KR101496835B1 - Primer set for Salmonella spp.-specific identification using loop-mediated isothermal amplification and method for detecting Salmonella spp. using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 살모넬라균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 살모넬라균의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer composition for isothermal amplification reaction for detecting Salmonella and a method for detecting Salmonella using the primer composition.
살모넬라균(Salmonella ssp.)은 그람 음성의 운동성이 있는 통성 혐기성 간균으로 국내 뿐만 아니라 전 세계적으로 가장 빈발하는 식중독 원인균 중 하나이다. 살모넬라균을 원인으로 하는 살모넬라 식중독은 오염된 식품을 섭취하거나 살모넬라균에 감염 동물과 직접 접촉함으로써 발생할 수 있다. 사람에서의 살모넬라 감염증은 주로 식품 매개 형태로 발생하며 복통, 설사, 발열 등의 임상증상을 보인다. 특히 영·유아, 노인, 면역결핍환자 등에서 임상증상은 중증으로 발전될 수 있으며 드물게 사망까지 이르는 매우 치명적인 결과를 야기할 수 있다. 전세계적으로 살모넬라균에 의한 식중독 사고는 세균성 식중독 사고의 대부분을 차지한다. 미국에서는 살모넬라균에 의한 식중독 사고가 연간 150만건에 이르며 (Steve Yan et al., 2004), 인접 국가인 중국에서는 세균성 식중독 사고의 70~80%가 Salmonella로 인해 발생하는 것으로 보고되고 있다(Yang et al., 2010). 국내 식품의약품안전처 식중독 통계 시스템 자료에 따르면, 2011년 살모넬라 식중독은 24건, 환자수 1,065명으로 보고되어 세균성 식중독 사고 중 병원성 대장균에 이어 두 번째로 높은 수준으로 보고되었다. 살모넬라 식중독을 예방하기 위한 국가적 차원의 노력에도 불구하고 매년 살모넬라 식중독 사고는 꾸준히 발생하여 경제적 손실을 일으키고 있는 실정이다.Salmonella spp. Is a gram-negative motile anaerobic bacterium that is one of the most frequent causative agents of food poisoning in Korea and worldwide. Salmonella food poisoning caused by Salmonella can occur by ingesting contaminated food or by contacting Salmonella directly with an infected animal. Salmonella infections in humans are predominantly food-borne and present clinical symptoms such as abdominal pain, diarrhea, and fever. Clinical symptoms may develop seriously in young and infants, elderly people, immunodeficient patients, and can lead to very fatal outcomes, rarely leading to death. Food poisoning accidents caused by Salmonella worldwide are the most common bacterial food poisoning accidents. In the United States, food poisoning accidents due to Salmonella have been reported to 1.5 million per year (Steve Yan et al., 2004) and 70-80% of bacterial food poisoning accidents in neighboring China have been reported to occur due to Salmonella (Yang et al. al., 2010). According to the Food and Drug Administration's Food and Drug Administration statistics, 24 cases of Salmonella food poisoning were reported in 2011, and 1,065 cases were reported in 2011, the second highest level following bacterial food poisoning accidents following pathogenic E. coli. Despite national efforts to prevent Salmonella food poisoning, annual Salmonella food poisoning accidents have been steadily occurring, causing economic losses.
살모넬라균은 현재까지 2,500여종 이상의 다양한 혈청형이 보고되었으며, 그 중 식중독을 일으키는 주요한 혈청형으로 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라에슐스(Salmonella choleraesuls)등이 있고, 그 외에도 살모넬라 톰슨(Salmonella thompson), 살모넬라 인펀티스(Salmonella infantis), 살모넬라 더비(Salmonella derby) 등이 있다. 특히 살모넬라 엔터라이티디스는 가금류에 흔히 감염되어 오염된 식육 또는 계란을 통해 폭발적인 식중독 사고를 일으키기 때문에 가금류에서의 살모넬라 감염의 예방 및 차단은 공중보건학적으로 매우 중요하다. 그러나 가금류의 경우 대부분 농장에서 밀집사육되고 있기 때문에 오히려 살모넬라균 전파가 용이한 실정이다(Penha Filho et al., 2009). 또한, 도계과정 중 분변 및 근접 도체에 의한 2차오염 및 교차오염도 살모넬라균에 의한 식중독 사고의 위험을 더욱 증가시키는 요인이다. 국내 가금류 중 소비량이 가장 높은 계육에서의 살모넬라균 오염에 대해서는 국내외적으로 많은 연구가 보고되어 있으나, 두 번째로 소비량이 높은 오리육의 살모넬라균 오염에 대해서는 그 연구가 부족한 실정이다(Cha et al., 2013). 그러나 2003년부터 2005년간 영국에서 가금육 중 살모넬라균 오염이 가장 높았던 종류는 오리육(29%)으로, 이는 계육(5%)의 오염수준을 훨씬 상회하는 것으로 오리육에 의한 살모넬라 식중독 사고 위험이 높음을 시사한다(Little et al., 2008). 최근 국내 오리육의 소비량이 점차 증가함을 감안할 때, 오리육에서 살모넬라균 균체를 빠른 시간 내에 검출하여 살모넬라균 감염 위험을 최소화하는 것이 살모넬라균의 전파를 초기에 차단하여 오리 산업은 물론 공중보건학적으로도 경제적 손실을 방지할 수 있는 매우 중요한 전략이라고 할 수 있다. 따라서 신속 정확한 살모넬라균의 검출을 위한 진단체계의 마련이 필요한 실정이다. Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuls (Salmonella choleraesuls), Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuls Salmonella thompson, Salmonella infantis, Salmonella derby, and the like. Prevention and prevention of Salmonella infection in poultry is very important in public health, especially since Salmonella Enteritidis causes explosive food poisoning accidents through contaminated meat or eggs often infected with poultry. However, most of the poultry are concentrated in farms, which makes it easier to spread salmonella (Penha Filho et al., 2009). In addition, secondary contamination and cross contamination by feces and nearby conductors during the process of cattle ranching further increase the risk of food poisoning accidents due to Salmonella. Although there have been many reports on the contamination of salmonella in domestic poultry with the highest consumption of domestic poultry, the research on salmonella contamination of duck meat, which consumes the highest amount, has been lacking (Cha et al. , 2013). However, in 2003-2005, the highest level of salmonella contamination in poultry in the UK was duck meat (29%), which is far above the level of contamination of meat (5%), indicating a high risk of Salmonella food poisoning by duck meat (Little et al., 2008). Considering that the consumption of domestic duck meat is gradually increasing recently, minimizing the risk of Salmonella infection by detecting salmonella bacteria in duck meat in a short period of time will initially prevent the transmission of salmonella, Is a very important strategy that can prevent economic losses. Therefore, it is necessary to establish a diagnostic system for the rapid and accurate detection of Salmonella.
