KR101490346B1

KR101490346B1 - 유기금속화합물을 유효성분으로 하는 항균제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101490346B1
Application number: KR20130067067A
Authority: KR
Inventors: 이형진; 오승호; 김윤지; 김순기
Original assignee: 이형진; 오승호; 김윤지
Priority date: 2013-06-12
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2015-02-10
Also published as: KR20140144901A

Abstract

아연(zinc)과 철(iron)을 함유하는 유기금속화합물을 유효 성분으로 포함하는 항균제 및 그 제조방법에 관한 것으로, (a) 물 100중량부에 대하여 유기산 1~3중량부를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계, (b) 상기 용해물에 아연 및 철을 각각 1000~3000ppm 및 10000~30000ppm의 농도로 투입하여 복합체를 형성하는 단계, (c) 상기 복합체를 50~60℃에서 48~72시간 반응시켜 반응물을 형성하는 단계 및 (d) 상기 반응물을 수득한 후 정제하는 단계를 포함하여 제조된 항균제를 마련하여, 포유동물에 적용하여 유기 항생제의 기능을 발휘할 수 있다.

Description

유기금속화합물을 유효성분으로 하는 항균제 및 그 제조방법{Antimicrobial agent comprising organic metal compounds as active ingredient and method for preparing thereof}

본 발명은 유기 항균제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 특히 아연(zinc)과 철(iron)을 함유하는 유기금속화합물을 유효 성분으로 포함하는 유기 항균제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

항균제(antimicrobial agent)는 세균성 질병의 치료에 쓰이는 약제로서 먹이거나 주사 또는 약욕 등과 같은 방법으로 병원을 죽이거나 발육을 저지하고, 항생물질, 약제, 설파제 및 nitrofuran제는 주로 먹이거나 주사에 사용한다.

이와 같은 항균제는 크게 유기계와 무기계로 대별될 수 있으며 그 작용에 따라서는 살균과 항균으로 나뉠 수가 있다.

유기계 항균제는 약제의 용출에 의한 효과를 주로 이용하며, 살균보다는 세균의 군락 형성하는 것을 방지하는 항균에 가까운 작용을 한다, 유기계를 사용할 경우의 가장 큰 장점은 제품에 가공시 표면으로의 노출이 빠르게 진행되어 즉각적인 세균 번식을 방지하는 기능을 한다는 점이다. 그리고 비교적 싸다는 점과 제품의 색상에 큰 영향을 미치지 않는다는 점과 가공이 용이하다는 점도 장점이다. 반면에 단점으로는 빠른 용출로 인하여 내구성이 취약하다는 점이다. 고온작업의 조건의 제품에서는 유기항균제의 열분해로 인해 적용이 불가능하다는 점과 인체 및 환경에의 유해성 등의 문제점이 발생한다. 대표적인 유기항균제는 유기금속계로서 비소(As)계의 OBPA(oxybisphenox arsine)로서 욕실용 실란트에는 거의 모두가 이를 사용하고 있다.

무기계 항균제는 주로 은, 구리, 아연과 같은 금속이온이 사용된다. 구리의 경우에는 독성 및 산화에 의한 변색의 문제로 인해 건자재 등에만 적용이 될 뿐이며, 실제적으로는 은이 가장 많이 응용이 되고 있다. 은 이온의 경우는 세포벽과 결합하여 에너지이동을 방해하거나 세포 내에 침투한 경우에는 단백질의 황성분과 결합함으로써 신진대사를 일으키는 효소의 작용을 억제함으로써 세균을 죽게 한다. 금속이온은 제품 내의 함침된 금속성분으로부터 이온화가 되어 제품의 표면으로 용출됨으로써 작용을 하는데 은 입자의 경우 수 ppb의 농도로 용출되기 때문에 함량이 적정하면 대부분은 제품의 내구성까지 지속적인 작용을 하게 된다.

또한 최근에는 나노기술의 발달로 벌크입자보다는 나노입자를 응용하는 경우가 비약적으로 발전이 되고 있다. 나노입자를 사용할 경우에는 질량대비 비표면적의 증가로 용출을 극대화할 수가 있어 훨씬 소량으로도 동일한 효과를 발휘할 수 있어서 경제적인 면으로도 획기적으로 낮출 수 있다.

