JP6073417B2

JP6073417B2 - Spontaneous killing cell proliferation method and composition for spontaneous killing cell proliferation

Info

Publication number: JP6073417B2
Application number: JP2015128928A
Authority: JP
Inventors: ソクバク，ヨン; チョイ，ミキョン; ラカン，ユ
Original assignee: チャバイオテックカンパニーリミテッド
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: JP2017012010A

Description

本発明は、自然殺害細胞増殖方法、及びその増殖用組成物、並びに増殖された自然殺害細胞の抗癌効果増大に関する。 The present invention relates to a method for proliferating spontaneously killed cells, a composition for proliferation thereof, and an increase in the anticancer effect of the naturally killed cells grown.

免疫細胞治療法に利用されている自然殺害細胞（natural killer cell、「ＮＫ細胞」ともする）は、形態学的に、細胞質に大きい顆粒を有する細胞であり、血液内リンパ球の約５〜１５％を占める。現在まで明らかにされたＮＫ細胞の主要機能としては、腫瘍細胞を殺害することができる能力、ウイルス感染細胞に対する細胞毒性、及び細菌及び真菌を殺害する能力などがある。従って、ＮＫ細胞は、抗腫瘍、免疫、及び微生物に対する保護免疫に係わり、重要な役割を行うものであると期待される。 Natural kill cells (also referred to as “NK cells”) used in immune cell therapy are cells having large granules in the cytoplasm, morphologically about 5-15 of the lymphocytes in the blood. %. The major functions of NK cells that have been revealed to date include the ability to kill tumor cells, cytotoxicity against virus-infected cells, and the ability to kill bacteria and fungi. Therefore, NK cells are expected to play an important role in anti-tumor, immunity, and protective immunity against microorganisms.

ＮＫ細胞は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４または免疫グロブリンのような細胞表面受容体を有しておらず、既存のＴ細胞及びＢ細胞とは異なる独特の免疫細胞と分類される。特に、ＮＫ細胞は、非特異的に癌を殺傷することができる能力がある細胞として知られている。このようなＮＫ細胞の殺害能力は、リンホカイン活性殺生細胞（ＬＡＫ：lymphokine activated killer cell）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：tumor infiltration lymphocytes）と共に、固形癌治療に活用されたり、あるいは供与者リンパ球注入（donor lymphocyte infusion）を介した免疫治療法（非特許文献１）を遂行することにより、骨髄移植時や臓器移植時に発生する拒絶反応を防止するための新たな細胞治療法に応用される。また、ＮＫ細胞の分化及び活性における欠陥は、乳癌（非特許文献２）、黒色腫癌（非特許文献３）、肺癌（非特許文献４）など多様な癌疾患と関連していると報告されている。そのような意味において、かような疾患の治療分野において、ＮＫ細胞治療法が注目されている。 NK cells do not have cell surface receptors such as T cell receptors, CD4 or immunoglobulins, and are classified as unique immune cells that are different from existing T and B cells. In particular, NK cells are known as cells capable of killing cancer non-specifically. Such killing ability of NK cells is utilized for treatment of solid cancer together with lymphokine activated killer cells (LAK) and tumor infiltration lymphocytes (TIL), or donor lymphocyte injection By performing an immunotherapy (non-patent document 1) via (donor lymphocyte infusion), it is applied to a new cell therapy for preventing rejection that occurs during bone marrow transplantation or organ transplantation. In addition, defects in differentiation and activity of NK cells have been reported to be associated with various cancer diseases such as breast cancer (Non-patent document 2), melanoma cancer (Non-patent document 3), and lung cancer (Non-patent document 4). ing. In such a sense, NK cell therapy has attracted attention in the field of treatment of such diseases.

ＮＫ細胞を、抗癌など免疫細胞治療に効果的に利用するためには、多数のＮＫ細胞確保が要求される。しかし、前述のように、ＮＫ細胞は、健常者の場合にも、血液内リンパ球の５〜１５％に過ぎず、癌患者においては、ＮＫ細胞の数、分化及び機能が頻繁に低下しており、事実上、疾病治療のために十分な細胞数の確保が困難な実情である。また、既存に開発されたＮＫ細胞の増殖方法によって得られたＮＫ細胞は、増殖率及び細胞毒性（cytotoxicity）活性能において、多様な偏差が存在する。従って、十分な癌細胞殺傷能を維持するＮＫ細胞の多量確保のための新たなＮＫ細胞の増殖方法または分化方法が切実に要求されている。 In order to effectively use NK cells for immune cell therapy such as anti-cancer, it is necessary to secure a large number of NK cells. However, as described above, NK cells are only 5 to 15% of blood lymphocytes even in healthy individuals, and in cancer patients, the number, differentiation and function of NK cells are frequently reduced. In fact, it is difficult to secure a sufficient number of cells for disease treatment. In addition, NK cells obtained by existingly developed NK cell proliferation methods have various deviations in proliferation rate and cytotoxicity activity. Therefore, there is an urgent need for a new NK cell proliferation method or differentiation method for securing a large amount of NK cells that maintain sufficient cancer cell killing ability.

Tilden. A. B. et al., J. Immunol., 136Tilden. A. B. et al., J. Immunol., 136 KonjevicG, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001KonjevicG, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001 Ryuke Y, et al., Melanoma Res., 13: 349-356, 2003Ryuke Y, et al., Melanoma Res., 13: 349-356, 2003 Villegas FR, et al., Lung Cancer, 35: 23-28, 2002Villegas FR, et al., Lung Cancer, 35: 23-28, 2002

本発明が解決しようとする課題は、抗癌効果が向上された自然殺害（ＮＫ）細胞の増殖方法を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide a method for proliferating spontaneous killing (NK) cells with improved anticancer effects.

本発明が解決しようとする課題はまた、自然殺害細胞増殖用組成物を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is also to provide a composition for multiplying spontaneously killed cells.

前記課題を解決するために本発明は、自然殺害（ＮＫ）細胞を、第１インターロイキン、第２インターロイキン及び抗ＮＫｐ４６抗体を含む培養液で培養する段階を含む自然殺害細胞増殖方法を提供している。 In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method for proliferating spontaneous killing cells, comprising culturing natural killing (NK) cells in a culture medium containing a first interleukin, a second interleukin and an anti-NKp46 antibody. ing.

前記課題を解決するために本発明はまた、第１インターロイキン、第２インターロイキン及び抗ＮＫｐ４６抗体を含む自然殺害細胞増殖用の組成物を提供する。 In order to solve the above problems, the present invention also provides a composition for spontaneous killing cell proliferation comprising a first interleukin, a second interleukin and an anti-NKp46 antibody.

本発明による自然殺害（ＮＫ）細胞増殖方法、または自然殺害細胞増殖用の組成物は、自然殺害細胞増殖及び分化を促進させることができ、細胞毒性活性が増大した自然殺害細胞を安定して提供することができる。また、これによって製造された自然殺害細胞は、抗癌治療など疾病治療に有用に利用される。 The natural killing (NK) cell proliferation method or the composition for natural killing cell proliferation according to the present invention can promote natural killing cell proliferation and differentiation, and stably provide natural killing cells having increased cytotoxic activity. can do. In addition, the naturally killed cells produced thereby are usefully used for disease treatment such as anticancer treatment.

本発明の一具体例による増殖方法によって得られた総細胞数の結果である。3 is a result of total cell number obtained by a growth method according to an embodiment of the present invention. 本発明の一具体例による増殖方法によって得られたＮＫ細胞数（Ｂ）の増殖倍数の結果である。It is a result of the multiplication factor of the number of NK cells (B) obtained by the proliferation method according to an embodiment of the present invention. 多様な具体例による増殖方法によって得られた総細胞数の結果である。FIG. 6 is a result of total cell number obtained by a proliferation method according to various embodiments. 多様な具体例による増殖方法によって得られたＮＫ細胞の比率結果である。FIG. 6 is a ratio result of NK cells obtained by a proliferation method according to various specific examples. FIG. ＩＬ−２濃度によるＮＫ細胞増殖効果を示す結果である。It is a result which shows the NK cell proliferation effect by IL-2 density | concentration. ＩＬ−１２濃度によるＮＫ活性を示す結果である。It is a result which shows NK activity by IL-12 density | concentration. ＩＬ−１８濃度によるＮＫ活性を示す結果である。It is a result which shows NK activity by IL-18 density | concentration. 本発明の一具体例による増殖方法によって得られたＮＫ細胞の流細胞分析結果である。It is a flow cytometry result of the NK cell obtained by the proliferation method by one specific example of this invention. 一具体例によって得られたＮＫ細胞の活性化受容体を、流細胞分析器を利用して示す結果である。It is the result which shows the activated receptor of the NK cell obtained by one specific example using a flow cytoanalyzer. 一具体例によって得られたＮＫ細胞において、抗癌物質の発現を確認するための流細胞分析結果を示すグラフである。It is a graph which shows the flow-cell analysis result for confirming the expression of an anticancer substance in the NK cell obtained by one specific example. 多様な具体例によって得られたＮＫ細胞の白血病細胞株であるＫ５６２細胞に対する癌細胞殺傷度（cell lysis）％を、流細胞分析方法で評価した結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having evaluated the cancer cell killing degree (cell lysis%) with respect to K562 cell which is a leukemia cell line of the NK cell obtained by various specific examples by the flow cell analysis method. 一具体例によって得られたＮＫ細胞の癌細胞殺傷度（cell lysis）％を、流細胞分析方法で評価した結果を示し、Ｋ５６２（慢性白血病）、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝臓癌）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）、Ａ７０４（腎臓癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）に対する癌細胞殺傷度に係るものである。FIG. 7 shows the results of evaluation of the NK cell cancer lysis% obtained by one specific example using a flow cytometric analysis method, K562 (chronic leukemia), OVCAR3 (ovarian cancer), Hep3B (liver cancer), This relates to the degree of cancer cell killing against HepG2 (liver cancer), A704 (kidney cancer), and DU145 (prostate cancer). Donor １における培養前ＰＢＭＣ特性のうち、ＮＫ細胞（Ｑ９，ＣＤ３−ＣＤ５６＋）の比率を示す図面である。It is drawing which shows the ratio of NK cell (Q9, CD3-CD56 +) among the PBMC characteristics before culture in Donor 1. Donor １における培養前ＰＢＭＣ特性のうち、ＣＤ１６が発現するＮＫ細胞（Ｑ２，ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋）を示す。Among the pre-culture PBMC characteristics in Donor 1, NK cells (Q2, CD16 + CD56 +) expressing CD16 are shown. Donor １における培養前ＰＢＭＣ特性のうち、Ｂ細胞（Ｑ５，ＣＤ３−ＣＤ１９＋）を示す図面である。It is drawing which shows B cell (Q5, CD3-CD19 +) among the PBMC characteristics before culture in Donor 1. Donor １における培養前ＰＢＭＣ特性のうち、Ｋ５６２細胞において、cytotoxicity（７ＡＡＤ＋，Ｅ：Ｔ＝１０：１）を示す図面である。It is drawing which shows cytotoxicity (7AAD +, E: T = 10: 1) in K562 cell among the PBMC characteristics before culture | cultivation in Donor 1. FIG. Donor １の凍結及び解凍の過程を経たＰＢＭＣにおいて、１４日培養した細胞の特性のうち、ＮＫ細胞（Ｑ５，ＣＤ３−ＣＤ５６＋）の比率を示す図面である。4 is a graph showing the ratio of NK cells (Q5, CD3-CD56 +) among the characteristics of cells cultured for 14 days in PBMC that has undergone the process of freezing and thawing Donor 1. Donor １の凍結及び解凍の過程を経たＰＢＭＣにおいて、１４日培養した細胞の特性のうち、ＣＤ１６が発現するＮＫ細胞（Ｑ１０，ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋）を示す図面である。It is drawing which shows NK cell (Q10, CD16 + CD56 +) in which CD16 expresses among the characteristics of the cell cultured for 14 days in PBMC which passed through the process of freezing and thawing of Donor 1. Donor １の凍結及び解凍の過程を経たＰＢＭＣにおいて、１４日培養した細胞の特性のうち、Ｂ細胞（Ｑ１，ＣＤ３−ＣＤ１９＋）を示す図面である。It is drawing which shows B cell (Q1, CD3-CD19 +) among the characteristics of the cell cultured for 14 days in PBMC which passed through the process of freezing and thawing | donating Donor 1. FIG. Donor １の凍結及び解凍の過程を経たＰＢＭＣにおいて、１４日培養した細胞の特性のうち、Ｋ５６２細胞におけるcytotoxicity（７ＡＡＤ＋，Ｅ：Ｔ＝１０：１）を示す図面である。It is drawing which shows cytotoxicity (7AAD +, E: T = 10: 1) in K562 cell among the characteristics of the cell cultured for 14 days in PBMC which passed through the process of freezing and thawing | donating Donor 1. FIG.

