KR101499345B1 - Medium for ex vivo amplification of canine natural killer cell and ex vivo culture method of canine natural killer cell using the same - Google Patents

Medium for ex vivo amplification of canine natural killer cell and ex vivo culture method of canine natural killer cell using the same Download PDF

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공주대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a medium for ex vivo amplification of canine natural killer cells and, more specifically, to an ex vivo culturing method of canine natural killer cells capable of amplifying ex vivo amplification efficiency of the canine natural killer cells using the medium for ex vivo amplification of the canine natural killer cells, and preparing the canine natural killer cells in which anticancer activities are enhanced. The ex vivo culturing method of canine natural killer cells comprises: a first step of isolating the canine natural killer cells from blood collected from a canine; and a second step of ex vivo culturing the canine natural killer cells by adding the same to the medium for ex vivo amplification.

Description

개 자연살해세포 체외 증폭배지 및 이를 이용한 개 자연살해세포 체외 배양방법{Medium for ex vivo amplification of canine natural killer cell and ex vivo culture method of canine natural killer cell using the same}[0001] The present invention relates to an extracellular amplification medium for canine natural killer cells and a method for culturing canine natural killer cells using the same,

본 발명은 개 자연살해세포 체외 증폭용 배지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 개 자연살해세포 체외 증폭용 배지를 이용하여 개 자연살해세포 체외 증폭 효율을 증대시키며, 항암 활성이 증진된 개 자연살해세포를 제조할 수 있는 개 자연살해세포 체외 배양방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a culture medium for extracorporeal amplification of cancellous natural killer cells, and more particularly, to a method for enhancing extracellular amplification efficiency of cannulated natural killer cells using the above- And to a method for culturing cancellous natural killer cells in which cells can be produced.

성체 줄기세포 중 하나인 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액을 구성하는 모든 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 및 림프구)로 분화할 수 있는 세포로서, 주로 골수에 있는 조혈줄기세포로부터 생체의 면역체계를 구성하는 세포가 지속적으로 자가 재생된다. 이들 면역체계를 구성하는 세포들 중 특히, 자연살해세포(natural killer cell, 이하 'NK 세포'라 약칭함)는 비특이적으로 암세포 및 바이러스 감염세포를 살상할 수 있는 능력이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되었으며, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암, 흑색종암, 폐암 등 다양한 질병들과 관련되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 연구들을 바탕으로 암과 같은 난치성질환 치료에 NK 세포를 이용하는 NK 세포 치료법이 대두되고 있다.Hematopoietic stem cells, one of the adult stem cells, are cells capable of differentiating into all the cells constituting the blood (red blood cells, white blood cells, platelets and lymphocytes), and mainly from the hematopoietic stem cells in the bone marrow. The cells that make up are continuously self-renewing. Among the cells constituting these immune systems, natural killer cells (hereinafter abbreviated as "NK cells") have been found to be capable of killing cancer cells and virus-infected cells nonspecifically, and many studies have been conducted , Defects in NK cell differentiation and activity have been found to be associated with various diseases such as breast cancer, melanoma, and lung cancer. Based on these studies, NK cell therapy using NK cells is emerging for the treatment of intractable diseases such as cancer.

NK 세포는 보통 말초혈액단핵구세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)에서 적은 양만 존재한다. 그러므로 건강한 기증자 유래 말초혈액단핵 구세포를 이용한 플라스크 세포배양에서 폴리클로날(polyclonal) NK 세포 및 NK 유사 T 세포, B 세포 만성 림포성백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia) 및 다발성골수종(multiple myeloma, MM) 증식을 하게 하는 강화된 의약품 제조 및 품질관리기준(current good manufacturing practice, cGMP)를 포함하는 방법이 개발되고 있다. 이러한 세포들은 시험관 내 새로운 인간 종양세포 및 임상적 설정에서 평가되는 가능성을 여는 실험적 인간 종양 모델에 대하여 특이적 세포 독성 활성을 행사하는 것을 보인다. 그러나, 기존의 플라스크-기초의 배양은 노동-집약적이고 번거로우며, 사실상 제한된 세포 수에 대한 평가만 이루어질 수 있다. NK cells are usually present in small amounts in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Therefore, in culture of flask cells using a healthy donor-derived peripheral blood mononuclear cell, polyclonal NK cells and NK-like T cells, B cell chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma, Methods have been developed that include enhanced good manufacturing practice (cGMP) that allows for the proliferation of MM. These cells appear to exert specific cytotoxic activity against new human tumor cells in vitro and experimental human tumor models opening the possibility of being evaluated in clinical settings. However, conventional flask-based cultures are labor-intensive and cumbersome, and only an assessment of virtually limited cell numbers can be made.

상기와 같은, NK 세포를 이용한 세포 치료를 위해서는 생체외(ex vivo) 상에서 NK 세포를 배양하는 것이 필요하고, NK 세포의 생체외 분화 조건을 최적화하는 것은 필수적이다. 그러나, 그 동안 사용되어온 공통 유전형의 마우스 모델(syngenic mouse model)이나 제노그래프트 마우스 모델(xenograft mouse model) 등 실험동물에서의 실험은 개나 영장류를 이용한 실험에 비해 실제 임상적 효능을 예측하기 어려운 것으로 잘 알려져 있고, 실험용 쥐에서 NK 세포의 체외 증폭기술이 확립되지 않아 대부분 NK 세포를 순수 분리한 다음 사이토카인으로 활성화시켜 사용하여 왔다.In order to treat cells using NK cells as described above, it is necessary to cultivate NK cells ex vivo, and it is essential to optimize the ex vivo differentiation conditions of NK cells. However, it is difficult to predict the actual clinical efficacy of the experiment in experimental animals such as syngenic mouse model or xenograft mouse model, which have been used in the past. Since the in vitro amplification technique of NK cells has not been established in experimental mice, most of the NK cells have been purified and activated by cytokines.

한편, 개의 게놈(genome) 판독 결과 인간과 개의 게놈이 매우 유사하다고 입증되었으며, 특히 개에서 자연적으로 발생된 암의 유전적, 분자 생물학적, 병리조직학적 양상 및 일반적으로 사용되고 있는 암치료법에 대한 반응이 사람에서 발생되는 암과 거의 비슷하다는 사실이 밝혀졌으며, 인간의 면역질환 및 감염성 질환과 유사한 질병이 자연발생적으로 유발되기 때문에 아주 흥미로운 실험모델이다. 아울러 개에서 암이나 바이러스 질환 등과 같은 난치성 질환의 발생이 현저히 증가하고 있어 이들 난치성 질환에 대한 새로운 치료제 개발 역시 매우 필요하다.On the other hand, as a result of genome reading of dogs, it has been proved that human and dog genomes are very similar. Especially, genetic, molecular, and histopathological aspects of naturally occurring cancers in dogs and reactions to commonly used cancer therapies It has been shown that it is almost similar to cancer in humans, and it is a very interesting experimental model because diseases like human immunological diseases and infectious diseases are induced spontaneously. In addition, the incidence of intractable diseases such as cancer and viral diseases in dogs is remarkably increasing, and it is also necessary to develop new therapeutic agents for these intractable diseases.

이와 같은 생물학적 유사성 때문에 개에 대한 암에 관한 연구는 사람 또는 다른 실험동물만을 대상으로 한 암 연구와 차별화되는 귀중한 정보를 제공하며, 이와 같은 가치에 대한 인식은 암-관련 유전자 확인 연구를 비롯하여 환경성 위험요소, 암의 생물학적 특성 이해, 그리고 특히 새로운 암치료법 개발 및 효능 평가 등의 연구 분야에서 현저히 높아지고 있다. 그러나 아직까지 세계적으로 개로부터 NK 세포의 확인, 이의 증폭 및 이를 이용한 암치료에 관련된 보고가 없다.Because of this biological similarity, research on cancer in dogs provides valuable information that differentiates itself from cancer research in humans or other laboratory animals, and recognition of such values is associated with cancer- Ureters, understanding the biological characteristics of cancer, and developing novel cancer therapies and evaluating efficacy, among others. However, there is no report about the confirmation of NK cells from dogs, its amplification, and cancer treatment using it from around the world.

