KR101511934B1 - 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는 지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는 지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-8 또는 GRO-α를 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포에 치료적 유전자 또는 그의 산물을 전달하는 세포치료용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한 유전자치료법에 의하여 뇌종양을 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)를 이용한 뇌종양의 진단 및 치료, 치료경과 모니터링방법, 이를 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

Description

제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는 지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물{Composition for the diagnosis, prevention or treatment of diseases related to cells expressing IL-8 or GRO-α, comprising UCB-MSCs}
본 발명은 인터루킨-8(IL-8) 또는 지알오-알파(GRO-α)를 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포에 치료적 또는 마커 유전자 또는 그의 산물을 전달하는, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한 유전자치료법에 의하여 IL-8 또는 GRO-α을 발현하는 세포에 발생된 질병, 뇌종양을 치료하는 것에 관한 것이다.
또한 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)를 이용한 뇌종양의 진단, 예방, 치료, 치료경과 모니터링방법, 이를 위한 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 병변부위로 이동하는 현상을 보인다고 알려져 있다. 최근에는 골수유래 간엽줄기세포가 종양부위로 이동하는 유주활성(tropism)을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 이렇게 특정 종양부위로 이동할 수 있는 간엽줄기세포는 유전자치료를 위한 유용한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어 유주활성을 갖는 골수유래 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 치료용 자살유전자를 종양 형성 부위로 타겟팅하기 위한 비히클로 사용가능하다[Ponte A.L. 등, Stem Cells, 25, 1737-1745 (2005); Kahler C.M. 등, Respir Res 8, 50 (2007)]. 그러나 이러한 흥미있는 현상에도 불구하고 간엽줄기세포가 종양부위로 이동하는 현상을 조절하는 분자기전에 대해서는 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.
최근 몇 년간, 골수 유래 간엽줄기세포의 이동이 몇몇 가용성 인자(soluble factor)에 의하여 유도되는 것 같다는 증거들이 나오고 있다. 유방암에서 분비하는 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)이 골수유래 간엽줄기세포의 이동을 자극한다는 것이 알려졌다[Dwyer R.M.등 Clin Cancer Res 13, 5020-5027 (2007)]. 또한 케모카인 리간드2 (CCL2) 및 케모카인 리간드10(CCL-10)은 중간뇌동맥폐색(MCAo; Middle cerebral artery occlusion) 졸증 모델에서 신경모세포(neural progenitor cell)가 손상된 부위로 이동하는 것을 유도할 수 있다 [J Neurosci Res 85, 2120-2125 (2007)]. 인슐린유사성장인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1)은 쥐의 골수유래 간엽줄기세포의 이동반응을 현저하게 증가시켰다 [Li Y. 등 Biochem Biophys Res Commun 356, 780-784 (2007)]. 따라서, 간엽줄기세포의 이동에 영향을 주는 가용성 인자를 확인하는 것은 간엽줄기세포가 어떻게 종양조직 또는 손상된 조직으로 이동하는가를 이해하는데 중요하다고 보인다.
골수유래 간엽줄기세포에 도입된 유전자는 신체 내에서 과발현되어 그의 생리활성을 발휘한다는 것이 보고되었다. 인간 안지오포이에틴-1 유전자(hAng1 gene)가 도입된 골수유래 간엽줄기세포는 급성심근경색 모델동물의 경색부위에서 혈관신생을 증가시키는 것이 확인되었으며[Sun L.등, Biochemical Biophysical Research Communication 357(2007) 779-784], Akt가 과발현되는 골수 유래 간엽줄기세포는 심근경색을 극적으로 치료하고 심장의 기능을 향상시켰고[Nicolas N.등, Molecular Therapy 14(6), 840-850, 2006], Bcl-2 유전자로 수식된 골수 유래 간엽줄기세포는 세포사멸을 저해하고 심장기능을 향상시켰다[Stem Cells 25, 2118-2127 (2007)]. 또 다른 예로는 내피 산화질소합성효소(endothelial nitric oxide synthase)를 과발현하는 골수유래 간엽줄기세포가 폐고혈압으로 기인된 우심실의 손상을 회복시킨다는 보고를 들 수 있다[Sachiko 등 Circulation, 114[suppl I]:I-181~I-185]. 이러한 결과들은 유전자가 도입된 간엽줄기세포를 유전자 치료의 도구로 사용할 수 있다는 것을 시사한다.
한편, 뇌(brain)와 척수(spinal cord)로 이루어지는 중추신경계의 세포는 보통 잘 통제되어 성장하나, 어떤 이유에 의해서 이러한 통제가 무너지게 되면 세포는 끊임없이 분열하여 종양(tumor)를 형성하게 된다. 이러한 종양은 양성종양과 악성종양을 포함한다. 중추신경계는 신경세포와 신경세포를 지지하고 보호하는 글리아세포(glia cell)의 두 가지 종류의 세포로 이루어져 있다. 글리아세포에 생긴 종양은 글리오마(glioma; 신경교종)라 하는데 일차성(원발성) 뇌종양의 50%, 일차성 척수종양의 15%를 차지한다. 그 외에 뇌종양에는 신경, 혈관, 분비선(gland)에 생기는 종양도 포함된다. 뇌종양에는 신체의 다른 부위에 생긴 종양이 전이되어 생기는 이차성(속발성) 뇌종양도 포함되며 뇌종양의 가장 많은 부분을 차지한다.
뇌종양은 그 위치의 특성상 치료가 어렵다. 뇌종양의 치료법으로는 외과적인 수술 및 화학요법이 있으나, 종양부위를 완전히 적출하게 되면 합병증의 위험성이 크며, 화학요법을 이용할 경우 뇌혈류장벽(brain-blood barrier) 때문에 고농도의 항암제의 투여가 필요하게 되어 다른 장기에 심각한 부작용을 초래하게 된다. 최근에는 뇌종양치료를 위하여 유전자치료법의 적용이 시도되고 있다. 암세포의 증식을 억제하는 유전자를 암세포에 도입하는 유전자치료법은 대부분이 바이러스벡터를 사용하는 것을 근간으로 한다. 바이러스 벡터는 목적하는 암부위로 선택적으로 이동하는 능력이 없으므로 이를 위하여 표면을 변성시키는 등의 방법이 사용되고 있으나 충분한 양의 바이러스 벡터를 표적 부위로 이동시키는 데에는 한계가 있다.
줄기세포가 병변부위로 이동하는 현상(Homing effect)에 대한 연구결과들이 발표되어 줄기세포가 뇌종양치료를 위한 전달매체로서 유용하게 사용될 가능성이 있다는 것을 보여주고 있으나 그 기전은 명확히 알려져 있지 않다. 신경줄기세포(neural stem cells)가 뇌종양 즉 악성 글리오마로의 유주활성이 있다는 것이 밝혀졌다. 이를 토대로 신경줄기세포를 뇌종양부위로의 유전자 전달매체로 사용하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다 (Yip S 등, The Cancer J 9(3), 189-204, 2003; Kim SK 등, Clin Cancer Res 12(18), 5550-5556, 2006). Yip 등은 신경줄기세포에 면역조절유전자, 아폽토시스(apoptosis) 촉진 유전자, 프로드러그전환효소, 암 용해 바이러스(oncolytic virus) 등을 탑재하여 뇌종양을 치료할 수 있음을 기재하고 있다. Brown 등은 항암제인 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil; 5-FU)의 전구약물인 5-플루오로시토신 (5-fluorocytosine; 5-FC)을 5-FU로 전환시킬 수 있는 시토신 데아미나제(cytosine deaminase) 유전자를 포함하는 벡터를 신경줄기세포에 도입하여 뇌에 이식하고, 5-FC를 투여한 결과 높은 효율로 뇌종양이 치료됨을 확인하였다 (Brown AB 등, Human Gene Ther. 14(18), 1777-1785, 2003). Ehtesham 등은 인터루킨-12 또는 종양괴사인자 관련 아폽토시스 유도 리간드를 전달하도록 처리된 신경줄기세포를 주입한 결과 뇌종양의 성장이 느려졌다고 보고하였다 (Cancer Res 62, 5657-5663, 2002; Cancer Res 62, 7170-7174, 2002). 그러나 신경줄기세포를 임상에 사용하는 것은 신경줄기세포를 얻는 방법에 있어서의 윤리적인 문제와 동종이식(allogenic transplantation)에 의한 면역거부반응에 대한 문제를 안고 있다. 따라서 이러한 문제점들이 없고 보다 쉽게 구할 수 있는 다른 줄기세포를 찾는 것이 중요하게 되었다.
Akira 등은 골수 유래 간엽줄기세포가 뇌종양에 대한 유주활성이 있다는 것을 밝혔다 (Cancer Res 65(8), 3307-3316, 2005). 골수 유래 간엽줄기세포는 환자로부터 얻을 수 있으며, 자가이식(autologous transplantation)되면 면역거부반응에 대한 문제가 없으므로 임상적으로 사용하는데 이점을 갖는다. 사람 글리오마 세포주가 두개골 내에 이식된 누드마우스에 골수유래 사람 간엽줄기세포를 경동맥으로 주입한 결과, 간엽줄기세포는 이식된 글리오마 내로만 이동하였으며, 글리오마 부근의 정상적인 뇌에서는 관찰이 되지 않았다. 골수 유래 사람 간엽줄기세포는 또한 두개골 내에 이식될 경우에도 글리오마를 향하여 이동하였다. 상기 골수 유래 사람 간엽줄기세포를 IFN-beta 유전자의 cDNA를 함유하는 아데노바이러스 벡타로 감염시킨 후, 두개골 내에 글리오마가 이식된 누드마우스의 경동맥을 통하여 주입할 경우, 상기 누드마우스의 생존기간을 연장하였다. 국제특허공개 제WO 07/037653 A1호는 시토신 데아미나제 유전자를 발현하는 골수유래 간엽줄기세포를 포함하는 암치료용 조성물에 대하여 기재하고 있다. 그러나 골수유래 간엽줄기세포의 채취는 여러 단계의 시술이 필요하고 시술과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통과 부담을 주는 문제점이 있어 보다 확보가 용이한 다른 줄기세포를 찾는 것이 중요하다.
많은 양의 간엽줄기세포가 존재하는 제대혈은 골수와는 달리 분만과정에서 버려지는 제대 (umbilical cord)로부터 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 제대혈의 보관산업이 활성화되어 이미 구축된 인프라를 통하여 공여자를 구하는 것도 쉬우므로 간엽줄기세포의 확보가 용이하고, 타가 유래의 제대혈로부터 얻은 간엽줄기세포의 경우에도 이식 후 면역반응을 일으키지 않아 면역학적 안정성을 갖는다. 따라서 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 이용한 치료, 예를 들어 뇌종양 치료를 위한 용도에의 사용가능성을 확인하는 것은 매우 중요하나, 아직까지 이에 대한 시도가 이루어진 바 없다. 본 발명의 명세서에 인용되는 선행문헌의 내용은 모두 본 명세서에 도입된다. 또한 이곳에 기재된 정보들은 단지 본 발명의 기술적 배경에 대한 이해를 돕고자 하는 것으로서, 본 발명에 대한 선행기술로서 작용할 수 없음은 당연하다.
