KR101501099B1

KR101501099B1 - 신규한 ｐｎａ 및 이를 포함하는 항균용 조성물

Info

Publication number: KR101501099B1
Application number: KR1020130026406A
Authority: KR
Inventors: 윤장원; 황선영; 권가희; 박용호; 신숙
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2015-03-10
Also published as: KR20140111901A

Abstract

본 발명은 신규한 PNA (peptide nucleic acid), PNA-펩타이드 복합체, 상기 PNA-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물 및 상기 항균용 조성물을 포함하는 박테리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PNA-펩타이드 복합체는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 우수한 항생, 항균 활성을 가지고 있어, 항균용 조성물 및 박테리아 감염 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 ＰＮＡ 및 이를 포함하는 항균용 조성물 {Novel PNA and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 신규한 PNA (peptide nucleic acid), PNA-펩타이드 복합체, 상기 PNA-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물 및 상기 항균용 조성물을 포함하는 박테리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

현대 의학에서 항생제의 발견 및 개발로 인해 얻을 수 있었던 발전은 매우 혁명적인 것이었으나, 계속된 오남용으로 항생제 내성을 가진 세균의 출현을 막을 수 없었다. 이렇게 축적된 항생제 내성 병원성 세균으로 인해 발생한 질병의 경우, 기존에 개발된 항생제를 사용하여 치료할 수 없는 상황에 이르고 있다. 이에 전 세계적으로 기존 항생제의 한계를 뛰어넘을 수 있는 새로운 기전의 항-박테리아 또는 항-감염 전략에 대한 연구가 활발하게 진행 중에 있다.

그 중 대표적인 전략으로 인위적으로 합성된 핵산(artificially synthesized nucleic acid)의 일종인 PNA(peptide nucleic acid)가 가지고 있는, 병원성 세균의 특정 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 효과를 이용한 방법이 제안되었다.

PNA는 올리뉴클레오티드 및 올리뉴클레오티드 유사체와 유사하고 DNA와 RNA를 모방할 수 있다. PNA는 DNA의 데옥시리보스 골격이 슈도 펩타이드 골격 (pseudo-peptide backbone)으로 치환되어 있다 (Nieslsen et al., Science, 1991, 254, 1475). PNA에 존재하는 각 서브유니트 또는 단량체는 상기 골격에 부착된 천연 또는 비천연 핵염기 (nucleobase)를 가지고 있다. 하나의 골격은 아미드 결합을 통하여 연결된 N-(2-아미노에틸)글리신의 반복 단위로 구성되어 있다. PNA는 왓슨과 크릭 염기쌍을 통하여 상보적 핵산과 혼성화하고 나선체가 형성된다 (Egholm et al., Nature, 1993, 365, 566). PNA는 DNA와 RNA 모두에 결합하여 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중가닥체를 형성한다. 상기 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중가닥체는 Tms로 결정하였을 때, 대응되는 DNA/DNA 또는 RNA/RNA 이중가닥체에 비하여 큰 친화성으로 결합되어 있다. PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중가닥체의 열적 안정성은 PNA의 중성 골격에서 전하 반발의 결여 때문일 수 있다. 친화성이 높아질 뿐만 아니라, PNA는 DNA/DNA에 비하여, 더 높은 특이성으로 DNA와 혼성화된다.

그러나 현재까지 광범위한 균주에 대해서 항생, 항균 효과를 갖는 PNA에 대해서는 연구가 미미한 실정이다.

이에 본 발명자들은 주요 병원성 세균에 필수적으로 존재하는 유전자를 표적으로 하여 신규한 PNA를 디자인하고, PNA를 펩타이드와 융합시킨 PNA-펩타이드 복합체를 제조한 후, 상기 PNA-펩타이드 복합체가 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 광범위한 항생, 항균 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 PNA (peptide nucleic acid)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PNA-펩타이드 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PNA-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 포함하는 박테리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 신규한 PNA (peptide nucleic acid)를 제공한다.