本発明の一様態は、ＮＫ（natural killer）細胞を、第１インターロイキン（ＩＬ）、第２インターロイキン及び抗ＮＫｐ４６抗体を含む培養液で培養する段階を含むＮＫ細胞増殖方法を提供する。 One embodiment of the present invention provides a method for proliferating NK cells, comprising culturing natural killer (NK) cells in a culture medium containing a first interleukin (IL), a second interleukin, and an anti-NKp46 antibody.

前記第１インターロイキンは、ＩＬ−２でもある。 The first interleukin is also IL-2.

前記第２インターロイキンは、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）からなる群から選択される１種以上のインターロイキンでもある。また望ましくは、前記第２インターロイキンは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、またはＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１８でもあり、さらに望ましくは、ＩＬ−１８である。 The second interleukin may be one or more interleukins selected from the group consisting of interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), and interleukin-18 (IL-18). is there. Also preferably, the second interleukin is IL-12, IL-18, IL-12 / IL-18, or IL-12 / IL-15 / IL-18, more preferably IL-18. is there.

前記ＮＫ細胞の培養は、ガンマグロブリン（ＩｇＧ）及びフィブロネクチンの存在の下に前記の第１インターロイキン、第２インターロイキン、及び抗ＮＫｐ４６抗体を含む培養液で培養することでもある。本発明の方法は、ＮＫ細胞をガンマグロブリン（ＩｇＧ）及びフィブロネクチンの存在下で培養することにより、ＮＫ細胞の抗癌効果がさらに向上する。 The culture of the NK cells is also performed by culturing in a culture medium containing the first interleukin, the second interleukin, and the anti-NKp46 antibody in the presence of gamma globulin (IgG) and fibronectin. In the method of the present invention, NK cells are cultured in the presence of gamma globulin (IgG) and fibronectin, whereby the anticancer effect of NK cells is further improved.

本明細書において、用語「細胞増殖」は、細胞が一連の細胞分裂段階を経て、培養物で細胞の数が増加したり、あるいは細胞が分化したりすることを意味する。用語「自然殺害細胞増殖」は、一連の細胞分裂段階を経て、培養物でＮＫ細胞の数が増加したり、あるいは未成熟血液細胞において、ＮＫ細胞への分化によって、ＮＫ細胞数が増加したりすることを意味する。従って、前記「自然殺害細胞増殖」は、前記ＮＫ細胞数の増加、または未分化のリンパ球細胞が、ＮＫ細胞の形質を獲得し、ＮＫ細胞で分化またはＮＫ細胞が未成熟状態で成熟ＮＫ細胞になる状態を含むことができる。 As used herein, the term “cell proliferation” means that a cell undergoes a series of cell division stages to increase the number of cells in a culture or to differentiate. The term “spontaneous killing cell proliferation” refers to an increase in the number of NK cells in a culture through a series of cell division stages, or an increase in the number of NK cells in immature blood cells by differentiation into NK cells. It means to do. Therefore, the “spontaneous killing cell proliferation” is the increase in the number of NK cells, or undifferentiated lymphocytes acquire NK cell traits, differentiated with NK cells, or mature NK cells with NK cells immature. Can be included.

前記増殖の原料になるＮＫ細胞は、商業的に購入するか、あるいはヒトまたは動物から採取することができ、望ましくは、ＮＫ細胞による治療を必要とするヒトから供給されてもよい。また、前記ＮＫ細胞は、生体内任意の組織供給源から供給されてもよい。例えば、前記自然殺害細胞は、生体から採取された血液中にも含まれる。前記血液は、ＮＫ細胞を含む血液であるならば、本発明のＮＫ細胞増殖方法に適用するためのＮＫ細胞供給源として利用可能であり、例えば、全血、臍帯血、骨髄または末梢血液でもある。 The NK cells that serve as the raw material for the proliferation can be purchased commercially or harvested from humans or animals and desirably supplied from humans in need of treatment with NK cells. The NK cell may be supplied from any tissue source in the living body. For example, the naturally killed cells are also contained in blood collected from a living body. If the blood is blood containing NK cells, it can be used as a source of NK cells for application to the NK cell proliferation method of the present invention, such as whole blood, umbilical cord blood, bone marrow or peripheral blood. .

前記自然殺害細胞増殖は、例えば、末梢血液単核細胞の培養を含んでもよい。用語「末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cells）」は、哺乳動物、望ましくは、ヒト末梢血液から分離された単核の細胞であり、主に、Ｂ細胞、Ｔ細胞、自然殺害細胞のような免疫細胞、及び好塩球（basophil）、好酸球（eosinophil）、好中球（neutrophil）のような顆粒球を含む。前記ＰＢＭＣは、生体から採取した末梢血液から、一般的な製造方法によって設けることができる。望ましくは、前記ＰＢＭＣは、フィコール（Ficoll）を利用した比重遠心分離法を利用して、末梢血液から分離することができる。 Said spontaneous killing cell proliferation may include, for example, culture of peripheral blood mononuclear cells. The term “peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)” are mononuclear cells isolated from mammalian, preferably human peripheral blood, mainly B cells, T cells, spontaneous killing cells. And granulocytes such as basophils, eosinophils, neutrophils. The PBMC can be provided from peripheral blood collected from a living body by a general manufacturing method. Preferably, the PBMC can be separated from peripheral blood using a specific gravity centrifugation method using Ficoll.

また、前記末梢血液単核細胞は、治療を必要とする個体から得られるもの、すなわち、自家（autologous）末梢血液単核細胞でもある。前記末梢血液単核細胞が、自家末梢血液単核細胞である場合、増殖されたＮＫ細胞集団において、一部Ｔ細胞が存在しても、全ての細胞が患者本人由来であるために、Ｔ細胞を除去する必要がないという長所がある。 The peripheral blood mononuclear cells are also those obtained from an individual in need of treatment, i.e., autologous peripheral blood mononuclear cells. When the peripheral blood mononuclear cells are autologous peripheral blood mononuclear cells, even if some T cells are present in the expanded NK cell population, all the cells are derived from the patient himself. There is an advantage in that it is not necessary to remove.

また、本発明のＮＫ細胞増殖方法に利用される末梢血液単核細胞は、凍結されて保存されたものでもある。一具体例において、前記末梢血液単核細胞は、血液で分離された後、凍結させた後、それをさらに解凍させ、ＮＫ細胞増殖に利用することができる。前記凍結は、従来公知の方法を利用することができ、望ましくは、４ないし−４２℃範囲の第１凍結段階、−４２ないし−１５℃範囲の第２凍結段階、及び−１５ないし−１２０℃範囲の第３凍結段階からなる凍結方法によって凍結される。その場合、各凍結段階は、温度範囲内のさまざまな不連続的温度で、順次に一定時間試料を維持させることにより、各凍結段階の温度範囲の上限線または下限線まで温度を昇降させる。一具体例において、第１凍結段階は、０℃で１０〜１５分、−１２℃で５〜１０分、及び−４２℃で０．５〜１分間の条件で凍結させ、前記第２凍結段階は、第１凍結段階後−２５℃で１〜３分、及び−１５℃で１〜３分の条件で凍結させ、前記第３凍結段階は、第２凍結段階後、−４２℃で２０〜４０分、及び−１２０℃で２０〜５０分の条件で凍結させる過程からなってもよい。他の具体例において、前記第１凍結段階は、４〜−４０℃範囲で、０．５〜５℃／ｍで凍結させ、前記第２凍結段階は、第１凍結段階後、−４０〜−９０℃範囲で、１〜１０℃／ｍの条件で凍結させ、前記第３凍結段階は、第２凍結段階後、−９０〜−１２０℃範囲で、１〜１０℃／ｍの条件で凍結させる過程からなる。凍結方法の各凍結段階は、ＣＲＦ（controlled rate freezer）によって遂行される。本発明の末梢血液単核細胞を凍結させる場合、分離した細胞をcryostor ＣＳ１０、またはＡＬｙＳ５０５ＮＫ−ＥＸとAlbumin＋ＤＭＳＯとの混合液で細胞を浮遊させ、適正な細胞数になるように調節した後で凍結することが望ましい。前記凍結保存された末梢血液単核細胞は、解凍後、本発明によるＮＫ細胞の培養及び増殖に提供され、凍結過程を経ることにより、患者から血液を採取した後、所望する時期に、培養過程及び増殖過程を介して使用することができるという長所を有する。ほとんどの免疫細胞治療剤は、臨床で効果的な細胞数を生産するために、培養期間を２週間設定することにより、培養期間を考慮し、患者が２週ごとに採血をしなければならないという負担があり、患者のコンディションによって、細胞培養に影響を及ぼしてしまう。しかし、本発明は、高い生存率を維持し、活性化されたＮＫ細胞の培養方法に効果的に適用することができる末梢血液単核細胞の凍結方法及び解凍方法を提供する。それによって、患者のコンディションの良好時に、多量の血液を確保し、分離した後で凍結させて保管しておくことができ、患者のコンディションに係わりなく、規則的にＮＫ細胞の生産及び投与が可能になる。 The peripheral blood mononuclear cells used in the NK cell proliferation method of the present invention are also frozen and stored. In one embodiment, the peripheral blood mononuclear cells can be separated from the blood, frozen, and then thawed for use in NK cell proliferation. For the freezing, a conventionally known method can be used. Preferably, the first freezing step in the range of 4 to -42 ° C, the second freezing step in the range of -42 to -15 ° C, and -15 to -120 ° C. It is frozen by a freezing method consisting of a third freezing stage of the range. In that case, each freezing step raises or lowers the temperature to the upper or lower limit line of the temperature range of each freezing step by sequentially maintaining the sample for a certain time at various discontinuous temperatures within the temperature range. In one embodiment, the first freezing step includes freezing at 0 ° C. for 10 to 15 minutes, −12 ° C. for 5 to 10 minutes, and −42 ° C. for 0.5 to 1 minute, and the second freezing step Is frozen at −25 ° C. for 1 to 3 minutes and −15 ° C. for 1 to 3 minutes after the first freezing step, and the third freezing step is after the second freezing step at −42 ° C. for 20 to 20 minutes. It may consist of a process of freezing for 40 minutes and at −120 ° C. for 20 to 50 minutes. In another embodiment, the first freezing step is frozen at 0.5 to 5 ° C / m in the range of 4 to -40 ° C, and the second freezing step is -40 to-after the first freezing step. The third freezing stage is frozen in the range of −90 to −120 ° C. in the range of −10 to 10 ° C./m after the second freezing stage. It consists of a process. Each freezing step of the freezing method is performed by a CRF (controlled rate freezer). When freezing the peripheral blood mononuclear cells of the present invention, the separated cells are suspended in a mixture of cryostor CS10 or AlyS505NK-EX and Albumin + DMSO, adjusted to an appropriate cell number, and then frozen. It is desirable. The cryopreserved peripheral blood mononuclear cells are provided for NK cell culture and proliferation according to the present invention after thawing, and after the blood is collected from the patient through the freezing process, the culture process is performed at a desired time. And has the advantage that it can be used through the growth process. Most immunocytotherapeutic agents require that the patient should collect blood every 2 weeks in consideration of the culture period by setting the culture period to 2 weeks in order to produce clinically effective cell numbers. It is burdensome and affects the cell culture depending on the patient's condition. However, the present invention provides a method for freezing and thawing peripheral blood mononuclear cells that maintain a high survival rate and can be effectively applied to a method for culturing activated NK cells. As a result, when the patient's condition is good, a large amount of blood can be secured, separated and stored frozen, and NK cells can be produced and administered regularly regardless of the patient's condition. become.