최근 간엽줄기세포의 특이적 이동성을 이용하여 줄기세포에 치료용 유전자를 탑재하고 병변부위로 이동시킨 후 질병을 치료하고자 하는 표적형 유전자치료법이 대두되고 있다. 간엽줄기세포의 유주활성을 이용한 유전자 치료법의 개발을 위해서는 간엽줄기세포가 종양으로 이동하는 현상을 조절하는 분자기전에 대한 명확한 이해가 필요하나, 아직까지 이에 대하여 명확히 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 발명에서 해결하고자 하는 과제 중의 하나는 간엽 줄기세포가 종양세포로 이동하는 분자적 기전을 밝혀 이를 유전자치료에 활용하는 방법을 제공하는 것이다.
뇌종양 치료를 위하여 신경줄기세포 및 골수 유래 간엽줄기세포의 사용 가능성에 대한 연구가 진행 중이나, 윤리적인 문제나 면역거부반응, 채취시 채취대상의 고통 및 부담 등의 문제가 있어, 이러한 문제점들이 없이 획득이 보다 용이하고, 뇌종양으로의 유주활성에 더 효율적인 다른 줄기세포를 찾아 제공하는 것이 본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제이다.
본 발명의 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 지속적으로 연구한 결과, 제대혈 유래 간엽줄기세포 (Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells; UCB-MSCs)가 뇌종양세포로의 유주활성을 가지며, 골수유래 간엽줄기세포 (Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BM-MSCs)보다도 그 활성이 더 크다는 것을 밝히고, 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 이용한 뇌종양 치료용도를 제공함으로써 상기 과제를 해결하였다.
또한 본 발명의 발명자들은 상기 UCB-MSCs의 유주활성이 인터루킨-8(IL-8) 또는 GRO-α의 영향을 받는다는 것을 알아내었다. 이를 기초로 본 발명자들은 IL-8 또는 GRO-α을 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포에 치료적 유전자 또는 그의 산물을 전달하는 방법 및 유전자치료를 위한 이의 용도를 제공한다.
본 발명에 의한 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 조성물은 IL-8 또는 GRO-α를 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포 또는 뇌종양세포에 대하여 선택적인 유주활성을 가지며, 유주활성이 기존의 다른 줄기세포보다 더 우수하므로, 보다 효과적으로 치료적 유전자 또는 그의 산물을 전달할 수 있다. 따라서 본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 의약 조성물 또는 키트는 IL-8 또는 GRO-α 발현 세포가 관련된 질병 또는 뇌종양의 진단, 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 제대혈세포의 수득과정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포와 각종 세포주와의 공동배양에 사용된 트랜스웰 챔버(transwell chamber)의 모식도이다.
도 3은 PKH로 표시된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 트랜스웰 챔버의 상부에, U-87 MG, LS174T, NC37 및 NIH3T3 세포를 트랜스웰 챔버의 하부에 두고 공동배양한 후 하부로 이동한 간엽줄기세포의 수를 측정한 결과이다. (A)의 그래프에서 왼쪽 막대는 트랜스웰 챔버 하부의 세포주의 수가 1X105 cells, 오른쪽 막대는 5X105 cells인 경우이며 간엽줄기세포의 수는 1X105 cells이다. (B)는 사람세포주가 없는 배지만 첨가한 경우(control; 좌측)와 U-87 MG 세포가 공동 배양된 경우(우측)의 PKH26으로 표지한 간엽줄기세포가 챔버하부로 이동한 것을 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는 PKH로 표시된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 트랜스웰 챔버의 상부에, U-87 MG, KATO III, A549, PLC/PRF5, LN18, U138 및 U251 세포를 트랜스웰 챔버의 하부에 두고 공동배양한 후 하부로 이동한 간엽줄기세포의 수를 측정한 결과이다(A 및 C). (B)는 PKH26으로 표지한 제대혈 유래 간엽줄기세포가 챔버하부로 이동한 것을 형광현미경으로 관찰한 결과이다. (D)는 U-87 MG 세포 또는 U-87 MG 세포를 포함하지 않는 U-87 MG 세포를 배양하여 얻은 조절된 배지(conditioned media)와 공동배양시 이동한 UCB-MSC의 수를 측정한 결과이다.
도 5는 골수유래 간엽줄기세포와 제대혈 유래 간엽줄기세포의 U-87 MG에 대한 유주활성을 비교한 것이다. PKH로 표시된 제대혈 유래 간엽줄기세포와 골수유래 간엽줄기세포를 트랜스웰 챔버의 상부에, U-87 MG 세포를 트랜스웰 챔버의 하부에 두고 공동배양한 후 하부로 이동한 두 간엽줄기세포의 수를 비교한 결과이다. 그래프에서 왼쪽 막대는 U-87 MG 세포가 없는 경우이며 오른쪽 막대는 U-87 MG 세포가 있는 경우 (U-87 MG 세포의 수 5X105 cells)이다. 이 때 간엽줄기세포의 수는 1X105 cells 이다.
도 6은 각종 암세포주 (A549, HeLa 세포 및 U-87 MG)와 제대혈 유래 간엽줄기세포를 공동배양한 후, 각 암세포주에서 골수유래 간엽줄기세포의 유닛(Unit)들의 주화성 지수(chemotactic index)를 비교한 것이다.
도 7은 각 세포주와 제대혈 유래 간엽줄기세포를 공동배양한 후, 세포 추출물과 배양배지를 사이토카인 어레이를 통하여 분석한 결과이다.
도 8은 UCB-MSCs 단독, U-87 MG 세포 단독, 상기 두 세포주를 함께 배양한 것으로부터 조절된 배지를 수득하고, 상기 배지를 어레이막 (array membrane) 상에서 배양하고 ECL 시약으로 시각화한 것이다. (A)는 UCB-MSCs 및 배지대조구에서의 사이토카인 항체 어레이 분석 결과이다. (B)는 U-87 MG 단독 배양 배지, UCB-MSCs 및 U-87 MG의 공동배양배지에서의 사이토카인 항체 어레이 분석 결과이다. (C)는 U-87 MG가 존재할 때 또는 존재하지 않을 때 배양된 UCB-MSCs(좌측) 또는 UCB-MSCs가 존재하거나 존재하지 않을 때 배양된 U-87 MG(우측)로부터 mRNA를 분리하여 확인한 결과이다. IL-8 특이 프라이머들을 사용하여 RP-PCT를 수행하였으며 GAPDH를 대조군으로 사용하였다.
도 9는 도 8에서 분석된 사이토카인 중에서 IL-8과 GRO-α가 간엽줄기세포의 이동성에 미치는 영향을 조사한 결과이다. (A)는 재조합 IL-8 단백질을 간엽줄기세포에 0, 1, 10 및 100 ng을 24시간 동안 처리하고 하부챔버로 이동한 간엽줄기세포의 수를 측정한 결과이다. (B)는 IL-8의 세포내 수용체로 알려진 CXC 케모카인 수용체 1(chemokine receptor 1; CXCR1)의 항체 0.02, 0.2 및 2 μg을 전처리하여 수용체를 저해한 후 IL-8 50 ng을 처리하여 간엽줄기세포의 이동을 촉진시킨 결과이다 (*, p=0.007; **, p<0.001). (C)는 GRO-α를 간엽줄기세포에 처리하여 하부챔버로 이동한 세포수를 측정한 결과이고(*,p<0.005), (D)는 MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1)을 처리하여 간엽줄기세포의 이동성을 측정한 결과이다.
도 10은 U-87 MG, KATO III, A549, PLC/PRF5, LN18, U138 및 U251 세포를 배양한 배지에서 IL-8 분비량을 ELISA로 측정한 결과이다(A 및 B). (C)는 IL-8의 분비량이 낮은 A549 세포에 IL-8 유전자를 도입시키고 과발현시킨 후, 간엽줄기세포에 대한 이동성을 측정한 결과이다. (D)는 C의 조건에서 배지로 분비된 IL-8의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 11은 제대혈 유래 간엽줄기세포(UCB-MSC)와 골수 유래 간엽줄기세포 (BM-MSC)의 U-87 MG에 대한 유주활성을 비교한 것이다. (A)는 U-87 MG에 대해서 하부챔버로 이동한 골수 유래 간엽줄기세포와 재대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성을 비교한 결과이고, (B)는 IL-8을 14시간 동안 처리할 때 BM-MSC와 UCB-MSC의 유주활성을 비교한 것이다.
도 12는 UCB-MSCs와 BM-MSCs에서 IL-8의 수용체로 알려진 CXCR1 및 CXCR2의 발현정도를 mRNA와 단백질을 측정하여 비교한 것이다. (A)는 각 두 세포에서 mRNA를 분리하고 CXCR1 및 CXCR2에 특이적인 프라이머를 넣고 RT-PCR한 결과이다. 분리된 RNA를 정량하기 위하여 각 시료와 GAPDH를 반응시켰다. (B)는 A에서 수득된 겔의 각 mRNA 밴드 세기를 덴시토미터 (densitometer)로 측정하여 두 세포 간의 발현 정도를 그래프로 나타낸 결과이다(* 및 **, p<0.001; n=4). (C)는 CXCR1과 CXCR2의 단백질 발현 정도를 CXCR1 및 CXR2의 특이적 항체를 이용하여 면역염색법 (Immunostaining)을 수행하여 두 세포에서 확인한 결과이다 (x400). (D)는 CXCR1, 2의 항체를 처리하지 않고 이차항체만을 처리하여 CXCR1 및 CXCR2 항체의 항원 특이성을 증명한 결과이다.
도 13은 제대혈 간엽줄기세포에 녹색형광단백질 유전자를 도입하여 과발현 시킨 결과를 형광현미경 하에서 관찰한 결과이다.
도 14는 녹색형광단백질을 코딩한 유전자와 empty 유전자를 제대혈유래 간엽줄기세포에 각각 과발현시킨 후, 트랜스웰 챔버의 상부에 녹색형광단백질을 발현한 간엽줄기세포를, 그리고 하부에는 U-87 MG세포를 넣고 24시간 공동 배양하여 하부로 이동한 세포 중 GFP 양성(positive) 세포를 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 실험을 위하여 사용된 프라이머 서열이다.
본 발명의 발명자들은 종양에 대한 보다 효과적인 유주활성을 갖는 줄기세포를 찾기 위한 연구를 한 결과, 놀랍게도 제대혈유래 간엽줄기세포가 특히 뇌종양에 대한 유주활성이 강하며, 나아가 뇌종양에 대한 유주활성이 있는 것으로 알려진 골수 유래 간엽줄기세포보다 유주활성이 더 크다는 것을 최초로 밝혔다. 또한, 본 발명의 발명자들은 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성에는 IL-8 또는 GRO-α이 관여한다는 것을 밝혔다.
본 발명의 발명자들은 제대혈유래 간엽줄기세포와 대표적인 종양 세포주들을 공동 배양하여 간엽줄기세포의 유주 활성의 특성을 파악하고 또한 이에 관련된 사이토카인들을 분석하였다. 트랜스웰 챔버를 이용하여 제대혈유래 간엽줄기세포와 사람 뇌종양 세포주 (U-87 MG, LN18, U138 및 U251), 사람 직장암 세포주 (LS174T), 사람 B 림포사이트 (NC37), 쥐의 섬유아세포 (NIH3T3), 위암세포주인 KATO III, 폐암세포주인 A549, 또는 간암세포주인 PLC/PRF5를 공동 배양하여 간엽줄기세포의 이동성을 측정한 결과, 뇌종양 세포주인 U-87 MG, LN18, U138 및 U251에서 강력한 유주활성을 확인하였다(도 3 및 4). UCB-MSC는 U-87 MG 세포를 포함하지 않는 U-87 MG 세포를 배양하여 얻은 조절된 배지(conditioned media)를 향해서도 유주활성을 보였다 (도 4D).
또한 현재 줄기세포의 공급원으로서 많이 이용되고 있는 골수유래 간엽줄기세포와 제대혈유래 간엽줄기세포의 뇌종양 세포주에 대한 유주활성을 비교 분석한 결과 제대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성이 훨씬 뛰어남을 확인하였다(도 5). 또한 각종 암세포주에 대한 간엽줄기세포의 주화성 지수 값이 뇌종양세포에서 가장 높았다(도 6). 이는 골수유래 간엽줄기세포보다 확보가 유리하고 면역학적 안정성을 가지는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 또 다른 장점으로 뇌종양 내부 또는 뇌종양 부근에 치료유전자를 보다 효과적으로 전달하여 세포를 이용한 뇌종양의 유전자 치료에 더욱 적합한 매개체임을 입증하는 중요한 결과이다.