또한, 본 발명은 PNA-펩타이드 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PNA-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균용 조성물을 포함하는 박테리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 PNA-펩타이드 복합체는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 우수한 항생, 항균 활성을 가지고 있어, 항균용 조성물 및 박테리아 감염 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 다양한 P-PNA 복합체의 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 안티센스 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 다양한 P-PNA 복합체의 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 최소 유효 농도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 다양한 P-PNA 복합체의 그람양성균에 대한 항생 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 다양한 P-PNA 복합체의 그람음성균에 대한 항생 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 신규한 PNA (peptide nucleic acid)를 제공한다.

본 발명에서 PNA란 펩타이드 핵산을 의미하며, 이는 데옥시리보오스 포스페이트 골격(backbone)이 펩타이드 올리고머로 치환된 DNA 유사 화합물이다. 기존에 공지된 일반적인 PNA의 구조는 N-(2-아미노에틸)글리신 (N-(2-aminoethyl)glycine) 단위가 아마이드 결합에 의해 반복적으로 연결되어 N-(2-아미노에틸)글리신 골격을 형성하고 이 골격에 퓨린(purin: A 및 G)과 피리미딘(pyrimidine: C 및 T) 염기와 같은 핵산 염기가 메틸렌 카르보닐(methylene carbonyl) 결합을 통해 연결되어 있다.

또한, 본 발명은 하기 식 1로 표시되는 PNA-펩타이드 복합체를 제공한다.

[식 1]

PNA-L-펩타이드

상기 식 1에서, PNA는 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 펩타이드 핵산이고,

L은 링커 또는 결합이고,

펩타이드는 C-(B-A)n-D로 표시되며, 여기서 A는 1 내지 8개의 전하를 띠지 않은 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, B는 1 내지 3개의 양전하를 띤 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, C는 0 내지 4개의 전하를 띠지 않은 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, D는 0 내지 3개의 양전하를 띤 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, n은 1 내지 10의 정수이다.

상기 펩타이드는 세포막의 투과성을 높여주기 위한 것으로, 펩타이드의 구체적인 예로는 KFFKFFKFFK (서열번호 8), KFFKFFKFF (서열번호 9), KFFKFFKF (서열번호 10), KFFKFFK (서열번호 11), KFFKFF (서열번호 12), KFFKF (서열번호 13), KFFK (서열번호 14), KFF (서열번호 15), FFRFFRFFRRLLR (서열번호 16), LLKKLAKAL (서열번호 17), KRRWPWWPWKK (서열번호 18), KFKVKFVVKK (서열번호 19), LLKLLLKLLLK (서열번호 20) 및LLKKLAKALK (서열번호 21)가 포함되며, 바람직하게는 KFFKFFKFFK(서열번호 8)이나 이에 제한되지 않는다.

상기 L은 링커 또는 결합으로, 세포막의 투과성을 높여주기 위한 것으로 공지된 임의의 링커 모이어티일 수 있다. 바람직하게는 루신(L) 또는 글라이신(G)이며, 보다 바람직하게는 루신(L)이다.

본 발명의 PNA-펩타이드 복합체는 바람직하게는 Pjyh-cmk1 ((KFF)₃K (서열번호 8)-L-tcatgcgtca(서열번호 1)), Pjyh-deoD1 ((KFF)₃K (서열번호 8)-L-tcatttgtta(서열번호 2)), Pjyh-ligA1 ((KFF)₃K (서열번호 8)-L-ccatccctta(서열번호 5)), Pjyh-pryH1 ((KFF)₃K (서열번호 8)-L-ccattttctt(서열번호 6)), Pjyh-smpB1 ((KFF)₃K (서열번호 8)-L-tcatactcac(서열번호 7))일 수 있다.