또한, 개의 말초혈액에는 자연살해세포(natural killer cell, NK세포)의 개체수(전체 임파구세포 중 0 ~ 5% 차지)가 사람(평균 10 ∼ 15%)에 비해 현저하게 낮다. 따라서, 면역세포치료를 수행하기 위해서, 개의 말초혈액으로부터 극소량(전체 임파구세포 중 0 ~ 5% 차지)으로 존재하는 NK 세포를 분리하고 정제하여 항암치료에 직접 사용하는 것은 사실상 불가능할 뿐만 아니라 말초혈액으로부터 NK 세포를 체외 증폭하는데 심각한 장애 요인이 되는 것으로 알려져 있다. 그러나 임상치료를 위해서는 고도로 활성화된 대량의 NK 세포가 필요하므로 체외 증폭 효율 개선이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.In addition, the number of natural killer cells (NK cells) in the peripheral blood of dogs (0 ~ 5% of total lymphocytes) is significantly lower than that of humans (10 ~ 15%). Therefore, it is practically impossible to isolate and purify NK cells present in very small amounts (0 to 5% of total lymphocyte) from the peripheral blood of dogs and to directly use them for chemotherapy in order to perform immunotherapy, It is known that NK cells are a serious obstacle to in vitro amplification. However, since a large amount of highly activated NK cells is required for clinical treatment, there is a desperate need to improve the efficiency of amplification in vitro.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 인터루킨-21을 이용하여 개 자연살해세포의 체외 증폭 효율을 증대할 수 있는 개 자연살해세포 체외 증폭배지 및 이를 이용한 개 자연살해세포 체외 배양방법을 제공하려는 목적이 있다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide an extracellular amplification medium capable of enhancing the extracorporeal amplification efficiency of cannulated keratinocytes using interleukin- There is a purpose to provide a method.

본 발명은 인터루킨-15(interleukin-15), 인터루킨-2(interleukin-2) 및 인터루킨-21(interleukin-21)을 포함하는 개 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 체외 증폭 배지를 제공한다.The present invention provides a natural killer cell (NK cell) ex vivo amplification medium comprising interleukin-15, interleukin-2 and interleukin-21 .

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 개 자연살해세포 체외 증폭 배지는 100 중량부의 인터루킨-21에 대하여 50 ~ 200 중량부의 인터루킨-15 및 10,000,000 ~ 100,000,000 중량부의 인터루킨-2를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the cannabinoid extracellular amplification medium may contain 50-200 parts by weight of interleukin-15 and 10,000,000-100,000,000 parts by weight of interleukin-2 relative to 100 parts by weight of interleukin-21.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 개 자연살해세포 체외 증폭 배지는 10 ~ 500 U/㎖의 인터루킨-2, 2 ~ 10 ng/㎖의 인터루킨-21 및 2 ~ 10 ng/㎖의 인터루킨-15를 포함할 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the cannulated eukaryotic extracellular amplification medium comprises 10 to 500 U / ml of interleukin-2, 2 to 10 ng / ml of interleukin-21 and 2 to 10 ng / -15. ≪ / RTI >

나아가, 인터루킨-21을 연속적 또는 간헐적으로 투여하기 위한 개 자연살해세포 체외 증폭 배지를 제공한다.
Furthermore, an extracellular boost medium for cannulated natural killer cells for administration of interleukin-21 continuously or intermittently is provided.

또한, 본 발명은 개로부터 채취한 혈액에서 개 자연살해세포를 분리하는 1단계; 및 상기 개 자연살해세포를 세포 체외 증폭 배지에 첨가하여 체외배양하는 2단계; 를 포함하고, 상기 2단계의 체외 배양은 인터루킨-21(interleukin-21)을 체외 증폭 배지에 첨가하며 수행하는 개 자연살해세포 체외 배양방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for isolating natural killer cells from blood collected from a dog; And 2) in vitro culture of the natural killer cells by adding the cells to an extracellular amplification medium; And the second stage in vitro culture is performed by adding interleukin-21 to an extracorporeal amplification medium.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 1단계의 분리는 불연속 밀도구배 방법을 수행하여 개 자연살해세포를 포함하는 단핵구세포를 분리할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the separation in the first step may be performed by a discontinuous density gradient method to separate mononuclear cells including the natural killer cells.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 불연속 밀도구배는 비중 1.0 내지 1.2 g/㎖ 범위에서 서로 다른 비중을 갖는 3개의 물질을 이용하며, 상기 3개의 물질의 서로 다른 비중 차이에 의해 개 자연살해세포를 포함하는 단핵구세포가 분리될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the discontinuous density gradient uses three materials having different specific gravities in the specific gravity range of 1.0 to 1.2 g / ml, Mononuclear cells containing killer cells can be isolated.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계의 세포 체외 증폭 배지는 배양보조세포(feeder cell), 인터루킨-2(interleukin-2) 및 인터루킨-15(interleukin-15)을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the extracellular amplification medium of step 2 may include a feeder cell, interleukin-2, and interleukin-15. have.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포 체외 증폭 배지에 인터루킨-21을 간헐적 또는 연속적으로 첨가할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, interleukin-21 may be intermittently or continuously added to the extracellular amplification medium.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인터루킨-21의 간헐적 첨가는 배양 초기, 배양 말기 또는 배양 초기와 배양 말기의 첨가일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the interleukin-21 may be added intermittently at the initial stage of culture, at the end of culture or at the beginning of culture and at the end of culture.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 시작일 ~ 10일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the IL-21 addition in step 2 may be added to the in vitro expansion medium for the first 10 days of in vitro culture.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 시작일 ~ 4일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하고, 체외 배양 시작 후 6 ~ 11일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하고, 체외 배양 시작 후 13 ~ 18일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the IL-21 addition in the second step is added to the in vitro expansion medium for the first 4 days from the start of the in vitro culture and added to the in vitro expansion medium for 6 to 11 days after the start of the in vitro culture , And may be added to the in vitro expansion medium for 13 to 18 days after in vitro culture.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 전기간 동안 체외 증폭 배지에 첨가하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the two-step addition of IL-21 may be added to the in vitro expansion medium during in vitro culture.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 시작일 ~ 10일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하고, 체외 배양 종료 3일 전 ~ 체외 배양 종료일까지 첨가하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the IL-21 addition in the second step may be added to the in vitro expansion medium for the first 10 days of in vitro culture, and may be added from 3 days before the in vitro culture to the end of the in vitro culture have.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인터루킨-21의 첨가는 체외 증폭 배지에 인터루킨-21의 함유량이 2 ~ 10 ng/㎖로 유지하도록 첨가하는 것일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the addition of the interleukin-21 may be carried out so that the content of interleukin-21 in the extracorporeal medium is maintained at 2 to 10 ng / ml.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.Hereinafter, terms of the present invention will be described.

본 발명의 "자연살해세포"란 세포독성 대형 과립 림프구(cytotoxic large granular lymphocyte: CLGL)를 의미하며, 자연살해세포의 특성 및/또는 효과를 갖는 대형 과립 림프구를 포함한다. "Natural killer cell" of the present invention refers to a cytotoxic large granular lymphocyte (CLGL), and includes large granular lymphocytes having characteristics and / or effects of natural killer cells.

본 발명의 "Feeder cell(피더 세포, 배양보조세포)"란, 방사선 조사를 통하여 분열증식하지 못하게 하였으며, NK세포의 활성화 및 증식에 필요한 활성 리간드를 세포 표면에 발현하고 있으므로 목적 세포의 활성화 및 증식을 돕는 세포로서, 최초에 이식한 세포를 '피더 세포'라고 한다.The term "feeder cell (feeder cell, culture assisting cell)" of the present invention prevents the proliferation of proliferation through irradiation, and since the active ligand necessary for NK cell activation and proliferation is expressed on the cell surface, The first transplanted cells are called feeder cells.

본 발명의 "간헐적" 첨가란, 세포의 배양기간 중 1일 또는 수일 동안 체외 증폭 배지에 인터루킨-21을 첨가하는 것으로, 배양 초기, 배양 말기 또는 배양 초기와 배양 말기에 첨가하는 것을 포함한다.The "intermittent" addition of the present invention means that the interleukin-21 is added to the extracorporeal medium for one day or several days during the cell culture period, and includes the addition at the initial stage of culture, at the end of culture or at the initial stage and at the end of culture.

본 발명의 "연속적" 첨가란, 세포의 배양기간 전기간 동안 체외 증폭 배지에 인터루킨-21을 첨가하는 것으로, 배양 시작일 ~ 배양 종료일에 첨가하는 것을 포함한다.The "continuous" addition of the present invention means adding the interleukin-21 to the extracorporeal amplification medium during the incubation period of the cells, and includes the addition from the start of culture to the end of culture.

본 발명은 개 자연살해세포 체외 증폭 배지는 개 자연살해세포의 체외증폭 효율을 현저하게 증가시키는 효과가 있다.In the present invention, the extracellular amplification medium of the natural killer cell has an effect of remarkably increasing the extracorporeal amplification efficiency of the natural killer cells.