상기 트랜스웰 챔버 내에서의 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성은 두 세포의 공동배양에서 유도 분비되는 사이토카인에 의한 것으로 사료되어, 트랜스웰 챔버를 이용하여 두 세포를 공동 배양 한 후 배지 (Media)를 얻어 사이토카인 어레이 (Cytokine array)로 분석한 결과, 간엽줄기세포와 U-87 MG를 공동배양한 배지에서 IL-8, GRO-α과 같은 사이토카인의 분비가 높게 나타난다는 것이 확인되었다(도 7). 따라서 이들이 간엽줄기세포의 유주활성을 유도했을 가능성이 높다.
본 발명의 발명자들은 UCB-MSCs 단독 배양, U-87 MG 세포 단독 배양, 상기 두 세포주의 공동 배양 후, 각 세포로부터 IL-8 mRNA 레벨을 RT-PCR로 분석하였다.
UCB-MSCs는 U-87 MG 세포가 존재하거나 존재하지 않거나 IL-8을 발현시키지 않았으나 U-87 MG는 두 조건하에서 모두 IL-8을 발현하였다(도 8). UCB-MSCs를 IL-8로 처리하면 처리하지 않은 경우와 비교하여 이동이 현저하게 많아졌다(도 9A). 그러나 UCB-MSCs를 IL-8 수용체에 대한 항체인 항-CXCR1 항체와 미리 배양한 후, 재조합 IL-8을 UCB-MSCs에 처리하자, IL-8에 의한 UCB-MSCs의 이동이 항체용량에 의존적으로 감소하였다 (도 9B). 항 CXCR2 처리 역시 동일한 효과를 보였다. GRO-α를 처리할 경우도 역시 처리하지 않은 경우와 비교하여 UCB-MSCs의 이동을 증가시켰다 (도 9C). 반면, MCP-1이 처리된 배양에서는 UCB-MSCs의 이동에 있어 유의한 차이를 관찰할 수 없었다 (도 9D). 이는 UCB-MSCs의 U-87 MG 세포로의 이동에 IL-8 및 GRO-α가 관여한다는 것을 말해준다.
각 암세포에서 분비된 IL-8의 양과 간엽줄기세포의 이동성과의 상관관계를 살펴본 결과, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 가장 많이 이동시킨 U-87 MG가 IL-8을 가장 많이 생산하였다(도 10A). 이는 UCB-MSCs가 IL-8을 생산하는 세포에 대하여 강한 이동성향을 갖는다는 것을 말해 준다. 이를 확인하기 위하여 원래는 IL-8의 발현도가 낮은 인간폐암세포인 A549에서 인위적으로 IL-8이 과발현되도록 하고 UCB-MSCs와 공동배양한 결과, A549 세포로의 이동성이 낮았던 UCB-MSCs가 IL-8을 과발현하는 A549 세포로는 높은 이동성을 보이는 것이 확인되었다. 이는 IL-8이 UCB-MSCs 이동을 강하게 유발한다는 것을 말해준다(도 10C).
본 발명의 발명자들은 BM-MSCs와 UCB-MSCs의 U-87 MG 세포 또는 IL-8에 대한 이동성을 비교하였다. UCB-MSCs가 BM-MSCs에 비하여 현저하게 높은 이동능을 보였다. UCB-MSCs는 IL-8에 반응하여 이동이 극적으로 증가하였으나, BM-MSCs의 경우는 IL-8에 반응한 이동능이 약하였다(도 11).
UCB-MSCs와 BM-MSCs에서 IL-8의 수용체로 알려진 CXCR1 및 CXCR2의 발현정도를 mRNA와 단백질을 측정하여 비교하였다(도 12). UCB-MSCs 및 BM-MSCs으로부터 분리한 총 RNA를 RT-PCR 분석한 결과, CXCR1 및 CXCR2의 PCR 산물에 의한 밴드 밀도가 BM-MSCs에 비하여 UCB-MSCs에서 더 높았다. CXCR1과 CXCR2의 단백질 발현 정도는 UCB-MSCs 및 BM-MSCs에서 모두 CXCR1과 CXCR2이 높게 발현되었다. IL-8이 CXCR1과 CXCR2에 대한 친화도가 높으므로, UCB-MSCs의 U-87 MG에 대한 더 높은 이동성은 상기 두 수용체의 상향조절 발현(up-regulated expression)에 기인한 것으로 보인다.
본 발명자들은 제대혈 간엽줄기세포에 유전자를 도입하는 실험의 예로서 녹색형광단백질(GFP)을 코딩하는 유전자를 사용하여 시험한 결과 GFP 유전자가 성공적으로 도입되어 발현되는 것을 확인하였다(도 13). 또한, 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자가 과발현된 제대혈유래 간엽줄기세포도 U-87 MG에 대한 유주활성 능력을 여전히 갖는다는 것을 확인하였다(도 14). 상기와 같은 결과는 제대혈 유래 간엽줄기세포로 유전자 또는 그의 산물을 도입하여 IL-8 또는 GRO-α를 분비하는 세포로 전달이 가능함을 보여 준다.
상기 결과를 바탕으로 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하여 IL-8 또는 GRO-α를 발현하는 세포로 유전자 또는 그의 산물을 전달하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 IL-8 또는 GRO-α를 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포에 치료적 또는 마커유전자 또는 그의 산물을 전달하는, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하는 뇌종양 예방 및 치료용 의약조성물, 키트, 용도 및 치료방법을 제공한다. 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하는 뇌종양의 진단용 또는 치료경과 모니터링용 조성물, 키트 및 진단 또는 모니터링 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는 본 발명은 다음을 제공하나 이로 제한되는 것은 아니다.
[1] 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[2] [1]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 뇌종양의 유전자치료를 위한 캐리어로 사용되는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[3] [1]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 항종양 유전자가 도입된 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[4] [3]에 있어서, 항종양 유전자가 종양억제 유전자, 아폽토시스 유발인자 유전자, 세포주기조절 유전자 및 혈관신생억제 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[5] [4]에 있어서, 종양억제 유전자가 PTEN(Phosphatase chromosome 10), Maspin, RUNX3, Caveolin-1, nm23, Rb 단백질, Brush-1, ING-4(Inhibitor of tumor growth), Survivin, XIAP(X chromosome linked inhibitor apoptosis protein) 및 NAIP(Neural apoptosis inhibitory protein)의 유전자, 및 이들의 조절과 관련된 단백질의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[6] [4]에 있어서, 아폽토시스 유발인자 유전자가 사이토카인, 인터루킨, 세포괴사인자(TNF), 인터페론(INF-α, INF-β, INF-γ), 콜로니자극인자(CSFs), p53, Apaf-1, TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), Caspase, Bax, Bad, FADD, JNK 및 p38 키나제의 유전자, 및 이들 인자의 조절과 관련된 단백질의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[7] [4]에 있어서, 세포주기조절 유전자가 cdc2, Cyclin (Cyclin A, Cyclin D, Cyclin E), cdc25C, p21WAF, p16INK4, CDK (CDK1, CDK2, CDK4, CDK6), Rb 단백질, E2F의 유전자, 이들의 안티센스 또는 siRNA 및 이들의 조절과 관련된 단백질의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[8] [4]에 있어서, 혈관신생억제 유전자가 트롬보스폰딘-1 (Thrombospondin-1), 엔도스타틴(Endostatin), 텀스타틴(Tumstatin), 칸스타틴(Canstatin), 바스타틴(Vastatin), 레스틴(Restin), 혈관내피성장억제제(Vascular endothelial growth inhibitor), 마스핀(Maspin), 안지오포이에틴(Angiopoietins), 프로락틴 16-kd 단편(16-kd prolactin fragment) 및 엔도레펠린(Endorepellin)의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[9] [1]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 프로드러그 전환효소 유전자가 도입된 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[10] [9]에 있어서, 상기 프로드러그 전환효소 유전자가 시토신 데아미나제 (cytosine deaminase) 및 CYP2B1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[11] [1]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 종양과 관련된 유전자에 대한 안티센스 또는 siRNA가 도입된 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
[12] [11]에 있어서, 종양과 관련된 유전자가 Ras family, c-myc, abl, erbB-1, EGF-R, Bax, APIP (Apaf-1 interacting protein), WISP-1 (Wnt-1-induced secreted protein 1), Wnt, Raf-1, Src, Akt, Erk-1,2 및 BcL-2 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
[13] [1]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 암 용해 바이러스가 도입된 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[14] [13]에 있어서, 암 용해 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) 및 레오바이러스 타입 3 (Reovirus type 3)로 구성된 군에서 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[15] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 뇌종양이 성상세포종 (Astrocytoma), 모양세포성 성상세포종 (Pilocytic astrocytoma), 저-등급 성상세포종 (Low-grade Astrocytoma), 역행성 성상세포종 (Anaplastic Astrocytoma), 다형성 교모 세포종 (Glioblastoma Multiforme), 뇌간글리오마 (Brain Stem Glioma), 상의세포종 (Ependymoma), 상의하세포종 (Subependymoma), 신경절신경종 (Ganglioneuroma), 혼합된 신경교종 (Mixed Glioma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 시신경 교종 (Optic Nerve Glioma), 청신경 종양 (Acoustic Neuroma), 척색종 (Chordoma), 중추신경 림프종 (CNS Lymphoma), 두개인두종 (Craniopharyngioma), 혈관아세포종 (Hemangioblastoma), 수모세포종 (Medulloblastoma), 뇌수막증 (Meningioma), 송과선암 (Pineal Tumors), 뇌하수체암 (Pituitary Tumors), 원시신경외배엽종 (Primitive Neuroectodermal Tumors), 횡문성 종양 (Rhabdoid Tumors), 신경초종 (Schwannoma), 낭종 (Cysts), 신경섬유종증 (Neurofibromatosis), 가상 뇌종양 (Pseudotumor Cerebri) 및 결절성 경화증 (Tuberous Sclerosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약조성물.
[16] 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 뇌종양 진단 또는 치료경과 모니터링용 조성물.
[17] [16]에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽 줄기세포가 검출가능한 마커로 표지된 것인 조성물.