본 발명에 따른 PNA-펩타이드 복합체는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 신규한 PNA-펩타이드 복합체는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 우수한 항생, 항균 활성을 가지고 있어, 항균용 조성물 및 박테리아 감염 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 바람직하게 약학적 조성물일 수 있다.

상기 항균용 조성물은 병원성 미생물 또는 내성균에 대한 항균용 조성물이며, 바람직하게는 그람양성균 또는 그람음성균에 대한 항균용 조성물, 보다 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus), 스트렙토코커스 디스갈락티애 (Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 우베리스 (Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 에쿠이 (Streptococcus equi), 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 크렙실라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 등에 대한 항균용 조성물이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 PNA-펩타이드 복합체뿐만 아니라, 병원성 미생물 또는 내성균에 대한 항균활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 항균용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 담체"는 상기 조성물이 투여되는 개체에 해로운 항체 생산을 유발하여서는 안되며, 독성이 있어서도 안된다. 적당한 담체는 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당, 폴리락틱산, 폴리글리콜릭산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같이 크고, 천천히 대사되는 거대분자이다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같은 미네랄산 염, 또는 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염이 사용될 수 있다. 또한, 상기 담체에는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 부가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 형태로 약 0.001mg 내지 1000mg이 투여될 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물은 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 바람직하게 의약외품 조성물일 수 있다. 즉, 본 발명은 병원성 미생물 또는 내성균에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 의약외품 조성물은 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 상기 박테리아(병원성 미생물 또는 내성균)에 의한 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 박테리아(병원성 미생물 또는 내성균)에 의한 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 병원성 미생물은 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물로서, 그람 양성균 및 그람 음성균의 세균을 포함하고, 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus), 스트렙토코커스 디스갈락티애 (Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 우베리스 (Streptococcus uberis ), 스트렙토코커스 에쿠이 (Streptococcus equi), 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 크렙실라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 내성균은 임의의 질환 및 이의 합병증 또는 임의의 박테리아성 장애 및 이의 합병증을 치료 또는 예방하기 위하여 약물을 지속적으로 사용한 결과, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 의미한다. 상기 항생제의 예로는 반코마이신, 세팔로스포린, 퀴놀론 및 플루오로퀴놀론, 페니실린, 베타 락타마제 억제제, 카르베페넴, 모노박탐, 마크롤리드 및 린코사민, 글리코펩타이드, 리팜핀, 옥사졸리디논, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 스트렙토그라민 및 술폰아미드 등이 있으며, 항생제 내성균은 상기 열거된 항생제를 처리하는 경우에도 저항성을 나타내어 개체에서 지속적으로 질환이 유지된다. 바람직하게는 메티실린 저항성 포도상구균(MRSA, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 퀴놀론 저항성 포도상구균(QRSA, Quinolone-resistant Staphylococcus aureus), 반코마이신 저항성 포도상구균(VRSA, Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) 또는 반코마이신 저항성 앤테로코커스(VRE, Vancomycin-resistant Enterococcus) 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 박테리아 감염 질환은 박테리아(병원성 미생물 또는 내성균) 감염에 의하여 유발되는 피부감염, 식중독, 중이염, 방광염, 복막염, 요로감염, 유방염, 폐렴, 심내막염, 결막염, 관절염, 자궁내막염, 선역, 패혈증, 여드름 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신규한 PNA 디자인

먼저, 세균의 생존에 필수적인 유전자를 선발하기 위해 DEG(Database of Essential Genes)를 사용하여, 종래 공지된 Duffield et . al .의 방법에 따라 총 7개의 유전자를 선발하였다. 이를 표 1에 나타내었다.