살모넬라균의 검출법으로는 전통적으로 표준배양법이 사용되고 있다. 그러나 이 방법은 균의 특성상 배양 및 분리, 검출까지 최소 3일에서 5일 정도가 소요되는 단점이 있다. 또한 동시에 많은 양의 시료를 처리하는데 집약적인 노동력이 필요하므로 신속하고 정확한 검출을 통한 원인균 조기 스크리닝에 활용하기에는 어려움이 있다. Traditionally, standard culture methods have been used for the detection of Salmonella. However, this method is disadvantageous in that it requires at least 3 to 5 days for culture, separation and detection due to the characteristics of the bacteria. In addition, it requires labor intensive to process a large amount of samples at the same time, so it is difficult to utilize it for early screening of causative bacteria through rapid and accurate detection.
최근 기존의 표준배양법과 병용하여 유전자 기반의 검출법인 PCR(Polymerase Chain Reaction)법 및 실시간(real-time) PCR법 등이 여러 분야에 응용되고 있다. 이는 균 특이 유전자를 증폭함으로써 원인균을 검출할 수 있는 기법으로 표준배양법과 비교하였을 때 간단하고 신속하게 결과를 판정할 수 있는 장점이 있으나 PCR의 경우 증폭산물을 확인하기 위하여 한천 겔 상에서 전기영동 과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있을 뿐만 아니라, 우유 및 식육 등 식품 시료 성분에 의한 유전자 증폭반응의 저해가 우려되기도 한다(Bickley et al., 1996; Kim et al., 2000; Rossen et al., 1992).Recently, PCR (Polymerase Chain Reaction) method and real-time PCR method, which are gene-based detection methods, have been applied in various fields in combination with existing standard culture methods. This method is able to detect the causative organism by amplifying the bacterial specific gene. It has the merit that it is possible to judge the result simply and quickly when compared with the standard culture method. However, in the case of PCR, electrophoresis process on the agar gel to confirm the amplification product (Bickley et al., 1996; Kim et al., 2000; Rossen et al., 1992), as well as the inconvenience and hindrance of gene amplification by food samples such as milk and food.
한편, 등온증폭(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)법은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요없는 Bst 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 루프모양처럼 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전반응시켜 증폭유무를 확인하는 방법으로, 고가의 PCR 또는 실시간 PCR 장비 없이 간단하게 30분 내지 1시간 내에 진단할 수 있는 방법이다.Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a method of performing a reaction under an isothermal condition using a Bst polymerase which does not require a PCR cycle, unlike the conventional PCR method. Basically, four primers are used, Is synthesized like a loop to amplify a specific part of a gene indefinitely and confirms whether amplified DNA product is amplified by using fluorescence detection reagent or precipitation reaction. Minute to one hour.
이에 본 발명자들은 살모넬라균를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 살모넬라균을 검출함으로써, 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors completed the present invention by preparing a primer set for LAMP capable of specifically detecting Salmonella and detecting Salmonella using the same.
본 발명의 목적은 살모넬라균(Salmonella spp.) 검출을 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a primer set for detection of Salmonella spp.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라균 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting salmonella comprising the above primer set.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting Salmonella which comprises the above composition.
본 발명의 다른 목적은 상기 살모넬라균 검출을 위한 프라이머 세트를 이용한 살모넬라균의 검출방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for detecting Salmonella using a primer set for detecting Salmonella.
본 발명은 살모넬라균(Salmonella spp.) 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer set for detection of Salmonella spp.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라균 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting salmonella comprising the primer set.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting salmonella comprising the above composition.
또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 검출을 위한 프라이머 세트를 이용한 살모넬라균의 검출방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting Salmonella using a primer set for detecting Salmonella.
본 발명의 프라이머 조성물은, 살모넬라균을 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있어 살모넬라를 신속하게 검색 및 진단할 수 있도록 하는 효과가 우수하다. 또한 살모넬라 발생률을 간단하고 정확하게 파악하여 공중보건학적 기초 자료로 활용할 수 있으며, 살모넬라에 오염된 축산식품의 조기 스크리닝 시스템으로서 효과적으로 활용될 수 있다.The primer composition of the present invention is capable of specifically detecting Salmonella bacteria with high sensitivity, and thus has an excellent effect of promptly detecting and diagnosing Salmonella. In addition, the incidence of Salmonella can be easily and accurately identified and utilized as basic data for public health, and it can be effectively utilized as an early screening system for contaminated animal foods.
도 1은 살모넬라균 순수 배양액에서의 LAMP법의 검출한계를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 LAMP법의 검출한계를 X축으로 하고 시간을 Y축으로 한 그래프로서, 정량공식 및 R2를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a graph showing the results of measurement of the detection limit of the LAMP method in a pure culture medium of Salmonella.
FIG. 2 is a graph showing the detection limit of the LAMP method as the X axis and the time as the Y axis, which shows the quantification formula and R 2 .
본 발명은 살모넬라(Salmonella spp.)균 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer set for detection of Salmonella spp .
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 살모넬라균을 특이적으로 검출하는 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. The primer set specifically detecting the Salmonella of the present invention is characterized by being composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6.
서열번호1의 FIP는 invA 유전자의 정방향 내부 프라이머(forward inner primer);The FIP of SEQ ID NO: 1 is a forward inner primer of the invA gene;
서열번호2의 BIP는 invA 유전자의 역방향 내부 프라이머(backward inner primer);The BIP of SEQ ID NO: 2 is a backward inner primer of the invA gene;
서열번호3의 F3는 invA 유전자의 invA 유전자의 정방향 외부 프라이머(forward outer primer);F3 in SEQ ID NO: 3 is a forward outer primer of the invA gene of invA gene;
서열번호4의 B3는 invA 유전자의 역방향 외부 프라이머(backward outer primer);B3 in SEQ ID NO: 4 is a backward outer primer of the invA gene;
서열번호5의 LF는 invA 유전자의 고리 정방향 프라이머(loop forward primer);LF of SEQ ID NO: 5 is a loop forward primer of the invA gene;
서열번호6의 LB는 invA 유전자의 고리 역방향 프라이머(loop backward primer)이다.LB in SEQ ID NO: 6 is a loop backward primer of the invA gene.