이러한 무기계 항균제에 대한 기술의 일 예가 하기 문헌 1 및 2 등에 개시되어 있다.

예를 들어, 하기 특허문헌 1에는 금속 이온으로 치환된 무기 담체, 상기 금속 이온으로 치환된 무기 담체에 담지되며, 수산화 알루미늄, 수산화 지르코늄 또는 이들의 조합으로 이루어진 금속 수산화물 나노 입자 및 상기 금속수산화물 나노 입자가 담지되고, 금속 이온으로 치환된 무기 담체에 형성된 규산나트륨 코팅층을 포함하는 무기 항균제에 대해 개시되어 있다.

또 하기 특허문헌 2에는 은 이온(Ag+)을 포함하는 염 수용액 0.1 내지 1.0 mole/L과 설페이트계 음이온을 포함하는 염 수용액 1.0 내지 5 mole/L을 혼합한 후, 60 내지 80 ℃에서 30분 내지 2시간 정도 숙성시켜 평균 입경이 2 내지 5 nm인 은(Ag)-설페이트계 착체를 제조하는 단계 및 상기 단계에서 제조된 은(Ag)-설페이트계 착체를 물에 10 내지 1000 ppm으로 희석시키는 단계를 포함하는 은계 항균제의 제조방법에 대해 개시되어 있다.

대한민국 특허등록공보 제10-1244778호(2013.03.12 등록) 대한민국 특허등록공보 제10-0652941호(2006.11.24 등록)

그러나, 상술한 바와 같은 종래의 기술에서는 식품의 신선도 유지를 위한 탈취 기능, 가축 또는 농산물에만 발휘하는 무기 항균제에 대해서만 개시되어 있을 뿐, 인체에 적용하는 유기 항균제의 기술에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않았다.

본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 포유 동물에 적용을 하여도 부작용이 없으면서 치료에 효과적인 유기금속화합물을 유효성분으로 하는 유기 항균제 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 유기 항균제는 유기금속 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 유기 항균제에 있어서, 상기 유기금속 화합물은 아연과 철을 함유하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 유기 항균제에 있어서, 상기 아연은 산화 아연인 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 유기 항균제에 있어서, 상기 산화 아연은 나노입자로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 유기 항균제에 있어서, 상기 유기금속 화합물은 약학적 조성물 총 중량에 대해 1~14 중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 유기 항균제의 제조방법은 (a) 물 100중량부에 대하여 유기산 1~3중량부를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계, (b) 상기 용해물에 아연 및 철을 각각 1000~3000ppm 및 10000~30000ppm의 농도로 투입하여 복합체를 형성하는 단계, (c) 상기 복합체를 50~60℃에서 48~72시간 반응시켜 반응물을 형성하는 단계 및 (d) 상기 반응물을 수득한 후 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 유기 항균제의 제조방법에 있어서, 상기 유기산은 구연산(citric acid)이고, 상기 아연은 나노입자로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 경구약제는 상술한 바와 같은 유기 항균제의 제조방법에 의해 제조되고, 정제, 피복정제, 과립제, 산제 또는 캡슐의 형태로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 주사제는 상술한 바와 같은 유기 항균제의 제조방법에 의해 제조되고, 비경구 투여용 제제로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 피부 외용제는 상술한 바와 같은 유기 항균제의 제조방법에 의해 제조되고, 페이스트 연고, 크림, 밀크, 파프제, 분제, 침투 패드, 용액, 겔, 분무제, 로션 또는 현탁액 형태의 제형으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 유기금속화합물을 유효성분으로 하는 유기 항균제 및 그 제조방법에 의하면, 포유 동물에 적용하여 유기 항생제의 기능을 발휘할 수 있다는 효과가 얻어진다.