유전자	단백질	기능
cmk	cytidylate kinase or cystidine monophosphate kinase	ATP + (d)C/UMP → ADP + (d)C/UDP
deoD	purine nucleoside phosporylase (PNPase)	Nucleotide synthesis (inosine)
ftsA	Cell division protein FtsA	early component of the Z-ring required for cell division
glmU	UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase/glucosamine-1-phosphate	bifunctional enzyme with acetyltransferase and uridyltransferase activities, essential for the biosynthesis of the　bacterialcell wall
ligA	DNA ligase	Ligation
pryH	uridylate kinase	UMP kinase catalyzing UMP phosphorylation
smpB (small proteinB)	ssrA(small stable RNA A)-binding protein	Required for recycling of ribosomes

상기 표 1에서 선발된 유전자의 전사 개시 부위를 포함하여 RBR (ribosomal binding region)인 업스트림의 6 bp를 아우르는 부위의 유전자 서열에 상보적인 서열을 합성하고, 여기에 세포 내부로의 전달성을 높이기 위하여 양이온성 펩타이드 (KFFKFFKFFKL)를 융합하였다. 상기 합성은 Panagen (Deajeon, Korea)에서 진행하였으며 구체적인 서열 정보를 표 2에 나타내었다. 상기 표 2에서 P-PNA 구조 중 L은 루신이다.

P- PNA ID	표적 유전자	표적 염기서열 (위치)	P- PNA 구조	PNA bp	Aggregation
Pjyh-cmk1	cmk	5’-TGACGCATGA-3’ (-6∼+3)	(KFF)₃K-L-tcatgcgtca	10	+++
Pjyh-deoD1	deoD	5’-TAACAAATGA-3’ (-6∼+3)	(KFF)₃K-L-tcatttgtta	10	++
Pjyh-ftsA2	ftsA	5’-GTGCCTATCTATG-3’ (-10~+2)	(KFF)₃K-L-catagataggcag	13	+++
Pjyh-glmU1	glmU	5’-ATGTTCATGC-3’ (-6∼+3)	(KFF)₃K-L-gcatgaacat	10	+
Pjyh-ligA1	ligA	5’-TAAGGGATGG-3’ (-6∼+3)	(KFF)₃K-L-ccatccctta	10	0
Pjyh-pryH1	pryH	5’-AAGAAAATGG-3’ (-6∼+3)	(KFF)₃K-L-ccattttctt	10	0
Pjyh-smpB1	smpB	5’-GTGAGTATGA-3’ (-6∼+3)	(KFF)₃K-L-tcatactcac	10	0

실시예 2. 안티센스 효과 검증

상기 실시예 1에서 디자인한 P-PNA들을 표준 균주인 S. aureus ATCC29740에 적용하여 강한 안티센스 효과를 보이는 P-PNA를 선별하였다. 보다 구체적으로, S. aureus ATCC29740 균주를 MHB(Mueller Hinton broth, BD) 배지에서 37°C에서 18시간 동안 배양한 후, 새 MHB 배지에 1:10000으로 희석하였다. 상기 희석액에 P-PNA (stock solution, 400 μM in DW)를 최종 농도가 40 μM 되도록 첨가한 후 37°C에서 진탕 배양 (shaking incubation)하였다. 4 시간 및 8 시간 후 균액을 일부 취하여 스팟 테스트에 이용하였다. 스팟 테스트는 MHA(Mueller Hinton agar)에 원액부터 10배씩 순차적으로 희석된 균액을 5 μl씩 떨어뜨린 후, 37°C에서 18 시간 동안 배양한 후 콜로니 수를 관찰하는 방법으로 이루어졌다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Pjyh-cmk1, Pjyh-deoD1의 효과가 가장 뛰어났으며, 이외에도 Pjyh-ligA1, Pjyh-pryH1, Pjyh-smpB1도 확실한 안티센스 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 최소 유효 농도 결정