一様態によるＮＫ細胞の増殖方法は、ガンマグロブリン（ＩｇＧ）及びフィブロネクチンの存在下で、ＮＫ細胞を培養する。前記ガンマグロブリン及びフィブロネクチンの存在下での培養は、例えば、培養液中に、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンが含まれているか、または培養面（細胞と接触する培養容器の面）に、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンがコーティングされた培養容器で細胞を培養するものでもある。望ましくは、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンがコーティングされた培養容器中で、ＮＫ細胞を培養するものである。前記ガンマグロブリン及びフィブロネクチンがコーティングされた培養容器は、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンを含む溶液を加えてコーティングすることによって製作される。また、前記フィブロネクチンの代わりに、公知の接着タンパク質を使用することができ、例えば、コラーゲンなどを使用することができる。一実施例において、培養容器（例えば、Ｔ７５フラスコ）に、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンが含有された溶液を加えた後、低温（例えば、２〜４℃）でインキュベーションすることにより、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンで培養容器のコーティングを行うことができる。 According to one embodiment of the method for growing NK cells, NK cells are cultured in the presence of gamma globulin (IgG) and fibronectin. In the culture in the presence of gamma globulin and fibronectin, for example, gamma globulin and fibronectin are contained in the culture medium, or gamma globulin and fibronectin are present on the culture surface (surface of the culture vessel in contact with the cells). The cells are also cultured in a coated culture vessel. Desirably, NK cells are cultured in a culture vessel coated with gamma globulin and fibronectin. The culture vessel coated with gamma globulin and fibronectin is manufactured by adding and coating a solution containing gamma globulin and fibronectin. Moreover, a well-known adhesion protein can be used instead of the said fibronectin, for example, collagen etc. can be used. In one embodiment, the gamma globulin and fibronectin culture is performed by adding a solution containing gamma globulin and fibronectin to a culture vessel (eg T75 flask) and then incubating at a low temperature (eg 2-4 ° C.). The container can be coated.

前記ガンマグロブリンの濃度は、０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌまたは１〜１００ｎｇ／ｍｌである。ガンマグロブリンは、ＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩを刺激し、ＮＫ細胞を活性化させることができる。 The concentration of the gamma globulin is 0.1-1 ng / ml, 1-10 ng / ml, 10-100 ng / ml or 1-100 ng / ml. Gamma globulin can stimulate NK cell FcγRIII and activate NK cells.

前記フィブロネクチンの濃度は、０．１〜５０μｇ／ｍｌ、１〜５０μｇ／ｍｌ、５〜５０μｇ／ｍｌ、１０〜５０μｇ／ｍｌである。フィブロネクチンは、ＮＫ細胞の移動を促進し、細胞間の相互作用を円滑に行わせることができる。 The concentration of the fibronectin is 0.1-50 μg / ml, 1-50 μg / ml, 5-50 μg / ml, 10-50 μg / ml. Fibronectin can promote the movement of NK cells and facilitate the interaction between cells.

また、一様態によるＮＫ細胞増殖方法は、ＮＫ細胞を、第１インターロイキン（インターロイキン−２（ＩＬ−２））、第２インターロイキン（インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）からなる群から選択される１種以上のインターロイキン）、抗ＮＫｐ４６抗体を含む培養液で培養する。前記培養液は、通常の免疫細胞培養用培地に、抗ＮＫｐ４６抗体、第２インターロイキン及びＩＬ−２を含むものである。例えば、免疫細胞培養用培地としては、ＡＬｙＳ５０５ＮＫ−ＥＸ（Cell Science & Technology Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．，日本）、ＲＰＭＩ１６４０（Life technologies，米国）、ｘ−ｖｉｖｏ１０（Lonza，米国）、ＣｅｌｌＧｒｏＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，ドイツ）、ＫＢＭ（Kohjin ｂｉｏ，日本）などの培養液を使用することができる。前述の免疫細胞培養用培地に、前記ＮＫ細胞の抗ＮＫｐ４６抗体、第２インターロイキン及びＩＬ−２を加え、本発明の一様態で使用するための培養液を準備することができる。また、ＩＬ−２を含んで市販される免疫細胞培養用培地に、抗ＮＫｐ４６抗体及び第２インターロイキンを加えて準備することもできる。また前記培養液は、第２インターロイキン、抗ＮＫｐ４６抗体及びＩＬ−２を含む免疫細胞培養用培地であるならば、制限なしに使用される。 Moreover, the NK cell proliferation method according to one aspect is that NK cells are divided into first interleukin (interleukin-2 (IL-2)), second interleukin (interleukin-12 (IL-12), interleukin-15). (IL-15), one or more interleukins selected from the group consisting of interleukin-18 (IL-18)), and a culture solution containing an anti-NKp46 antibody. The culture solution contains an anti-NKp46 antibody, a second interleukin, and IL-2 in a normal immune cell culture medium. For example, as a culture medium for immune cell culture, AlyS505NK-EX (Cell Science & Technology Inst. Inc., Japan), RPMI 1640 (Life technologies, USA), x-vivo10 (Lonza, USA), CellGroSCGM (CellGenix, Germany), A culture solution such as KBM (Kohjin bio, Japan) can be used. The above-mentioned NK cell anti-NKp46 antibody, second interleukin and IL-2 can be added to the aforementioned immune cell culture medium to prepare a culture solution for use in one embodiment of the present invention. Alternatively, an anti-NKp46 antibody and a second interleukin may be added to a commercially available culture medium for immune cell culture containing IL-2. Moreover, if the said culture solution is a culture medium for immune cell cultures containing a 2nd interleukin, anti-NKp46 antibody, and IL-2, it will be used without a restriction | limiting.

前記培養液に含まれるＩＬ−２の濃度は、５００〜５，０００ＩＵ／ｍｌ、６００〜４，０００ＩＵ／ｍｌ、７００〜３，０００ＩＵ／ｍｌ、８００〜２，０００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，５００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，２００ＩＵ／ｍｌまたは１，０００〜１，２００ＩＵ／ｍｌである。前記ＩＬ−２は、ＮＫ細胞の成長を促進させることができる。 The concentration of IL-2 contained in the culture solution is 500 to 5,000 IU / ml, 600 to 4,000 IU / ml, 700 to 3,000 IU / ml, 800 to 2,000 IU / ml, 900 to 1,500 IU. / Ml, 900-1,200 IU / ml or 1,000-1,200 IU / ml. The IL-2 can promote the growth of NK cells.

前記培養液に含まれる抗ＮＫｐ４６抗体の濃度は、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、１〜１０μｇ／ｍｌまたは５〜１０μｇ／ｍｌである。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞の活性化受容体であり、それにより、本発明の抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫｐ４６を刺激してＮＫ細胞を活性化させることができる。 The concentration of the anti-NKp46 antibody contained in the culture solution is 0.1 to 10 μg / ml, 0.5 to 10 μg / ml, 1 to 10 μg / ml, or 5 to 10 μg / ml. NKp46 is an NK cell activation receptor, whereby the anti-NKp46 antibody of the present invention can stimulate NKp46 to activate NK cells.

前記培養液に含まれる第２インターロイキンの濃度は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、２０〜１００ｎｇ／ｍｌ、３０〜〜１００ｎｇ／ｍｌ、５０〜１００ｎｇ／ｍｌまたは７０〜１００ｎｇ／ｍｌである。本発明の第２インターロイキンは、ＮＫ細胞の増殖効率を高めるだけではなく、ＮＫ細胞の活性化（activation）を大きく増大させることができる成分である。従って、本発明は、ＩＬ−２及び抗ＮＫｐ４６抗体以外に、第２インターロイキンを利用することにより、ＩＬ−２及び抗ＮＫｐ４６抗体が有するＮＫ細胞の増殖及び活性化を補強させてシナジー効果を有するようになり、既存のＮＫ細胞増殖方法と比較し、さらに優秀なＮＫ細胞の増殖効果を有することができる。 The concentration of the second interleukin contained in the culture solution is 0.1-100 ng / ml, 1-100 ng / ml, 10-100 ng / ml, 20-100 ng / ml, 30-100 ng / ml, 50-100 ng. / Ml or 70-100 ng / ml. The second interleukin of the present invention is a component that not only increases the proliferation efficiency of NK cells but also can greatly increase the activation of NK cells. Therefore, the present invention reinforces the proliferation and activation of NK cells possessed by IL-2 and anti-NKp46 antibody by using the second interleukin in addition to IL-2 and anti-NKp46 antibody, and has a synergy effect. As a result, the NK cell proliferation effect can be further improved as compared with existing NK cell proliferation methods.

結局、本発明のＮＫ細胞増殖のための組成物に含まれる成分であるＩＬ−２、第２インターロイキン及び抗ＮＫｐ４６抗体の組み合わせは、ＮＫ細胞の増殖及び培養効率を極大化させることができ、最適化された最小の組成により、コスト面でも非常に節減効果にすぐれるといえる。 Eventually, the combination of IL-2, the second interleukin, and the anti-NKp46 antibody, which are components included in the composition for NK cell proliferation of the present invention, can maximize the proliferation and culture efficiency of NK cells, It can be said that the optimized minimum composition is very cost effective.

前記培養液は、血漿または血清をさらに含んでもよい。また、前記培養液に含まれる血漿または血清は、ＮＫ細胞培養のために利用されるＰＭＢＣを分離させた末梢血液から得ることができる。前記血漿の濃度は、全体培養液に対して、１〜２０ｖ／ｖ％、１〜１５ｖ／ｖ％、２〜１５ｖ／ｖ％、５〜１５ｖ／ｖ％または５〜１０ｖ／ｖ％でもある。 The culture medium may further contain plasma or serum. Moreover, the plasma or serum contained in the culture solution can be obtained from peripheral blood obtained by separating PMBC used for NK cell culture. The concentration of the plasma is 1-20 v / v%, 1-15 v / v%, 2-15 v / v%, 5-15 v / v%, or 5-10 v / v% with respect to the whole culture solution.

一具体例において、ＮＫ細胞が投与される患者の末梢血液から、ＰＢＭＣ及び血漿（または、血清）をそれぞれ分離し、得られたＰＢＭＣは、前記ＩＬ−２、第２インターロイキン、抗ＮＫｐ４６抗体、及び前記末梢血液から分離された血漿（または、血清）を含む培地中で培養される。また、前記培養は、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンがコーティングされた培養容器内で培養されることが望ましい。 In one embodiment, PBMC and plasma (or serum) are separated from the peripheral blood of a patient to which NK cells are administered, respectively, and the obtained PBMC is the IL-2, the second interleukin, the anti-NKp46 antibody, And cultured in a medium containing plasma (or serum) separated from the peripheral blood. The culture is preferably performed in a culture vessel coated with gamma globulin and fibronectin.

前記末梢血液単核細胞の培養は、一般的な細胞培養条件、すなわち、約３７℃、ＣＯ_２インキュベータで行われ、培養液を２日あるいは３日に１回ずつ添加しながら継続的に培養することができる。また、培地に加えられるＰＢＭＣの濃度は、４Ｘ１０^５〜５Ｘ１０^７cells／ｍｌの範囲でもあるが、それに制限されるものではない。培養期間は、例えば、７〜２０日間、８〜１８日間、１０〜１６日間、１０〜１５日または１０〜１４日間遂行されることができるが、それらに制限されるものではなく、所望するＮＫ細胞数の収得のために、前記培養日数の範囲内または範囲外で、適切に設定することができる。培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレート、培養バッグを含んでもよい。 The peripheral blood mononuclear cells are cultured in general cell culture conditions, that is, at about 37 ° C. in a CO ₂ incubator, and continuously cultured while adding the culture solution once every two days or three days. be able to. The concentration of PBMC added to the medium is also in the range of ⁴ × 10 ^{5 to 5} × 10 ⁷ cells / ml, but is not limited thereto. The culture period can be performed, for example, 7 to 20 days, 8 to 18 days, 10 to 16 days, 10 to 15 days, or 10 to 14 days, but is not limited thereto, and may be a desired NK. In order to obtain the number of cells, it can be appropriately set within or outside the range of the culture days. Culture vessels may include commercially available dishes, flasks, plates, multiwell plates, culture bags.