살모넬라균의 invA 유전자는 상피세포 부착 및 침습에 관련된 필수적인 유전자로, 살모넬라균 고유의 특이 서열을 가지고 있어 다양한 종류의 시료로부터 살모넬라 균체 검출에 사용될 수 있다. 본 발명에서는 invA 유전자를 마커로서 사용하여 살모넬라균에 특이적인 등온증폭(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)반응용 프라이머 세트를 제조하였다.The invA gene of Salmonella is an essential gene related to epithelial cell adhesion and invasion. It has a specific sequence unique to Salmonella and can be used for detection of Salmonella cells from various kinds of samples. In the present invention, a primer set for a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction specific to Salmonella was prepared using the invA gene as a marker.
상기 프라이머 세트는 등온증폭(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)법에 사용하는 것이 바람직하다.The primer set is preferably used in a Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method.
상기 살모넬라균은 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라에슐스(Salmonella choleraesuls)등이 있고, 그 외에도 살모넬라 톰슨(Salmonella thompson), 살모넬라 인팜티스(Salmonella infamtis) 및 살모넬라 더비(Salmonella derby)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.The Salmonella strains include Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuls, Salmonella thompson, Salmonella infamtis (Salmonella typhimurium), Salmonella spp. ) And Salmonella derby. ≪ / RTI >
본원 발명에서 사용하는 용어인 "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template, Refers to a short nucleic acid sequence that functions as a starting point. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents (DNA polymerase or reverse transcriptase) for polymerisation and four different dNTPs (deoxynucleoside triphosphate) at appropriate buffer solutions and temperatures.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.Primers can incorporate additional features that do not alter the primer's basic properties that serve as a starting point for DNA synthesis.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. The primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, "capping ", substitution of one or more natural nucleotides into homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers such as methylphosphonate, phosphotriester, (E.g., phosphoramidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). The nucleic acid can be in the form of one or more additional covalently linked residues such as a protein such as a nuclease, a toxin, an antibody, a signal peptide, a poly-L-lysine, an intercalator such as acridine, ), Chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.In addition, the primer nucleic acid sequences of the present invention may, if necessary, comprise markers detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules, chemical groups (e.g., biotin), etc. .
본원 발명에서 사용하는 용어인 "검출"은 시료에서 다른 미생물과 살모넬라균을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
As used herein, the term "detection" means that the microorganism and Salmonella can be distinguished from each other in the sample.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라균 검출용 성물을 포함한다.In addition, the present invention includes a salmonella detection composition comprising the aforementioned primer set.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for detecting salmonella comprising the above composition.
본 발명의 6개의 프라이머 조성물은 DNA를 증폭시킬 수 있는 등온증폭 (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응 방법에만 이용될 수 있다. 6개의 프라이머 조성물 중 2개(F3-forward outer primer, B3-backward outer primer)만 일반 PCR에 사용할 수 있다.The six primer compositions of the present invention can be used only in a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reaction method capable of amplifying DNA. Only two of the six primer compositions (F3-forward outer primer, B3-backward outer primer) can be used for general PCR.
본 발명에서 등온증폭은, 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension) 세 가지 단계의 온도의 변화를 주어야 하는 기존의 PCR과 달리, 일정한 온도에서 변성, 접합 및 신장이 가능한 장점이 있다. 등온증폭에서는 특히 Bst. DNA 중합효소를 사용하며, 이 Bst. DNA 중합효소는 일반 PCR의 Taq. DNA 중합효소와는 달리 헬리카제(helicase)의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 변성, 접합 및 신장이 수행될 수 있도록 한다.Isothermal amplification in the present invention is advantageous in denaturing, joining and stretching at a constant temperature, unlike the conventional PCR, in which the temperature must be changed in three stages of denaturation, annealing, and extension . In isothermal amplification, Bst. DNA polymerase is used, and this Bst. The DNA polymerase can be obtained from Taq. Unlike the DNA polymerase, it has the characteristic of helicase, so that the double helix structure of the DNA can be modified, joined and stretched at a junction temperature close to the Tm value without being subjected to heat denaturation.
본 발명의 살모넬라균 검출용 키트는 살모넬라균 검출용 프라이머 조성물과 미생물 검출키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 살모넬라균 검출용 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, Bst DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있다. 상기 살모넬라균 검출용 키트에는 살모넬라 판별용 배지 또는 상기 배지를 포함하는 균주 배양용 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 균주 배양용 장치는 상기 배지 특히, 바람직하게는 고체상의 상기 배지와 상기 배지가 적재되어 있는 용기로 구성될 수 있다.
The kit for detecting salmonella of the present invention may contain common components contained in the primer composition for detecting salmonella and the microorganism detection kit. Typical components included in the kit for detecting salmonella may be reaction buffer, Bst DNA polymerase, dNTP, MgCl 2 , and the like. The kit for detecting salmonella may further include a culture medium for identifying Salmonella or a culture apparatus for culturing a strain containing the culture medium. The apparatus for culturing a strain may be composed of the medium, particularly, the medium in the form of a solid, and a container on which the medium is loaded.
또한, 본 발명은 (a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;Further, the present invention provides a method for detecting a protein, comprising: (a) separating a genomic DNA (gDNA) of a sample;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, (b) using the separated genomic DNA as a template,
서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트A first primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트 및A second primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 3 and 4, and
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Amplifying the target sequence by performing an isothermal amplification reaction using a third primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 5 and 6; And
(c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 살모넬라균의 검출방법을 제공한다.(c) detecting the amplified product. The present invention also provides a method for detecting Salmonella.
본 발명의 살모넬라균의 검출방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.The method for detecting Salmonella according to the present invention will be described in detail as follows.
상기 (a) 단계는 시료의 게놈 DNA를 분리하는 단계로, 상기 시료는 생물학적 시료, 천연물(예를 들어, 물) 및 식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The step (a) is a step of isolating the genomic DNA of the sample, and the sample may be a biological sample, a natural product (e.g., water), and a food, but is not limited thereto.