또한, 상술한 개 자연살해세포 체외 증폭 배지를 이용한 개 자연살해세포 체외 배양방법은 항암활성이 향상된 개 자연살해세포를 높은 배양률로 배양하는 효과가 있으며, 개 자연살해세포의 체외 증폭 효율을 현저하게 증가시킨 배양방법을 제공할 수 있다.In addition, the above-described in vitro culture method using cannulated keratinocyte extracellular amplification medium is effective for culturing cannulated keratinocytes with improved anticancer activity at a high culture rate, and the in vitro amplification efficiency of cannulated keratinocytes is remarkable By weight of the culture medium.

나아가, 본 발명의 체외 배양방법은 항암 활성이 현저하게 증진된 개 자연살해세포를 제공할 수 있다.Furthermore, the in vitro culture method of the present invention can provide a natural killer cell in which the anticancer activity is remarkably enhanced.

도 1은 실험예 1에서 측정한 개 NK세포의 증폭 효율 그래프이다.
도 2는 실험예 2에서 측정한 CD5low 세포 군체 분석 결과이다.
도 3은 실험예 3에서 측정한 개 NK세포의 암세포에 대한 세포독성능 평가 결과이다.
도 4는 실험예 4에서 측정한 개 NK세포의 암세포에 대한 인터페론-감마 생성능 평가 결과이다.
도 5는 실험예 5에서 측정한 개 NK세포의 암세포에 대한 세포독성능 평가 결과이다.
도 6은 실험예 6에서 측정한 개 NK세포의 암세포에 대한 인터페론-감마 생성능 평가 결과이다.FIG. 1 is a graph showing the amplification efficiency of the individual NK cells measured in Experimental Example 1. FIG.
FIG. 2 shows the results of analysis of CD5 low cell colonies measured in Experimental Example 2. FIG.
FIG. 3 shows the cytotoxicity test results of cancer cells of the individual NK cells measured in Experimental Example 3. FIG.
FIG. 4 shows the result of the interferon-gamma production of cancer cells of the individual NK cells measured in Experimental Example 4. FIG.
FIG. 5 shows the cytotoxicity test results of cancer cells of the individual NK cells measured in Experimental Example 5. FIG.
FIG. 6 shows the results of the evaluation of interferon-gamma production of cancer cells of canine NK cells measured in Experimental Example 6. FIG.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

상술한 바와 같이, 개의 면역세포치료를 수행하기 위해서, 말초혈액에 극소량(전체 임파구세포 중 0 ~ 5%) 존재하는 NK 세포를 분리하고 정제하여 항암치료에 직접 사용하는 것은 사실상 불가능할 뿐만 아니라 말초혈액으로부터 NK 세포를 체외 증폭하는데 심각한 장애 요인이 되는 것으로 알려져 있다. 그러나 개의 임상치료를 위해서는 고도로 활성화된 대량의 개 NK 세포가 필요하므로 체외 증폭 효율 개선이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
As described above, it is practically impossible to isolate and purify NK cells present in peripheral blood (0 to 5% of total lymphocyte) in the peripheral blood and directly use them for chemotherapy, Is known to be a serious obstacle to in vitro amplification of NK cells. However, for the clinical treatment of dogs, a highly activated large amount of canine NK cells is required, and therefore, there is a desperate need to improve the efficiency of in vitro amplification.

이에 본 발명은 인터루킨-15(interleukin-15), 인터루킨-2(interleukin-2) 및 인터루킨-21(interleukin-21)을 포함하는 개 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 체외 증폭 배지를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 개 NK 세포의 체외 증폭 효율을 증가시키는 효과가 있다.
Accordingly, the present invention provides a natural killer cell (NK cell) in vitro amplification medium containing interleukin-15, interleukin-2 and interleukin-21 Thereby solving the above-mentioned problem. Thus, it is possible to increase the efficiency of in vitro amplification of individual NK cells.

본 발명의 개 NK 세포 체외 증폭 배지는 인터루킨-15(interleukin-15, IL-15), 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 및 인터루킨-21(interleukin-21, IL-21)을 포함한다.The NK cell extracellular boosted medium of the present invention contains interleukin-15, IL-15, interleukin-2, IL-2 and interleukin-21 and IL-21 do.

상기 개 NK 세포 체외 증폭 배지는 개 자연살해세포를 체외에서 증폭 및/또는 배양하기 위해 사용될 수 있는 배지로, 통상적으로 판매 및/또는 정제하여 사용할 수 있는 IL-15, IL-2 및 IL-21을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 100 중량부의 IL-21에 대하여 50 ~ 200 중량부의 인터루킨-15 및 10,000,000 ~ 100,000,000 중량부의 인터루킨-2를 포함하는 것일 수 있다. The above NK cell extracellular amplification medium can be used for amplification and / or culture of cannulated keratinocytes in vitro, and can be used for IL-15, IL-2 and IL-21 But it is preferable that 50 to 200 parts by weight of interleukin-15 and 10,000,000 to 100,000,000 parts by weight of interleukin-2 relative to 100 parts by weight of IL-21 are included.

또한, 바람직하게는 IL-21을 2 ~ 10 ng/㎖, IL-2을 10 ~ 500 U/㎖ 및/또는 IL-15을 2 ~ 10 ng/㎖ 포함하는 것일 수 있다.
Further, it may preferably contain 2 to 10 ng / ml of IL-21, 10 to 500 U / ml of IL-2 and / or 2 to 10 ng / ml of IL-15.

만약, IL-15를 2 ng/㎖ 미만으로 포함할 경우, NK 세포 증식에 문제가 발생하여 증식율이 저하되는 문제가 발생할 수 있으며, IL-15를 10 ng/㎖ 초과하는 양을 포함할 경우, 과도한 자극에 의하여 NK 세포의 세포살상능이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.If IL-15 is contained in an amount of less than 2 ng / ml, there may arise a problem that NK cell proliferation occurs and the proliferation rate is lowered. When the amount of IL-15 is more than 10 ng / ml, Excessive stimulation may lead to a problem that the cell killing ability of NK cells is deteriorated.

또한, 만약, IL-21을 2 ng/㎖ 미만으로 포함할 경우, 낮은 수준의 자극으로 인하여 체외 증식률 저하 및 NK 세포의 세포살상능이 저하되는 문제가 발생할 수 있으며, IL-21을 10 ng/㎖ 초과하는 양을 포함할 경우, 사이토카인의 과도한 자극으로 면역세포에서 발생되는 활성화-유도 세포사멸(activation-induced cell death, AICD)기전에 의하여 체외 배양 증식률 및 활성도에 문제가 발생할 수 있다.In addition, if IL-21 is contained at less than 2 ng / ml, there may arise a problem that the in vitro proliferation rate is lowered and the cell killing ability of NK cells is lowered due to the low level of stimulation, and IL- (AICD) mechanism, which occurs in immune cells due to excessive stimulation of cytokines, may cause problems with the growth rate and activity of the in vitro culture.

나아가, 만약, IL-2를 10 U/㎖ 미만으로 포함할 경우, 상기의 체외 증식률 저하 및 저활성도 등의 문제가 발생할 수 있으며, IL-2를 500 U/㎖ 초과하는 양을 포함할 경우, 상기의 활성화-유도 세포사멸 기전이 발생하여 체외 배양 증식률 및 활성도에 문제가 발생할 수 있다.
Furthermore, if IL-2 is contained in an amount of less than 10 U / ml, problems such as the above-mentioned out-vitro growth rate and low activity may arise. If the amount of IL-2 is more than 500 U / The above-mentioned activation-induced cell death mechanism may occur, resulting in problems with the in vitro culture proliferation rate and activity.

더불어, 상기 개 NK 세포 체외 증폭 배지는 통상적으로 동물 유래 세포의 체외 배양 및/또는 증폭 배지에 포함할 수 있는 물질들을 추가로 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 열처리된 (56℃, 30분) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제(페니실린, 스트렙토마이신 등), L-글루타민,방사선 조사(감마선, 100 Gy)된 배양보조세포(feeder cell) 등을 더 포함할 수 있다.
In addition, the above-mentioned NK cell extracellular amplification medium may further include substances that can normally be contained in an in vitro culture and / or an amplification medium of animal-derived cells. For example, culture assisted cells (100 μM) supplemented with heat (56 ° C, 30 min) fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.), L-glutamine, feeder cell, and the like.

또한, 인터루킨-21을 연속적 또는 간헐적으로 투여하기 위한 개 자연살해세포 증폭 배지를 제공한다.
In addition, a genetic killer cell amplification medium for administration of interleukin-21 continuously or intermittently is provided.

본 발명은 개로부터 채취한 혈액에서 개 자연살해세포를 분리하는 1단계; 및 상기 개 자연살해세포를 세포 체외 증폭 배지에 첨가하여 체외배양하는 2단계; 를 포함하고, The present invention relates to a method for separating natural killer cells from blood collected from a dog; And 2) in vitro culture of the natural killer cells by adding the cells to an extracellular amplification medium; Lt; / RTI >

상기 2단계의 체외 배양은 인터루킨-21(interleukin-21)을 첨가하며 수행하는 개 자연살해세포 체외 배양방법을 제공한다.
The in vitro culture of the above two stages is carried out by adding interleukin-21 (interleukin-21).