도 1은 본 발명의 아연과 철을 함유하는 유기금속화합물에 대한 매스 스펙트럼(Mass Spectrum)을 보여주는 그래프,
도 2는 그람 양성 세균에 대한 시험물질의 항균 활성 시험의 결과를 나타낸 도면,
도 3은 그람 음성 세균에 대한 시험물질의 항균 활성 시험의 결과를 나타낸 도면,
도 4는 진균에 대한 시험물질의 항진균 활성 시험을 나타낸 도면,
도 5는 그람 양성 세균에 대한 시험물질의 두 가지 농도(10%, 30%)에 의한 항균 활성 시험 결과를 나타낸 도면,
도 6은 그람 음성 세균에 대한 시험물질의 두 가지 농도(10%, 30%)에 의한 항균 활성 시험 결과를 나타낸 도면,
도 7은 시험물질과 대조군의 시간별 항균활성을 나타내는 그래프.

본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

먼저 본 발명이 적용되는 유기 항균제의 특성에 대해 기술한다.

본 발명에 사용되는 산화아연(Zinc oxid, ZnO)은 미 FDA에서도 '일반적으로 안전한 것으로 알려져 있는 물질'로 규정하고 있다.

최근 ZnO 나노입자의 독성 대한 연구에서, ZnO 나노입자는 사람의 세포에 대해 매우 제한적인 낮은 독성을 나타내는 반면, 박테리아에서는 높은 독성(항 세균 활성)을 나타낸다는 결과가 발표되었다.

이는 ZnO 나노입자가 의약품(항생제) 소재로서의 갖추어야 할, 진핵세포(사람)와 원핵세포(병원균)에 대한 선택능이 있음을 제시하는 중요한 결과이다.

이러한 ZnO의 세균에 대한 항세균 활성의 정확한 작용 기전에 대해서는 구체적으로 알려져 있지 않지만, 최근, 그람 음성균주인 Campylobacter jejuni에 대한 ZnO의 항균 활성 연구에 의하면 ZnO는 1차적으로 병원균의 세포막에 직접 작용하여 세포막에 손상을 유발하며, 2차적으로는 손상된 세포막을 통해 유입된 ZnO가 병원균의 산화적 스트레스를 유발함으로써, 세포의 성장을 억제하고 최종적으로는 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있다(Yanping et al, 2011).

본 출원인은 산화아연을 핵심소재로 하여, ZnO를 나노 입자화하는 기술과 나노 입자화된 ZnO의 항미생물 활성을 증가시킬 수 있는 방안에 대한 연구를 통해 시험물질 도출과 효과(피부 재생 효과, 항미생물 활성, 감염모델에서의 치료효과)를 입증함으로써, 새로운 항미생물 소재를 개발하였다.

이하, 본 발명의 구성을 도면에 따라서 설명한다.

본 발명은 다음의 단계들을 포함하여 제조되는 유기금속화합물을 유효 성분으로 함유하는 유기 항균제를 제공한다:

(1) 물 100중량부에 대하여 유기산 1~3중량부를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계,

(2) 상기 용해물에 아연 및 철을 각각 1000~3000ppm 및 10000~30000ppm의 농도로 투입하여 복합체를 형성하는 단계,

(3) 상기 복합체를 50~60℃에서 48~72시간 반응시켜 반응물을 형성하는 단계 및

(4) 상기 반응물의 상층액을 수득한 후 정제하는 단계.

상기 단계 (1)의 유기산은 구연산(citric acid)인 것이 바람직하다. 물에 투입되는 유기산의 함량이 1 중량부 미만인 경우에는 반응물이 지나치게 적어져서 유효 성분으로 작용하는 유기금속화합물을 충분히 얻을 수 없는 문제점이 있고, 3 중량부를 초과하는 경우에는 용해도가 낮아지며, 반응시간이 너무 길어지는 문제점이 있다.

상기 단계 (2)의 아연과 철은 물에 용해되어 있는 유기산 분자와 반응하여 아연, 철 및 유기산 복합체를 이루게 된다. 이 경우 첨가되는 아연과 철의 함량은 각각 1000~3000ppm 및 10000~30000ppm의 농도가 바람직하며, 상기 농도 범위에서 제조된 유기금속화합물을 포함하는 조성물이 항균성이 우수한 것으로 확인되었다.