상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변, 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물은 살모넬라균에 감염될 수 있는 종을 모두 포함하며, 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래, 닭 및 오리 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The biological sample may be, but is not limited to, blood, sweat, urine, feces, and tissue of an animal. The animal includes all species susceptible to Salmonella and includes, but is not limited to, humans, dogs, cows, pigs, sheep, whales, chickens and ducks.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 6개의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계이다. 상기 프라이머 세트는 살모넬라균의 invA 유전자를 표적으로 하는 프라이머이다. 상기 등온증폭반응은 60~67℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 64~66℃에서 수행될 수 있다.In the step (b), the genomic DNA isolated in the step (a) is used as a template and an isothermal amplification reaction is performed using 6 primer sets to amplify the target sequence. The primer set is a primer targeting the invA gene of Salmonella. The isothermal amplification reaction may be performed at 60 to 67 ° C, preferably at 64 to 66 ° C.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 서열을 검출하여 살모넬라균을 검출하는 단계로, 상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the step (c), the target sequence amplified in step (b) is detected to detect Salmonella, and the detection of the amplification product in step (c) is performed using DNA chip, gel electrophoresis, Or phosphorescence measurement, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행한 결과, 56종의 살모넬라 표준균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 살모넬라균 12종의 DNA중에서 살모넬라균만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였고, 높은 특이도와 민감도로 살모넬라 발생 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, the isothermal amplification reaction was carried out using the primer set according to the present invention. As a result, 56 Salmonella strains were detected, and only Salmonella strains among DNAs of 12 Salmonella species genetically and serologically related Specificity and susceptibility to Salmonella can be rapidly and accurately diagnosed with high specificity and sensitivity.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. It will be apparent to those skilled in the art that the embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.
실시예 1. 살모넬라균을 특이적으로 검출하는 LAMP용 프라이머 조성물의 제작Example 1. Preparation of primer composition for LAMP specifically detecting Salmonella
살모넬라균을 특이적으로 증폭할 수 있는 새로운 LAMP용 프라이머를 제작하기 위하여, 다양한 살모넬라균의 invA 유전자 서열(Genebank number U43252, U43272, U43273, M90846, NC016857)을 대상으로 CLUSTAL W(Lasergene? 10.1.1, USA)법을 이용하여 공통서열을 확보하였다. 확보한 공통서열을 토대로 Primer explorer V4 소프트웨어(http://primerexplorer.jp, Fujitsu Ltd., JP)을 이용하여 총 6개의 LAMP 프라이머를 제작하였다. 제작된 LAMP 프라이머는 내부 프라이머 세트(FIP, BIP), 외부 프라이머 세트(F3, B3) 및 고리 프라이머 세트(LF, LB)로 구성하였다. 이를 표 1에 나타내었으며, 서열번호 1 내지 6으로 표시하였다.In order to prepare a novel primer for LAMP capable of specifically amplifying Salmonella, the invA gene sequence (Genebank number U43252, U43272, U43273, M90846, NC016857) of various Salmonella strains was subjected to CLUSTAL W (Lasergene? 10.1 , USA). A total of six LAMP primers were constructed using Primer explorer V4 software (http://primerexplorer.jp, Fujitsu Ltd., JP) based on the obtained common sequences. The prepared LAMP primer consisted of internal primer set (FIP, BIP), external primer set (F3, B3) and ring primer set (LF, LB). These are shown in Table 1, and are shown in SEQ ID NOS: 1-6.
상기 표 2에서,In Table 2,
서열번호1의 FIP는 invA 유전자의 정방향 내부 프라이머;FIP of SEQ ID NO: 1 is a forward internal primer of the invA gene;
서열번호2의 BIP는 invA 유전자의 역방향 내부 프라이머;The BIP of SEQ ID NO: 2 is the reverse internal primer of the invA gene;
서열번호3의 F3는 invA 유전자의 정방향 외부 프라이머;F3 in SEQ ID NO: 3 is a forward external primer of the invA gene;
서열번호4의 B3는 invA 유전자의 역방향 외부 프라이머;B3 in SEQ ID NO: 4 is the reverse external primer of the invA gene;
서열번호5의 LF는 invA 유전자의 고리 정방향 프라이머;LF of SEQ ID NO: 5 is a cyclic forward primer of the invA gene;
서열번호6의 LB는 invA 유전자의 고리 역방향 프라이머이다.
LB in SEQ ID NO: 6 is a ring-reverse primer of the invA gene.
실시예Example 1. One. inclusivityinclusivity 및 And exclusivityexclusivity 시험 exam
본 발명에 사용한 균주정보를 하기 표 2에 나타내었다. 한국생명자원센터(KCTC)에서 분양받은 S. Enteritidis KCTC 23837, S. Typhimurium KCTC 12456을 inclusivity 실험 및 양성대조군으로 실험에 이용하였으며, 농림수산검역검사본부에서 분양 받은 다양한 혈청형의 Salmonella spp. 44주 및 오리도체시료에서 분리한 Salmonella spp. 10주를 inclusivity 실험에 이용하였다. 살모넬라균 외의 표준균주 12주는 exclusivity 실험에 이용하였다. Inclusivity는 실험에 이용된 살모넬라균의 표준균주 및 분리주 중 개발된 LAMP법으로 증폭반응을 보인 비율로 정의하였고, exclusivity는 실험에 이용된 살모넬라균 외의 표준균주 및 분리주 중 개발된 LAMP법으로 증폭반응이 나타나지 않은 비율로 정의하였다.The strain information used in the present invention is shown in Table 2 below. S. enteritidis KCTC 23837 and S. typhimurium KCTC 12456, which were purchased from the Korea Life Resource Center (KCTC), were used for the inclusivity test and the positive control group. The serotypes of Salmonella spp. Salmonella spp. Isolated from 44 week and duck conductor samples. Ten weeks were used for inclusivity experiments. 12 strains other than Salmonella strains were used for exclusivity experiments. Inclusivity was defined as the rate of amplification by the LAMP method developed for the standard strains and isolates of Salmonella used in the experiment. The exclusivity was defined as the amplification reaction by the LAMP method developed among the standard strains and isolates of Salmonella used in the experiment And the ratio was not shown.