먼저, 1단계는 개로부터 채취한 혈액에서 개 자연살해세포를 분리한다. 개 자연살해세포의 분리는 통상적으로 혈액에서 세포를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 불연속 밀도구배 방법을 사용할 수 있다.First, Step 1 isolates the natural killer cells from the blood collected from the dog. Isolation of cannulated natural killer cells is not particularly limited as long as it is a method of separating cells from blood, but preferably a discontinuous density gradient method can be used.

만약, 불연속 밀도구배 방법을 수행하여 개 자연살해세포를 분리할 경우, 서로 다른 비중을 갖는 3개의 물질을 사용하여 개 자연살해세포를 분리할 수 있으며, 바람직하게는 비중이 1.0 내지 1.2 g/㎖ 범위 내에서 선택된 서로 다른 3개의 값을 갖는 물질을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비중 1.058 g/㎖을 갖는 물질 1, 물질 1의 비중과 0.01 ~ 0.04 g/㎖ 차이를 갖는 물질 2 및 상기 물질 2의 비중과 0.03 ~ 0.055 g/㎖ 차이를 갖는 물질 3을 사용하여 혈액으로부터 개 자연살해세포를 분리할 수 있다.
If the natural killer cells are separated by performing the discontinuous density gradient method, the natural killer cells can be separated using the three materials having different specific gravity, preferably 1.0 to 1.2 g / ml Material having a specific gravity of 1.058 g / ml, material 2 having a specific gravity of material 1 of 0.01 to 0.04 g / ml and material 2 having a specific gravity of 1.058 g / 2 can be used to separate natural killer cells from blood using a material 3 having a specific gravity of 0.03 to 0.055 g / ml.

다음으로, 2단계는 분리한 개 자연살해세포를 세포 체외 증폭 배지에 첨가하여 체외 배양한다. Next, in step 2, isolated natural killer cells are added to an extracellular amplification medium for in vitro culture.

상기 세포 체외 증폭 배지는 통상적으로 동물 유래 세포를 체외에서 배양 및/또는 증폭하기 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 배양보조세포(feeder cell), 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 및 인터루킨-15(interleukin-15, IL-15)을 포함하는 배지를 사용할 수 있다.The extracellular amplification medium is not particularly limited as long as it is used for culturing and / or amplifying an animal-derived cell in vitro. Preferably, the extracellular amplification medium is a feeder cell, interleukin-2, IL- 2) and interleukin-15 (interleukin-15, IL-15) can be used.

상기 세포 체외 증폭 배지에 포함되는 IL-2 및 IL-15는 통상적으로 판매 및/또는 정제하여 사용할 수 있는 IL-15 및 IL-2를 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 인간 IL-2 및 인간 IL-15를 사용할 수 있다.The IL-2 and IL-15 contained in the extracellular amplification medium are not particularly limited as long as they include IL-15 and IL-2 that can be used for sale and / or purification, And human IL-15 can be used.

또한, 세포 체외 증폭 배지에서 포함되는 IL-2 및 IL-15의 함유량은 통상적으로 체외 증폭 배지에 첨가될 수 있는 첨가제의 양이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 IL-2을 10 ~ 500 U/㎖ 및 IL-15을 2 ~ 10 ng/㎖ 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 IL-2을 50 ~ 200 U/㎖ 및 IL-15을 3 ~ 8 ng/㎖ 포함하는 것일 수 있다.In addition, the content of IL-2 and IL-15 contained in the extracellular amplification medium is not particularly limited as long as it is the amount of the additive that can be added to the extracorporeal amplification medium, but is preferably 10-500 U / Ml and IL-15 in an amount of 2 to 10 ng / ml, and most preferably 50 to 200 U / ml of IL-2 and 3 to 8 ng / ml of IL-15.

만약, IL-15를 2 ng/㎖ 미만으로 포함할 경우, NK 세포 증식에 문제가 발생할 수 있으며, IL-15를 10 ng/㎖ 초과하는 양을 포함할 경우, 과도한 자극에 의하여 NK 세포의 세포살상능이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.If IL-15 is contained at less than 2 ng / ml, it may cause problems in NK cell proliferation. If it contains an amount exceeding 10 ng / ml of IL-15, There may arise a problem that the killing ability is lowered.

나아가, 만약, IL-2를 10 U/㎖ 미만으로 포함할 경우, 낮은 수준의 자극으로 인하여 체외 증식률 저하 및 NK 세포의 낮은 세포살상능 등의 문제가 발생할 수 있으며, IL-2를 500 U/㎖ 초과하는 양을 포함할 경우, 사이토카인의 과도한 자극시 면역세포에서 발생되는 활성화-유도 세포사멸 기전에 의한 체외 배양 증식률 및 활성도에 문제가 발생할 수 있다.
Further, when IL-2 is contained at less than 10 U / ml, low-level stimulation may cause problems such as a decrease in vitro proliferation rate and a low cell killing ability of NK cells. In addition, when IL- Ml may result in problems with in vitro culture proliferation rate and activity due to the activation-induced apoptosis mechanism occurring in immune cells upon excessive stimulation of cytokines.

상기 배양보조세포는 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 세포인 개 자연살해세포의 증식을 돕는 역할을 하며, 통상적으로, 동물 유래 세포의 체외 증식 및/또는 배양에 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, Ewing’s 골수종세포주, 개 갑상선암세포주 등을 사용할 수 있다.The culture-assisting cells serve to assist in the proliferation of target natural kill cells, which produce various metabolites, and are not particularly limited as long as they are normally used for in vitro proliferation and / or culture of animal-derived cells. For example, Ewing's myeloma cell line, dog thyroid cancer cell line and the like can be used.

또한, 개 유래 세포 체외 증폭 배지에 첨가하는 배양보조세포의 양은 통상적으로 동물 유래 세포의 체외 증폭 및/또는 배지에 첨가하는 양이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 0.2×106 ~ 2×106 cells/well로 첨가할 수 있다.
The amount of the culture aid cells added to the dog-derived cell extracellular amplification medium is not particularly limited as long as it is an amount to be added to the extracorporeal amplification and / or the culture medium of animal-derived cells in general, but is preferably 0.2 × 10 6 to 2 × 10 6 cells / well.

나아가, 상기 세포 체외 증폭 배지는 통상적으로 동물 유래 세포의 체외 배양 및/또는 증폭 배지에 포함할 수 있는 물질들을 추가로 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제(페니실린, 스트렙토마이신 등), L-글루타민 등을 더 포함할 수 있다.
Further, the extracellular amplification medium may further include substances which can be normally contained in an in vitro culture and / or an amplification medium of animal-derived cells. For example, fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.), L-glutamine and the like.

더불어, 상기 체외배양 시 첨가하는 IL-21은 통상적으로 판매 및/또는 정제하여 사용할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 개 IL-21을 사용할 수 있다.
In addition, IL-21 to be added in the in vitro culture is not particularly limited as long as it can be usually used for sale and / or purification, but IL-21 can be preferably used.

또한, 상기 체외 배양시 IL-21의 첨가는 통상적으로 세포 체외 배양시 첨가제를 첨가하는 기간이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 간헐적 또는 연속적으로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 배양 초기, 배양 말기 또는 배양 초기와 배양 말기에 첨가하거나 체외 배양 시작일 ~ 종료일 동안 첨가할 수 있다.
In addition, the addition of IL-21 during the in vitro culture is not particularly limited as long as the additive is added during the in vitro culture, but it may be added intermittently or continuously, more preferably at the early stage of culture, Or may be added at the initial stage of culture and at the end of culture, or may be added during the initial stage to the end of culture.

나아가, 상기 체외배양 시, IL-21의 첨가량은 개 자연살해세포 증폭 및/또는 배양 효율을 향상시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 체외 증폭 배지에 IL-21의 함량이 2 ~ 10 ng/㎖로 유지되도록 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 체외 증폭 배지에 IL-21의 함량이 3 ~ 8 ng/㎖로 유지되도록 첨가할 수 있다.
Further, the amount of IL-21 added in the in vitro culture is not particularly limited as long as it can enhance the efficiency and / or the culture efficiency of the natural killer cells. Preferably, the content of IL-21 is 2 to 10 ng / ml. More preferably, it can be added so that the content of IL-21 in the extracellularly-amplified medium is maintained at 3 to 8 ng / ml.

본 발명의 일구현예에서는, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 시작일 ~ 10일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하는 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, the IL-21 addition in step 2 may be added to the in vitro expansion medium for the first 10 days of in vitro culture.