상기 단계 (3)의 반응 조건하에서 본 발명의 유기금속화합물을 포함하는 조성물의 반응이 완결된다. 구체적으로 반응 온도는 50~60℃에서 수행되며, 50℃ 미만의 온도에서 반응을 수행하는 경우 반응 시간이 지나치게 길어지며, 60℃를 초과하는 온도에서 반응을 수행하는 경우 반응 속도는 빨라지나 부반응이 발생하여 항균 성능에 대한 효과가 미미하다. 반응 시간은 48~72시간이며, 48시간 미만 동안 반응을 수행하는 경우 금속과 유기산이 충분한 반응을 할 수 없으며, 72시간을 초과하는 경우에는 부반응이 진행되어 문제된다.

상기 단계 (4)는 단계 (3)에서 완성된 반응물을 정제하는 단계로서, 침전물로부터 상층액을 분리한 후 여과, 크로마토그래피 등의 방법으로 본 발명의 유기금속화합물이 포함된 상층액을 정제할 수 있다.

상기 단계 (1) 내지 단계 (4)를 거친 결과물에 대한 매스 스펙트럼(Mass Spectrum)의 결과를 도 1에 나타내었으며, 본 발명의 유기금속화합물의 분자량이 472임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 유기금속화합물의 성분을 분석하여 아래 표 1에 나타내었다

본 발명의 제조 방법에 따라 얻어진 유기금속화합물은 포함하는 유기 항균제는 약학적 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 14중량%로 포함한다.

본 발명에 다른 항균제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 측면은 아연 및 철을 함유하는 유기금속화합물을 유효 성분으로 함유하는 유기 항균제의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 약제학적 유효량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항균제는 페이스트 연고, 크림, 밀크, 파프제, 분제, 침투 패드, 용액, 겔, 분무제, 로션 또는 현탁액 형태의 제형에도 적용 가능하다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 항균제로서, 경구용 고형제제를 제조하는 경우는, 주약에 부형제, 추가로 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제 등을 첨가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등 형태의 제제를 조제할 수 있다. 사용되는 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분, 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다.

경구 투여를 위한 액체제제, 예를 들면 유제, 시럽제, 현탁제, 액제의 제조에는 일반적으로 사용되는 불활성인 희석제, 예를 들면 물 또는 식물유를 사용할 수 있다. 이 제제에는 불활성인 희석제 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제, 현탁 보조제, 감미제, 방향제, 착색제 또는 보존제를 배합할 수 있다. 액체제제를 조제한 후, 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐 속에 충전해도 된다.

비경구 투여용 제제, 예를 들면 주사제 또는 좌제 등의 제조에 사용되는 용제 또는 현탁제로서는, 예를 들면 물, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 벤질알코올, 올레산에틸, 레시틴을 들 수 있다. 좌제의 제조에 사용되는 기제로서는, 예를 들면 카카오버터, 유화 카카오버터, 라우린버터, 위텝졸을 들 수 있다. 제제의 조제방법은 특별히 한정되지 않고, 당업계에서 범용되고 있는 방법은 모두 이용 가능하다.

주사제의 형태로 하는 경우에는, 담체로서 예를 들면 물, 에틸알코올, 마크로골(macrogol), 프로필렌글리콜, 구연산, 초산, 인산, 젖산, 젖산나트륨, 황산 및 수산화나트륨 등의 희석제, 구연산나트륨, 초산나트륨 및 인산나트륨 등의 pH 조정제 및 완충제, 피로아황산나트륨, 에틸렌디아민사초산, 티오글리콜산 및 티오젖산 등의 안정화제 등을 사용할 수 있다. 또한, 이 경우, 등장성 용액을 조제하기 위해 충분한 양의 식염, 포도당, 만니톨 또는 글리세린을 제제 중에 배합해도 되고, 통상의 용해 보조제, 무통화제 또는 국소 마취제 등을 사용하는 것도 가능하다.