一方、ＮＫ細胞を最大限増殖させるために、培養は、各段階別に培養される。その場合、各培養段階は、培養液成分、培養容器及び培養期間が同一であってもよく、異なってもよく、各段階別最適の培養期間を求めることにより、最終的に、ＮＫ細胞の増殖が行われる。また、本発明は、培養期間の間、フラスコ内に、２〜３日間隔で、培養組成物（または、培養液）を追加して培養することを特徴とし、それにより、ＮＫ細胞の培養が効果的になされるように一助となる役割を行う。 On the other hand, in order to maximize the proliferation of NK cells, the culture is cultured for each stage. In this case, each culture stage may have the same culture solution component, culture vessel, and culture period, or may be different. By determining the optimum culture period for each stage, the growth of NK cells is finally achieved. Is done. Further, the present invention is characterized in that the culture composition (or culture solution) is additionally cultured in the flask at intervals of 2 to 3 days during the culture period, whereby NK cells can be cultured. Play a role that helps to be effective.

本発明のＮＫ細胞増殖方法は、一具体例において、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンがコーティングされた培養容器に、末梢血液単核細胞、並びに第１インターロイキン、第２インターロイキン、抗ＮＫｐ４６抗体、及び血漿を含む培養液を入れて培養する第１培養段階と、前記第１培養段階から得た培養物に、第１インターロイキン、第２インターロイキン、抗ＮＫｐ４６抗体、及び血漿を含む培養液をさらに添加して培養する第２培養段階と、を含んでもよい。前記増殖方法において、前記第１インターロイキンは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）でもある。また、前記第２インターロイキンは、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）からなる群から選択される１種以上のインターロイキンでもある。また、前記第１インターロイキン及び前記第２インターロイキンは、前述の通りである。 In one specific example, the NK cell proliferation method of the present invention comprises, in a culture vessel coated with gamma globulin and fibronectin, peripheral blood mononuclear cells, first interleukin, second interleukin, anti-NKp46 antibody, and plasma. A first culture stage in which the culture medium containing the culture medium is added, and a culture liquid containing the first interleukin, the second interleukin, the anti-NKp46 antibody, and plasma is further added to the culture obtained from the first culture stage. And a second culturing stage for culturing. In the proliferation method, the first interleukin is also interleukin-2 (IL-2). The second interleukin is one or more interleukins selected from the group consisting of interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), and interleukin-18 (IL-18). It's also Roykin. The first interleukin and the second interleukin are as described above.

前記血漿は、末梢血液単核細胞が由来する末梢血液から収得されるものでもある。前記血漿の代わりに、血清を使用することができる。 The plasma is also obtained from peripheral blood from which peripheral blood mononuclear cells are derived. Serum can be used in place of the plasma.

前記第１培養段階において、培養液に含まれるＩＬ−２の濃度は、５００〜５，０００ＩＵ／ｍｌ、６００〜４，０００ＩＵ／ｍｌ、７００〜３，０００ＩＵ／ｍｌ、８００〜２，０００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，５００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，２００ＩＵ／ｍｌまたは１，０００〜１，２００ＩＵ／ｍｌである。 In the first culture step, the concentration of IL-2 contained in the culture solution is 500 to 5,000 IU / ml, 600 to 4,000 IU / ml, 700 to 3,000 IU / ml, 800 to 2,000 IU / ml. 900 to 1,500 IU / ml, 900 to 1,200 IU / ml, or 1,000 to 1,200 IU / ml.

前記第１培養段階は、第１インターロイキン（ＩＬ−２）、第２インターロイキン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８からなる群から選択される１種以上のインターロイキン）、抗ＮＫｐ４６抗体、及び血漿を含む培養液内で、末梢血液単核細胞を、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日または１０日間培養することができ、例えば３日、４日、５日、６日、望ましくは、５日間培養することができる。 The first culturing step includes a first interleukin (IL-2), a second interleukin (one or more interleukins selected from the group consisting of IL-12, IL-15 and IL-18), anti-NKp46. Peripheral blood mononuclear cells can be cultured in a culture medium containing antibody and plasma for 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days, For example, it can be cultured for 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, preferably 5 days.

本発明によるＮＫ細胞増殖方法は、前記第１培養段階において、培養物に、ＩＬ−２、及び血漿を含む培養液を追加して添加する段階を含んでもよい。例えば、前記追加して添加されるＩＬ−２、及び血漿を含む培養液は、第１培養段階の培養３日目、及び／または培養４日目に添加することができる。前記追加して添加される培養液に含まれるＩＬ−２の濃度は、第１培養段階の培養液のＩＬ−２の濃度と同一であるが、それに制限されるものではない。また、添加される培養液の体積は、培養物の体積と同一である。 The NK cell proliferation method according to the present invention may include a step of additionally adding a culture solution containing IL-2 and plasma to the culture in the first culture step. For example, the additional culture medium containing IL-2 and plasma can be added on the third day of culture and / or the fourth day of culture in the first culture stage. The concentration of IL-2 contained in the additionally added culture solution is the same as the IL-2 concentration of the culture solution in the first culture stage, but is not limited thereto. Moreover, the volume of the culture solution added is the same as the volume of the culture.

本発明のＮＫ細胞細胞増殖方法は、一具体例において、第１培養段階から得た培養物に、第１インターロイキン（ＩＬ−２）、第２インターロイキン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８からなる群から選択される１種以上のインターロイキン）、抗ＮＫｐ４６抗体、及び血漿を含む培養液をさらに添加して培養する第２培養段階を含む。 In one specific example, the NK cell cell growth method of the present invention comprises adding a first interleukin (IL-2), a second interleukin (IL-12, IL-15 and IL) to the culture obtained from the first culture stage. A second culture stage in which a culture solution containing at least one interleukin selected from the group consisting of -18), an anti-NKp46 antibody, and plasma is further added and cultured.

前記第２培養段階は、第１培養段階の培養物を新たな容器に移して遂行される。前記新たな容器は、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンを含まない。前記第２培養段階培養液のＩＬ−２の濃度は、第１培養段階の培養液のＩＬ−２の濃度と同一であるが、それに制限されるものではない。また、前記第２培養段階において、培養液に含まれるＩＬ−２の濃度は、５００〜５，０００ＩＵ／ｍｌ、６００〜４，０００ＩＵ／ｍｌ、７００〜３，０００ＩＵ／ｍｌ、８００〜２，０００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，５００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，２００ＩＵ／ｍｌまたは１，０００〜１，２００ＩＵ／ｍｌである。前記第２培養段階において、培養物に添加される第１インターロイキン（ＩＬ−２）、第２インターロイキン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８からなる群から選択される１種以上のインターロイキン）、抗ＮＫｐ４６抗体、及び血漿を含む培養液は、培養物と同一の体積でもある。 The second culture stage is performed by transferring the culture of the first culture stage to a new container. The new container does not contain gamma globulin and fibronectin. The IL-2 concentration in the second culture stage culture solution is the same as the IL-2 concentration in the first culture stage culture solution, but is not limited thereto. In the second culturing step, the concentration of IL-2 contained in the culture solution is 500 to 5,000 IU / ml, 600 to 4,000 IU / ml, 700 to 3,000 IU / ml, 800 to 2,000 IU. / Ml, 900-1,500 IU / ml, 900-1,200 IU / ml or 1,000-1,200 IU / ml. In the second culturing step, at least one selected from the group consisting of a first interleukin (IL-2) and a second interleukin (IL-12, IL-15, IL-18) added to the culture The culture medium containing interleukin), anti-NKp46 antibody, and plasma is also the same volume as the culture.

前記第２培養段階は、培養液内で、細胞を１日、２日、３日、４日、５日または６日間培養することができ、望ましくは、１日、２日または３日間培養する。 In the second culturing step, the cells can be cultured for 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days or 6 days in the culture medium, and preferably 1 day, 2 days or 3 days. .

本発明のＮＫ細胞増殖方法は、培養物のＩＬ−２濃度を、培養物添加以前、濃度対比で、４／５ないし１／１０以下に低めた後で培養する第３培養段階を追加して含んでもよい。前記培養液内で、ＩＬ−２濃度を低めるのは、培養物に、ＩＬ−２を含まない培養液を添加することによって遂行される。前記第３培養段階において、添加される培養液は、血漿を含んでもよい。 In the NK cell proliferation method of the present invention, a third culture stage is added in which culture is performed after the IL-2 concentration of the culture is lowered to 4/5 to 1/10 or less of the concentration before the addition of the culture. May be included. In the culture solution, the IL-2 concentration is decreased by adding a culture solution not containing IL-2 to the culture. In the third culturing step, the added culture medium may include plasma.

前記第３培養段階において、培養物のＩＬ−２濃度は、１，５００〜１，３００ＩＵ／ｍｌ、１，３００〜１，０００ＩＵ／ｍｌ、１，０００〜６００ＩＵ／ｍｌ、６００〜５００ＩＵ／ｍｌ、５００〜４００ＩＵ／ｍｌ、４００〜３００ＩＵ／ｍｌ、３００〜２００ＩＵ／ｍｌ、２００〜１００ＩＵ／ｍｌである。 In the third culture step, the IL-2 concentration of the culture is 1,500-1,300 IU / ml, 1,300-1,000 IU / ml, 1,000-600 IU / ml, 600-500 IU / ml, 500-400 IU / ml, 400-300 IU / ml, 300-200 IU / ml, 200-100 IU / ml.

また、各培養段階の培養液には、ＮＫ細胞を増幅させる効果を阻害しないことを条件に、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物、その他成分が含まれてもよい。 In addition, the culture solution at each culture stage may contain appropriate proteins, cytokines, antibodies, compounds, and other components on the condition that the effect of amplifying NK cells is not inhibited.

一実施例において、本発明のＮＫ細胞増殖方法によって増殖されたＮＫ細胞は、ＰＢＭＣと比較し、高程度の抗癌物質を発現し、優秀な抗癌活性を示した（図７ないし図９を参照）。 In one example, NK cells grown by the NK cell proliferation method of the present invention expressed a high degree of anticancer substance and showed excellent anticancer activity compared to PBMC (see FIGS. 7 to 9). reference).

本発明の他の様態は、前記ＮＫ細胞増殖方法によって増殖されたＮＫ細胞を含む癌治療または予防用薬学的組成物を提供する。 Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising NK cells proliferated by the NK cell proliferation method.

前記薬学的組成物に含まれるＮＫ細胞の増殖方法は、前述の通りである。 The method for growing NK cells contained in the pharmaceutical composition is as described above.

前記癌は、白血病、乳癌、卵巣癌、脳癌、黒色腫岩、胃癌、肝臓癌、大腸癌または肺癌でもあるが、それらに限定されるものではない。 The cancer may be leukemia, breast cancer, ovarian cancer, brain cancer, melanoma rock, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, or lung cancer, but is not limited thereto.