본 발명의 다른 일구현예에서는, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 시작일 ~ 4일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하고, 체외 배양 시작 후 6 ~ 11일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하고, 체외 배양 시작 후 13 ~ 18일 동안 체외 증폭 배지에 첨가하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the IL-21 addition in the second step is added to the in vitro expansion medium for 4 days from the start of the in vitro culture, added to the in vitro expansion medium for 6 to 11 days after the start of the in vitro culture, Lt; / RTI > to boosted medium for 13-18 days after start.

본 발명의 또 다른 일구현예에서는, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 전기간 동안 체외 증폭 배지에 첨가하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the IL-21 addition in step 2 may be added to the in vitro expansion medium during in vitro culture.

본 발명의 또 다른 일구현예에서는, 상기 2단계의 IL-21 첨가는 체외 배양 시작일 ~ 10일 동나 체외 증폭 배지에 첨가하고, 체외 배양 종료 3일 전 ~ 체외 배양 종료일까지 첨가하는 것일 수 있다.
In another embodiment of the present invention, the IL-21 addition in the second step may be added to the in vitro culture medium or the in vitro expansion medium and added from 3 days before the end of the in vitro culture to the end of the in vitro culture.

더불어, 상기 세포 체외 증폭 배지에 첨가하는 개 자연살해세포의 양은 통상적으로 동물 유래 세포의 체외 증폭 및/또는 배양시 첨가하는 양이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 0.2×106 ~ 2×106 cells/well을 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.5×106 ~ 1.5×106 cells/well을 첨가할 수 있다.
In addition, the amount of cannulated killing cells to be added to the extracellular amplification medium is not particularly limited as long as it is an amount added during in vitro amplification and / or culture of animal-derived cells, but is preferably 0.2 × 10 6 to 2 × 10 6 cells / well, and more preferably 0.5 x 10 6 to 1.5 x 10 6 cells / well.

또한, 상기 체외 배양은 통상적으로 동물 유래 세포의 체외 증폭 및/또는 배양하는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 30 ~ 45 ℃에서 14 ~ 30일 동안 배양할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 33 ~ 42 ℃에서 14 ~ 30일 동안 배양할 수 있다.
In addition, the in vitro culture is not particularly limited as long as it is a condition for extracorporeal amplification and / or culture of animal-derived cells, but it is preferably cultivated at 30 to 45 ° C for 14 to 30 days, Lt; RTI ID = 0.0 > 42 C < / RTI > for 14-30 days.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to explain the present invention to the average person skilled in the art in more detail.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1. 개  One NKNK 세포의 분리Isolation of cells

개의 말초혈액(perpheral blood)은 공주대학교 특수동물학과의 실험동물사육시설에서 사육하는 개 중에서 혈액검사와 정기적인 건강검진을 통해 건강하다고 인정되는 8세의 성견의 경정맥에서 15 내지 30 ㎖의 말초혈액을 무균적으로 채혈하였으며, 채혈된 말초혈액은 헤파린튜브(heparin tube; BD Biosciences사 제품)에 보관하여 2시간 내에 사용하였다.Perpheral blood was collected from 15 to 30 ml of peripheral blood in the jugular vein of an 8-year-old male dog, which is recognized as healthy through blood tests and periodic health examinations, in dogs raised at an experimental animal breeding facility of Kongju National University. Were collected aseptically, and the collected peripheral blood was stored in a heparin tube (BD Biosciences) and used within 2 hours.

상기 채취한 말초혈액을 PBS 버퍼(phosphate-buffered saline buffer, WEL GENE사, 제품명: DPBS)를 1:2 (v/v) 비율로 첨가하여 희석하여 희석한 말초혈액을 제조하였다. 또한, 불연속 밀도구배(discontinuous density gradients) 용액을 이용하여 상기 희석한 말초혈액에서 개 NK세포를 분리하였다.The collected peripheral blood was diluted by adding PBS buffer (phosphate-buffered saline buffer, WEL GENE, product name: DPBS) at a ratio of 1: 2 (v / v) to prepare diluted peripheral blood. In addition, individual NK cells were isolated from the diluted peripheral blood using a discontinuous density gradients solution.

상기 불연속 밀도구배 용액은 100% 농도의 Lymphoprep(비중 1.077, LymphoprepTM, Axis-Shield사) 5 ㎖ 또는 100% 농도의 Histopaque(비중 1.119, HISTOPAQUEⓡ-1119, Sigma사) 5 ㎖ 용액 위에 76% 농도의 Lymphoprep(비중 1.058, LymphoprepTM, Axis-Shield사) 10 ㎖를 각각 조심스럽게 올린 후, 상온에서 25분 동안 400 × g로 원심분리하여 개 NK세포를 분리하였다.
The discontinuous density gradient solution was dissolved in 5 ml of 100% Lymphoprep (specific gravity 1.077, Lymphoprep TM , Axis-Shield) or 5 ml of Histopaque (specific gravity 1.119, HISTOPAQUEⓡ-1119, Sigma) at a concentration of 76% , 10 ml of Lymphoprep (specific gravity 1.058, Lymphoprep ™ , Axis-Shield) were carefully raised and then centrifuged at 400 × g for 25 minutes at room temperature to isolate the individual NK cells.

실시예Example 2. 개  2 NKNK 세포의 배양Cell culture

실시예 1에서 분리한 개 NK세포를 24 웰 플라이트(well plate, Tissue Culture Plate24-Well, BD Biosciences사)에 1×106 cells/well로 넣은 후, 상기 24 웰 플라이트에 K562 세포주(kindly provided by Dr. Campana, St. Jude Children’s Research Hospital, USA) 0.5×106 cells/well을 추가하여 37℃, 5% CO2 배양기(Sanyo사 제품)에서 21일 동안 배양하여, 체외에서 개 유래 자연살해세포를 증폭시켰다. 또한, 상기 배양시 배양 시작일 ~ 배양 1주일 동안 개 IL-21 단백질(Recombinant Canine IL-21, R&D Systems사 제품)을 5 ng/㎖로 유지되도록 하였다.Each of the NK cells isolated in Example 1 was put into a 24-well plate (Tissue Culture Plate 24-Well, BD Biosciences) at 1 × 10 6 cells / well, and the K562 cell line Dr. Campana, St. Jude Children's Research Hospital, USA) 0.5 × 10 6 cells / well and added to the incubation in 37 ℃, 5% CO 2 incubator (Sanyo Co., Ltd.) 21, two in vitro-derived NK cells Lt; / RTI > Further, IL-21 protein (Recombinant Canine IL-21, manufactured by R & D Systems) was maintained at 5 ng / ml for 1 week from the start of culture to the culture for 1 week.

상기 배양은 RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen사)을 첨가하고 100 IU/㎖ human IL-2단백질(Recombinant Human IL-2, PeproTec사) 및 5 ng/㎖ human IL-15단백질(Recombinant Human IL-15, PeproTec사)를 첨가한 배지를 이용하였고. 배양액은 매 2일에 한 번씩 교체하며 총 21일간 배양하였다.
The culture was performed by adding 10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen) to RPMI 1640 medium, adding 100 IU / ml human IL-2 protein (Recombinant Human IL-2, PeproTec) and 5 ng / ml human IL- Recombinant Human IL-15, PeproTec) was used. The culture medium was changed every 2 days and cultured for a total of 21 days.

실시예Example 3. 3.

배양시 배양 시작일 ~ 3일 동안, 배양 7 ~ 10일 및 배양 14 ~ 17일에 배양 배지에 개 IL-21 단백질 5 ng/㎖로 유지되도록 첨가한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 개 NK세포를 배양하였다.
The same procedure as in Example 2 was carried out except that the culture medium was added so as to maintain 5 ng / ml of canine IL-21 protein in the culture medium for 7 days to 10 days of culture and 14 to 17 days of culture for 3 days from the start of culture Were cultured in NK cells.

실시예Example 4.  4.

배양시 배양기간인 21일 동안 배양 배지에 개 IL-21 단백질을 5 ng/㎖로 유지되도록 첨가한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 개 NK세포를 배양하였다.
The NK cells were cultured in the same manner as in Example 2 except that the IL-21 protein was added to the culture medium for 21 days as a culture period to maintain the IL-21 protein at 5 ng / ml.

비교예Comparative Example 1.  One.

배양시 개 IL-21 단백질을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상시 실시예 2와 동일한 방법으로 개 NK세포를 배양하였다.
The NK cells were cultured in the same manner as in Example 2 except that no IL-21 protein was added.

