 계면활성제의 예는 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 미리스테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 폴리글리세릴-4-올레에이트, 소비탄 아실레이트, 수크로스 아실레이트, PEG-150 라우레이트, PEG-400 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, PEG-1000 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 폴록사머 401, 스테아로일 모노이소프로판올아미드 및 폴리옥시에틸렌 수소화된 탈로우 아미드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예는 나트륨 N-도데실- -알라닌, 나트륨 N-라우릴- -이미노디프로피오네이트, 미리스토암포아세테이트, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 제제는 미생물의 성장을 억제하는 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제로, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 또한 활성 성분(들)의 분해를 방지할 수 있는 항산화제를 함유할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 펜톡시필린 및 항암제를 동시에 투여하거나 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 여기에서 투여란 정제, 캡슐제 등의 경구투여 및 비경구 투여를 모두 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 항암제는 대사길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 항암 항생제, 식물유래 알칼로이드, 항체 항암제 또는 분자표적 항암제일 수 있다. 분자표적 항암제는 단백질 등의 표적 물질에 특이적으로 반응하여 암세포를 사멸시키거나 혈관생성을 차단하여 암의 성장을 억제하는 항암제를 말한다. 분자표적 항암제에는 이마티닙, 엘로티닙, 제피티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 다사티닙 등이 포함된다.

본 발명의 한 구체예에서, 예를 들어, 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라실, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다라빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페플로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 항암제는 나노입자 형태로 제조된 것일 수 있다. 항암제를 나노입자 형태로 제조함으로써 약물의 누출을 줄이고, 저장 안정성을 높일 수 있으며 높은 약물 로딩 효율을 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서 나노입자 형태로 제조된 항암제를 사용하는 것은 항암제의 효과 또는 안정성을 향상시키기 위한 것으로 나노입자의 형태는 문제되지 않는다. 예를 들어, 항암제는 나노 리포좀 제제일 수 있으나 이에 제한되는 것을 아니다. 리포좀은 활성 약물을 캡슐화할 수 있는 인지질 이중층(bilayer)으로 구성된 미세소포(microscopic vesicle)로서 리포좀에 활성 약물을 봉입하여 활성 약물의 전달을 촉진할 수 있다. 나노입자 및 리포좀을 제조하는 방법은 업계에서 잘 알려져 있다(Liposome Technology 2^nd Edition in G. Gregoriadis, CRC Press Inc.,Boca Raton (1993)).

본 발명의 한 구체예에서, 펜톡시필린을 먼저 투여한 후에 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 항암치료 보조제일 수 있다. 펜톡시필린을 전처리한 후 항암제를 투여함으로써 항암제의 효능을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제를 이용하여 향상된 항종양 효과를 기대할 수 있는 암은 섬유아세포가 관여하는 모든 암을 포함한다. 섬유아세포란 결합조직에 있어 중요한 세포로, 콜라겐 등 조직성분을 합성하는 세포를 말한다. 섬유아세포가 관여하는 암에는, 예를 들어, 췌장암, 간암, 유방암, 폐암, 위암, 직장암, 담낭암, 난소암, 방광암, 대장암, 임파종, 뇌암, 자궁암, 전립선암 및 악성흑색종 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 펜톡시필린은 종양 내에 존재하여 항암제 접근을 막는 콜라겐 합성을 저해함으로써 항암제의 분배 또는 암세포의 감수성을 증가시킨다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실험의 준비

인간 췌장암 세포주, Capan-1은 한국 세포주 은행(서울, 한국)으로부터 입수하였다. 세포를 100 ug/mL 스트렙토마이신, 100 unit/mL 페니실린(Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 및 가열 비활성화한 우태아 혈청(Welgene, 서울, 한국)의 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 가습, 5%(v/v) Co₂ 대기, 37℃ 조건에서 인큐베이션했다. 펜톡시필린(pentoxyfylline) 파우더는 한독약품(서울, 한국)으로부터 입수하였다. 펜톡시필린을 10mg/mL 농도로 발열물질 비함유(pyrogen-free) 멸균 생리 식염수에 용해시키고 나서, 0.2-㎛-기공 필터 (Corning costar, Germany)를 통과시켰다. 독소루비신(doxorubicin)은 일동제약(서울, 한국)으로부터 입수하였고 리포조말 독소루비신(liposomal doxorubicin)은 Enhanced circulation time and antitumor activity of doxorubicin by comblike polymer-incorporated liposomes. Hee Dong Han, 2007, Journal of controlled release 에서 기술한 대로 제조했다. 젬시타빈(gemcitabine)은 보령제약(서울, 한국)으로부터 입수하였다.