前記薬学的組成物は、前記のＮＫ細胞増殖方法によって培養されたＮＫ細胞を含む細胞集団を含んでもよい。また、前記組成物は、前記の方法によって培養された細胞集団以外に、培養に利用された培養液または培養物を含んでもよい。また、前記組成物は、培養物から分離された細胞集団やサイトカインのような追加成分を含まない新たな培養液や生理食塩水を含んでもよい。前記新たな培養液は、ＮＫ細胞の培養に利用された培地のような組成を有する培地、または他の組成の培地が使用される。前記薬学的組成物において、ＮＫ細胞の投与量は、癌患者の状態及び体重、疾病の程度、投与形態、投与経路及び期間によって異なるが、例えば、１日１Ｘ１０^６ないし１Ｘ１０^９cells／ｋｇの用量、望ましくは、１Ｘ１０^７ないし１Ｘ１０^９cells／ｋｇの用量で投与される。前記投与は、一日に１回、または数回に分けて投与される。また、液剤、懸濁液、エマルジョンなどの液相単位製剤に製剤化される場合、やはり前記細胞濃度で患者に投与される。 The pharmaceutical composition may include a cell population containing NK cells cultured by the NK cell proliferation method. Moreover, the said composition may also contain the culture solution or culture utilized for culture | cultivation other than the cell population cultured by the said method. Moreover, the said composition may also contain the new culture solution and physiological saline which do not contain additional components, such as the cell population isolate | separated from the culture, and cytokine. As the new culture solution, a medium having a composition such as a medium used for culturing NK cells, or a medium having another composition is used. In the pharmaceutical composition, the dose of NK cells varies depending on the condition and weight of the cancer patient, the degree of illness, the administration form, the administration route and the period, for example, a dose of 1 × 10 ⁶ to 1 × 10 ⁹ cells / kg per day. Preferably, it is administered at a dose of 1 × 10 ⁷ to 1 × 10 ⁹ cells / kg. The administration is performed once a day or divided into several times. In addition, when formulated into a liquid unit preparation such as a solution, suspension, emulsion, etc., it is also administered to a patient at the aforementioned cell concentration.

本発明による薬学的組成物は、前述のように、本発明の方法によって増殖されたＮＫ細胞を含み、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。また、前記薬学的組成物は、通常の方法によって、液剤、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥剤などの非経口用剤形に製剤化される。前記薬学的に許容可能な担体は、リン酸緩衝食塩水、精製水、滅菌水などの水性希釈剤あるいは溶剤を含んでもよい。その他通常の保存剤などを含んでもよい。また、前記薬学的組成物は、前記ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞を含む細胞集団以外に、多様な抗腫瘍剤やその他治療剤を含んでもよい。 As described above, the pharmaceutical composition according to the present invention contains NK cells grown by the method of the present invention, and may further contain a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition is formulated into a parenteral dosage form such as a solution, suspension, emulsion, lyophilization agent and the like by a conventional method. The pharmaceutically acceptable carrier may contain an aqueous diluent or solvent such as phosphate buffered saline, purified water, sterilized water. Other conventional preservatives may also be included. The pharmaceutical composition may contain various antitumor agents and other therapeutic agents in addition to the NK cells or cell populations containing NK cells.

本発明のさらに他の様態は、第１インターロイキン（ＩＬ−２）、第２インターロイキン（インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）からなる群から選択される１種以上のインターロイキン）及び抗ＮＫｐ４６抗体を含むＮＫ細胞増殖用組成物を提供する。また、前記ＮＫ細胞増殖用組成物は、ガンマグロブリン、フィブロネクチンをさらに含んでもよい。前記組成物において、第１インターロイキン及び第２インターロイキンは、前述の通りである。 Still another aspect of the present invention includes a first interleukin (IL-2), a second interleukin (interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL -18) one or more interleukins selected from the group consisting of) and an anti-NKp46 antibody composition for proliferating NK cells. The NK cell proliferation composition may further contain gamma globulin and fibronectin. In the composition, the first interleukin and the second interleukin are as described above.

前記増殖用組成物において、ＩＬ−２濃度は、５００〜５，０００ＩＵ／ｍｌ、６００〜４，０００ＩＵ／ｍｌ、７００〜３，０００ＩＵ／ｍｌ、８００〜２，０００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，５００ＩＵ／ｍｌ、９００〜１，２００ＩＵ／ｍｌまたは１，０００〜１，２００ＩＵ／ｍｌである。 In the proliferation composition, the IL-2 concentration is 500 to 5,000 IU / ml, 600 to 4,000 IU / ml, 700 to 3,000 IU / ml, 800 to 2,000 IU / ml, 900 to 1,500 IU. / Ml, 900-1,200 IU / ml or 1,000-1,200 IU / ml.

前記増殖用組成物において、第２インターロイキンの濃度は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、２０〜１００ｎｇ／ｍｌ、３０〜〜１００ｎｇ／ｍｌ、５０〜１００ｎｇ／ｍｌまたは７０〜１００ｎｇ／ｍｌである。 In the proliferation composition, the concentration of the second interleukin is 0.1-100 ng / ml, 1-100 ng / ml, 10-100 ng / ml, 20-100 ng / ml, 30-100 ng / ml, 50- 100 ng / ml or 70-100 ng / ml.

前記増殖用組成物において、抗ＮＫｐ４６抗体の濃度は、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、１〜１０μｇ／ｍｌまたは５〜１０μｇ／ｍｌである。 In the proliferation composition, the concentration of the anti-NKp46 antibody is 0.1 to 10 μg / ml, 0.5 to 10 μg / ml, 1 to 10 μg / ml, or 5 to 10 μg / ml.

前記ＮＫ細胞増殖用組成物は、末梢血液単核細胞においてＮＫ細胞を、増殖または分化させるためのものである。 The composition for proliferating NK cells is for proliferating or differentiating NK cells in peripheral blood mononuclear cells.

前記ＮＫ細胞増殖用組成物は、血漿または血清をさらに含んでもよい。また、組成物に追加される血漿または血清は、ＮＫ細胞が分離された血液から得たことでもある。一具体例において、前記増殖用組成物に含まれる血漿は、末梢血液単核細胞が分離された末梢血液から得られるものである。 The NK cell proliferation composition may further contain plasma or serum. The plasma or serum added to the composition is also obtained from blood from which NK cells have been isolated. In one specific example, the plasma contained in the composition for proliferation is obtained from peripheral blood from which peripheral blood mononuclear cells have been separated.

前記増殖用組成物は、ガンマグロブリン、フィブロネクチン、第１インターロイキン（ＩＬ−２）、第２インターロイキン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８からなる群から選択される１種以上のインターロイキン）及び抗ＮＫｐ４６抗体成分以外に、ＰＢＭＣ培養、及びＮＫ細胞増殖のための必須成分またはその他担体、または補助剤を含んでもよい。 The composition for proliferation comprises at least one interleukin selected from the group consisting of gamma globulin, fibronectin, first interleukin (IL-2), second interleukin (IL-12, IL-15, IL-18). In addition to the component (leukin) and anti-NKp46 antibody, it may contain essential components or other carriers or adjuvants for PBMC culture and NK cell proliferation.

以下、本発明を実施例によって、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

実施例１．末梢血液単核細胞の準備
１．１．血液からの末梢血液単核細胞（ＰＭＢＣ）及び自家血漿の分離
血液は、健常者の静脈から採血して準備した。そのとき、採血容器は、ヘパリンが含まれた採血チューブを使用した。患者から採取した血液を、フィコール（Ficoll）（＃１７−１４４０〜０２，ＧＥ Healthcare、または同等以上）が込められたチューブ（＃３５２０７０，ＢＤ、または同等以上）２個に、それぞれ３０ｍｌずつ用心深く移して入れた。血液が込められたチューブを２，５００ｒｐｍで１０分間、break off状態で遠心分離した後、上層の血漿部分を新たなチューブに移し入れた。 Example 1. Preparation of peripheral blood mononuclear cells
1.1. Peripheral blood mononuclear cells (PMBC) and autologous plasma separated from blood were prepared by drawing blood from a healthy person's vein. At that time, a blood collection tube containing heparin was used as the blood collection container. 30ml each of the blood collected from the patient is carefully transferred to two tubes (# 352070, BD, or equivalent) containing Ficoll (# 17-1440-02, GE Healthcare, or equivalent). I put it in. The tube containing the blood was centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes in a break off state, and then the upper plasma portion was transferred to a new tube.

移し入れた血漿を、ヒートブロック（heat block）で３０分間不活性化させた後、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離されたチューブにおける上澄み液を、新たなチューブに移し、血漿と表記した後、２〜８℃で保管した。 The transferred plasma was inactivated with a heat block for 30 minutes and then centrifuged at 4,000 rpm for 5 minutes. The supernatant in the centrifuged tube was transferred to a new tube, labeled plasma, and stored at 2-8 ° C.

前記血液とフィコールとを入れて遠心分離したチューブから血漿を採取し、残った下層にある薄黄色層を、新たなチューブに、赤血球層と混入しないように、注意して移し入れた後、Ｃａ／Ｍｇ遊離（free）ＤＰＢＳ（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline）（＃１４１９０，Gibco）を入れた。その後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。上澄み液を除去して残った沈澱細胞を、ＲＢＣ溶解バッファ（red blood cell lysis buffer）（＃１５８９０４，Qiagen）５ｍｌに浮遊させた。その後、細胞懸濁液を、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去し、上澄み液が除去されたチューブに、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳを入れ、さらに１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を除去されて残った沈澱細胞を、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ（＃０１４１０Ｐ１０，ＣＳＴＩ）培地１ｍｌに浮遊させた。 Plasma is collected from the tube into which the blood and Ficoll have been added and centrifuged, and the remaining light yellow layer in the lower layer is carefully transferred to a new tube so as not to be mixed with the red blood cell layer. / Mg free (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) (# 14190, Gibco) was added. Then, after centrifuging at 1,500 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed. The precipitated cells remaining after removing the supernatant were suspended in 5 ml of RBC lysis buffer (# 158904, Qiagen). Thereafter, the cell suspension is centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, the supernatant is removed, Ca / Mg free DPBS is placed in the tube from which the supernatant is removed, and further centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. did. The remaining precipitated cells after removing the supernatant were suspended in 1 ml of Alys505NK-EX (# 01410P10, CSTI) medium.

前記Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸに浮遊させた細胞懸濁液から少量を取り、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳで、前記量の１００倍に希釈した後、希釈液少量を取り、同一ボリュームのトリパンブルーと混ぜた後、血球計算板（hemocytometer）に載せ、細胞数及び生存率を測定した。 After taking a small amount from the cell suspension suspended in the Alys505NK-EX and diluting with Ca / Mg free DPBS to 100 times the amount, taking a small amount of the diluted solution and mixing it with the same volume of trypan blue, The cell number and viability were measured by placing on a hemocytometer.

１．２．ＰＢＭＣの凍結
前記実施例１．１．で得られる全ての細胞懸濁液を、１，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。２ないし８℃で保管しておいたCryostor ＣＳ１０またはＡＬｙＳ５０５ＮＫ−ＥＸ＋Albumin＋ＤＭＳＯ混合液に細胞を浮遊させ、細胞数が１〜１００×１０^６cells／ｍｌになるようにした。浮遊した細胞を２ｍｌ凍結バイアル（cryogenic vial）に１ｍｌずつ分注した後、ＣＲＦ（controlled rate freezers）を使用し、０℃で１０〜１５分間の条件、−１２℃で５〜１０分間の条件、及び−４２℃で０．５〜１分間の条件で、第１段階凍結させ、第１凍結段階後、−２５℃で１〜３分の条件、及び−１５℃で１〜３分の条件で凍結させ、第２凍結段階後、−４２℃で２０〜４０分の条件、及び−１２０℃で２０〜５０分の条件で凍結させるか、あるいは４〜−４０℃範囲で３℃／ｍで、第１段階凍結し、第１凍結段階後、−４０〜−９０℃範囲で５℃／ｍの条件で、第２段階凍結させ、第２凍結段階後、−９０〜−１２０℃範囲で５℃／ｍの条件で凍結させた。凍結した細胞をＬＮ_２タンクに移して保管した（−１３０℃以下）。 1.2. Freezing of PBMC Example 1.1. After centrifuging all the cell suspensions obtained in 1,500 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed. Cells were suspended in a mixture of Cryostor CS10 or AlyS505NK-EX + Albumin + DMSO stored at 2 to 8 ° C. so that the number of cells was 1 to 100 × 10 ⁶ cells / ml. After 1 ml of the suspended cells were dispensed into a 2 ml cryogenic vial, using CRF (controlled rate freezers), conditions of 10-15 minutes at 0 ° C, conditions of -12 ° C for 5-10 minutes, And the first stage freezing at −42 ° C. for 0.5 to 1 minute. After the first freezing stage, at −25 ° C. for 1 to 3 minutes and at −15 ° C. for 1 to 3 minutes. Freeze and after the second freezing stage, freeze at -42 ° C for 20-40 minutes and -120 ° C for 20-50 minutes, or 3 ° C / m in the 4-40 ° C range, Freeze in the first stage, and after the first freezing stage, freeze in the second stage under the condition of 5 ° C./m in the range of −40 to −90 ° C., and after the second freezing stage, in the range of −90 to −120 ° C. / M. The frozen cells were transferred to an LN ₂ tank and stored (−130 ° C. or lower).