연고제, 예를 들면 페이스트, 크림 및 겔의 형태로 하는 경우에는, 통상 사용되는 기제, 안정제, 습윤제 및 보존제 등을 필요에 따라 배합할 수 있어, 통상적인 방법에 의해 성분을 혼합하여 제제화할 수 있다. 기제로서는 예를 들면 백색 바셀린, 폴리에틸렌, 파라핀, 글리세린, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘 및 벤토나이트 등을 사용할 수 있다. 보존제로서는 파라옥시안식향산 메틸, 파라옥시안식향산 에틸, 파라옥시안식향산 프로필 등을 사용할 수 있다. 첩부제(貼付劑)의 형태로 하는 경우에는, 통상의 지지체에 상기 연고, 크림, 겔 또는 페이스트 등을 통상적인 방법에 의해 도포할 수 있다. 지지체로서는 면, 스테이플 파이버(staple fiber) 및 화학섬유로 되는 직포 또는 부직포, 연질 염화비닐, 폴리에틸렌 및 폴리우레탄 등의 필름 또는 발포체 시트를 적합하게 사용할 수 있다.

[실시 예]

이하, 본 발명에 따른 항균제의 제조에 대한 하나의 실시 예에 대해 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

1. 유기금속화합물을 포함하는 조성물의 제조

5L 반응조에 물 1000ml를 투입하고, 다음으로 구연산 20g을 투입하여 용해시켰다.

구연산 수용액 내로 나노 입자화한 아연과 철을 각각 2000ppm과 20000ppm의 최종 농도가 되게 투입하고, 50℃에서 72시간 동안 교반하였다.

침전물을 여과지를 통하여 제거하고, 상층액을 크로마토그래피로 정제한 후, 본 발명의 조성물이 10중량%의 농도가 되게 제형을 제조하였다.

2. 실험군의 선별 및 적용

대조 물질로서 음성대조물질과 양성대조물질을 조제하였다.

즉, 시험에서 음성대조물질은 멸균 3차 증류수를 사용하였다.

또 양성대조물질로서 항세균 시험에서는 상용 항생제인 세프트리악손(ceftriaxone)을 조제하여 사용하였으며, 항진균 시험에서는 상용 항진균제인 나이스타틴(nystatin)을 조제하여 사용하였다.

다음에 양성대조물질을 조제하였다.

즉, 항세균 시험에서 사용한 세프트리악손은 전자저울로 소정량 칭량하고 멸균된 3차 증류수를 가해서 용해하였다. 그 후 3차 증류수로 정량하여 해당 시험에 따른 농도(w/v)로 대조 물질을 조제하였다. 항진균 시험에서 사용한 나이스타틴은 전자저울로 소정량 칭량하고 DMSO로 용해 후, 3차 증류수로 정량하여 해당 시험에 따른 농도(w/v)로 대조 물질을 조제하였다. 각각의 양성대조물질은 10 mg/ml 농도로 조제 후에 3차 증류수로 희석하여 사용하였다

다음에 본 발명에 따른 유기 항균제(이하, '시험물질(Zimon-101)'이라 함)을 조제하였다.

이와 같은 시험물질의 조제 이유는 다음과 같다.

시험물질의 순도와 농도에 대한 정확한 정보와 시험물질의 정량법에 대한 정보가 없어, 사전에 본 발명에 따른 항균제를 원액으로 가정하여 시험을 진행하였다. 따라서 시험물질의 농도를 100%로 정의하고, 각각의 시험을 진행시 시험물질의 최종 농도가 목적한 시험농도가 될 수 있도록 하기 위해 시험물질에 멸균 증류수를 혼합하여 시험에 사용하였다.

시험물질을 조제하기 위한 용매는 시험물질의 성분에 영향을 적게 줄 것으로 판단되는 멸균된 3차 증류수 사용하였다.

시험물질을 마이크로피펫으로 소정량 칭량하고, 3차 증류수를 가해서 해당 시험에 따른 농도(w/v)로 시험물질을 조제하였다.

본 발명의 시험을 위한 시험계는 다음과 같다.

세균은 50ml의 Mueller-Hilton Broth(MHB: Difco, USA) 또는 Tryptic Soy Broth(TSB: Difco, USA)를 사용하여 37℃, 200rpm으로 18시간 동안 정지상(stationary phase)까지 전 배양 후, 동일 조건하에서 각 균주들이 대수 증식기(logarithmic-phase)에 이르도록 2시간 30분간 2차 배양시킨 후 사용하였다. 진균의 경우에는 Potato Dextrose Broth(PDB: Difco, USA), YM broth(Difco, USA), Sabouraud Dextrose Broth(SDB: Difco, USA) 사용하여 24시간 또는 72시간 동안 각각 배양하여 사용하였다.