총 56개의 살모넬라 표준균주 및 분리주에 대해 LAMP의 inclusivity 시험을 시행한 결과, 56개의 균주에서 모두 양성의 증폭반응이 관찰되었다. 한편, 총 12개의 살모넬라균 외의 표준균주에 대해 exclusivity 시험을 시행한 결과, 12개의 균주에서 모두 음성의 증폭반응이 관찰되어 inclusivity 및 exclusivity는 각각 100%로 판정하였다. 모든 실험군에서 양성대조군과 음성대조군을 사용하였으며 가양성 및 가음성 결과는 관찰되지 않았다. 같은 시료를 PCR법으로 실험한 결과도 이와 같이 관찰되었다. 이는 invA 유전자가 살모넬라균을 검출하는데 매우 효과적임을 나타낸다. A total of 56 Salmonella strains and isolates were tested for inclusivity by LAMP. As a result, positive amplification reactions were observed in 56 strains. On the other hand, exclusion test of 12 strains except Salmonella strains showed that the amplification reaction of negative was observed in all 12 strains, and the inclusivity and exclusivity were 100%. Positive and negative controls were used in all experimental groups, and false positives and negative results were not observed. The results of the same PCR were also observed. Indicating that the invA gene is highly effective in detecting Salmonella.
실시예Example 3. 3. 살모넬라균(Salmonella ( SalmonellaSalmonella sppspp .) 검출한계 확인.) Confirm detection limit
3-1. LAMP 및 PCR법의 반응 조건3-1. Reaction conditions of LAMP and PCR
LAMP 반응액은 GspSSD DNA 중합효소(OptiGene Ltd., UK)를 이용하여 제조하였다. 총 반응액 20μL 중 프라이머의 최종농도는 FIP 및 BIP 0.8μM, LF 및 LB 0.4μM, F3 및 B3 0.2μM로 설정하였으며 GspSSD DNA 중합효소 6U, 주형 DNA는 4μL 첨가하였다. 음성대조군의 경우에는 뉴클레아제가 없는 3차 멸균증류수를 주형으로 첨가하였다. 반응액은 Genie? II platform(OptiGene Ltd., UK)을 이용하여 60~67℃ 사이의 온도에서 최적화 실험을 선행하였고, 같은 농도에서 검출시간이 가장 빨랐던 65℃를 등온증폭반응을 위한 최적 온도로 확인하고, 상기 온도에서 30분 동안 증폭을 수행하였으며, 증폭결과는 X축의 검출시간 (T)과 Y축의 형광세기 (K)의 증폭곡선으로 나타내었으며, 분석 결과 도출되는 어닐링 온도값을 기반으로 85.87±0.26℃ 범위 내의 값을 갖는 시료를 양성으로 판정하였다.The LAMP reaction solution was prepared using GspSSD DNA polymerase (OptiGene Ltd., UK). The final concentration of the primers in the total reaction solution was set to 0.8 μM of FIP and BIP, 0.4 μM of LF and LB, 0.2 μM of F3 and B3, and 6 μl of GspSSD DNA polymerase and 4 μL of template DNA were added. In the case of negative control, third sterilized distilled water without nuclease was added as a template. The reaction solution is Genie? II platform (OptiGene Ltd., UK), and the optimum temperature for the isothermal amplification reaction was determined as 65 ° C., which was the fastest detection time at the same concentration, And amplification was performed for 30 min. The amplification result was represented by the amplification curve of the detection time (T) of the X axis and the fluorescence intensity (K) of the Y axis. Based on the annealing temperature value obtained from the analysis, Was determined to be positive.
PCR 반응은 기존에 보고된 연구의 프라이머 및 반응 조건을 참고하여 실험하였다(Rahn et al., 1992). 보다 구체적으로, 총 25μL의 반응용액은 AmpliTaq? Gold DNA 중합효소 (Applied Biosystems, UK)를 사용하여 제조하였으며, 1μL 주형 DNA를 첨가하였다. 음성대조군의 경우 Nuclease free 멸균3차증류수를 주형으로 1μL 첨가하였다. 반응용액의 증폭은 MyCycler™ Thermal Cycler (Bio-Rad Inc., USA)를 사용하였다.PCR reactions were performed by reference to primers and reaction conditions of previously reported studies (Rahn et al., 1992). More specifically, a total of 25 μL of the reaction solution was AmpliTaq? Gold DNA polymerase (Applied Biosystems, UK) and 1 μL template DNA was added. In the case of negative control, 1 μL of Nuclease free sterilized tertiary distilled water was added as a template. The reaction solution was amplified using MyCycler ™ Thermal Cycler (Bio-Rad Inc., USA).
모든 실험군에서 양성대조군(S. Enteritidis KCTC 23837)과 음성대조군(뉴클레아제가 없는 3차 멸균증류수)을 사용하였다. 표준곡선 및 정량공식을 유도하기 위한 검출한계 실험은 3번 반복하였으며, 그 외는 2번 반복 실험하였다.A positive control (S. Enteritidis KCTC 23837) and a negative control (third sterilized distilled water without nuclease) were used in all experimental groups. The detection limit experiment to derive the standard curve and the quantification formula was repeated three times, and the others were repeated two times.
3-2. 살모넬라균 순수 배양액에서의 검출한계 확인3-2. Identification of detection limit in pure culture of Salmonella
Tryptic Soy Agar (Becton Dickinson, USA; TSA)에서 순수 분리된 S. Enteritidis KCTC 23837의 1개 집락을 Tryptic Soy Broth (Becton Dickinson, USA; TSB)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 McFarland scale 2.5에 맞추었다. 멸균생리식염수에 10배씩 단계별로 희석한 후, Plating Count Agar(Becton Dickinson, USA)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고 균수를 측정하였다. 단계별로 희석된 시료 중의 1mL은 바로 DNA를 추출하여 검출한계 실험에 사용하였으며, 실험 수행의 결과를 도 1에 나타내었다.One of the colonies of S. enteritidis KCTC 23837 purified from Tryptic Soy Agar (Becton Dickinson, USA; TSA) was inoculated into Tryptic Soy Broth (Becton Dickinson, USA; TSB) and incubated at 37 ° C for 24 hours. Respectively. The cells were diluted 10-fold in sterile physiological saline, and then inoculated on a Plating Count Agar (Becton Dickinson, USA) and cultured at 37 ° C for 24 hours. 1 mL of the diluted samples was directly used for the detection limit experiment by extracting DNA, and the results of the experiment were shown in FIG.