[18] [17]에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 루시퍼라제를 포함하는 효소기반 형광검출제 및 Tat 펩티드-유도체화된 자성 나노입자 (Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
[19] [16] 내지 [18] 중 어느 하나에 있어서, 상기 뇌종양이 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 저-등급 성상세포, 역행성 성상세포종, 다형성 교모 세포종, 뇌간글리오마, 상의세포종, 상의하세포종, 신경절신경종, 혼합된 신경교종, 핍지교종, 시신경 교종, 청신경 종양, 척색종, 중추신경 림프종, 두개인두종, 혈관아세포종, 수모세포종, 뇌수막증, 송과선암, 뇌하수체암, 원시신경외배엽종, 횡문성 종양, 신경초종, 낭종, 신경섬유종증, 가상 뇌종양 및 결절성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
[20] 프로드러그 전환효소 유전자를 포함하는 발현벡터, 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 항암제 전구물질을 포함하는 뇌종양 치료용 키트.
[21] [20]에 있어서, 상기 프로드러그 전환효소 유전자가 시토신 데아미나제 유전자 및 CYP2B1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
[22] [21]에 있어서, 프로드러그 전환효소 유전자를 포함하는 발현벡터 및 제대혈 유래 간엽줄기세포가 프로드러그 전환효소 유전자를 포함하는 발현벡터로 제대혈 유래 간엽줄기세로를 형질감염시킨 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
[23] [20] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 뇌종양이 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 저-등급 성상세포, 역행성 성상세포종, 다형성 교모 세포종, 뇌간글리오마, 상의세포종, 상의하세포종, 신경절신경종, 혼합된 신경교종, 핍지교종, 시신경 교종, 청신경 종양, 척색종, 중추신경 림프종, 두개인두종, 혈관아세포종, 수모세포종, 뇌수막증, 송과선암, 뇌하수체암, 원시신경외배엽종, 횡문성 종양, 신경초종, 낭종, 신경섬유종증, 가상 뇌종양 및 결절성 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 키트.
[24] 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는, IL-8 또는 GRO-α을 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포에 치료적 유전자 또는 그의 산물을 전달하는 유전자 치료용 조성물.
[25] [24]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 유전자치료를 위한 캐리어로 사용되는 유전자 치료용 조성물.
[26] [24]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 항종양 유전자가 도입된 것인 유전자 치료용 조성물.
[27] [26]에 있어서, 항종양 유전자가 종양억제 유전자, 아폽토시스 유발인자 유전자, 세포주기조절 유전자 및 혈관신생억제 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[28] [27]에 있어서, 종양억제 유전자가 PTEN, Maspin, RUNX3, Caveolin-1, nm23, Rb 단백질, Brush-1, ING-4, Survivin, XIAP 및 NAIP의 유전자, 및 이들의 조절과 관련된 단백질의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[29] [27]에 있어서, 아폽토시스 유발인자 유전자가 사이토카인, 인터루킨, 세포괴사인자(TNF), 인터페론(INF-α, INF-β, INF-γ), 콜로니자극인자(CSFs), p53, Apaf-1, TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), Caspase, Bax, Bad, FADD, JNK 및 p38 키나제의 유전자, 및 이들 인자의 조절과 관련된 단백질의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[30] [27]에 있어서, 세포주기조절 유전자가 cdc2, Cyclin (Cyclin A, Cyclin D, Cyclin E), cdc25C, p21WAF, p16INK4, CDK (CDK1, CDK2, CDK4, CDK6), Rb 단백질, E2F의 유전자, 이들의 안티센스 또는 siRNA 및 이들의 조절과 관련된 단백질의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[31] [27]에 있어서, 혈관신생억제 유전자가 트롬보스폰딘-1, 엔도스타틴, 텀스타틴, 칸스타틴, 바스타틴, 레스틴, 혈관내피성장억제제, 마스핀, 안지오포이에틴, 프로락틴 16-kd 단편 및 엔도레펠린의 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[32] [24]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 프로드러그 전환효소 유전자가 도입된 것인 유전자 치료용 조성물.
[33] [32]에 있어서, 상기 프로드러그 전환효소 유전자가 시토신 데아미나제 및 CYP2B1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 치료용 조성물.
[34] [24]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 종양과 관련된 유전자에 대한 안티센스 또는 siRNA가 도입된 것인 유전자 치료용 조성물.
[35] [34]에 있어서, 종양과 관련된 유전자가 Ras family, c-myc, abl, erbB-1, EGF-R, Bax, APIP, WISP-1, Wnt, Raf-1, Src, Akt, Erk-1,2 및 BcL-2 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[36] [24]에 있어서, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 암 용해 바이러스가 도입된 것인 유전자 치료용 조성물.
[37] [36]에 있어서, 암 용해 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 레오바이러스 타입3로 구성된 군에서 선택되는 것인 유전자 치료용 조성물.
[38] 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는, IL-8 또는 GRO-α을 발현하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도할 수 있는 세포를 포함하는 부위에 발생된 질병의 진단 또는 치료경과 모니터링용 조성물.
[39] [38]에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽 줄기세포가 검출가능한 마커로 표지된 것인 조성물.
[40] [39]에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 루시퍼라제를 포함하는 효소기반 형광검출제 및 Tat 펩티드-유도체화된 자성 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용된 용어 “제대혈(umbilical blood)”은 인간을 포함하는 모든 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대 정맥으로부터 채취된 혈액을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “제대혈 유래 간엽줄기세포(umbilical blood derived mesenchymal stem cell)”는 포유동물, 바람직하게는 인간의 제대혈로부터 분리 및 배양된 간엽줄기세포를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “치료”는 1) 아직 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나 이러한 경향이 있는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 질병 또는 장애가 발생되는 것의 예방; 2) 질환의 진전의 억제; 및 3) 질환의 경감을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “뇌종양”은 뇌 및 척수에 발생하는 악성 종양 및 양성종양을 모두 포함하며, 글리아세포 (glial cell)및 비글리아세포(non-glial cell)에 발생되는 모든 종양을 포함한다. 또한 1차성 및 2차성 뇌종양을 모두 포함한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.
제대혈로부터 간엽 줄기세포를 포함하는 단핵구 세포를 분리하기 위해서는 본 출원인에 의하여 등록된 한국등록특허 제489248호에 기재된 방법을 비롯한 가능한 모든 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 피콜-하이팩 밀도구배 분리법 (Ficoll-Hypaque density gradient method) 등을 사용할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 분만 후 태반이 박리되기 전에 제정맥 (umbilical vein)으로부터 채취한 제대혈을 피콜-하이팩 그라디언트 (Ficoll-Hypaque gradient)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 수차례 세척하여 불순물을 제거한다. 이와 같이 분리된 단핵구 세포는 간엽 줄기세포의 분리 및 배양에 바로 이용하거나 초저온 냉동시켜 장기간 보관 후 사용할 수 있다.
채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법으로는 대한민국 공개특허 제2003-0069115호의 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법 (Pittinger MF 등 Science, 284: 143-7, 1999; 및 Lazarus HM 등 Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995)을 사용할 수 있으며, 그 중 한 예를 들면 다음과 같다.
먼저, 채취된 제대혈을, 예를 들어, 피콜-하이팩 농도구배 (Ficoll-Hypaque gradient)를 이용하여 원심분리함으로써 조혈모세포 및 간엽줄기세포를 포함하는 단핵구 세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을 제거한다. 세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에 심어 배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데, 이 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성 (homogeneous)이면서, 방추형 모양 (spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 집락 (colony) 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포이다. 이후 세포가 배양되어 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시킨다.
본 발명의 조성물에 포함되는 세포는 냉동보관할 수 있으며, 이는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다 (Campos 등, Cryobiology 35:921-924, 1995). 냉동시 사용되는 배지의 조성은 10~20% FBS (fetal bovine serum) 및 10% DMSO (dimethylsulfoxide)로 구성되며, 상기 배지 1 mL에 약 1×106 ~ 5×106개의 세포가 존재하도록 세포를 현탁한다.
상기 세포 현탁액을 저온냉동용의 유리 또는 플라스틱 재질의 앰플에 분배하고, 이를 봉하여 미리 온도 조건이 맞춰진 프로그램 냉동기에 넣는다. 세포를 냉동시킬 때는, -1℃/분의 온도 변화를 제공하는 냉동 프로그램을 이용하는 것이 이후 해동시 세포 손상을 줄일 수 있어 바람직하며, 일단 앰플의 온도가 -90℃ 이하에 도달하면, -150℃ 이하의 액체 질소 저장 탱크로 이동시킨다.