상기 실시예 2에서 안티센스 효과가 우수하게 나타난 P-PNA 중 Pjyh-cmk1, Pjyh-deoD1, Pjyh-smpB1을 선택하여 안티센트 효과가 나타나는 최소 유효 농도(minimal effective concentration)를 결졍하였다. 보다 구체적으로, S. aureus ATCC29740 균주를 MHB (BD) 배지에서 37°C에서 18 시간 동안 배양한 후, 새 MHB배지에 1:10000으로 희석하였다. 상기 희석액에 P-PNA (stock solution, 400 μM in DW)를 최종 농도가 각각 40 μM, 20 μM, 15 μM, 10 μM, 5 μM이 되도록 첨가한 후, 37°C에서 진탕 배양하였다. 대조군에는 P-PNA를 첨가하지 않았다. 4시간 후 균액을 일부 취하여 콜로니 카운팅을 실시하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 P-PNA는 약 10 μM 부터 대조군과 차이가 나타남을 확인하였다.

실시예 4. 다양한 균주에 대한 항생 효과 검증

상기 실시예 2에서 안티센스 효과가 우수하게 나타난 P-PNA 중 Pjyh-cmk1, Pjyh-deoD1, Pjyh-smpB1이 다양한 병원성 세균에 대해서 항균 효과를 보이는지 검증하기 위해 20 μM의 농도에서 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 실험에 이용된 균주 목록을 표 3에 나타내었으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

Strains	Description
Staphylococcus aureus	ATCC 29740
Staphylococcus hyicus	ATCC 11249
Streptococcus dysgalactiae	ATCC 27957
Streptococcus uberis	ATCC 27958
Listeria monocytogenes	ATCC 19117
Streptococcus equi	ATCC 33398
Streptococcus zooepidemicus	ATCC 43079
Escherichia coli O157:H7	ATCC 43894
Salmonella Typhimurium DT104	ATCC 2501
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 15442
Klebsiella pneumoniae	ATCC 4352

도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 각 P-PNA 마다 정도의 차이는 있으나, 본 발명의 P-PNA는 다양한 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균에 대해 항생 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 5. 항생 활성을 나타내는 메커니즘 검증

상기 실시예 4와 같은 P-PNA에 의한 항생 활성이 유전자 전사의 방해에 의한 것인지, mRNA 발현의 방해에 의한 것인지, 그 메커니즘을 규명하기 위하여, RT-PCR을 실시하였다. 보다 구체적으로, Pjyh-cmk1와 Pjyh-deoD1를 각각 20 μM 농도로 처리한 S. aureus ATCC 29740균주를 3시간 동안 MHB에서 배양한 후, RNeasy 미니 키트 (Quiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다. GoScript Reverse Transcriptation System (Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 이용하여 실시간 PCR (Rotor-Gene SYBR Green PCR kit, Quiagen)을 수행하였다. 이때 이용한 프라이머 서열을 표 4에 나타내었다.

올리고머	표적 유전자	염기서열 (5’-3)’
cmkRealF1	cmk	TCT AAA GAG CCA GTA CGT TCA TTC
cmkRealR1	cmk	CGA TAT CGC GAC CAT CCA TTA C
deodRealF1	deoD	AGG TCA TTT CGC GCC TAT C
deodRealR1	deoD	CGT GTG TAG TAG CAC CGA TTT
gyr297F	gyrB	TTAGTGTGGGAAATTGTCGATAAT
gyr574R	gyrB	AGTCTTGTGACAATGCGTTTACA
STPYF	16s rRNA	ACGGTCTTGCTGTCACTTATA
STPYR2	16s rRNA	TACACATATGTTCTTCCCTAATAA

Rotor-Gene realtime PCR cycler (Quiagen)에서 제공한 소프트웨어에서 자동적으로 지정된 역치(threshold)를 기준으로 C _T 값을 결정한 후, P-PNA를 처리하지 않은 대조군에서 얻어진 C _T 값을 제하여 각 유전자 별로 ΔC _T 를 구하고, 이 값을 바탕으로 대조군 대비 P-PNA처리 그룹의 유전자 별 mRNA 상대량을 측정하였다. 또한 얻어진 gyrB와 cmk 또는 deoD의 ΔC _T 값에서 검정 유전자(reference gene) 중 하나인 16s rRNA의 ΔC _T 값을 제하여 ΔΔC _T 값을 도출하였으며, 이 값을 이용하여 P-PNA 처리 그룹 내에서의 cmk 또는 deoD와 gyrB의 상대적 mRNA 변화량을 비교하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