그룹당 적어도 세 마리의 마우스를 각 실험에 사용하였고 막대는 평균±표준오차(SE)를 나타낸다. 모든 결과의 통계적 유의도는 마이크로소프트 엑셀 2007에서 같거나 다른 분산으로 추정한 2-샘플 t-test를 이용하여 결정하였다.

실시예 1

펜톡시필린 및 젬시타빈의 조합 처리의 종양 성장 억제 효과

4주 동안 펜톡시필린 유무에 따른 젬시타빈의 종양 성장 억제 효과를 실험했다.

암컷 BALB/c nu/nu 마우스 (생후 5~6주)는 ㈜오리엔트 바이오(성남시, 경기도, 한국) 로부터 입수하였고 가톨릭중앙의료원(서울, 한국)의 무균 동물 사육 시설에서 사육했다. 동물을 표준 상태에서 사육하고 음식 및 물을 자유식(ad libitum)으로 공급했다. 동물을 가톨릭 대학교(Approval Number; CUMC-2010-0141-01) 의과대학의 Institutional Animal Care 및 Use Committee (IACUC)의 가이드라인에 따라 보살폈다. 종양 유도를 위해, 트립신 처리 후 Capan-1 세포를 수확했고 5 × 10⁶ 개의 살아있는 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사했다. 종양 지름이 4~6 mm 되었을 때, 종양에서 콜라겐 타입 I 분포에 미치는 펜톡시필린의 영향을 평가하기 위해 마우스를 처치했다. 2주 동안 매일, 100 mg/(kgㆍd) 펜톡시필린 또는 식염수를 마우스의 복강내로 투여했다. 약물의 종양 조직 내 침투를 평가하기 위하여, 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신 20 mg/kg을 마우스를 안락사시키기 전에 꼬리 정맥내 투여했다. 종양 크기가 200 mm³ 에 달하였을 때, 식염수, 펜톡시필린, 젬시타빈 또는 그들을 조합하여 투여한 경우에 있어서 펜톡시필린 및 젬시타빈의 상승된 항-종양 효과를 평가하였다. 28일 동안, 펜톡시필린은 100 mg/(kgㆍd)으로 매일 복강내 투여했고, 젬시타빈은 50 mg/(kgㆍd)으로 2주에 한번, 복강내 투여했다. 종양 크기(mm³)는 식: V = (a ×b2)/2(a는 종양의 가장 큰 지름이고 b는 가장 작은 지름)를 이용하여 계산하였다. 상대적인 종양 크기를 Capan-1 이종이식 종양의 약물 처치를 시작할 때의 부피에 대하여 노멀라이제이션하였다. 잘라낸 종양을 생화학적 분석을 위해 snap-frozen하고 -70℃에서 보관하거나 10% 포르말린 용액에 하룻밤 동안 고정시키고 면역조직화학을 위해 파라핀 포매(paraffin-embedded)하거나 면역형광항체법을 위해 optimal cutting temperature compound (Sakura, Tissue-Tek®)에 포매하였다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, 식염수 처리한 대조군 뿐만 아니라 젬시타빈 또는 펜톡시필린 단독 처리군 보다 조합 처리군에서 종양 크기가 상당히 감소했다(P < 0.001). 10일 후, 젬시타빈 단독 및 조합 처리군 사이에 종양 성장의 상당한 차이가 나타났고, 차이는 점점 증가했다. 펜톡시필린 단독 처리군은 식염수-처리 대조군과 비교하여 항-종양 효과를 나타내지 않았다. 모든 군에서 체중의 큰 변화는 없었다(도 1B).

실시예 2

펜톡시필린 전처리의 향상된 효과 및 종양에서 독소루비신 및 리포조말 독소루비신의 분포

펜톡시필린의 항암제 상승효과의 기전을 확인하기 위하여, 펜톡시필린을 전처리하여 독소루비신의 분배 및 효능의 변화를 측정했다. 종양 성장 억제 효과(도 2A)를 평가하기 위하여, 종양 부피가 100~150 mm³ 가 되었을 때 마우스를 처치했다. 2주 동안 펜톡시필린 100 mg/(kgㆍd) 전처리한 후 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신 8 mg/kg을 정맥내 투여하고 3주 동안 종양 크기를 측정했다.