냉동 보관된 세포를 해동시킬 때는, 앰플을 액체 질소 저장 탱크로부터 신속하게 37℃로 조절된 수조로 이동시킨다. 앰플 안에 해동된 내용물은 멸균 상태 하에서 배양 배지가 들어 있는 배양 용기에 즉각 옮기는 것이 바람직하다.
본 발명에서 간엽줄기세포의 분리·배양에 사용가능한 배양 배지로는 10% 내지 30% FBS를 포함하는 세포 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 세포 배양용 배지로는 DMEM, MEM 배지를 비롯하여 α-MEM, McCoys 5A 배지, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, (Ham's) F-12 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포배양용 배지는 모두 사용가능하며, DMEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 배양시에는 상기 배지 1 mL에 약 5×103 ~ 2×104개의 세포가 존재하도록 세포를 현탁한다.
또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 소 태아, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate) 및 젠타마이신 (gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B (amphotericin B) 및 니스타틴 (nystatin) 등의 항진균제 (antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포는 뇌종양 세포의 성장을 실질적으로 저해할 수 있는 치료제를 전달할 수 있도록 유전공학적으로 처리할 수 있다. 또한 본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-8 또는 GRO-α을 분비하는 세포에 치료적 유전자 또는 그의 산물을 전달할 수 있도록 유전공학적으로 처리할 수 있다. 여기서 사용된 “저해”란 세포분열 및 성장을 저해하는 것 뿐 아니라 괴사나 아폽토틱 세포사멸도 포함된다. 치료제에는 예를 들어 항종양 유전자, 프로드러그를 드럭으로 전환하는 효소의 유전자, 종양과 관련된 유전자에 대한 안티센스 또는 siRNA, 암 용해 바이러스 등을 들 수 있다 (Yip S 등, The Cancer J. 9(3), 189-204, 2003). 항종양 유전자로는 예를 들어 종양억제유전자, 아폽토시스 유발인자 유전자, 세포주기조절유전자(cell cycle regulatory genes) 또는 혈관신생억제유전자 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로, 종양억제 유전자로는 PTEN, Maspin, RUNX3, Caveolin-1, nm23, Rb 단백질, Brush-1, ING-4, Survivin, XIAP, 및 NAIP의 유전자 또는 이들의 조절과 관련된 단백질의 유전자를 들 수 있으며, 이들로 제한되는 것은 아니다. 아폽토시스 유발인자 유전자로는 사이토카인, 인터루킨, 세포괴사인자(TNF), 인터페론(INF-α, INF-β, INF-γ), 콜로니자극인자(CSFs), p53, Apaf-1, TRAIL, Caspase, Bax, Bad, FADD, JNK 및 p38 키나제의 유전자 또는 이들 인자의 조절과 관련 단백질의 유전자 등을 도입할 수 있으며, 이것들에 제한되는 것은 아니다. 세포주기조절유전자로는 예를 들어 cdc2, Cyclin (Cyclin A, Cyclin D, Cyclin E), cdc25C, p21WAF, p16INK4, CDK (CDK1, CDK2, CDK4, CDK6), Rb 단백질, E2F의 유전자 등을 들 수 있으며, 이들로 제한되는 것은 아니다. 혈관신생억제 유전자로는 트롬보스폰딘-1, 엔도스타틴, 텀스타틴, 칸스타틴, 바스타틴, 레스틴, 혈관내피성장억제제, 마스핀, 안지오포이에틴, 프로락틴 16-kd 단편 또는 엔도레펠린의 유전자를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 프로드러그을 드럭으로 전환하는 효소의 유전자로는 항암제 5-FU의 전구약물인 5-FC를 5-FU로 전환시킬 수 있는 시토신 데아미데이즈, 프로드러그인 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide) 및 이포스파미드 (ifosfamide)를 생활성화시키는데 관여하는 CYP2B1 유전자를 예로 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 종양과 관련된 유전자에 대한 안티센스 또는 siRNA 등의 예로는 Ras family, c-myc, abl, erbB-1, EGF-R, Bax, APIP, WISP-1, Wnt, Raf-1, Src, Akt, Erk-1,2 및 BcL-2에 대한 안티센스 또는 siRNA를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
제대혈 유래 간엽줄기세포에 탑재할 수 있는 암 용해 바이러스로는 헤르페스 심플렉스 바이러스, 레오바이러스 타입 3 등을 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 유전자를 발현 가능한 상태로 도입시킨 제대혈유래 간엽줄기세포는 당업자에 있어서는 공지의 기술을 이용해 적합하게 제작하는 것이 가능하다. 예를 들어 도입하고자 하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스벡터 또는 레트로바이러스벡터, 아데노-관련 바이러스벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스벡터, SV40 벡터, 폴리오마바이러스벡터, 파필로마바이러스벡터, 피카르노바이러스벡터, 백시니아바이러스벡터, 또는 렌티바이러스를 구축하고 (Dehari H 등, Cancer Gene Ther., 10, 75-85, 2003; WO07/037653), 이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 초대배양 간엽줄기세포에 체외(ex vivo) 유전자 형질도입을 실시할 수 있다. 예로서 Tsuda H 등의 방법 (Mol Ther 2003, 7, 354-365)을 사용할 수 있는데, 간단히 설명하면 아데노바이러스 유전자를 감염시키기 1일 전에 간엽줄기세포 (5x105개)를 배양접시에 파종하고, 세포를 상기 유전자가 도입된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 용액과 함께 37℃, 5% CO2에서 1시간 인큐베이션하여 감염시킬 수 있다. 감염시킨 후, 세포를 인산버퍼용액으로 세척하고 통상의 배지를 가한다. 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 naked DNA를 칼슘-인산염(calcium-phosphate)법, 양이온성 리포좀(cationic liposome)법, 전기영동(electrophoration)법 등을 사용하여 바람직한 유전자를 제대혈유래 간엽줄기세포로 도입시킬 수 있다. 또는 PTD(protein transduction domain)과 항종양 단백질의 융합단백질 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 상기 융합단백질 유전자를 간엽줄기세포로 도입할 수 있다 (Wu SP 등 Biochem Biophys Res Commun. 346(1), 1-6, 2006).
상기 벡터구성물은 추가로 조직학적 검사를 위한 유전자 마커를 포함할 수 있는데, 예를 들어 lacZ 나 녹색형광단백질(GFP) 같은 발색 또는 형광성 단백질을 암호화하는 유전자를 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다 (Yip S등, The Cancer J. 9(3), 189-204, 2003).
본 발명의 조성물로 진단, 예방, 치료가 가능한 뇌종양으로는 원발성(1차성) 뇌종양 및 속발성(2차성) 뇌종양을 포함한다. 또한 본 발명의 조성물로 진단, 예방, 치료가 가능한 뇌종양으로는 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 저-등급 성상세포, 역행성 성상세포종, 다형성 교모 세포종, 뇌간글리오마, 상의세포종, 상의하세포종, 신경절신경종, 혼합된 신경교종, 핍지교종, 시신경 교종, 청신경 종양, 척색종, 중추신경 림프종, 두개인두종, 혈관아세포종, 수모세포종, 뇌수막증, 송과선암, 뇌하수체암, 원시신경외배엽종, 횡문성 종양, 신경초종, 낭종, 신경섬유종증, 가상 뇌종양 및 결절성 경화증을 예로 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은 알려진 다른 항암제와 함께 투여될 수도 있다.
제대혈 유래 간엽줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR (class II)이 발현되지 않는 세포이므로 (Le Blanc, KC, Exp Hematol , 31:890-896, 2003; 및 Tse WT 등, Transplantation, 75:389-397, 2003), 기존의 이식수술시 문제가 되었던 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있기 때문에, 본 발명의 의약조성물에 포함되는 제대혈 유래 간엽줄기 세포는 자가유래 제대혈은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할 수 있다. 세포는 냉동보존한 것이어도 괜찮다.
본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 유전자 치료용 또는 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소투여용 제제 등이 바람직하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다.
제조된 본 발명의 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 뇌척수액 또는 정맥이나 병변에 혈류를 공급하는 동맥을 통하여 투여할 수 있고, 바람직하게는 뇌 또는 척수의 병변 주변 또는 그 반대쪽 부위에 직접 투여할 수 있으며, 예를 들어 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상 방법을 이용할 수 있다. 즉, 먼저 대상의 두개골을 약 지름 1cm 정도의 완두콩 크기로 절개한 다음, HBSS(Hank's balanced salt solution)와 혼합된 간엽 줄기세포 용액을 주입하는 방법이 이용될 수 있다. 이 때, 세포용액의 주입은 긴 바늘이 달려 있는 주사기와, 뇌 내부에 목적하는 세포용액을 정좌표로 삽입하기 위한 틀(stereotactic frame)을 이용하여 이루어진다.
상기 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 1일 투여량은 1x104 내지 1x107 세포/kg 체중, 바람직하게는 5x105 내지 5x106 세포/kg 체중이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