	2^ΔC _T ^a	2^ΔΔC _T ^b	P ^c
cmk	1.30±0.12	0.93±0.09	0.44
gyrB (reference gene 2)	1.34±0.16	0.97±0.03
16s rRNA (reference gene 1)	1.38±0.15
deoD	1.16±0.22	0.98±0.02	0.8
gyrB (reference gene 2)	1.31±0.12	0.97±0.08
16s rRNA (reference gene 1)	1.18±0.08

표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Pjyh-cmk1 또는 Pjyh-deoD1를 처리한 군에서의 cmk 또는 deoD의 mRNA 량은 대조군과 유의한 차이가 없었으며, 같은 처리군 내에서도 다른 유전자 (gyrB)의 mRNA 량과 유의한 차이가 없었다. 이를 통해, 본 발명의 P-PNA는 mRNA 전사량에는 영향을 주지 않으며, mRNA의 발현을 방해하는 안티센스 메커니즘을 통해 항생 효과를 나타냄을 확인하였다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Novel PNA and antibacterial composition comprising the same <130> 78 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 1 tcatgcgtca 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 2 tcatttgtta 10 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 3 catagatagg cag 13 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 4 gcatgaacat 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 5 ccatccctta 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 6 ccattttctt 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide nucleic acid <400> 7 tcatactcac 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 8 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 9 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 10 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 11 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 12 Lys Phe Phe Lys Phe Phe 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 13 Lys Phe Phe Lys Phe 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 14 Lys Phe Phe Lys 1 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 15 Lys Phe Phe 1 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 16 Phe Phe Arg Phe Phe Arg Phe Phe Arg Arg Leu Leu Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 17 Leu Leu Lys Lys Leu Ala Lys Ala Leu 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 18 Lys Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 19 Lys Phe Lys Val Lys Phe Val Val Lys Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 20 Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier peptide <400> 21 Leu Leu Lys Lys Leu Ala Lys Ala Leu Lys 1 5 10

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 PNA (peptide nucleic acid).
하기 식 1로 표시되는 PNA-펩타이드 복합체:
[식 1]
PNA-L-펩타이드
상기 식 1에서, PNA는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 펩타이드 핵산이고,
L은 링커 또는 결합이고,
펩타이드는 C-(B-A)n-D로 표시되며, 여기서 A는 1 내지 8개의 전하를 띠지 않은 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, B는 1 내지 3개의 양전하를 띤 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, C는 0 내지 4개의 전하를 띠지 않은 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, D는 0 내지 3개의 양전하를 띤 아미노산 또는 아미노산 유사체이고, n은 1 내지 10의 정수이다.
제 2항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 8 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, PNA-펩타이드 복합체.
제 3항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, PNA-펩타이드 복합체.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 PNA-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus), 스트렙토코커스 디스갈락티애 (Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 우베리스 (Streptococcus uberis ), 스트렙토코커스 에쿠이 (Streptococcus equi), 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 크렙실라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 대한 항균용인 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 약학적 조성물 또는 의약외품 조성물인 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 PNA-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는, 피부감염, 식중독, 중이염, 방광염, 복막염, 요로감염, 유방염, 폐렴, 심내막염, 결막염, 관절염, 자궁내막염, 선역, 패혈증 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 박테리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 박테리아 감염 질환은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus), 스트렙토코커스 디스갈락티애 (Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 우베리스 (Streptococcus uberis ), 스트렙토코커스 에쿠이 (Streptococcus equi), 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 크렙실라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 박테리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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