도 1에 나타낸 바와 같이, 3.2×107 CFU/mL부터 3.2×103 CFU/mL까지의 시료는 11.08 분에서 18.17분 사이에 순서대로 성공적으로 증폭되었다. 총 반응시간 30분이 지난 후 어닐링 온도 결과를 토대로 모두 양성의 증폭산물이 생성되었음을 확인하였다(85.87±0.26°C). LAMP법의 검출한계는 3.2×103 CFU/mL이며, 이 때의 검출시간은 평균 18.17±0.80분이었다. 같은 시료를 이용하여 PCR을 수행한 결과 검출한계는 3.2×105 CFU/mL로 이므로 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 LAMP법이 기존의 PCR보다 100배 더 민감한 것을 확인하였다. As shown in FIG. 1, samples from 3.2 × 10 7 CFU / mL to 3.2 × 10 3 CFU / mL were successively amplified in order from 11.08 min to 18.17 min. After a total reaction time of 30 min, it was confirmed that all positive amplification products were generated based on the annealing temperature results (85.87 ± 0.26 ° C). The detection limit of the LAMP method was 3.2 × 10 3 CFU / mL, and the detection time was 18.17 ± 0.80 min. As a result of performing PCR using the same sample, the detection limit was 3.2 × 10 5 CFU / mL. Therefore, it was confirmed that the LAMP method using the primer set according to the present invention was 100 times more sensitive than the conventional PCR.
또한, LAMP법의 간접정량화 가능성을 확인하기 위하여, 정량공식을 유도하였으며 이의 결과를 도 2에 나타내었다. In order to confirm the possibility of indirect quantification of the LAMP method, a quantitative formula was derived and the results are shown in FIG.
도 2에 나타낸 바와 같이, 정량공식은 y=-1.7667x + 23.734이며, 이 때의 R2값은 0.9446임을 확인하였다. E. coli의 시가독소 유전자(stx)를 타겟으로 LAMP법을 개발한 연구에서는 R2 값의 범위를 0.904 부터 0.997 사이로 보고하였으므로, 본 발명에서 유도한 정량공식은 3.2×107 CFU/mL에서 3.2×103 CFU/mL사이의 범위에서 미지의 농도로 존재하는 살모넬라 균체를 간접적으로 정량할 수 있음을 나타낸다.
As shown in FIG. 2, the quantitative formula was y = -1.7667x + 23.734, and the R 2 value at this time was found to be 0.9446. In a study in which the LAMP method was developed targeting the E. coli cytotoxin gene (stx), the range of R 2 values ranged from 0.904 to 0.997, so the quantification formula derived from the present invention was 3.2 × 10 7 CFU / mL to 3.2 X 10 < 3 > CFU / mL. ≪ / RTI >
3-3. 살모넬라균 3-3. Salmonella 증균액(BPW)에서의(BPW) in the presence of 검출한계 확인 Confirm detection limit
살모넬라균 증균액(BPW)상에서의 검출한계를 확인하기 위하여 상기 실시예 3-2에서 단계별 희석된 시료 중의 1mL를 각각 BPW 9mL에 접종하였다. 접종 후 배양 0시간 및 12시간에 각 시료당 1mL씩을 취하여 바로 DNA를 추출하거나 -20℃ 에서 보관 후 DNA를 추출하여 검출한계 실험에 사용하였으며, 실험 수행의 결과를 표 3에 나타내었다.In order to confirm the detection limit on Salmonella spp. (BPW), 1 mL of the diluted sample in Example 3-2 was inoculated into 9 mL of BPW, respectively. After inoculation, 1 mL of each sample was taken at 0 hours and 12 hours after the inoculation, and DNA was immediately extracted from the sample or stored at -20 ° C., and DNA was extracted for use in the detection limit experiment. The results of the experiment are shown in Table 3.
CFU/mL
CFU / mL
swab enriched in BPW (BPWS)Duck carcass
swab enriched in BPW (BPWS)
3.2 × 10 6
3.2 × 10 5
3.2×104
3.2 x 10 4
3.2×103
3.2 x 10 3
3.2×102
3.2 x 10 2
3.2 × 10 1
3.2×100
3.2 × 10 0
표 3에 나타낸 바와 같이, BPW 배지에서 12시간 배양한 살모넬라균 증균액(BPW-12)상에서의 검출한계는 LAMP 및 PCR 모두 시험한 범위 내의 시료(3.2×106 CFU/mL부터 3.2×100 CFU/mL까지)에서 증폭되었다. 한편, BPW배지에서 접종 후 0시간 배양한 살모넬라균 증균액(BPW-0)상에서의 LAMP와 PCR의 검출한계는 각각 3.2×103 CFU/mL 및 3.2×105 CFU/mL으로 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 LAMP법이 기존의 PCR에 비해 100배 더 민감한 것을 확인하였다.As shown in Table 3, the detection limit on the bacterium Salmonella (BPW-12) cultured in the BPW medium for 12 hours was 3.2 × 10 6 CFU / mL to 3.2 × 10 0 CFU / mL). On the other hand, the detection limits of LAMP and PCR on Salmonella enterococci (BPW-0) cultured for 0 hours after inoculation on BPW medium were 3.2 × 10 3 CFU / mL and 3.2 × 10 5 CFU / mL, It was confirmed that the LAMP method using the primer set was 100 times more sensitive than the conventional PCR.
또한, BPW의 성분이 유전자 증폭반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여 BPW-0와 멸균생리식염수상에서의 검출한계를 비교한 결과, LAMP 및 PCR에서 3.2×103 CFU/mL 및 3.2×105 CFU/mL로 일정하여 BPW 배지의 성분은 LAMP 및 PCR 반응을 저해하지 않음을 확인하였다.
In order to investigate the effect of BPW components on gene amplification, the detection limits of BPW-0 and sterilized physiological saline were compared. As a result, 3.2 × 10 3 CFU / mL and 3.2 × 10 5 CFU / mL, indicating that the components of the BPW medium do not inhibit LAMP and PCR reactions.