2주 동안의 펜톡시필린 전처리는 독소루비신 및 리포조말 독소루비신의 효능을 향상시켰다 (도 2). 펜톡시필린 단독 처리한 마우스는 식염수-처리 마우스와 비교하여 상대적인 종양 크기의 변화가 없었다. 그러나, 펜톡시필린 전처리 후 독소루비신을 처리한 마우스에서의 상대적인 종양 크기는 독소루비신 단독 처리한 마우스 보다 상당히 작았다(도 2B). 23일째, 독소루비신 단독 처리한 군 및 조합 처리군의 상대적인 종양 크기는 각각 1.52 및 1.16 이었다(P < 0.05). 유사하게, 25일 후, 펜톡시필린 전처리군에서 리포조말 독소루비신의 종양 성장 억제 효과가 상당히 향상되었다(도 2C). 35일째, 리포조말 독소루비신 단독처리군 및 조합 처리군의 상대적인 종양 크기는 각각 1.82 및 1.5이었다(P < 0.05). 펜톡시필린을 전처리한 리포조말 독소루비신의 경우 펜톡시필린을 전처리한 독소루비신과 비교하여 항암효과가 더 늦게 나타났다.

종양 내 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신의 분포를 확인하기 위해 면역형광법을 수행하였다. Optimal cutting temperature compound-포매 종양 샘플을 10 ㎛두께의 절편으로 잘라내고 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신 자기 형광을 도립 현미경(inverted microscope; Axiovert 200M, Carl Zeiss) 하에서, λE_x/Em=540/580 nm의 파장에서 100 W HBO 수은 광원으로 즉시 관찰하며 EC Plan-Neofluar 5X/0.55 NA렌즈로 이미징하고 AxioCamMR3 카메라로 캡처하였다. 모든 이미지는 16-bit 신호 깊이로 캡처되고 그 뒤에 가-착색되었다. 그리고 나서, 냉각된 아세톤으로 절편을 10분 동안 고정하고, PBS로 세척한 후, 절편을 60분 동안 5%의 정상 염소혈청이 함유된 PBS 중에서 60분 동안 비특이적 결합을 차단하였다. 희석된 버퍼 중의 토끼 항-콜라겐 타입 I 1:200 (abcam) 및 랫트 항-CD31 1:100 (BD PharMingen)에 대한 일차 항체를, 4 ℃에서, 하룻밤 동안 가습 챔버에서 인큐베이션하였다. 일차 항체를 인큐베이션한 후, PBS로 세척하고 Alexa-488-컨쥬게이션 염소 항-토끼 IgG 1:200 (Invitrogen) 또는 Cy3-컨쥬게이션 염소 항-랫트 IgG 1:100 (Jackson ImmunoResearch Laboratories)으로 염색했다. 그 다음, 절편을 PBS로 세척하고 고정하며 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신 자기 형광 측정 시와 같은 조건으로 도립 현미경 (Axiovert 200M, Carl Zeiss) 하에서 관찰했다. 그들을 합치기 위해, 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신과 같은 부분에서의 CD31 염색의 이미지를 취했다. CD31 염색 이미지는 Media Cybernetics Image Pro PLUS (version 5.0)의 이미지 오버레이 프로세스를 이용하여 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신의 이미지와 합쳐졌다. 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신의 측정된 퍼센트 영역은 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다.

종양절편에서 독소루비신 또는 리포조말 독소루비신의 CD31 (혈관 마커)의 면역염색은 펜톡시필린 처리군에서 혈관으로부터 먼 부분으로의 약물 분포가 향상됨을 나타내었다(도 3A). 펜톡시필린은 종양 절편에서 독소루비신 및 리포조말 독소루비신의 면적 퍼센트를 각각, 2.17- 및 1.75-배까지 증가시켰다(P < 0.001) (도 3B). CD31 면역 염색에 의해 나타나는 혈관 농도는 각 군 사이에 변함이 없었기 때문에 향상된 약물 분포는 증가된 혈관 농도에 기인한 것이 아니다(도 3B).

실시예 3

펜톡시필린의 종양에서 콜라겐 타입 I의 양 감소 효과

종양 스트로마가 종양에서의 약물 분포와 강하게 연관되어 있기 때문에, 이종이식 Capan-1에서 펜톡시필린이 콜라겐 타입 I의 양을 감소시키는지 실험하였다.