이를 위한 세균은 표 2와 같다.

또한 본 발명의 시험을 위한 진균은 표 3과 같다.

시험물질의 항-미생물 활성은 방사 확산분석(Radial diffusion assay) 방법으로 활성 유무를 확인 후에, 콜로니 카운트 분석(Colony count assay) 방법을 사용하여 활성의 정도를 평가하였다.

방사 확산 분석 방법은 다음과 같이 실행하였다.

항-미생물 활성을 측정할 시험물질은 앞서 상술한 바와 같이 멸균 증류수를 사용하여 희석한 시험물질 용액을 준비하였다. 그 후, 대수증식기의 4×10⁶CFU/ml의 세균 또는 진균을 포함한 하층 한천(9% 100 mM NaP buffer pH 7.4, 1% 100 mM sodium citrate buffer pH 7.4, 1% low EEO agarose, 0.03% tryptic soy broth powder) 플레이트에 직경 3 mm의 구멍을 만들고, 각각의 시료 5 ㎕를 주입하였다. 37℃에서 3시간 동안 배양한 시료가 주입된 하층 한천 평판(underlay agar plate) 위에 영양분이 풍부한 상층 한천(1% agarose, 60 mg/ml TSB powder)를 추가로 가한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후 5% 아세트 산(acetic acid)으로 시험 미생물의 성장을 중지시키고, 미생물의 생장억제 정도를 나타내는 클리어 존(clear zone)의 크기를 측정하여 항균 활성의 정도를 확인하였다. 클리어 존의 시료 주입용 구멍 3 mm를 제외한 직경 크기를 유닛 단위로 표시하였으며, 클리어 존의 0.1 mm는 1 유닛에 해당한다. 양성 대조군으로 사용한 세프트리악손과 나이스타틴은 1 ㎍/㎖ 농도도 조제하여 사용하였다.

콜로니 카운트 분석은 다음과 같이 실행하였다.

조제한 시험물질 용액 100 ㎕를 동량의 2×10⁶CFU/ml로 계산된 증식기(logarithmic phase) 세균을 포함하고 있는 10 mM NaP 버퍼(buffer)에 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 시험에서 계획한 시간 동안 반응시킨 후에 혼합액을 10씩 분취하여, 이를 희석하거나 그대로 pH 7.4의 1.5% Bacto-agar(Difco, Detroit, USA)나 pH 7.4의 SDB agar(1% agarose와 3% SDB powder가 포함된 10 mM NaP buffer)에 도말한 뒤, 37℃ 또는 30℃에서 하루 동안 배양한 후 집락들을 계수하여 그 활성 정도를 확인하였다. 양성 대조군으로 사용한 세프트리악손과 나이스타틴은 200 ㎍/㎖ 농도도 조제하여 사용하였다.

상술한 바와 같은 조건에 따른 시험 결과는 다음과 같다.

1. 방사 확산 분석

그람 양성균주 5종과 음성균주 5종 그리고 진균 5종에 대한 시험물질의 항 미생물 활성을 방사 확산 분석 방법으로 분석하였다. 시험물질은 원액(100%), 50%, 25%, 12.5%, 10% 희석액을 사용하였으며, 시험물질에 의한 생장 억제를 나타내는 클리어 존의 크기를 측정하여 항균 활성의 정도를 확인하였다. 클리어 존의 시료 주입용 구멍 3 mm를 제외한 직경 크기를 유닛 단위로 표시하였으며, 클리어 존의 0.1 mm는 1 유닛에 해당한다.

도 2는 그람 양성 세균에 대한 시험물질의 항균 활성 시험의 결과를 나타낸다.

도 3은 그람 음성 세균에 대한 시험물질의 항균 활성 시험의 결과를 나타낸다.

시험물질은 시험에 사용한 그람 양성 균주들에서, 농도에 비례한 고른 항세균 활성을 나타내었으며, 항생제 내성균주인 MRSA와 VRE에 대해서도 강한 항세균 활성을 나타내었다. 특히 시험물질은 MRSA 균주에 54 유닛의 높은 항세균 활성을 나타내었다(도 2 참조).