나아가 본 발명은, 환자에게 본 발명의 치료에 유효한 양의 의약조성물을 투여하는 것을 포함하는 IL-8 또는 GRO-α을 분비하여 제대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도하는 세포에 발생된 질병 또는 뇌종양의 치료방법에 관한 것이다. 상기 치료방법으로 이용되는 의약조성물에 포함되는 제대혈유래 간엽줄기세포는 환자 본인의 제대혈로부터 채취된 것 뿐 아니라 타인 또는 다른 의료용 동물 유래의 세포를 이용하는 것도 가능하다. 세포는 냉동보존한 것이어도 괜찮다. 본 발명의 치료방법은 반드시 사람에게만 한정되지 않는다. 통상, 사람이외의 포유동물에 있어서도 제대혈유래 간엽줄기세포를 이용하여, 본 발명의 방법을 실시하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하여 IL-8 또는 GRO-α을 분비하여 제대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성을 유도하는 세포에 발생된 질병 또는 뇌종양을 진단하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공한다. 이를 위하여 본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포는 검출가능한 마커로 표지된다. 검출가능한 마커로 표지된 제대혈 유래 간엽 줄기세포는 최신 이미징기술에 의하여 시각화 될 수 있으며, 살아있는 동물의 생체 내에서 실시간으로 추적이 가능하다. 이를 위하여 사용할 수 있는 검출가능한 마커로는 루시퍼라제를 포함하는 효소기반 형광검출제, Tat 펩티드-유도체화된 자성 나노입자 등을 예로 들 수 있다 (Yip S 등, The Cancer J. 9(3), 189-204, 2003). 루시퍼라제를 발현하는 줄기세포를 사용할 경우 실시간으로 생체발광(bioluminescence)을 확인함으로써, 투여된 줄기세포가 병소부위로 이동하는 것을 관찰할 수 있어 질병의 진단 및 발병위치의 확인이 가능하다 (Weissleder R 등, Nat Med 9, 123-128, 2003). Tat 펩티드-유도체화된 자성 나노입자는 Lewin 등의 방법(Nat Biotech 18, 410-414, 2000)에 따라 나노입자를 제대혈 유래 줄기세포에 연결시켜 생체내에 투여한 후, 자기공명이미징(Magnetic resonance Imaging; MRI)을 사용하여 추적이 가능하다. 따라서 상기 마커로 표지된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 생체에 투여하여, 상기 간엽줄기세포가 모이는 부위의 종양가능성을 진단가능하며, 그 위치를 알아낼 수 있다. 또한 상기 마커가 표지된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 뇌종양치료 중간에, 또는 치료 후에 투여하여 투여된 간엽줄기세포의 분포의 위치 및 크기를 관찰함으로써 종양치료가 어느 정도 효과가 있는 지에 대하여도 모니터링이 가능하다. 따라서 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하여 뇌종양 치료의 진전을 모니터링하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공한다. 상기와 같은 모니터링 방법 및 키트는 IL-8 또는 GRO-α을 분비함으로써 제대혈 유래 간엽줄기세포를 분비하는 세포에 발생하는 질병에도 적용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 시험에 사용된 U-87 MG, A549, KATO III, PLC/PRF5, LN18, U138 및 U251 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다. A549, KATO III 및 PLC/PRF5는 10~20%(v/v) FBS(HyClone, Logan UT, US) 및 겐타마이신을 포함하는 RPMI에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. U-87 MG, LN18, U138 및 U251 세포는 10~20%(v/v) FBS를 포함하는 이글즈 MEM(Eagle's minimum essential medium)에서 배양하였다. 골수유래 간엽줄기세포는 LONZA로부터 구입하였다. BM-MSCs 및 확립된 UCB-MSCs는 10~20% FBS를 함유하는 α-MEM에서 배양하였다.
< 실시예 1> 제대혈 ( umbilical cord blood , UCB )의 수득
제대혈 샘플은 산모의 동의를 얻어 출산시 제정맥 (umbilical vein)으로부터 수득하였다. 구체적으로, 44 mL의 CPDA-1 항응고제 (녹십자)를 포함하는 UCB 수집함 (collection bag)의 16-게이지의 주사바늘을 제정맥에 삽입하여 UCB가 중력에 의해 수집함으로 모이도록 하였다. 모든 제대혈 수득물은 채취 후 48시간 내에 처리하였으며, 전체 세포의 생존율은 90% 이상이었다.
< 실시예 2> 간엽 줄기세포의 분리 및 증폭
실시예 1에서 얻은 제대혈 수득물을 피콜-하이팩 그라디언트 (밀도: 1.077 g/mL, Sigma 사)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 수차례 세척하여 불순물을 제거하였다. 10~20% FBS (HyClone 사)를 함유한 최소 기본배지 (α-MEM, Gibco BRL 사)를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 상기 세포를 적당한 농도로 10~20% FBS를 함유한 최소 기본배지에 분주한 다음, 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 일주일에 두 번씩 배지를 교환해가며 배양하였다(도 1). 배양된 세포가 단일층을 형성하면, 위상차 현미경을 이용하여 스핀들 (spindle) 모양으로 증폭된 간엽 줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽 줄기세포가 충분히 증폭될 때까지 계대배양을 반복하였다.
< 실시예 3> PKH -26이 표지된 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 준비
실시예 2에서 분리 배양한 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 문헌 [Barreda DA 등, Developmental and Comparative Immunology, 24:395-406, 2000]에 기재된 방법에 따라 PKH-26 (Sigma 사)으로 염색하였다. 먼저 간엽줄기세포를 트립신을 이용하여 세포 배양용 dish에서 떼어낸 후 2x 107개의 세포를 FBS가 없는 배지로 수세하였다. 수세한 세포를 원심분리기를 이용하여 다시 모으고 이것을 키트에서 제공하는 1 mL의 Diluent C에서 단일세포로 만든 후 2x의 농도의 세포 현탁 용액 1mL과 2x 농도의 PKH 형광염료 1mL과 섞어 25℃에서 5분간 반응시켰다. 반응의 종결은 동량의 FBS가 포함된 배지를 넣어 준 후 1 분간 정치시켰다. 원심분리로 PKH26이 표시된 세포를 모은 후 10~20% FBS가 포함된 배지를 이용하여 3번 수세 한 후 실험에 사용하였다.
< 실시예 4> 트랜스웰 챔버를 이용한 간엽줄기세포와 다른 세포주의 혼합배양
인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포 (hUCB-MSCs)를 PKH-26 (Sigma)으로 염색하고, U-87 MG 외 3가지 종양세포주를 트랜스웰 챔버 (FALCON)를 이용하여 배양 조건에서 공동배양(co-culture)하였다 (간엽줄기세포:암세포주=1:5). 대조군으로서 종양세포들이 없는 간엽줄기세포를 동일한 조건으로 배양하였다. 배양에 사용된 트랜스웰 챔버는 도 2에 표시된 바와 같이, 8μm의 공극을 갖는 미세공막(microporous membrane)에 의해, 하부 (lower compartment)와 상부 (upper compartment)로 구분되어 있다. 트랜스웰 챔버의 미세공막을 기준으로 상부에 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를, 하부에 각각의 사람 뇌종양세포주 U-87 MG, 사람직장암세포주 LS174T, 사람 B 림포사이트 NC37, 쥐의 섬유아세포 NIH3T3를 배양하였다. 배양 1일 및 2, 3일 후에 각각 위상차 현미경(× 100)을 이용하여 간엽줄기세포의 이동을 관찰하고 이동한 세포 수를 측정 하였다(도 3). 또한 KATO III, A549, PLC/PRF5, LN18, U138 및 U251와 같은 종양세포주에 대해서도 동일한 실험을 하여 PKH26으로 표지된 UCB-MSCs의 이동을 관찰하였다. U-87 MG 세포에 의하여 조절된 배지를 트랜스웰 챔버의 하부에 두고 같은 실험을 하였다(도 4).
PKH로 표시된 제대혈유래 간엽줄기세포를 트랜스웰 챔버를 이용하여 각종 종양세포주와 공동 배양한 후 하부로 이동한 PKH 표시 간엽줄기세포의 수를 측정한 결과, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 뇌 종양세포주인 U-87 MG, LN18, U138 및 U251에 대해서는 강력한 유주활성을 보였으나, 다른 종양세포에 대해서는 유주활성이 미약하였다(도 3 및 도 4). 도 3의 B의 좌측은 대조군 즉, 첨가한 경우로, 도 3의 B의 우측은 U-87 MG 세포가 공동 배양된 경우로, 하부로 이동한 많은 PKH26 표지 제대혈 유래 간엽줄기세포들이 관찰되었다. 종양세포 대신 사람세포주가 없는 배지만 첨가하여 배양하는 경우 하부로 이동한 PKH26 표지세포의 수는 미약하였다(도 3B 좌측 대조군(control)). 그러나, U-87 MG 세포를 포함하지 않으나 U-87 MG 세포를 배양하여 얻은 조절된 배지를 향해서는 유주활성을 보였다 (도 4D). 이는 조절배지 내에 존재하는 어떤 가용성 요인이 UCB-MSCs가 U-87 MG 세포로 이동하도록 한다는 것을 의미한다.
<실시예 5 > U-87 MG에 대한 골수유래 간엽줄기세포와 제대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성 비교
U-87 MG에 대한 골수유래 간엽줄기세포와 제대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성정도를 비교하였다. 이틀 동안 트랜스웰 챔버를 이용하여 하부에는 U-87 MG 암세포 혹은 배지만을 첨가하고 모든 상부에는 각각의 간엽줄기세포를 넣고 2일간 배양하였다. 제대혈 간엽줄기세포가 골수유래 간엽줄기세포보다 강한 유주활성을 보였다(도 5).
<실시예 6> MSC 유닛간 이동(migration) 비교
4명으로부터 공여받은 제대혈 유래 간엽줄기세포와 각종 암세포주 (A549(폐암), HeLa(자궁경부암) 및 U-87 MG(뇌암-글리오마)를 트랜스웰 챔버를 이용하여 공동배양한 후, 각 암세포주에서 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유닛들의 주화성 지수를 비교하였다 (도 6).
각 세포들은 ATCC에서 구입하였으며 A549, U-87 MG는 10~20% 우혈청이 포함된 RPMI1640에서, HeLa는 DMEM에서 배양하였다. 주화성 지수는 대조군에서 이동한 세포수를 1로 보고 U-87 MG로 이동한 간엽줄기세포의 수를 환산하여 구하였다. 간엽줄기세포수가 암세포들에게 보이는 유주활성을 분석한 결과 특이하게도 뇌종양세포주인 U-87 MG에 가장 강력한 유주활성을 보임을 관찰할 수 있었다.
< 실시예 7> 사이토카인 어레이 ( Cytokine array )
간엽줄기세포와 U-87 MG 종양세포 등 3종류의 사람세포를 공동배양하고 배지를 얻은 후 간엽줄기세포만 배양한 배지를 사이토카인 어레이를 이용하여 분비된 사이토카인을 탐색하였다.
R&D system 사로부터 구입한 사이토카인 어레이 (array) 용 키트에서 각종 사이토카인의 항체가 부착된 막을 꺼내어 제품에 포함된 블로킹용액과 한 시간 동안 반응시켰다. 그동안 제대혈유래 간엽줄기세포와 U-87 MG 종양 세포 등 3가지 사람세포를 공동배양 하여 얻은 배지의 양을 최대 1.5 mL로 맞추고 여기에 키트에 포함된 각 사이토카인들에 대한 혼합 항체를 섞은 후, 한 시간 동안 항원 항체반응을 유도하였다. 공급된 사이토카인 항체와 분비된 사이토카인들이 서로 결합한 상태의 배지를 블로킹이 끝난 어레이용 막과 4 ℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 막을 세척 용액에 넣고 수세한 후 3차 증류수로 다시 한번 수세한 후 상온에서 막을 건조시켰다. 건조된 막을 다시 세척 용액에서 위의 과정으로 두 번 수세를 반복한 후 스트렙타아비딘-HRP를 포함한 용액에 넣고 30분 동안 반응시켰다. 세척용액으로 3번 수세한 후 발색시약과 반응시키고 암실에서 X-선 필름을 이용하여 감광시켰다.
가장 강력한 유주활성을 보인 U-87 MG 세포에서 성장-관련 온코진 (GRO-alpha; growth-related oncogene), IL-8, MCP-1, G-CSF, GM-DSF, IL-6, IL-1β, MIF (migration inhibitory factor), Serpin E1이 분비되며 GRO-alpha 및 IL-8의 분비가 가장 높게 나타났다. 도 7은 표시된 각각 세포의 용해물(cell lysate), 그리고 각각의 세포배양 상등액 (culture supernatant)을 사이토카인 어레이로 분석한 결과를 나타내고 있다. 어레이 결과를 대조군과 비교하여 변화하는 스팟들을 표 1에 정리하였다. 표 1에서 괄호안에 표시한 사이토카인들이 종양세포와 공동배양에 의해서 유도된 사이토카인들로 간엽줄기세포의 유주활성을 유도했을 가능성이 높다.
세포 용해물
(cell Lysate)		 배양 상등액