3-4. 3-4. 오리도체시료Duck conductor sample 채취 및 균주 분리 Harvesting and isolating strains
2013년 5월 1회에 걸쳐 서울시 구로구 소재의 대형마트 1곳에서 냉동상태의 오리(지육)를 구입하여 4℃에서 실험실로 즉시 운송하였다. 50℃로 설정된 항온수조에서 급격히 해동한 오리 지육을 5 mL의 Buffered Peptone Water (Becton Dickinson, USA; BPW)로 습한 멸균된 거즈를 사용하여 흉부를 3~5회 겹치지 않게 닦아낸 후 25 mL의 BPW에 넣고 세게 진탕하였다. 진탕액 10 mL를 90 mL의 BPW에 접종하여 37℃에서 24시간 정치배양하였다. BPW 배양액 1 mL를 Tetrathionate broth, Hajna (Becton Dickinson, USA; TTH)배지 10 mL 중에 접종하여 진탕한 후 37℃에서 24시간 정치배양하였다. TTH 배양액 10 μL를 XLT4 한천 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 전형적인 살모넬라균 집락이 형성되지 않았음을 확인하고, BPW 배양액에서의 LAMP 및 PCR 결과 invA 유전자의 증폭산물이 관찰되지 않음을 확인한 후 인공접종 실험의 시료로 사용하였다.
In May 2013, frozen ducks were purchased from 1 large mall in Guro-gu, Seoul and immediately transported to the laboratory at 4 ℃. The duck fat, which was thawed rapidly in a constant temperature water bath set at 50 ° C, was wiped with 5 mL of Buffered Peptone Water (Becton Dickinson, USA; BPW) using wet sterilized gauze to prevent the chest from overlapping 3-5 times. And vigorously shaken. 10 mL of the shampoo solution was inoculated into 90 mL of BPW and incubated at 37 DEG C for 24 hours. 1 mL of BPW culture was inoculated in 10 mL of Tetrathionate broth, Hajna (Becton Dickinson, USA; TTH) medium, and incubated at 37 ° C for 24 hours. TTH culture was inoculated on XLT4 agar medium and cultured at 37 ° C for 24 hours. It was confirmed that no typical Salmonella colonies were formed, and amplification products of invA gene were not observed in LPS and PCR in BPW medium And then used as a sample for artificial inoculation experiment.
3-5.3-5. 인공접종된Artificially-inoculated 오리도체시료Duck conductor sample 증균액(BPWS)에서의(BPWS) 검출한계 확인 Confirm detection limit
살모넬라균이 인공접종된 오리도체시료 증균액(BPWS)상에서의 검출한계를 확인하기 위하여 상기 실시예 3-2에서 단계별 희석된 시료 중의 1mL를 각각의 오리도체시료가 접종된 BPW 9mL에 접종하였다. 접종 후 배양 0시간 및 12시간에 각 시료당 1mL씩을 취하여 바로 DNA를 추출하거나 -20℃ 에서 보관 후 DNA를 추출하여 검출한계 실험에 사용하였으며, 실험 수행의 결과를 상기 표 3에 나타내었다.1 mL of the diluted samples in Example 3-2 was inoculated into 9 mL of BPW inoculated with each of the duck specimens in order to confirm the detection limit on the BPWS inoculated with salmonella. After inoculation, 1 mL of each sample was taken at 0 hour and 12 hours after the inoculation. The DNA was immediately extracted from the sample or stored at -20 ° C., and the extracted DNA was used for the detection limit experiment. The results of the experiment are shown in Table 3 above.
표 3에 나타낸 바와 같이, 12시간 증균 후 LAMP의 검출한계는 3.2×100 CFU/mL이고, PCR의 검출한계는 3.2×101 CFU/mL으로 나타났으며, 이를 통해 LAMP가 10배 더 민감한 것을 확인하였다. 한편, 접종 후 0시간에서 LAMP의 검출한계는 3.2×103 CFU/mL이고, PCR의 검출한계는 3.2×105 CFU/mL으로 나타났으며, 이를 통해 LAMP가 PCR보다 100배 더 민감한 것을 확인하였다.As shown in Table 3, the detection limit of LAMP was 3.2 × 10 0 CFU / mL after 12 hours of incubation, and the detection limit of PCR was 3.2 × 10 1 CFU / mL, indicating that LAMP was 10 times more sensitive Respectively. On the other hand, the detection limit of LAMP was 3.2 × 10 3 CFU / mL and the detection limit of PCR was 3.2 × 10 5 CFU / mL at 0 hour after inoculation, confirming that LAMP was 100 times more sensitive than PCR Respectively.
또한 배양액 종류에 상관없이 12시간 증균액의 LAMP 및 PCR의 검출한계 결과를 비교하면 LAMP의 검출한계는 3.2×100 CFU/mL으로 일정하였으나 PCR의 검출한계는 오리도체시료가 포함된 증균액에서 감도가 10배 떨어지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 LAMP법은 지방, 단백질 등의 성분이 포함된 오리도체 시료에 의한반응의 저해가 관찰되지 않으므로 기존의 PCR에 비해 시료 내 살모넬라 균체 존재 여부를 정확하게 검출할 수 있는 효과적인 방법임을 확인하였다.
In addition, the detection limits of LAMP and PCR were constant at 3.2 × 100 CFU / mL, regardless of the type of culture medium. However, the limit of detection of PCR was found to be sensitive to sensitivity Which was 10 times lower than that of the control group. Therefore, the LAMP method using the primer set according to the present invention can not accurately detect the presence of Salmonella cells in the sample as compared with the conventional PCR because the inhibition of the reaction by the test sample containing the fat and protein is not observed Which is an effective method.