그람 음성 세균에 대한 시험물질의 항세균 활성은 도 3에서 제시한 내용과 같다. 내성균주인 MDRPA를 비롯한 나머지 균주들에서 시험물질은 농도 의존적인 항세균 활성의 양상을 보였으며, 시험한 그람 음성 균주들 중 시험물질이 가장 높은 항세균 효과를 나타낸 균주는 69 유닛을 나타낸 S. enterica 이다.

도 4는 진균에 대한 시험물질의 항진균 활성 시험을 나타낸다.

진균에 대한 시험물질의 항진균 활성은 도 4와 같다. 시험물질은 시험에 사용된 진균들에 대하여 유의성 있는 활성은 확인되지 않았다.

2. 콜로니 카운트 분석

이 시험은 예비 시험에서 시험물질이 활성을 나타내는 세균만을 대상으로 하였으며, 활성을 나타내지 못한 진균은 제외하였다. 시험 세균은 2×10⁵CFU/ml 농도로 준비하였으며, 20% 농도로 희석한 시험물질을 세균이 포함된 용액과 동일한 부피로 혼합하여, 최종적으로 시험물질의 농도가 10%되도록 시험을 진행하였다. 혼합액은 37℃에서 반응시켰으며, 10분과 20분, 그리고 40분 경과 후 반응액의 일부(10 ㎕)를 분취하여, 분취액을 희석하거나, 분취한 원액 그대로 평판 배지에 도말하였다. 도말된 평판 배지는 37℃에서 하루 동안 배양 후에 형성된 집락을 계수하였다.

도 5는 그람 양성 세균에 대한 시험물질의 두 가지 농도(10%, 30%)에 의한 항균 활성 시험 결과를 나타낸다.

시험물질은 시험에 사용한 그람 양성 세균 모두에 대하여 유의성 있는 항세균 활성을 나타내었으며, 특히 고초균(B. subtilus ) 균주에 대한 시험에서는 10% 농도에서도 시험 균주를 완전히 제어하는 매우 강한 활성을 나타내었다. M. luteus에 대해서는 낮은 항세균 활성을 나타내었지만, 항생제 저항성균주인 MRSA에 대해서는 30% 농도에서 시험 균주를 10⁶CFU/ml 농도에서 10³ CFU/ml로 감소시키는 항세균 활성을 나타내었으며, 또 다른 항생제 내성균주인 VRE에 대해서도 강하진 않지만 유의성 있는 항세균 활성을 나타내었다.

도 6은 그람 음성 세균에 대한 시험물질의 두 가지 농도(10%, 30%)에 의한 항균 활성 시험 결과를 나타낸다.

그람 음성 세균에 대한 시험물질의 항세균활성 시험 결과 사용한 모든 균주에 대하여 유의성 있는 항세균 활성을 나타내었으며, 특히 항생제 내성균주인 MDRPA와 E. coli 두 균주에 대해서는 30% 농도에서 10³ CFU/ml 이하로 감소시키는 강한 항세균 활성을 나타내었다.

본 발명에 따른 항균제의 치사 동역학(killing kinetics)를 확인하기 위하여 30% 농도의 시험물질과 대조군으로 사용한 100/ml 농도의 세프트리악손의 시간별 항균활성을 고초균을 대상으로 한 콜로니 카운트 분석을 통해 확인하였다. 시험 방법은 앞선 시험과 대부분 동일하나 반응시간을 짧게(1분, 5분, 10분) 하여 진행하였다. 그 결과 도 7에 도시된 바와 같이, 시험물질은 시험 균주와 1분간 반응 시에도 항세균 활성을 나타내기 시작하였지만, 대조군의 경우에는 반응 10분 후부터 비슷한 수준의 활성을 나타내기 시작하였다. 도 7은 시험물질과 대조군의 시간별 항균활성을 나타내는 그래프이다.

상술한 바와 같은 실험 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

그람 양성 세균 5종, 음성 세균 5종, 진균 5종을 대상으로 본 발명에 따른 항균제의 항-미생물 활성을 평가하였다. 본 시험에 사용한 시험계는 일반적으로 인체의 피부에 상재하거나 감염될 수 있는 미생물을 선정하였으며, 이를 대상으로 기초적인 항-미생물 활성 시험을 수행하였다.