NC37
MIF+++
MIF+++

sICAM-1++
Serpin E1+++

MIP-1a++
MIP-1a++

IL-16++
MIP-1b++

IL-6+

IL-8+

LS174-T
MIF+++
MIF+++

IL-1ra++
SerpinE1+++

GROa+
IL-6+

IL-8+




U87
sICAM-1+++
(GROa+++)

IL-6+++
IL-6+++

MIF+++
(IL-8+++)

SerpinE1+++
Serpin E1+++

IL-1ra++
(G-CSF++)

IL-8++
MIF++

G-CSF++
(MCP-1+)

IL-1a+

IL-1b+
UCB-MSCs의 단독배양, U-87 MG 세포의 단독배양, 상기 두 세포주의 공동배양으로부터 조절된 배지를 수득하였다. 상기의 각 배지를 어레이막 상에서 배양하고 ECL 시약으로 시각화하여 비교하였다(도 8). 도 8A는 UCB-MSCs 및 배지대조구에서의 사이토카인 항체 어레이 분석결과이며, 도 8B는 U-87 MG 단독 배양 배지, UCB-MSCs 및 U-87 MG의 공동배양배지에서의 사이토카인 분석결과이다.
도 8C는 U-87 MG가 존재할 때 또는 존재하지 않을 때 배양된 UCB-MSCs(좌측) 또는 UCB-MSCs가 존재하거나 존재하지 않을 때 배양된 U-87 MG(우측)로부터 mRNA를 분리하여 확인한 결과이다. IL-8 특이 프라이머들을 사용하여 RP-PCT를 수행하였으며 GAPDH를 대조군으로 사용하였다. IL-8 mRNA 레벨을 RT-PCR로 분석한 결과, U-87 MG는 UCB-MSCs 세포가 존재하거나 존재하지 않거나 IL-8을 발현한다는 것이 확인되었다.
< 실시예8 > UCB - MSCs 의 이동에 대한 사이토카인의 영향
UCB-MSCs의 이동에 대한 IL-8, GRO-α 및 MCP-1(RND Systems, MN, USA)의 효과를 조사하였다. PHK-26이 표지된 UCB-MSCs를 트랜스웰 챔버의 상부에 두고, 하부 에는 어떤 세포도 두지 않고 배양하였다. UCB-MSCs를 배지단독, 또는 각기 다른 농도의 재조합 인간 IL-8를 포함하는 배지에서 24시간 처리하였다. UCB-MSCs를 IL-8로 처리하면 처리하지 않은 경우와 비교하여 이동이 현저하게 많아졌다(도 9A).
UCB-MSCs상의 IL-8 수용체는 항-인간 CXC 케모카인 수용체 1(CXCR1) 항체에 의하여 효과적으로 저해될 수 있다. UCB-MSCs를 항-CXCR1 항체와 미리 배양한 후, 재조합 IL-8을 UCB-MSCs에 처리하자, IL-8에 의한 UCB-MSCs의 이동이 항체 용량에 의존적으로 감소하였다 (도 9B). 항 CXCR2 처리 역시 동일한 효과를 보였다.
GRO-α를 처리할 경우도 역시 처리하지 않은 경우와 비교하여 UCB-MSCs의 이동을 증가시켰다 (도 9C). GRO-α도 IL-8과 마찬가지로 CC subfamily에 속하며 CXCR2 수용체와 작용한다고 알려져 있다[Wuyts A.등 Eur J Biochem 255, 67-73 (1998)].
반면, MCP-1이 처리된 배양에서는 UCB-MSCs의 이동에 있어 유의한 차이를 관찰할 수 없었다 (도 9D). 이는 UCB-MSCs의 U-87 MG 세포로의 이동에 IL-8 및 GRO-α가 관여한다는 것을 말해준다.
< 실시예 9> UCB - MSCs 의 IL -8을 과발현하는 A549에로의 이동성
각 암세포에서 분비된 IL-8의 양과 간엽줄기세포의 이동성과의 상관관계를 살펴보았다. 도 10A는 U-87 MG (뇌종양), KATOIII (위암), A549 (폐암) 및 PLC/PRF5 (간암)세포를 배양한 배지에서 IL-8의 분비량을 ELISA로 측정한 결과를 나타내었다. 1x105 cells 당 IL-8의 농도로 표준화하여 계산하였다. U-87 MG가 IL-8을 가장 많이 생산하였다. 이는 UCB-MSCs가 IL-8을 생산하는 세포에 대하여 강한 이동성향을 갖는다는 것을 말해 준다. 또한 U-87 MG 외의 다른 사람 뇌종양 세포인 LN18, U138 및 U251 세포 역시 U-87 MG와 유사한 IL-8 생산량을 보였다(도 10B). 이것 역시 뇌종양세포가 분비하는 IL-8에 간엽줄기세포가 유주활성을 가진다는 것을 말해준다.
IL-8을 잘 발현하지 않는 세포가 IL-8을 발현하도록 하면 UCB-MSCs가 그쪽으로 이동하는지를 알아보기 위하여, 인간폐암세포인 A549에서 IL-8이 과발현되도록 하였다. 도 10C는 리포펙타민(lipofectamine) 시약을 이용하여 IL-8의 분비량이 낮은 A549 세포에 IL-8 유전자를 도입시키고 과발현시킨 후, 간엽줄기세포에 대한 이동성을 측정한 결과이다. A549 세포보다 IL-8을 과발현하는 A549 세포로 이동한 UCB-MSCs의 수가 훨씬 많았다. 이는 IL-8이 UCB-MSCs 이동을 강하게 유발한다는 것을 말해준다. 도 10D는 C의 조건에서 배지로 분비된 IL-8의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
< 실시예 10> BM - MSCs 와 UCB - MSCs 의 IL -8에 대한 반응 비교
BM-MSCs가 in vitro 및 in vivo에서 U-87 MG 세포로 이동한다는 것은 알려져 있으므로, BM-MSCs와 UCB-MSCs의 U-87 MG 세포로의 이동성과 IL-8에 대한 이동성을 비교하였다(도 11). 도 11에서 A는 U-87 MG에 대해서 하부챔버로 이동한 골수 유래 간엽줄기세포와 재대혈유래 간엽줄기세포의 유주활성을 비교한 것이고, B는 IL-8을 14시간 동안 처리할 때 BM-MSC와 UCB-MSC의 유주활성을 비교한 것이다. UCB-MSCs가 BM-MSCs에 비하여 현저하게 높은 이동능을 보였다. UCB-MSCs는 IL-8에 반응하여 이동이 극적으로 증가하였으나, BM-MSCs의 경우는 IL-8에 반응한 이동능이 약하였다.
<실시예 11> UCB-MSCs에서의 CXCR1 및 CXCR2의 발현
UCB-MSCs와 BM-MSCs에서 IL-8의 수용체로 알려진 CXCR1 및 CXCR2의 발현정도를 mRNA와 단백질을 측정하여 비교하였다. 도 12A는 각 두 세포에서 mRNA를 분리하고 CXCR1 및 CXCR2에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR한 결과이다. 분리된 RNA를 정량하기 위하여 각 시료와 GAPDH를 반응시켰다. 도 12B는 A에서 수득된 겔의 각 mRNA 밴드 세기를 덴시토미터로 측정하여 두 세포 간의 발현 정도를 그래프로 나타낸 결과이다(* 및 **, p<0.001; n=4). UCB-MSCs 및 BM-MSCs으로부터 분리한 총 RNA를 RT-PCR 분석한 결과, CXCR1 및 CXCR2의 PCR 산물에 의한 밴드 밀도가 BM-MSCs에 비하여 UCB-MSCs에서 더 높았다. 도 12C는 CXCR1과 CXCR2의 단백질 발현 정도를 CXCR1 및 CXR2의 특이적 항체를 이용하여 면역염색법을 수행하여 두 세포에서 확인한 결과이다 (x400). UCB-MSCs 및 BM-MSCs에서 모두 CXCR1과 CXCR2이 높게 발현되었다. IL-8이 CXCR1과 CXCR2에 대한 친화도가 높으므로, UCB-MSCs의 U-87 MG에 대한 더 높은 이동성은 상기 두 수용체의 상향 조절 발현에 기인한 것으로 보인다. 도 12D는 상기 면역염색법에서 CXCR1과 CXCR2의 항체를 처리하지 않고 이차항체만을 처리하여 CXCR1과 CXCR2 항체의 항원 특이성을 증명한 결과이다.
<실시예 12> 제대혈 간엽줄기세포로의 유전자의 도입
삭제
제대혈 간엽줄기세포에 유전자를 도입하는 실험의 예로써 녹색형광단백질(GFP)을 amaxa biosystem사의 인간 MSC 뉴클레오펙터(nucleofector™)를 사용하여 전기영동 방법으로 과발현시키는 실험을 수행하였다. 4x105 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이틀간 배양한 후 5 mg의 GFP 인코딩 유전자를 100 ml의 인간 MSC 뉴클레오펙터와 섞은 혼합액에서 15분간 정치하고 전기영동기에서 유전자를 도입하였다. 세포를 플레이트로 옮기고 24시간 후 녹색형광단백질의 발현정도를 형광현미경 하에서 관찰하였다. 각 간엽줄기세포의 세포질에서 녹색형광단백질을 관찰할 수 있었다(도 13).
유전자가 도입된 제대혈 유래 간엽줄기세포의 유주활성을 테스트하기 위하여 녹색형광단백질을 코딩한 유전자와 empty 유전자를 제대혈유래 간엽줄기세포에 각각 과발현 시킨 후 U-87 MG에 대한 유주활성 능력을 검증하였다. 상기와 같이 유전자를 도입한 후, 트랜스웰 챔버를 이용하여 상부에 녹색형광단백질을 발현한 간엽줄기세포를 그리고 하부에는 U-87 MG 세포를 넣고 24시간 공동 배양하여 하부로 이동한 세포 중 GFP 양성 세포를 확인하였다. GFP 유전자 도입으로 GFP가 과발현된 제대혈 유래 간엽줄기세포도 U-87 MG 세포에 대하여 강한 유주활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
<110> MEDIPOST CO., LTD. <120> Composition for the diagnosis, prevention or treatment of diseases related to cells expressing IL-8 or GRO-alpha, comprising UCB-MSCs <130> PN090691 <150> KR1020070087228 <151> 2007-08-29 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for GAPDH <400> 1 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for GAPDH <400> 2 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for IL-8 <400> 3 tcctgatttc tgcagctctg tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for IL-8 <400> 4 tgcttgaagt ttcactggca tc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for CXCR1 <400> 5 gagccccgaa tctgacatta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for CXCR1 <400> 6 gcagacactg caacacacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for CXCR2 <400> 7 attctgggca tccttcacag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence for CXCR2 <400> 8 tgcacttagg caggaggtct 20