실험예Experimental Example 1. 개  One NKNK 세포의 증폭 효율 측정Measurement of cell amplification efficiency

실시예 2 내지 4 및 비교예 1에서 배양된 개 NK세포의 증폭 효율을 확인하기 위하여 배양 당일부터 1주일 단위로 세포 수와 순도를 확인하였으며 그 방법들은 다음과 같다. In order to confirm the amplification efficiency of the canine NK cells cultured in Examples 2 to 4 and Comparative Example 1, the number of cells and purity were checked every week from the day of culturing, and the methods were as follows.

구체적으로, 피펫으로 웰(Well)에서 배양 중인 개 NK세포를 현탁한 후 동 세포현탁액 10㎕를 세포혈구세포 계수기(Hemocytometer, Paul Marienfeld GmbH사)에 분주하고 커버슬라이드(Microscope Cover Glasses, Paul Marienfeld 사)를 얹은 후 현미경(Leica Microsystems, Leica사)에서 세포 수를 직접 세어 ㎖ 당 세포 수를 계산하였다. 세포현탁액 100,000개 세포를 사이토스핀 슬라이드(Paul Marienfeld GmbH사 제품)에 분주하고 메이-그룬왈드-김자(May-Grunwald-Giemsa)로 염색한 다음 현미경 관찰을 통하여 500개의 세포를 한 구획으로 하여 그 중에서 개 NK세포의 특징을 갖는 세포수를 세고 500으로 나누어 순도를 계산하였다. 측정한 배양된 개 NK세포 수는 도면 1에 나타냈다.Specifically, 10 μl of the cell suspension was dispensed into a cell counting cell (Hemocytometer, Paul Marienfeld GmbH) after being incubated in a well using a pipette, and the cells were placed on a cover slide (Microscope Cover Glasses, Paul Marienfeld ), And the number of cells per ml was counted by directly counting the number of cells in a microscope (Leica Microsystems, Leica). 100,000 cells of the cell suspension were dispensed into a cytospin slide (manufactured by Paul Marienfeld GmbH), stained with May-Grunwald-Giemsa, and then subjected to microscopic observation to make 500 cells as one compartment The number of cells with the characteristics of individual NK cells was counted and divided by 500 to calculate the purity. The number of cultured dog NK cells measured is shown in FIG.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 개 IL-21이 첨가된 실시예 2 내지 4 에서 개 NK세포 증폭률이 향상된 것을 확인하였다. 특히, 개 IL-21을 체외 증폭 초기 1주일 간 첨가한 실시예 2의 개 NK세포에서 현저하게 증폭률이 증가한 것을 확인할 수 있었다.As shown in Fig. 1, it was confirmed that the amplification rates of individual NK cells were improved in Examples 2 to 4 in which IL-21 was added. In particular, it was confirmed that the amplification rate was significantly increased in the individual NK cells of Example 2 in which the dog IL-21 was added during the initial week of in vitro amplification.

따라서, 개 IL-21의 시간차 첨가(실시예 2 내지 4)는 개 NK세포 증폭 효율을 현저하게 향상시키는 것을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the time-lag addition of canine IL-21 (Examples 2 to 4) remarkably improves the efficiency of canine NK cell amplification.

실험예Experimental Example 2. 개  2 NKNK 세포의 표현형 분석Phenotypic analysis of cells

개 IL-21의 시간차 첨가로 체외 증폭된 실시예 2 내지 4 및 비교예 1 각각의 개 NK세포들의 표현형(phenotype)의 변화를 분석하였다. The phenotypic changes of each of the NK cells of Examples 2 to 4 and Comparative Example 1, which were extracellularly amplified by the addition of time-lagged IL-21, were analyzed.

각각의 배양된 개 NK세포들로부터 피펫으로 현탁하여 세포를 회수하고, 회수한 세포를 식염수로 세척한 후 계수하여 십만 개 단위로 96-웰(well) 둥근 바닥 플레이트(96 Well Cell Culture Plate U-type, SPL사)에 분주하고 2000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 피펫으로 제거하였다. 이후 둥근 바닥 플레이트에 남아있는 세포를 수집하고, 수집한 세포에 100 ㎕ 유세포 염색용 완충액(식염수 + 1% 소혈청알부민(Albumin BovineFraction V, ㈜바이오세상사))을 첨가하여 현탁하였다. 이후 모든 웰(well)에 APC-개 CD5 항체(RAT ANTI DOG CD5:APC, SeroTech사) 3 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 각각 FITC-개 CD3 항체(MOUSE ANTI DOG CD3:FITC, seroTec사), PE-개 CD4 항체(RAT ANTI DOG CD4:RPE, SeroTech사), CD8 항체(RAT ANTI DOG CD8:RPE, SeroTech사) 3 ㎕씩 첨가하고 마이크로 피펫으로 혼합하여 4℃에서 20분간 결합시켰다.The cells were suspended in each of the cultured NK cells by pipette, and the recovered cells were washed with a saline solution and counted in 100,000 wells of a 96 well cell culture plate U- type, SPL), centrifuged at 2000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed by pipetting. Then, the cells remaining on the round bottom plate were collected, and 100 쨉 l of a flow cytometer staining buffer (saline + 1% bovine serum albumin (Albumin Bovine Fraction V, Bio Products) was added to the collected cells. Then, 3 μl of APC-CD5 antibody (RAT ANTIDOG CD5: APC, SeroTech) was added to all wells, and then mixed with FITC-CD3 antibody (MOUSE ANTIDOG CD3: FITC, seroTec) 3 μl of CD4 antibody (RAT ANTIDOG CD4: RPE, SeroTech) and CD8 antibody (RAT ANTIDOG CD8: RPE, SeroTech) were added to each well and mixed with a micropipette at 4 ° C. for 20 minutes.

이후 2,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 식염수 및 2% 포름알데히드(Formaldehyde solution 36.5~38%, Sigma사)를 포함하는 혼합 용액 100 ㎕를 첨가하고 현탁하여 세포를 고정시켰다. 이후 유세포 분석용 튜브(5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Biosciences사)에 옮겨서 2% 포름알데히드 용액(Formaldehyde solution 36.5~38%, Sigma사) 500 ㎕를 첨가하고 고르게 현탁하였다. 이후 유세포 분석기인 FACSCalibur (BD Biosciences사)에서 분석하여 도면 2에 나타내었다.Then, the supernatant was removed by centrifugation at 2,000 rpm for 3 minutes, and 100 μl of a mixed solution containing saline and 2% formaldehyde solution (36.5-38%, Sigma) was added and suspended to fix the cells. Then, the cells were transferred to a flow cytometry tube (5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Biosciences) and 500 μl of 2% formaldehyde solution (36.5-38% of formaldehyde solution, Sigma) was added and suspended in an even solution. And analyzed by flow cytometry analyzer FACSCalibur (BD Biosciences).

도 2에서 확인되는 바와 같이, 개 NK세포의 특성으로 알려진 CD5low 세포 군체가 비교예 1에 비해 개 IL-21를 첨가한 실시예 2 내지 4에서 증가하였으며 특히 배양 초기 1주일 간 첨가한 실시예 2 및 매일 첨가한 실시예 4에서 현저하게 CD5low 세포들이 증가함을 확인하였다.As can be seen in FIG. 2, CD5 low cell clusters known to be characteristic of individual NK cells were increased in Examples 2 to 4, in which IL-21 was added compared to Comparative Example 1, 2 < / RTI > and daily addition of CD5 low cells significantly increased in Example 4.

따라서, 개 IL-21의 시간차 첨가(실시예 2 내지 4)는 개 NK세포의 특성으로 알려진 CD5low 세포를 월등히 증가시키는 것을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the time-dependent addition of IL-21 (Examples 2 to 4) significantly increased CD5 low cells, which are known to be characteristic of individual NK cells.

실험예Experimental Example 3. 암세포에 대한  3. For cancer cells 세포독성능Cytoxin performance 평가 evaluation

NK세포가 효과 세포(effector cells)로서 갖는 특징 중의 하나는 암세포주에 대한 세포독성능(cytotoxicity)이므로 이를 통하여 체외 증폭과정에서 개 IL-21로 시간차 첨가한 실시예 2 내지 4 및 비교예 1에서 배양한 개 NK세포의 항암 기능을 평가할 수 있다. 이를 위하여, 실시예 2 내지 4 및 비교예 1에서 배양한 개 NK세포의 과립 임파구에 민감한 암세포주인 개 갑상선 암세포주(canine thyroid adenocarcinoma, CTAC; European Collection of Cell Cultures사)에 대한 세포독성능을 평가하였다. One of the characteristics that NK cells have as effector cells is cytotoxicity against cancer cell lines. Therefore, in Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 in which the cells were added with time-lapse IL-21 in vitro, The anti-cancer function of cultured NK cells can be evaluated. To this end, cytotoxicity of canine thyroid adenocarcinoma (CTAC; European Collection of Cell Cultures) sensitive to granulocyte lymphocyte of cultured NK cells in Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 was evaluated Respectively.