실시예Example 4. 4. LAMP용For LAMP 프라이머primer 조성물의 민감도 확인 Identify the sensitivity of the composition
2013년 6월 1회에 걸쳐 국내 소재의 도압장 1곳에서 오리도체의 표면시료 100점을 수집하였다. 5 mL의 멸균생리식염수로 습한 멸균된 거즈를 사용하여 도체의 흉부를 3~5회 겹치지 않게 닦아낸 후, 25 mL의 BPW에 넣어 냉장조건에서 실험실로 즉시 운송하였다. 시료를 세게 진탕한 후, 진탕액 10 mL를 37℃ 에서 6시간 정치배양하였다. BPW 배양액 1 mL를 TTH 배지 10 mL 중에 접종하여 진탕한 후 37℃ 에서 24시간 정치배양하였다. TTH 배양액 10 μL를 XLT4 한천 배지에 접종하여 37℃ 에서 24시간 배양한 후 전형적인 살모넬라균 집락을 관찰한 후, 양성 추정 집락만을 선택하여 Rambach 한천 배지(Becton Dickinson, USA)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 양성 추정 집락은 VITEK 2 compact system(BioMerieux, France)을 사용하여 생화학적 동정을 거쳐 최종적으로 판정하였다. In June 2013, 100 samples of surface samples of duck conductors were collected from one location in Korea. The chest of the conductor was wiped off 3 to 5 times with 5 mL of sterile physiological saline using wet sterile gauze, and immediately transferred to the laboratory under refrigeration conditions in 25 mL of BPW. After vigorously shaking the sample, 10 mL of the shaking solution was incubated at 37 DEG C for 6 hours. 1 mL of the BPW culture was inoculated in 10 mL of TTH medium, shaken, and cultured at 37 DEG C for 24 hours. TTH culture was inoculated on XLT4 agar medium and incubated at 37 ° C for 24 hours. A typical Salmonella colony was observed, and positive cultured colonies were selected and inoculated into Rambach agar medium (Becton Dickinson, USA) Time. The positive colonies were finally identified by biochemical identification using the
BPW 배양액 1 mL는 오리도체시료 증균액에서의 민감도 실험을 위하여 -20℃ 에서 보관 후 DNA를 추출하였다. 살모넬라균 양성 시료 25개에서 추출한 DNA를 주형으로 이용하여, LAMP 및 PCR법을 수행하였으며, 민감도를 확인하였다. 25개 양성 시료 중 LAMP 및 PCR로 양성으로 판정된 시료수의 비율로 민감도(sensitivity)를 계산하였으며, 이의 결과를 표 4에 나타내었다. 1 mL of BPW culture was stored at -20 ° C for DNA susceptibility test. LAMP and PCR were performed using DNA extracted from 25 Salmonella positive samples as a template and the sensitivity was confirmed. Sensitivity was calculated as the ratio of the number of samples determined to be positive by LAMP and PCR among 25 positive samples. The results are shown in Table 4.
- 민감도 = (양성 판정 시료 개수)/(양성 시료 개수)×100 (%)- Sensitivity = (number of positive determination samples) / (number of positive samples) × 100 (%)
표 4에 나타낸 바와 같이, LAMP법으로는 25개 양성시료 중 24개(민감도 96%)를 양성으로 판정하였고, PCR은 13개의 시료를 양성으로 판정하였다(민감도 52%). 이는 표준 배양법과 달리 2차 증균액인 TTH 배양액을 사용하지 않고 BPW에서 6시간 배양한 1차 증균액을 사용하였기 때문에, 증균액 중 살모넬라균이 LAMP의 검출한계 이하로 존재하여 25개 양성시료 중 1개에서 음성으로 판정된 것으로 추측된다. 그러나 PCR법에 비교했을 때 LAMP법은 1차 증균만으로도 시료 내에 적은 농도로 존재하는 살모넬라 균체를 효과적으로 검출할 수 있음을 나타낸다. 뿐만 아니라, 표준배양법으로는 최종 판정까지 5일 가량의 시간이 소요되나 LAMP법으로는 6시간 동안 배양한 1차 증균만으로도 시료 채취 당일에 신속히 결과를 판정할 수 있기 때문에 검사 시간, 인력 및 비용을 효과적으로 절감할 수 있음을 나타낸다.As shown in Table 4, 24 of the 25 positive samples (96% sensitivity) were judged to be positive by the LAMP method, and 13 samples were judged positive by PCR (sensitivity: 52%). This is because, unlike the standard culture method, the first-order bacterium that was cultured in BPW for 6 hours was used without using the TTH culture medium, which is a secondary bacterium, so that Salmonella in the mycorrhizal fungus was below the detection limit of LAMP, It is presumed that one voice is judged by voice. However, as compared with the PCR method, the LAMP method indicates that Salmonella cells present in a small concentration in the sample can be effectively detected by only primary coagulation. In addition, the standard culture method takes about 5 days to reach the final judgment. However, since the LAMP method can be used to determine the results on the day of sampling even with the first incubation incubated for 6 hours, the test time, manpower and cost It can be effectively saved.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Primer set for Salmonella spp.-specific identification using loop-mediated isothermal amplification and method for detecting Salmonella spp. using the same <130> p-181 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 1 atgatgccgg caatggcgtc agccagcttt acggttcct 39 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 2 gatgacccgc catggtatgg atccatcacc gatggtcagc 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 3 gaagcgtact ggaaagggaa 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 4 gggatctggg cgacaaga 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 5 ttgataaact tcatcgcacc gt 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 6 ttatcctccg cgctgtctac tta 23 <110> SNU R & DB FOUNDATION <120> Primer set for Salmonella spp. -Specific identification using loop-mediated isothermal amplification and method detecting Salmonella spp. using the same <130> p-181 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 1 atgatgccgg caatggcgtc agccagcttt acggttcct 39 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 2 gatgacccgc catggtatgg atccatcacc gatggtcagc 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 3 gaagcgtact ggaaagggaa 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 4 gggatctggg cgacaaga 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 5 ttgataaact tcatcgcacc gt 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Salmonella ssp. <400> 6 ttatcctccg cgctgtctac tta 23
Claims (11)
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고,
서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트 및
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트를 이용하여 64~66℃에서 실시간 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 것으로, 살모넬라균의 invA 유전자를 표적으로 하여 시료 내 살모넬라균 감염 여부를 균분리가 완료되기 전 선별진단 하는 것을 특징으로 하는 살모넬라균의 검출방법.(a) separating the genomic DNA (gDNA) of the hypobarbital cultured in the biological sample or the conductor sample for 1 to 12 hours;
(b) using the separated genomic DNA as a template,
A first primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2
A second primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 3 and 4, and
Performing a real-time isothermal amplification reaction at 64 to 66 ° C using a third primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 5 and 6 to amplify the target sequence; And
(c) detecting the amplified product, wherein the invA gene of Salmonella is used as a target, and the presence or absence of Salmonella infection in the sample is screened prior to completion of bacterial isolation Way.
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