１．３．凍結されたＰＢＭＣの解凍
ヒートブロックを３７℃になるようにセッティングした後、Ｔフラスコに、１０％血漿（plasma）が添加された培養液を入れた。細胞濃度によって、培養液ボリュームは、例えば、４ｍｌ、６ｍｌ、８ｍｌ、１０ｍｌなどに多様に調節する。前記実施例１．２．で凍結しておいた凍結バイアルをヒートブロックに入れ、凍結されたＰＢＭＣを解かした。凍結されたＰＢＭＣが半分ほど解けたとき、培養液が込められたＴフラスコに移した。次に、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータに入れ、一日の間培養した。培養されたＰＢＭＣをチューブに集めた後、Ｃａ／Ｍｇfree ＤＰＢＳを添加し、１，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。遠心分離によって分離された細胞を、少量の培養液に浮遊させた後、細胞数を測定した。凍結保管された細胞の解凍後、生存率は、表１に記載する。表１から分かるように、本発明によって凍結保管された後で解凍したＰＭＢＣは、９３％以上が生存しており、高い生存率が維持されるということを確認することができた。

1.3. A frozen PBMC thawing heat block was set to 37 ° C., and a culture solution supplemented with 10% plasma was added to a T-flask. Depending on the cell concentration, the volume of the culture solution is variously adjusted to 4 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, and the like. Example 1.2. The frozen vial that had been frozen in (1) was placed in a heat block, and the frozen PBMC was thawed. When half of the frozen PBMC was thawed, it was transferred to a T-flask containing the culture medium. Next, it was placed in a 37 ° C., 5% CO ₂ incubator and cultured for one day. After the cultured PBMCs were collected in a tube, Ca / Mgfree DPBS was added and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed. After the cells separated by centrifugation were suspended in a small amount of culture solution, the number of cells was measured. After thawing of the cryopreserved cells, the viability is listed in Table 1. As can be seen from Table 1, more than 93% of the PMBC thawed after being frozen and stored according to the present invention was alive, and it was confirmed that a high survival rate was maintained.

実施例２．ＮＫ細胞の培養
２．１．フィブロネクチン及びガンマグロブリンでコーティングされた培養フラスコの準備
２．１．１．フィブロネクチン培養フラスコ及びガンマグロブリンコーティング培養フラスコ（１）
１５ｍｌチューブに、０．１ｍｌフィブロネクチン（＃ＦＣ−０１０，Millipore）及び０．１２１ｍｌガンマグロブリン（＃０２０Ａ１００４，緑十字）を入れた後、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳ９．７７９ｍｌを添加した。製造されたコーティング液を、ピペットを利用して、Ｔ７５フラスコ（＃１５６４９９，Ｎｕｎｃ）に入れ、１６時間以上２〜８℃で反応させた。細胞培養前、残余コーティング液をＣａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳで洗浄した後で除去した。 Example 2 Culture of NK cells
2.1. Preparation of culture flasks coated with fibronectin and gamma globulin
2.1.1. Fibronectin culture flask and gamma globulin coated culture flask (1)
After adding 0.1 ml fibronectin (# FC-010, Millipore) and 0.121 ml gamma globulin (# 020A1004, green cross) to a 15 ml tube, 9.779 ml of Ca / Mg free DPBS was added. The produced coating solution was put into a T75 flask (# 156499, Nunc) using a pipette and allowed to react at 2-8 ° C. for 16 hours or more. Prior to cell culture, the remaining coating solution was removed after washing with Ca / Mg free DPBS.

２．１．２．フィブロネクチン培養フラスコ及びガンマグロブリンコーティング培養フラスコ（２）
実施例２．１．１において、フィブロネクチンの量１０μｌ、ガンマグロブリンの量１．２１ｍｌのみを異ならせ、実施例２．１．１と同一に、フィブロネクチン及びガンマグロブリンでコーティングされた培養フラスコを準備した。 2.1.2. Fibronectin culture flask and gamma globulin coated culture flask (2)
A culture flask coated with fibronectin and gamma globulin was prepared in the same manner as in Example 2.1.1 except that the amount of fibronectin was 10 μl and the amount of gamma globulin was 1.21 ml. .

２．１．３．フィブロネクチン・コーティング培養フラスコ
１５ｍｌチューブに、０．２ｍｌフィブロネクチン（＃ＦＣ−０１０，Millipore）を入れ、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳに１０ｍｌになるまで加えた。その後、実施例２．１．１．と同一の過程によって、フィブロネクチンだけでコーティングされた培養フラスコを準備した。 2.1.3. A 15 ml fibronectin-coated culture flask was charged with 0.2 ml fibronectin (# FC-010, Millipore) and added to Ca / Mg free DPBS to 10 ml. Thereafter, Example 2.1.1. A culture flask coated with fibronectin alone was prepared by the same process.

２．２．ＮＫ細胞の一次培養
２．２．１．ＮＫ細胞の一次培養（１）
実施例１で用意した細胞懸濁液を取り、前記実施例２．１．で製造されたコーティングフラスコに入れ、自家血漿１．５ｍｌ、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．０３ｍｌ、ＩＬ−１８（＃Ｂ００３−２，Ｒ＆Ｄ）０．０７５ｍｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ（＃０１４１０Ｐ１０，ＣＳＴＩ）１３．４６２５ｍｌを添加し、ＣＯ_２インキュベータで２〜３日間培養した。その後、フラスコに、自家血漿１．５ｍｌ及びＡｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ１３．５ｍｌを添加し、ＣＯ_２インキュベータで１〜２日間培養した。 2.2. Primary culture of NK cells
2.2.1. Primary culture of NK cells (1)
The cell suspension prepared in Example 1 was taken and the Example 2.1. In a coating flask prepared in Step 1, 1.5 ml of autologous plasma, 0.03 ml of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution, 0.075 ml of IL-18 (# B003-2, R & D), Alys505NK-EX (# 01410P10, (CSTI) 13.4625 ml was added and cultured in a CO ₂ incubator for 2-3 days. Thereafter, 1.5 ml of autologous plasma and 13.5 ml of Alys505NK-EX were added to the flask and cultured in a CO ₂ incubator for 1-2 days.

２．２．２．ＮＫ細胞の一次培養（２）
実施例２．２．と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（同上）溶液を３μｌ、ＩＬ−１８（同上）を３７．５μｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸを２回添加し、総３５．９５ｍｌを使用したことだけ異にして実施した。 2.2.2. Primary culture of NK cells (2)
Example 2.2. All procedures are the same except that 3 μl of anti-NKp46 (same as above) solution, 37.5 μl of IL-18 (same as above), Alys505NK-EX was added twice, and a total of 35.95 ml was used. Carried out.

２．２．３．ＮＫ細胞の一次培養（３）
実施例２．２．と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（同上）溶液を１５μｌ、ＩＬ−１２（＃５５４６１３，ＢＤ）を７．５μｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸを２回添加し、総２６．９８ｍｌを使用したことだけ異にして実施した。 2.2.3. Primary culture of NK cells (3)
Example 2.2. All procedures were the same, but 15 μl of anti-NKp46 (same as above) solution, 7.5 μl of IL-12 (# 554613, BD), Alys505NK-EX were added twice, and a total of 26.98 ml was used. Only the difference was carried out.

２．２．４．ＮＫ細胞の一次培養（４）
実施例２．２．と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（同上）溶液を１５μｌ、ＩＬ−１２（同上）を７．５μｌ、ＩＬ−１８（同上）を３７．５μｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸを２回添加し、総２６．９４ｍｌを使用したことだけ異にして実施した。 2.2.4. Primary culture of NK cells (4)
Example 2.2. All procedures are the same, but 15 μl of anti-NKp46 (same as above) solution, 7.5 μl of IL-12 (same as above), 37.5 μl of IL-18 (same as above), and Alys505NK-EX were added twice. The procedure was different except that a total of 26.94 ml was used.

２．２．５．ＮＫ細胞の一次培養（５）
実施例２．２．と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（同上）溶液を０．０３ｍｌ、ＩＬ−１２（同上）を７．５ｍｌ、ＩＬ−１５（＃２４７−ＩＬ−００２５，Ｒ＆Ｄ）を１２．５μｌ、ＩＬ−１８を３７．５μｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸを２回添加し、総２６．９１３ｍｌを使用したことだけ異にして実施した。 2.2.5. Primary culture of NK cells (5)
Example 2.2. All procedures are the same except that 0.03 ml of anti-NKp46 (same as above) solution, 7.5 ml of IL-12 (same as above), 12.5 μl of IL-15 (# 247-IL-0025, R & D), The procedure was different except that 37.5 μl of IL-18 and Alys505NK-EX were added twice and a total of 26.913 ml was used.

２．３．ＮＫ細胞の二次培養
２．３．１．ＮＫ細胞の二次培養（１）
実施例２．２．１の一次培養後、培養基で細胞が培養されているＴ７５フラスコを取り出して細胞を集めた後、Ｔ１７５フラスコ（＃１５９９１０，Ｎｕｎｃ）に移した。自家血漿３ｍｌ及びＡｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ（＃０１４１０Ｐ１０、ＣＳＴＩ）２７ｍｌをＴ１７５フラスコに添加し、ＣＯ_２インキュベータで１〜２日間培養した。その後、自家血漿６ｍｌ、抗ＮＫｐ４６溶液０．１２ｍｌ、ＩＬ−１８０．０３ｍｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ（＃０１４１０Ｐ１０，ＣＳＴＩ）５３．８５ｍｌを添加した後、さらにＣＯ_２インキュベータで１〜２日間培養した。 2.3. Secondary culture of NK cells
2.3.1. Secondary culture of NK cells (1)
After the primary culture of Example 2.2.1, the T75 flask in which the cells were cultured in the culture medium was taken out, collected, and transferred to a T175 flask (# 159910, Nunc). 3 ml of autologous plasma and 27 ml of Alys505NK-EX (# 01410P10, CSTI) were added to a T175 flask and cultured in a CO ₂ incubator for 1-2 days. Thereafter, 6 ml of autologous plasma, 0.12 ml of anti-NKp46 solution, 0.03 ml of IL-18, 53.85 ml of Alys505NK-EX (# 01410P10, CSTI) were added, and further cultured in a CO ₂ incubator for 1-2 days.

２．３．２．ＮＫ細胞の二次培養（２）
実施例２．３．１と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．０６ｍｌ、ＩＬ−１８（＃Ｂ００３−２，Ｒ＆Ｄ）０．０６ｍｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ５３．８８ｍｌを使用したことだけ異にし、実施例２．２．２の培養物の二次培養を実施した。 2.3.2. Secondary culture of NK cells (2)
All procedures are the same as Example 2.3.1, but 0.06 ml of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution, 0.06 ml of IL-18 (# B003-2, R & D), Alys505NK-EX 53. A subculture of the culture of Example 2.2.2 was performed, with the difference that 88 ml was used.

２．３．３．ＮＫ細胞の二次培養（３）
実施例２．３．１と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．１２ｍｌ、ＩＬ−１２（＃５５４６１３，ＢＤ）０．０３ｍｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ５３．８５ｍｌを使用したことだけ異にし、実施例２．２．３の培養物の二次培養を実施した。 2.3.3. Secondary culture of NK cells (3)
All procedures are the same as Example 2.3.1, but 0.12 ml of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution, 0.03 ml of IL-12 (# 554613, BD), 53.85 ml of Alys505NK-EX. A subculture of the culture of Example 2.2.3 was performed, with the only difference being the use.