실시예 2 내지 4 및 비교예 1에서 배양한 개 NK세포로부터 피펫으로 개 NK세포를 현탁하고 식염수로 세척한 후 증폭용 배지인 10% FBS(Invitrogen사 제품)가 함유된 RPMI1640(Invitrogen사 제품) 배지로 현탁하고 세포 수를 계산하였다. 상기 세포 수 계산은 혈구세포 계수기(Hemocytometer, Paul Marienfeld GmbH사)에 동세포현탁액 10㎕를 분주하고 커버슬라이드(Microscope Cover Glasses, Paul Marienfeld 사)를 얹은 후 현미경(Leica Microsystems, Leica사)에서 세포 수를 직접 세어 ㎖ 당 세포 수를 계산하여 수행하였다.The canine NK cells were suspended from each of the NK cells cultured in Examples 2 to 4 and Comparative Example 1, washed with saline, and then suspended in RPMI1640 (Invitrogen) containing 10% FBS (Invitrogen) The cells were suspended in the medium and counted. The cell count was calculated by dividing 10 쨉 l of the cell suspension into a hemocytometer (Paul Marienfeld GmbH), placing it on a cover slide (Microscope Cover Glasses, manufactured by Paul Marienfeld), measuring the number of cells in a microscope (Leica Microsystems, Leica) And counting the number of cells per ml.

이후 표적 세포인 CTAC는 실험 전날 96-well 평판 플레이트(flat bottom plate, SPL사 제품)에 웰(well) 당 1×104개의 세포를 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 분석 당일 날 배지를 피펫으로 제거하고 효과세포:표적세포 비율(10:1, 5:1, 2.5:1)에 따라 실시예 3 내지 4 및 비교예 1 내지 2의 개 NK세포 각각을 100 ㎕ 용량으로 분주하고 1500 rpm에서 3분간 원심분리기를 가동하여 상기 암세포주와 접촉시켰다. 이후 이산화탄소-배양기(Sanyo사 제품)에 넣고 3시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, EZ-CyTox kit(대일랩서비스사 제품)의 매뉴얼에 따라 WST-1 용액 10 ㎕를 첨가하고 1시간 더 추가배양하였다. 상기 추가배양 이후에 원심분리하고 상층액 90 ㎕를 취하여 새 플레이트에 분주하고 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 1로 세포독성능을 평가하였다.The target cell, CTAC, was cultured on a 96-well flat bottom plate (manufactured by SPL) on the day before the experiment with 1 × 10 4 cells per well for 24 hours. The medium was then pipetted off on the day of the analysis and 100 μl of each of the individual NK cells of Examples 3 to 4 and Comparative Examples 1 and 2 was cultured according to the effect cell: target cell ratio (10: 1, 5: 1, 2.5: And centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes to make contact with the cancer cell line. Then, the cells were placed in a carbon dioxide-incubator (manufactured by Sanyo) and cultured for 3 hours. After the above cultivation, 10 μl of WST-1 solution was added according to the manual of EZ-CyTox kit (Daeil Lab Service Co.) and further incubated for 1 hour. After the additional incubation, the cells were centrifuged and 90 [mu] l of the supernatant was dispensed into a new plate. The absorbance was measured at a wavelength of 450 nm and the cytotoxicity was evaluated by the following equation (1).

Figure 112013085076262-pat00001
Figure 112013085076262-pat00001

수학식 1에서, A450값은 450 ㎚에서의 흡광도이다.In equation (1), the A 450 value is the absorbance at 450 nm.

상기 세포독성능의 결과는 도면 3에 나타냈다.The results of the cytotoxicity are shown in FIG.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 비교예 1에 비하여 개 IL-21이 첨가된 실시예 2 내지 4가 CTAC 암세포주에 대한 세포독성능이 증가하였다. 또한, 배양 초기 1주일 간 첨가한 실시예 2에 비해 매주 3일간 첨가한 실시예 2 및 매일 첨가한 실시예 4에서 현저하게 암세포 살상능력이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
As can be seen in FIG. 3, Examples 2 to 4, in which IL-21 was added as compared to Comparative Example 1, increased cytotoxicity against CTAC cancer cell lines. In addition, it was confirmed that the cancer cell kill ability was remarkably increased in Example 2 added for 3 days every week and Example 4 added daily for 1 week compared to Example 2 added for 1 week in the initial stage of culture.

상기와 같이, 개 IL-21을 체외 증폭 초기 1주일 동안 첨가한 실시예 2는 증폭률을 향상시키고 매일 첨가한 실시예 4는 암세포 살상능력을 증가시키는 것을 알 수 있다.
As described above, it can be seen that the amplification rate of Example 2 in which the open IL-21 was added for the first week of the extracorporeal amplification was improved, and Example 4, which was added daily, increased the cancer cell lysis capability.

실험예Experimental Example 4.  4. 암세포주에Cancer cell 대한 인터페론-감마  Interferon-gamma 생성능Generation 평가 evaluation

NK세포가 갖는 특징은 암세포주에 반응하여 인터페론-감마(interferon-γ)를 생산하는 것이다. 이를 통하여 체외 증폭과정에서 개 IL-21을 시간 차로 첨가시킨 실시예 2 내지 4 및 비교예 1의 암세포주에 대한 항암기능을 비교하였다.The characteristic of NK cells is the production of interferon-gamma in response to cancer cell lines. The anticancer functions of the cancer cell lines of Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 in which IL-21 was added in a time-course manner during the in vitro amplification were compared.

개 IL-21의 시간차 첨가로 체외 증폭된 개 NK세포의 항암기능을 조사하기 위하여, 실시예 2 내지 4 및 비교예 1로부터 CTAC 세포주에 대하여 인터페론-감마 생성능을 평가하였다. Interferon-gamma production was evaluated for CTAC cell lines from Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 in order to investigate the anticancer function of canine NK cells extracellularly amplified by the addition of time-lagged IL-21.

상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실시예 2 내지 4 및 비교예 1로부터 개 NK세포들을 수집하여 계수하였다. 표적세포인 CTAC는 실험 전날 96-well 평판 플레이트에 well 당 5×104개의 세포를 분주하여 24시간 동안 배양하였고 분석 당일 날 배지를 피펫으로 제거하였다. 이후 효과세포(배양한 개 NK세포):표적세포(CTAC 암세포주) 비율이 10:1이 되도록 실시예 2 내지 4 및 비교예 1로부터 배양한 개 NK세포를 100 ㎕ 당 5×105개로 조제하여 분주하였다. 이후 1500 rpm에서 3분간 원심분리기를 가동하여 암세포주와 접촉시킨 후 이산화탄소-배양기에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 2000 rpm에서 5분간 원심분리하였고 배양 상등액을 회수하여 인터페론-감마 생성 정도를 BD OptEIATM SetCanineKit(BD Biosciences사 제품)를 이용하고 해당 제조사의 매뉴얼에 따라 ELISA법으로 분석하였다. 분석한 결과는 도면 4에 나타냈다.NK cells were collected and counted from Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 in the same manner as in Experimental Example 3 above. CTAC, the target cell, was cultured for 24 hours on a 96-well flat plate on the day before the experiment by dividing 5 × 10 4 cells per well, and the medium was removed by pipette on the day of analysis. Then, the NK cells cultured from Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 were cultured at 5 × 10 5 per 100 μl so that the ratio of the effector cells (cultured NK cells) to the target cells (CTAC cancer cell lines) was 10: 1 Respectively. After centrifugation at 1500 rpm for 3 minutes, the cells were contacted with cancer cells and cultured in a carbon dioxide-incubator for 24 hours. After culturing, the culture supernatant was centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. The culture supernatant was recovered and the degree of interferon-gamma production was analyzed by ELISA according to the manufacturer's manual using BD OptEIATM SetCanine Kit (BD Biosciences). The results of the analysis are shown in FIG.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 비교예 1에 비하여 개 IL-21이 첨가된 실시예3 내지 4가 CTAC 암세포주에 대한 인터페론-감마 생산능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.As can be seen in FIG. 4, it was confirmed that Examples 3 to 4, in which IL-21 was added as compared to Comparative Example 1, increased interferon-gamma production capacity for CTAC cancer cell lines.

이로 인해, 시간차에 따라 개 IL-21을 첨가하는 것 중 배양 초기 1주일 동안 첨가한 실시예 2에 비해 배양기간 동안 매일 또는 매주 3일간 개 IL-21을 첨가하는 것이 암세포에 대한 인터페론-감마 생산능을 증가시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
Therefore, the addition of canine IL-21 daily or weekly for 3 days during the incubation period compared to Example 2 added during the first week of culture among the addition of canine IL-21 according to the time difference results in interferon-gamma production It was found that there was an effect of increasing the performance.