방사 확산 분석 방법으로 15종의 시험 미생물에 대한 시험물질의 항-미생물 활성을 분석한 결과 시험에 사용한 세균들 모두에 대하여 농도 의존적인 고른 항 세균 활성이 확인 되었으나, 진균들에 대해서는 유의성 있는 항 진균 활성은 관찰되지 않았다. 방사 확산 분석 시험에서 그람 양성균 모두에 대해 대조물질(Ceftriaxone)이 활성을 나타내지 못한 것으로 나타난 이유는 대조물질에 감수성이 높은 그람 음성균주에 기준을 두어 농도를 낮게 적용되었기 때문이다.

콜로니 카운트 분석 시험을 통한 항세균 활성 시험에서 시험물질은 시험에 사용한 10 종의 세균에 대하여 농도와 시간 의존적인, 유의성 있는 항세균 활성을 나타내었다. 특히 주목할 만한 점은 메티실린 내성 포도상구균(MRSA) 균주와 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 모두 내성을 갖는 다제내성 녹농균(MDRPA)에 대해서 고른 항균 활성을 나타낸다는 점이며, 반코마이신 내성 장구균(VRE)에 대해서도 약하지만 유의성 있는 항세균 활성을 나타내었다.

시험물질이 가장 강한 활성을 보이는 고초균에 대한 치사 동역학 시험에서 시험물질은 비교적 빠른 작용 시간을 갖는 것으로 나타났다. 시험물질은 본 시험에서 가장 짧은 시간 반응시킨 1분 후부터 활성을 보이기 시작하며, 반응 시간의 5분 경과 후 10³CFU/ml 이하, 20분 경과 후 10²CFU/ml 이하로 시험균주를 감소시키는 활성을 나타냈다. 반면에 대조군으로 사용한 상용항생제인 세프트리악손의 경우 10분 경과 후부터 활성을 나타내기 시작하였다.

종합하면 시험물질은 기존 항생제보다 강하지는 않으나, 더 광범위한 항세균 활성을 보유하고 있으며, 치사 동력학 또한 항생제보다 빠른 장점을 지닌 물질로 판단되었다.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.

본 발명에 따른 유기금속화합물을 유효성분으로 하는 항균제 및 그 제조방법을 사용하는 것에 의해 광범위한 항세균을 도모할 수 있다.

Claims

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나노입자로 이루어진 산화 아연과 철을 함유하는 유기금속 화합물을 유효성분으로 포함하는 유기 항균제.
제4항에 있어서,
상기 유기금속 화합물은 약학적 조성물 총 중량에 대해 1~14 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기 항균제.
(a) 물 100중량부에 대하여 구연산(citric acid) 1~3중량부를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계,
(b) 상기 용해물에 나노 입자화한 아연 및 철을 각각 1000~3000ppm 및 10000~30000ppm의 농도로 투입하고 유기화하여 복합체를 형성하는 단계,
(c) 상기 복합체를 50~60℃에서 48~72시간 반응시켜 반응물을 형성하는 단계 및
(d) 상기 반응물을 수득한 후 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기 항균제의 제조방법.
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제6항에 있어서,
상기 아연 및 철은 약학적 조성물 총 중량에 대해 1~14 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기 항균제의 제조방법.
특허청구의 범위 제6항 또는 제8항 중의 어느 한 항의 유기 항균제의 제조방법에 의해 제조되고, 정제, 피복정제, 과립제, 산제 또는 캡슐의 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 경구약제.
특허청구의 범위 제6항 또는 제8항 중의 어느 한 항의 유기 항균제의 제조방법에 의해 제조되고, 비경구 투여용 제제로 이루어진 것을 특징으로 하는 주사제.
특허청구의 범위 제6항 또는 제8항 중의 어느 한 항의 유기 항균제의 제조방법에 의해 제조되고, 페이스트 연고, 크림, 밀크, 파프제, 분제, 침투 패드, 용액, 겔, 분무제, 로션 또는 현탁액 형태의 제형으로 이루어진 것을 특징으로 하는 피부 외용제.