실시예 1에서와 같은 방법으로 마우스에 종양을 유도한 후, 종양 지름이 4~6 mm 되었을 때, 종양에서 콜라겐 타입 I 분포에 미치는 펜톡시필린의 영향을 평가하기 위해 마우스를 처치했다. 2주 동안 매일, 100 mg/(kgㆍd) 펜톡시필린 또는 식염수를 마우스의 복강내로 투여했다.

2주 동안 펜톡시필린을 처리한 군에서 종양 절편의 중심 및 주변 부분 모두의 콜라겐 타입 I의 양이 감소했다(도 4A, 4B). 펜톡시필린 전처리 유무에 따라 상당한 차이가 있었다. 펜톡시필린의 고용량(100 mg/kg) 처리군에서 저용량(50 mg/kg) 처리군보다 콜라겐 양이 약간 낮게 나타났다(P < 0.05). 2주 동안 펜톡시필린 전처리군에서 대조군과 비교하여 콜라겐 I의 mRNA 발현이 72% (P < 0.02)까지 감소했다(도 4C).

실시예 4

펜톡시필린의 종양 내 섬유형성(profibrotic) 성장인자의 발현 억제 효과

펜톡시필린 전처리에 의한 콜라겐 합성 감소 효과의 기전 및 타겟 세포를 확인하기 위해, 섬유형성 성장인자인 TGF-β1, α-SMA 및 CTGF의 발현을 실험하고자 면역조직화학을 수행하였다.

Dako EnVision^TM 검출 시스템(K5007, DAKO)을 이용하여 α-SMA, TGF-β1, CTGF, MT1-MMP 을 위한 면역조직화학 염색을 수행하였다. 파라핀 포매, 포르말린 고정 샘플을 3 ㎛ 두께의 절편으로 자르고, 탈파라핀화 및 재수화하였다. 항원 회복을 위해, 마이크로파법의 pressure cooker를 Target Retrieval Solution (S2375, DAKO)로 5분 동안(pH 9.0) 수행하고 20분 동안 실온에서 냉각했다. TBS에서 세척한 후, 10% 정상 염소 혈청을 함유한 PBS 중에서 60분 동안 비특이적 결합을 차단하였다. 그리고 나서 4 ℃, 습식 챔버에서 하룻밤 동안, 희석 버퍼 내의 α-SMA 1:200 (Abcam), TGF-β1 1:200 (Abcam), CTGF 1:400 (Abcam), MT1-MMP 1:40 (Abcam)에 대한 일차 항체와 함께 절편을 인큐베이션하였다. 그 다음, 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해 절편을 TBS로 세척하고 0.3% H₂O₂를 함유한 DW 중에서, 15분 동안, 실온에서 인큐베이션한 후 Dako EnVision^TM검출 시스템으로 가시화 하였다. 수돗물로 세척한 후, 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색 및 고정하고 현미경(AX70, TR-6A02, Olympus)으로 관찰했다. 통계적 분석을 위해, 각 슬라이드의 총 면적의 95%를 포함하기 위해 무작위적으로 40X 배율로 하여 이미지를 얻었다. α-SMA, TGF-β1, CTGF 및 MT1-MMP 염색의 퍼센트 면적 측정은 이미지 분석 프로그램 OPTIMAS 버전 6.5 (Media Cybernetics®, Silver Spring, MD)를 이용하여 수행했다. 문턱값 아래의 최소 신호 레벨은 각 조직 절편에 따라 염색하지 않은 지역으로부터 측정된 평균 배경값에 기초하여 설정 되었다.

2 주 동안 펜톡시필린을 처리한 군은 종양 절편에서 α-SMA 및 CTGF 면역염색은 각각, 66% (P < 0.001) 및 25% (P < 0.05)까지 감소시켰다(도 5A).