２．３．４．ＮＫ細胞の二次培養（４）
実施例２．３．１と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．０６ｍｌ、ＩＬ−１２（同上）０．０３ｍｌ、ＩＬ−１８（同上）０．０２ｍｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ４４．８９ｍｌを使用したことだけ異にし、実施例２．２．４の培養物の二次培養を実施した。 2.3.4. Secondary culture of NK cells (4)
All procedures are the same as Example 2.3.1, but 0.06 ml of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution, 0.03 ml of IL-12 (same as above), 0.02 ml of IL-18 (same as above), A subculture of the culture of Example 2.2.4 was performed, except that 44.89 ml of Alys505NK-EX was used.

２．３．５．ＮＫ細胞の二次培養（５）
実施例２．３．１と全ての手続きは同一であるが、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．０６ｍｌ、ＩＬ−１２（同上）０．０３ｍｌ、ＩＬ−１５（同上）０．０６ｍｌ、ＩＬ−１８（同上）０．０２ｍｌ、Ａｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ６２．８３ｍｌを使用したことだけ異にし、実施例２．２．５の培養物の二次培養を実施した。 2.3.5. Secondary culture of NK cells (5)
All procedures are the same as Example 2.3.1, but 0.06 ml of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution, 0.03 ml of IL-12 (same as above), 0.06 ml of IL-15 (same as above), Subculture of the culture of Example 2.2.5 was performed, except that 0.02 ml of IL-18 (same as above) and 62.83 ml of Alys505NK-EX were used.

２．４．ＮＫ細胞の三次培養
前記実施例２．３．で培養されたＴ１７５フラスコの細胞、及び自家血漿を３００ＩＵ／ｍｌＩＬ−２を含む培養液に入れ、ＣＯ_２インキュベータで培養した。２〜３日後、新たな同一ボリュームの培養液（３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む培養液）を、細胞が培養されている細胞懸濁液と混ぜた後、ＣＯ_２インキュベータで培養した。
前記培養（一次培養、二次培養及び三次培養のいずれも）で、ＩＬ−２が添加された培養液の代わりに、ＩＬ−２が添加されていない免疫細胞培養液に、ＩＬ−２を所定量でそれぞれ添加して使用することもできる。 2.4. Tertiary culture of NK cells Example 2.3. The cells in the T175 flask cultured in the above and autologous plasma were placed in a culture solution containing 300 IU / ml IL-2 and cultured in a CO ₂ incubator. Two to three days later, a new culture solution of the same volume (a culture solution containing 300 IU / ml IL-2) was mixed with a cell suspension in which cells were cultured, and then cultured in a CO ₂ incubator.
In the culture (all of primary culture, secondary culture, and tertiary culture), IL-2 was added to an immune cell culture medium not added with IL-2 instead of the culture medium added with IL-2. It can also be used by adding each in a fixed amount.

実施例３．培養されたＮＫ細胞の増殖及び活性化の確認
３．１．培養された細胞の総細胞数とＮＫ細胞増殖倍数との確認
前記実施例２．４．で培養された細胞をいずれも収去した後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、リン酸緩衝食塩水に浮遊させた。細胞浮遊液から１０μｌを取り、リン酸緩衝食塩水で希釈した後、希釈液１０μｌを取り、トリパンブルー１０μｌと混ぜた後、血球計算板（hemocytometer）に載せ、細胞数及び生存率を測定した。細胞数は、（生細胞数＋死滅細胞数）×１／４×２×希釈倍数×全体積×１０^４の数式で求め、細胞生存率は、生細胞数÷（生細胞数＋死滅細胞数）×１００の数式で求めた。 Example 3 Confirmation of proliferation and activation of cultured NK cells
3.1. Confirmation of total number of cultured cells and NK cell growth factor Example 2.4. After removing all the cells cultured in (1), the mixture was centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the suspension was suspended in phosphate buffered saline. After taking 10 μl from the cell suspension and diluting with phosphate buffered saline, 10 μl of the diluted solution was taken, mixed with 10 μl of trypan blue, and placed on a hemocytometer, and the cell number and viability were measured. The number of cells is determined by the formula (number of living cells + number of dead cells) × 1/4 × 2 × dilution multiple × total volume × 10 ⁴ , and cell viability is calculated as number of living cells / (number of living cells + number of dead cells) ) × 100.

本発明に使用された細胞培養液で増殖させたＮＫ細胞数の結果は、図２Ａの通りである。 The result of the number of NK cells grown in the cell culture medium used in the present invention is as shown in FIG. 2A.

また、本発明に使用された細胞培養液で増殖させたＮＫ細胞の比率の結果は、図２Ｂの通りである。使用した実験条件及び結果を要約すれば、下記表２の通りである。

Moreover, the result of the ratio of the NK cell grown by the cell culture solution used for this invention is as FIG. 2B. The experimental conditions and results used are summarized in Table 2 below.

総合すれば、ＩＬ−２とＩＬ−１８との組み合わせが、細胞数及びＮＫ比の上昇に効果的であるということが分かった。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−１２及びＩＬ−１５の混合物、またはＩＬ−１８がＮＫ比を高めるのに効果的であるということが分かった。 Taken together, it was found that the combination of IL-2 and IL-18 is effective in increasing the cell number and NK ratio. It has been found that IL-12, IL-15, or a mixture of IL-12 and IL-15, or IL-18 is effective in increasing the NK ratio.

３．２．第１インターロイキンの濃度によるＮＫ細胞増殖効果の確認
実施例１で用意した細胞懸濁液を取り、前記実施例２．１．で製造されたコーティングフラスコに入れ、自家血漿１．５ｍｌ、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．０３ｍｌ、ＩＬ−１８（＃Ｂ００３−２，Ｒ＆Ｄ）０．０７５ｍｌ、ＩＬ−２が添加されていないＡｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ（＃０１４００Ｐ１０，ＣＳＴＩ）１３．４６２５ｍｌを添加し、ＩＬ−２は、０ないし１０，０００ＩＵ／ｍｌ濃度で添加し（図３参照）、ＣＯ_２インキュベータで全１４日間培養した。１４日間培養した細胞を、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、リン酸緩衝食塩水に浮遊させた。浮遊した細胞から、１０μｌの検体を採取し、リン酸緩衝食塩水で希釈した後、希釈液１０μｌを取り、トリパンブルー１０μｌと混ぜた後、血球計算板（hemocytometer）に載せ、細胞数を測定した。細胞数測定方法は、実施例３．１．と同一である。ＮＫ細胞の数は、流細胞分析を介して得られたＮＫ細胞の比率を介して計算した。１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２濃度を１にし、残りのＩＬ−２濃度処理によるＮＫ細胞の増殖倍数を計算した。 3.2. Confirmation of NK cell proliferation effect by concentration of first interleukin The cell suspension prepared in Example 1 was taken, and Example 2.1. In the coating flask produced in step 1, 1.5 ml of autologous plasma, 0.03 ml of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution, 0.075 ml of IL-18 (# B003-2, R & D), and IL-2 are added. 13.4625 ml of Alys505NK-EX (# 01400P10, CSTI) was added, IL-2 was added at a concentration of 0 to 10,000 IU / ml (see FIG. 3), and cultured for 14 days in a CO ₂ incubator. The cells cultured for 14 days were centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, and then suspended in phosphate buffered saline. A 10 μl sample was collected from the suspended cells, diluted with phosphate buffered saline, 10 μl of the diluted solution was taken, mixed with 10 μl of trypan blue, and placed on a hemocytometer, and the number of cells was measured. . The cell number measurement method is described in Example 3.1. Is the same. The number of NK cells was calculated via the proportion of NK cells obtained via flow cell analysis. The IL-2 concentration of 100 IU / ml was set to 1, and the multiplication factor of NK cells by the remaining IL-2 concentration treatment was calculated.

その結果、図３から確認することができるように、ＩＬ−２濃度が５００ないし５，０００ＩＵ／ｍｌ範囲であるとき、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２濃度より６倍以上のＮＫ細胞の増殖効果を示した。 As a result, as can be confirmed from FIG. 3, when the IL-2 concentration is in the range of 500 to 5,000 IU / ml, the proliferation effect of NK cells is more than 6 times higher than the IL-2 concentration of 100 IU / ml. Indicated.

３．３．第２インターロイキンの濃度によるＮＫ細胞活性確認
１．７ｍｌチューブに、１μｌフィブロネクチン（＃ＦＣ−０１０，Millipore）及び１．２１μｌガンマグロブリン（＃０２０Ａ１００４，緑十字）を入れた後、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳ９７．７９μｌを添加した。製造されたコーティング液を、ピペットを利用して、９６ウェルプレート（＃１６７００８，ｕｎｃ）に入れ、１６時間以上、２ないし８℃で反応させた。細胞培養前、残余コーティング液をＣａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳで洗浄した後で除去した。実施例１で用意した細胞懸濁液を取り、製造され９６ウェルプレートに入れ、自家血漿１０μｌ、抗ＮＫｐ４６（＃ＭＡＢ１８５０，Ｒ＆Ｄ）溶液０．２μｌ、ＩＬ−２１，０００ＩＵ／ｍｌが添加されたＡｌｙｓ５０５ＮＫ−ＥＸ（＃０１４１０Ｐ１０，ＣＳＴＩ）８９．８μｌを添加し、ＩＬ−１２は、０ないし１０ｎｇ／ｍｌ濃度で添加し（図４Ａ参照）、ＩＬ−１８は、０ないし３００ｎｇ／ｍｌ濃度で添加し（図４Ｂ参照）、ＣＯ_２インキュベータで総４８時間培養した。４８時間後、上澄み液を新たなチューブに移し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液だけ新たなチューブに移した。ＮＫ細胞の活性は、ＩＦＮ−gamma ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＩＦ５０，Ｒ＆Ｄ）を利用して、ＩＦＮ−gamma分泌量で確認した。 3.3. Confirmation of NK cell activity by the concentration of the second interleukin After placing 1 μl fibronectin (# FC-010, Millipore) and 1.21 μl gamma globulin (# 020A1004, green cross) in a 1.7 ml tube, Ca / Mg free DPBS 97.79 μl was added. The prepared coating solution was put into a 96-well plate (# 167008, unc) using a pipette and allowed to react at 2 to 8 ° C. for 16 hours or more. Prior to cell culture, the remaining coating solution was removed after washing with Ca / Mg free DPBS. The cell suspension prepared in Example 1 was taken, put into a 96-well plate, and 10 μl of autologous plasma, 0.2 μl of anti-NKp46 (# MAB1850, R & D) solution and IL-2 1,000 IU / ml were added. 89.8 μl of Alys505NK-EX (# 01410P10, CSTI) is added, IL-12 is added at a concentration of 0 to 10 ng / ml (see FIG. 4A), and IL-18 is added at a concentration of 0 to 300 ng / ml. (See FIG. 4B), and cultured in a CO ₂ incubator for a total of 48 hours. After 48 hours, the supernatant was transferred to a new tube, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and only the supernatant was transferred to a new tube. The activity of NK cells was confirmed by the amount of IFN-gamma secretion using an IFN-gamma ELISA kit (# DIF50, R & D).

その結果、ＩＬ−１２は、０．１ないし１０ｎｇ／ｍｌ濃度範囲で、高いＩＦＮ−gammaが分泌され、ＩＬ−１８は、１ないし１００ｎｇ／ｍｌ濃度範囲で、高いＩＦＮ−gammaの分泌量が測定された。 As a result, IL-12 has a high IFN-gamma secretion in a concentration range of 0.1 to 10 ng / ml, and IL-18 has a high secretion amount of IFN-gamma in a concentration range of 1 to 100 ng / ml. It was done.

３．４．培養されたＮＫ細胞の活性受容体発現確認
流細胞分析器（flowcytometry）を利用して、実施例２で培養されて収去されたＮＫ細胞の表面抗原を分析した。具体的には、収去された細胞を、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳに浮遊させ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットに、蛍光物質を含む抗体（ＣＤ３−ＦＩＴＣ，ＣＤ５６−ＡＰＣ）をそれぞれ加えた後、４℃で２０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液を加え、８，０００ｒｐｍで１分間１回遠心分離し、流細胞分析器（ＦＡＣＳCalibur，ＢＤ）で分析した。 3.4. NK cell surface antigens cultured and removed in Example 2 were analyzed using a flow cytometry confirming the expression of active receptor in cultured NK cells. Specifically, the collected cells were suspended in Ca / Mg-free DPBS, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a cell pellet. To the obtained cell pellet, an antibody (CD3-FITC, CD56-APC) containing a fluorescent substance was added, followed by incubation at 4 ° C. for 20 minutes. FACS buffer was added, centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute, and analyzed with a flow cytometer (FACSCalibur, BD).