Claims (36)

  1. 항종양 유전자가 도입된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는, 뇌종양에 항종양 유전자 또는 그의 산물을 전달하기 위한 조성물로서, 상기 뇌종양은 IL-8을 발현하고, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-8에 대한 유주활성을 갖고, 상기 항종양 유전자는 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)인 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 뇌종양에 유전자 또는 그의 산물을 전달하기 위한 캐리어로 사용되는 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 프로드러그 전환효소 유전자가 도입된 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프로드러그 전환효소 유전자가 시토신 데아미나제 (cytosine deaminase) 및 CYP2B1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 종양과 관련된 유전자에 대한 안티센스 또는 siRNA가 도입된 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 종양과 관련된 유전자가 Ras family, c-myc, abl, erbB-1, EGF-R, Bax, APIP (Apaf-1 interacting protein), WISP-1 (Wnt-1-induced secreted protein 1), Wnt, Raf-1, Src, Akt, Erk-1, Erk-2 및 BcL-2 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 암 용해 바이러스가 도입된 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암 용해 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus; HSV) 및 레오바이러스 타입 3 (reovirus type 3)로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
  14. 제1항, 제2항 및 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌종양이 성상세포종 (Astrocytoma), 모양세포성 성상세포종 (Pilocytic astrocytoma), 저-등급 성상세포종 (Low-grade Astrocytoma), 역행성 성상세포종 (Anaplastic Astrocytoma), 다형성 교모 세포종 (Glioblastoma Multiforme), 뇌간글리오마 (Brain Stem Glioma), 상의세포종 (Ependymoma), 상의하세포종 (Subependymoma), 신경절신경종 (Ganglioneuroma), 혼합된 신경교종 (Mixed Glioma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 시신경 교종 (Optic Nerve Glioma), 청신경 종양 (Acoustic Neuroma), 척색종 (Chordoma), 중추신경 림프종 (CNS Lymphoma), 두개인두종 (Craniopharyngioma), 혈관아세포종 (Hemangioblastoma), 수모세포종 (Medulloblastoma), 뇌수막증 (Meningioma), 송과선암 (Pineal Tumors), 뇌하수체암 (Pituitary Tumors), 원시신경외배엽종 (Primitive Neuroectodermal Tumors), 횡문성 종양 (Rhabdoid Tumors), 신경초종 (Schwannoma), 낭종 (Cysts), 신경섬유종증 (Neurofibromatosis), 가상 뇌종양 (Pseudotumor Cerebri) 및 결절성 경화증 (Tuberous Sclerosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  15. 검출가능한 마커로 표지된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는, 신경교종 진단 또는 치료경과 모니터링용 조성물로서, 상기 신경교종은 IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상을 발현하고, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상에 대한 유주활성을 갖는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 루시퍼라제를 포함하는 효소기반 형광검출제 및 Tat-펩티드 유도체화된 자성 나노입자 (Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 삭제
  18. 프로드러그 전환효소 유전자를 포함하는 발현벡터가 도입된 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 항암제 전구물질을 포함하는, 뇌종양에 상기 프로드러그 전환효소 유전자 또는 그 산물을 전달하기 위한 키트로서, 상기 뇌종양은 IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상을 발현하고, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상에 대한 유주활성을 갖는 것인 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 프로드러그 전환효소 유전자가 시토신 데아미나제 유전자 및 CYP2B1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 뇌종양이 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 저-등급 성상세포, 역행성 성상세포종, 다형성 교모 세포종, 뇌간글리오마, 상의세포종, 상의하세포종, 신경절신경종, 혼합된 신경교종, 핍지교종, 시신경 교종, 청신경 종양, 척색종, 중추신경 림프종, 두개인두종, 혈관아세포종, 수모세포종, 뇌수막증, 송과선암, 뇌하수체암, 원시신경외배엽종, 횡문성 종양, 신경초종, 낭종, 신경섬유종증, 가상 뇌종양 및 결절성 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 키트.
  21. 치료적 유전자가 도입된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는, IL-8을 발현하는 세포에 치료적 유전자 또는 그의 산물을 전달하기 위한 조성물로서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-8에 대한 유주활성을 갖고, TRAIL이 도입된 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 유전자 전달을 위한 캐리어로 사용되는 것인 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제21항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 프로드러그 전환효소 유전자가 도입된 것인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 프로드러그 전환효소 유전자가 시토신 데아미나제 및 CYP2B1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  31. 제21항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 종양과 관련된 유전자에 대한 안티센스 또는 siRNA가 도입된 것인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 종양과 관련된 유전자가 Ras family, c-myc, abl, erbB-1, EGF-R, Bax, APIP, WISP-1, Wnt, Raf-1, Src, Akt, Erk-1, Erk-2 및 BcL-2 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  33. 제21항에 있어서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포가 암 용해 바이러스가 도입된 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 암 용해 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 레오바이러스 타입 3로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
  35. 검출가능한 마커로 표지된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는, IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상을 발현하는 세포를 모니터링하기 위한 조성물로서, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상에 대한 유주활성을 갖고, 상기 IL-8 및 GRO-α 중 하나 이상을 발현하는 세포는 신경교종인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 루시퍼라제를 포함하는 효소기반 형광검출제 및 Tat-펩티드 유도체화된 자성 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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