상기와 같이, 개 IL-21을 체외 증폭 초기 1주일 동안 첨가한 실시예 2는 증폭률을 향상시키고 매일 첨가한 실시예 4 및 매주 3일간 첨가한 실시예 3은 암세포 살상능력뿐만 아니라 인터페론-감마 생산능을 증가시키는 것을 알 수 있다.
As described above, Example 2, in which the canine IL-21 was added for the first week of extracorporeal amplification, improved amplification efficiency, and Example 4 added daily and Example 3 added every three days showed not only cancer cell kill ability but also interferon- It can be seen that the performance is increased.

실시예Example 5.  5.

증폭 초기 1주일간 개 IL-21을 5 ng/㎖의 농도가 유지되도록 첨가하여 증폭한 후, 증폭 19일 ~ 21일 동안 개 IL-21의 농도가 5 ng/㎖로 유지되도록 추가 첨가한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 개 NK세포를 배양하였다. 상기 개 IL-21 첨가 방법은 배양액의 반교체(half-change)시에 개 IL-21의 농도가 2 ㎖ 용량의 배지 내에서 최종적으로 5 ng/㎖이 되도록 새 배지에 개 IL-21을 첨가하였다.
Except that additional IL-21 was added at a concentration of 5 ng / ml for the first week of amplification and then added to maintain IL-21 concentration at 5 ng / ml for 19 to 21 days of amplification And then NK cells were cultured in the same manner as in Example 3. The above-mentioned IL-21 addition method comprises adding IL-21 to a fresh medium such that the concentration of IL-21 in the medium is finally 5 ng / ml in a medium having a capacity of 2 ml when the culture medium is half- Respectively.

실험예Experimental Example 5.  5.

실험예 3과 동일한 방법으로 실시예 2 및 실시예 4 내지 5에서 배양한 개 NK세포의 CTAC 암세포주에 대한 세포독성능을 평가하였다. 측정한 세포독성능은 도면 5에 나타내었다.The cytotoxic performance of the individual NK cells cultured in Example 2 and Examples 4 to 5 on CTAC cancer cell lines was evaluated in the same manner as in Experimental Example 3. The measured cytotoxicity is shown in FIG.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 개 IL-21을 배양 초기 1주일 간 첨가한 실시예 2에 비해 증폭 19일 ~ 21일 동안 첨가한 실시예 5가 현저하게 암세포 살상능력이 증가하였으며 매일 첨가한 실시예 4와 유사한 수준의 세포독성능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. As can be seen in FIG. 5, in Example 5, in which the canine IL-21 was added for 19 days to 21 days compared to Example 2 in which the canine IL-21 was added for 1 week in the culture period, the cancer cell killing ability was remarkably increased. It was confirmed that it exhibited a level of cytotoxicity similar to that of Example 4.

이로 인해, 개 IL-21를 배양 초기 1주일 동안 및 배양 19 ~ 21일째 추가 첨가하는 것이 세포독성능을 증가시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
As a result, it was found that addition of the additional IL-21 for 1 week in the culture and 19 to 21 days for culture increased the cytotoxicity.

실험예Experimental Example 6. 6.

실험예 4와 동일한 방법으로 실시예 2 및 실시예 4 내지 5에서 배양한 개 NK세포의 CTAC 암세포주에 대한 인터페론-감마 생성 능력을 평가하였다. 측정한 인터페론-감마 생성 능력은 도면 6에 나타내었다.The ability of the NK cells cultured in Example 2 and Examples 4 to 5 to generate interferon-gamma for CTAC cancer cell lines was evaluated in the same manner as in Experimental Example 4. The measured interferon-gamma production capacity is shown in FIG.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 실시예 5는 개 IL-21을 배양 초기 1주일 간 첨가한 실시예 2와 유사한 수준의 인터페론-감마 생성능을 보였으며, 매일 개 IL-21을 첨가한 실시예 4가 실시예 5보다 암세포에 대한 인터페론-감마 생산능을 증진하는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 6, Example 5 showed a level of interferon-gamma production similar to that of Example 2 in which dog IL-21 was added for one week in the initial stage of culture, and in Example 4 Was able to enhance interferon-gamma production ability for cancer cells as compared with Example 5.

이로 인해, 개 IL-21을 배양 초기 1주일 동안 및 배양 19 ~ 21일째 추가 첨가하는 것이 인터페론-감마 생성능 증진에는 효과가 없으나 세포독성능을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
As a result, it was found that the addition of the IL-21 cells for 1 week and 19-21 days of culture did not improve the interferon-gamma production but increased cytotoxicity.

실시예, 비교예 및 실험예를 통해 알 수 있는 것과 같이, 본 발명의 시간차 개 IL-21 첨가는 개 NK세포 증식 효율을 놀랍게 증가시킬 수 있으며, 암세포주에 대한 항암활성도 월등히 향상시키는 것을 알 수 있었다. 이로 인해, 본 발명의 시간차 개 IL-21 첨가는 NK세포의 증폭과정에서 항암기능이 향상된 대량의 개 NK세포치료제 제조법에 활용하여 현저하게 향상된 결과를 보일 수 있다.
As can be seen from the Examples, Comparative Examples and Experimental Examples, it was found that the time-dependent IL-21 addition of the present invention can remarkably increase the proliferation efficiency of the individual NK cells and significantly improve the anticancer activity against cancer cell lines there was. Therefore, the time-dependent IL-21 addition of the present invention can be remarkably improved by utilizing the method for producing a large amount of the NK cell therapeutic agent having improved anticancer function in the amplification process of NK cells.

Claims (13)

개로부터 채취한 혈액에서 개 자연살해세포를 분리하는 1단계; 및
상기 개 자연살해세포를 인터루킨-2(interleukin-2) 및 인터루킨-15(interleukin-15)을 포함하는 세포 체외 증폭 배지에 첨가하여 체외 배양하는 2단계; 를 포함하고,
상기 2단계의 체외 배양은 CD5- 표현형을 가진 개 자연살해세포를 증식시키기 위해,
인터루킨-21(interleukin-21)을 체외 배양 시작일 ~ 4일 동안 체외 증폭 배지에 첨가; 체외 배양 시작 후 6 ~ 11일 동안 체외 증폭 배지에 첨가; 및 체외 배양 시작 후 13 ~ 18일 동안 세포 체외 증폭 배지에 첨가;하여 수행하는 개 자연살해세포 체외 배양방법.A first step of isolating the natural killer cells from the blood collected from the dog; And
Adding the natural killer cells to an extracellular amplification medium containing interleukin-2 and interleukin-15 for in vitro culture; Lt; / RTI >
The two-step in vitro culture was performed in order to proliferate natural killer cells having the CD5-phenotype,
Interleukin-21 was added to the in vitro expansion medium for the first 4 days of in vitro culture; Added to in vitro expansion medium for 6-11 days after in vitro culture; And adding them to the cell extracellular amplification medium for 13 to 18 days after initiation of the in vitro culture. 제1항에 있어서, 상기 1단계의 분리는 불연속 밀도구배 방법을 수행하여 개 자연살해세포를 포함하는 단핵구세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 개 자연살해세포 체외 배양방법.The method according to claim 1, wherein the separation in the first step is carried out by a discontinuous density gradient method to separate mononuclear cells containing the natural killer cells. 제1항에 있어서, 상기 개 자연살해세포 체외 증폭 배지는 10 ~ 500 U/㎖의 인터루킨-2 및 2 ~ 10 ng/㎖의 인터루킨-15를 포함하는 것을 특징으로 하는 개 자연살해세포 체외 배양방법.2. The method according to claim 1, wherein the natural killer cell extracorporeal medium comprises 10 to 500 U / ml of interleukin-2 and 2 to 10 ng / ml of interleukin-15. . 제1항에 있어서, 상기 개 자연살해세포 체외 증폭 배지는 100 중량부의 인터루킨-21에 대하여 50 ~ 200 중량부의 인터루킨-15 및 10,000,000 ~ 100,000,000 중량부의 인터루킨-2를 포함하는 개 자연살해세포 체외 배양방법.2. The method according to claim 1, wherein the natural killer cell extracorporeal medium comprises 50 to 200 parts by weight of interleukin-15 and 100,000 to 100,000,000 parts by weight of interleukin-2 relative to 100 parts by weight of interleukin-21. . 제1항에 있어서, 상기 인터루킨-21의 첨가는 체외 증폭 배지에 인터루킨-21의 함유량이 2 ~ 10 ng/㎖로 유지하도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 개 자연살해세포 체외 배양방법.2. The method according to claim 1, wherein the addition of the interleukin-21 is carried out so that the content of interleukin-21 in the extracorporeal medium is maintained at 2 to 10 ng / ml. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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