quantitative real-time RT-PCR 분석을 위해 Trizol법을 이용하여 종양 호모제네이트로부터 총 RNA를 분리하였고 Nanodrop spectrophotometer (ND-1000)에 의해 정량하였다. AccuPower CycleScript RT PreMix (Bioneer)로 조직으로부터 총 RNA 의 1 ㎍을 역전사 한 후, 제조업자의 추천에 따라 SYBR Green Master mix (Roche)와 함께 LightCycler 480 Real-Time PCR System II (Roche)을 이용하여 quantitative real-time 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 마우스 GAPDH, 인간 GAPDH, 마우스 α-SMA, 마우스 TGF-β1, 마우스 CTGF, 마우스 COL1A1 (콜라겐 타입 I, 알파 1) 및 인간 MT1-MMP을 위한 프라이머는 다음과 같다: 마우스 GAPDH 프라이머, forward 5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCTA-3', reverse 5'-AGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3'; 인간 GAPDH 프라이머, forward 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3', reverse 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'; 마우스 α-SMA 프라이머, forward 5'-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3', reverse 5'-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3'; 마우스 TGF-β1 프라이머, forward 5'-CAACAATTCCTGGCGTTACCTTGG-3', reverse 5'-GAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3'; 마우스 CTGF 프라이머, forward 5'-TCCCGAGAAGGGTCAAGCT-3', reverse 5'-TCCTTGGGCTCGTCACACA-3'; 마우스 COL1A1 프라이머, forward 5'-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3', reverse 5'-TACTCGAACGGGAATCCATC-3'.

모든 발현 데이터를 GAPDH 발현을 이용하여 노멀라이제이션 하였다. ΔΔC _t method (2-ΔΔC _t )를 이용하여 상대적인 유전자 발현을 정량하였다. quantitative real-time RT-PCR 데이터는 2 주 동안의 펜톡시필린 처리가 상대적인 α-SMA 및 CTGF mRNA 발현을 각각, 77% 및 50% (P < 0.05)까지 감소시킨다는 것을 보여주었다 (도 5B).

펜톡시필린의 TGF-β1 발현에 미치는 효과에 있어서, 면역조직화학 염색에 더하여 ELISA 어세이를 통하여 확인하였다.

냉동된 종양은 작은 조각으로 잘라 Precellys 24 homogenizer (Bertin Technologies)를 이용하여 프로테아제 억제제 혼합물(Complete Mini, Roche)을 함유한 조직 추출제I (Invitrogen)으로 균질화하였다. 종양 호모제네이트를 원심분리하고 상청액을 분리하여 ELSA 분석을 위해 사용할 때까지 -70℃에서 보관했다. BCA 단백질 어세이 키트(Pierce)에 의해 총 단백질 농도를 측정하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 TGF-β1 ELISA 키트 (eBioscience)를 이용하여 총 활성 TGF-β1 농도를 측정하였다. 면역조직화학 결과 및 ELISA 데이터는 펜톡시필린이 종양 조직에서 TGF-β1의 활성 및 총 TGF-β1 수준에 영향이 없음(도 5A 및 5C)을 보여주었으나 mRNA 발현에는 큰 차이가 있었다(도 5B).

실시예 5

펜톡시필린의 젬시타빈 내성에 의한MT1-MMP 발현에 미치는 효과

콜라겐 타입 I은 젬시타빈 내성이 유도된 PDAC에서 MT1-MMP의 발현을 촉진한다. 따라서, 펜톡시필린 처리에 의해 감소된 콜라겐 타입 I은 또한 젬시타빈 내성이 유도한 MT1-MMP의 발현을 감소시킬 것이라는 가설을 세우고 실시예 4와 동일한 방법으로 실험하였다. 그러나, 2주 동안 펜톡시필린 처리는 종양 절편에서 MT1-MMP 면역염색을 감소시키지 않았고(도 6A) 펜톡시필린은 또한 종양에서 MT1-MMP의 mRNA 발현을 상당히 감소시키지 않았다(도 6B). 실시예 4 및 5의 결과를 종합하여, 펜톡시필린이 섬유화 관련 인자들, α-SMA, CTGF 및 TGF-β1에 미치는 영향을 모식도로 나타내었다(도 7).

Claims (8)

1. 젬시타빈 및 독소루비신으로부터 선택되는 항암제의 항암치료 보조제에 있어서, 펜톡시필린을 포함하는 항암치료 보조제.
   
2. 제1항에 있어서, 펜톡시필린과 항암제를 동시 또는 순차적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 항암치료 보조제.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 항암제는 나노입자 형태로 제조된 것인 항암치료 보조제.
   
6. 제1항에 있어서, 항암제는 리포좀 제제인 것인 항암치료 보조제.
   
7. 제2항에 있어서, 펜톡시필린을 먼저 투여한 후 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 항암치료 보조제.
   
8. 제1항에 있어서, 암은 췌장암, 간암, 유방암, 폐암, 위암, 직장암, 담낭암, 난소암, 방광암, 대장암, 임파종, 뇌암, 자궁암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항암치료 보조제.

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