また、ＮＫ細胞の活性受容体の発現いかんを流細胞分析器を利用して確認した。具体的には、収去された細胞を、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳに浮遊させ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットに、蛍光物質を含む抗体（ＫＩＲＤＬ１−ＰＥ，ＮＫＧ２Ａ−ＰＥ，ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ，ＮＫｐ３０−ＰＥ，ＮＫｐ４４−ＰＥ，ＮＫｐ４６−ＰＥ）をそれぞれ加えた後、４℃で２０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液を加え、８，０００ｒｐｍで１分間１回遠心分離し、流細胞分析器（Ｇｕａｖａ８ＨＴ，merk）で分析した。 In addition, the expression of the NK cell active receptor was confirmed using a flow cell analyzer. Specifically, the collected cells were suspended in Ca / Mg-free DPBS, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a cell pellet. Antibodies (KIRDL1-PE, NKG2A-PE, NKG2D-PE, NKp30-PE, NKp44-PE, NKp46-PE) containing a fluorescent substance were added to the obtained cell pellet, respectively, and then incubated at 4 ° C. for 20 minutes. . FACS buffer was added, centrifuged once at 8,000 rpm for 1 minute, and analyzed with a flow cytometer (Guava8HT, merc).

３．５．培養されたＮＫ細胞の抗癌能分析
１）抗癌物質発現程度の分析
実施例２で製造されたＮＫ細胞の抗癌物質発現程度を確認するために、流細胞分析器（flowcytometry）を利用して分析した。具体的には、収去された細胞を、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳに浮遊させ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを、Fixation／Permeabilization solution（＃５１−２０９０ＫＺ，ＢＤ）で処理した後、蛍光物質を含む抗体（Perforin−ＰＥ，GranzymeＢ−ＰＥ，ＴＲＡＩＬ−ＰＥ）をそれぞれ加えた後、４℃で３０分間インキュベーションした。Ｐｅｒｍ／Wash buffer（＃５１−２０９１ＫＺ，ＢＤ）を加え、８，０００ｒｐｍで１分間２回遠心分離し、流細胞分析器（ＦＡＣＳCalibur，ＢＤ）で分析した。 3.5. Anticancer activity analysis of cultured NK cells
1) Analysis of the degree of anticancer substance expression In order to confirm the degree of anticancer substance expression of the NK cells produced in Example 2, analysis was carried out using a flow cytometry. Specifically, the collected cells were suspended in Ca / Mg-free DPBS, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a cell pellet. After the obtained cell pellet was treated with Fixation / Permeabilization solution (# 51-2090KZ, BD), an antibody containing a fluorescent substance (Perforin-PE, Granzyme B-PE, TRAIL-PE) was added, and then 4 ° C. For 30 minutes. Perm / Wash buffer (# 51-2091KZ, BD) was added, centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute twice, and analyzed with a flow cytometer (FACSCalibur, BD).

２）癌細胞殺傷能の確認
対象癌細胞として、白血病（chronic myelogenous leukemia）細胞株であるＫ５６２、及び多様な固形癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ，ＯＶＣＡＲ３，ＨｅｐＧ２，Ａ７０４，ＤＵ１４５）を収去し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳで洗浄した。洗浄された細胞ペレットに培養液を添加し、５×１０^５cells／ｍｌ濃度で細胞を準備した。用意された細胞を、ＣＦＳＥ（＃ｃ３４５５４，Life technologies）で処理し、ＣＯ_２インキュベータで１０分間インキュベーションした。Ｃａ／Ｍｇ遊離ＤＰＢＳで２回洗浄した後、製造されたＮＫ細胞と共に処理し、ＣＯ_２インキュベータで４時間インキュベーションした。インキュベーションが終わり、１０分間全７ＡＡＤを処理し、インキュベーションが終わった後、細胞をエッペンドルフ試験管に収去し、流細胞分析器（ＦＡＣＳCalibur，ＢＤ）で癌細胞殺傷能を分析した。癌細胞殺傷能の数値は、下記公式で計算した。
Cytotoxicity（％）＝（sample処理群−自然遊離）／（１００−自然遊離）ｘ１００ 2) Confirmation of cancer cell killing ability As a target cancer cell, leukemia (chronic myelogenous leukemia) cell line K562 and various solid cancer cell lines (Hep3B, OVCAR3, HepG2, A704, DU145) are removed, After centrifuging at 500 rpm for 5 minutes and removing the supernatant, it was washed with Ca / Mg free DPBS. A culture solution was added to the washed cell pellet to prepare cells at a concentration of 5 × 10 ⁵ cells / ml. The prepared cells were treated with CFSE (# c34554, Life technologies) and incubated for 10 minutes in a CO ₂ incubator. After washing twice with Ca / Mg free DPBS, the cells were treated with the produced NK cells and incubated for 4 hours in a CO ₂ incubator. At the end of the incubation, all 7 AADs were processed for 10 minutes and after the incubation was complete, the cells were transferred to an Eppendorf tube and analyzed for cancer cell killing ability with a flow cytometer (FACSCalibur, BD). The numerical value of cancer cell killing ability was calculated by the following formula.
Cytotoxicity (%) = (sample treatment group−natural release) / (100−natural release) × 100

Ｋ５６２ lysisの結果は図８及び表２の通りであり、多様な固形細胞株に係わるlysis結果は、図９の通りである。 The results of K562 lysis are as shown in FIG. 8 and Table 2, and the lysis results for various solid cell lines are as shown in FIG.

結果として、フィブロネクチン、ガンマグロブリンでコーティングされたフラスコに対するａＮＫｐ４６組み合わせ使用が、高いＫ５６２除去効能を示し、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝臓癌）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）、Ａ７０４（腎臓癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）などの多様な固形癌でも、Ｅ：Ｔ比（Effector cell数：Target cell数）により、除去効能が上昇している。前記Effector cellは、ＮＫ細胞を意味し、前記Target cellは、癌細胞を意味する。 As a result, the use of aNKp46 combination on fibronectin and gamma globulin coated flasks showed high K562 removal efficacy, OVCAR3 (ovarian cancer), Hep3B (liver cancer), HepG2 (liver cancer), A704 (kidney cancer), DU145 Even in various solid cancers such as (prostate cancer), the removal efficacy is increased by the E: T ratio (number of effector cells: number of target cells). The “Effector cell” means an NK cell, and the “Target cell” means a cancer cell.

３．６．凍結ＰＢＭＣを利用したＮＫ細胞の培養結果
Donor ３人の血液から分離したＰＢＭＣ及び凍結ＰＢＭＣで、１４日間、本発明の増殖方法で培養した細胞の特性について、流細胞分析器（flowcytometry）を利用して、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６の発現有無を確認し、Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性度（cytotoxicity）を確認した。その結果、Donor １のＮＫ細胞数は、９６８倍増加し、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）の比率が１０．５％から７８．８％でに上昇した（表３、図１０及び図１１）。

3.6. Results of NK cell culture using frozen PBMC
Donor The characteristics of cells cultured in the growth method of the present invention for 14 days with PBMC separated from the blood of three people and frozen PBMC were analyzed using CD3, CD16, CD19, CD56 using a flow cytometry. The presence or absence of expression was confirmed, and the cytotoxicity against K562 cells was confirmed. As a result, the number of Donor 1 NK cells increased 968 times, and the ratio of NK cells (CD3-CD56 +) increased from 10.5% to 78.8% (Table 3, FIG. 10 and FIG. 11).

また、Donor ２のＮＫ細胞数は、８２３倍増加し（表３）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）の比率は、１５．２％から７７．２％に上昇した（表４）。

In addition, the number of Donor 2 NK cells increased 823 times (Table 3), and the ratio of NK cells (CD3-CD56 +) increased from 15.2% to 77.2% (Table 4).

かような結果は、本発明のＰＢＭＣ凍結方法及び解凍方法、並びにＮＫ細胞培養方法によって、凍結ＰＢＭＣがＮＫ細胞に培養されるということを示すものである。 Such a result shows that frozen PBMC is cultured in NK cells by the PBMC freezing and thawing methods and NK cell culture method of the present invention.

以上、本発明の内容について詳細に記述したが、当業界の当業者において、かような具体的技術は、ただ望ましい実施例であるのみ、それにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点が明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されるものである。 The contents of the present invention have been described in detail above. However, those skilled in the art will be aware that such specific techniques are merely preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. The point will be clear. Accordingly, the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and equivalents thereof.

本発明の自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物は、例えば、免疫細胞治療関連の技術分野に効果的に適用可能である。 The method of proliferating spontaneously killed cells and the composition for proliferating spontaneously killed cells of the present invention can be effectively applied to, for example, technical fields related to immune cell therapy.

Claims

Natural killing cells,
IL-2 as the first interleukin,
As the second interleukin, one or more selected from the group consisting of IL-12, IL-15 and IL-18,
The step of culturing in a culture medium containing an anti-NKp46 antibody, only including,
Culturing is performed in the presence of gamma globulin and fibronectin, and is a method for growing spontaneously killed cells.

The method of proliferating spontaneous killing cells according to claim 1, wherein the spontaneous killing cell proliferation is performed by culturing peripheral blood mononuclear cells.

The method according to claim 2, wherein the peripheral blood mononuclear cells are cryopreserved and then thawed.

The freezing is by a freezing method comprising a first freezing step in the range of 4 to -42 ° C , a second freezing step in the range of -42 to -15 ° C, and a third freezing step in the range of -15 to -120 ° C. The method for growing spontaneously killed cells according to claim 3, wherein the method is carried out.

The method of proliferating the naturally killed cells is:
A first culture stage in which peripheral blood mononuclear cells and a culture solution are placed in a culture vessel coated with gamma globulin and fibronectin and cultured;
In the first culturing step, a second culturing step of further culturing by further adding a culture solution to the cultured culture,
The culture solution includes at least one selected from the group consisting of IL-2 as the first interleukin and IL-12, IL-15 and IL-18 as the second interleukin, an anti-NKp46 antibody, and plasma. The method for growing spontaneously killed cells according to any one of claims 1 to 4, characterized by comprising:

6. The method according to claim 5 , wherein the plasma is separated from peripheral blood from which peripheral blood mononuclear cells are derived.

The method for growing spontaneously killed cells according to claim 5 or 6 , wherein the IL-2 concentration is 500 to 5,000 IU / ml in the culture solution of the first culture stage and the second culture stage.

8. The method according to claim 5, further comprising a third culture step of culturing at a lower IL-2 concentration in the culture to 4/5 to 1/10 or less after the second culture step . 2. The method for growing spontaneously killed cells according to item 1 .

The method for growing spontaneously killed cells according to claim 8 , wherein the IL-2 concentration is 100 to 1,500 IU / ml in the culture solution of the third culture stage.

The proliferated spontaneous killing cell expresses at least one selected from the group consisting of CD56, CD16, NKG2D, perforin and granzyme B higher than the spontaneous killing cell before proliferation. The method for growing spontaneously killed cells according to any one of the above.

A spontaneously killed cell comprising the steps of growing spontaneously killed cells by the method according to any one of claims 1 to 10 and storing the propagated spontaneously killed cells in a solution containing dextran and albumin. the method of production.

As the first interleukin, IL-2,
As the second interleukin, one or more selected from the group consisting of IL-12, IL-15 and IL-18,
An anti-NKp46 antibody;
A composition for spontaneous killing cell growth comprising gamma globulin and fibronectin .

The composition for natural killing cell proliferation according to claim 12 , wherein the composition is used for growing spontaneous killing cells from peripheral blood mononuclear cells.

The composition for proliferating spontaneously killed cells according to claim 13 , wherein the peripheral blood mononuclear cells are frozen and then thawed.

The composition for spontaneous killing cell proliferation according to claim 13 , wherein the composition further comprises plasma separated from peripheral blood from which peripheral blood mononuclear cells are derived.