KR101483990B1

KR101483990B1 - 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법

Info

Publication number: KR101483990B1
Application number: KR20130044944A
Authority: KR
Inventors: 김윤태; 한대석; 김재구; 이창호; 김인호; 조승목
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2015-01-20
Also published as: KR20140126868A

Abstract

본 발명은 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법을 제공한다. 본 발명을 이용하면 실험 동물로부터 통증 반응 시 발생되는 초음파 음력대의 발생 횟수 또는 지속 시간을 정확하게 측정하여 객관적인 수치로 표현할 수 있어 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능을 평가하는데 매우 유용하며, 통증 반응의 측정에 있어서 종래의 방법이 갖는 실험자의 개별적 차이, 주관적 판단에 대한 오류를 최소화할 수 있다.

Description

시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법{Method for Evaluating Samples having Effects of Alleviation, Prevention or Treatment for Pain}

본 발명은 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법에 관한 것이다.

실험동물의 통증 정도를 측정하는 방법에는 주로 기계적 이질통 평가(von frey filament test), 체중부하검사(Weight bearing test) 등이 이용되고 있다. 이러한 종래의 테스트 방법들은 실험자의 주관적인 판단에 의존하고 있기 때문에 많은 경우 실험의 정확성이 저하되는 문제점이 발생한다. 따라서, 주의 깊은 블라인드 테스트(Blind test)가 요구된다. 또한, 종래의 테스트방법은 실험자가 팔을 이용하여 장시간동안 반복적으로 실험하여야 하므로 노동집약적이며 테스트시간이 많이 소요되어 양질의 테스트데이터를 얻기 힘든 문제점이 있었다. 따라서, 실험동물에서 통증 반응을 정확하게 측정할 수 있는 쉽고 객관적인 기술이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능을 평가할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과, 통증이 유발된 동물에 분석하고자 하는 시료를 투여한 다음, 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파를 측정하면 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능을 평가하는데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법:

(a) 인간을 제외한 동물에게 통증을 유발시키는 단계;

(b) 상기 동물에 분석하고자 하는 시료를 투여하는 단계; 및

(c) 상기 시료를 투여한 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파를 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파를 감소시키는 경우에 상기 시료는 통증의 완화, 예방 또는 치료 효능이 있는 것으로 판정된다.

본 발명자들은 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능을 평가할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과, 통증이 유발된 동물에 분석하고자 하는 시료를 투여한 다음, 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파를 측정하면 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능을 평가하는데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

본 발명의 방법에 따르면, 동물에게 통증을 유발시킨 다음, 분석하고자 하는 시료를 투여하고 시료를 투여한 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파 발생 횟수 또는 지속기간을 측정한다. 동물로부터 발생되는 22-27 kHz 음력대의 초음파 발생 횟수 또는 지속기간(duration)을 측정하여 시료를 투여하지 않은 동물과 비교하여 시료를 투여한 동물에서 22-27 kHz의 초음파 발생 횟수 또는 발생 지속기간이 감소하는 경우 상기 시료는 통증의 완화 또는 치료용 물질로 판단된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 동물에 분석하고자 하는 시료를 투여하는 단계는 동물의 통증 유발 전에 먼저 실시할 수 있다. 통증 유발 전 동물에 분석하고자 하는 시료를 투여한 다음, 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파 발생 횟수 또는 지속기간을 측정하여 시료를 투여하지 않은 동물과 비교하여 시료를 투여한 동물에서 22-27 kHz의 초음파 발생 횟수 또는 발생 지속기간이 감소하는 경우 상기 시료는 통증의 예방용 물질로 판단된다.

본 발명에서 시료는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 시료는 상술한 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물 이외에, 펩타이드, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody, 미국 특허 제5,831,012호), 아비머(Avimer, Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23(12):1556(2005)) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain, Arnoux B et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58(Pt 7):12524(2002)), 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9(2):2618(2006))을 포함한다.

본 발명에서 동물의 통증 유발은 약물 투여, 피부 절개 또는 신경 결찰을 통해 유도할 수 있다. 통증이 유발된 동물은 당업계에 공지된 다양한 통증 유발 방법에 의해 제안된 통증 동물 모델을 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 이용되는 통증 동물 모델은 CCI(Chronic constriction injury) 모델, PSL/셀처(Partial sciatic nerve ligation) 모델, SNL(Spinal nerve ligation) 모델, SNI(Spared nerve injury) 모델, 빈크리스틴(Vincristin-induced neuropathy) 모델, 절개 모델(Incision model), 경막 내 카테터 삽입(Intrathecal catheterization) 모델, 직접 요추 천자(Direct lumbar puncture) 모델일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 평가방법에 이용되는 동물은 설치류 동물이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 평가방법에 이용되는 동물은 마우스(Mus musculus) 또는 랫트(Rattus norvegicus)이다.

본 발명의 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법에서 용어 “통증(pain)”은 넓은 의미로 사용되며, 통각수용성 통증과 같은 급성 및 만성 통증, 예컨대 체성 통증(somatic pain) 및 내장성 통증(visceral pain); 염증성 통증, 기능장애 통증, 특발성 통증, 표면성 통증(superficial pain), 심부 통증(deep pain), 가려움, 신경병증성 통증, 예컨대, 중추발생성 통증(centrally generated pain) 및 말초발생성 통증(peripherally generated pain), 편두통 및 암 통증을 포함하는 모든 타입의 통증을 의미한다.

상기 용어 “통각수용성 통증(nociceptive pain)”은 신체 조직들을 손상시킬 우려가 있거나 또는 실제로 손상시키는 유해한 자극에 의해 유발되는 모든 통증을 포함하는데 사용되며, 벤 상처(cut), 타박상(bruise), 골절(bone fracture), 압궤손상(crush injury), 화상(burn) 및 이와 유사한 상처에 의한 통증을 제한 없이 포함한다. 조직 손상에 대한 통증 수용체(통각수용기, nociceptors)는 대부분 피부, 근골격계 또는 내부장기(internal organs)에 위치하고 있다.

상기 용어 “체성 통증(somatic pain)”은 뼈, 관절, 근육, 피부 또는 결합조직(connective tissue)에서 일어나는 통증을 나타내는데 사용된다. 이러한 타입의 통증은 전형적으로 매우 국부적이다.

상기 용어 “내장성 통증(visceral pain)”은 본 명세서에서 호흡기(respiratory), 위장기관(gastrointestinal tract) 및 췌장(pancreas)과 같은 내장장기들, 요로(urinary tract) 및 생식기관(reproductive organs)에서 일어나는 통증을 나타내는데 사용된다. 내장성 통증은 장기피막(organ capsule)의 종양 침범(tumor involvement)에 의해 유도되는 통증을 포함한다. 다른 타입의 내장성 통증은 전형적으로 유강장기(hollow viscus)의 폐색에 의해 유발되며, 간헐적 경련(intermittent cramping) 및 심한 국부 통증이 특징이다. 내장성 통증은 방광염(cystitis) 또는 역류성 식도염(reflux esophagitis)의 경우에서와 같이 염증과 관련될 수 있다.

상기 용어 “염증성 통증”은 외상(trauma), 외과수술, 감염 및 자가면역 질환 등에 의해 유발될 수 있는 활동성 염증(active inflammation)과 관련이 있는 통증을 포함한다.

상기 용어 “표면성 통증(superficial pain)"은 배근(dorsal root)의 신경이 분포된 피부 분절에 따라 느껴지는 통증을 말하며, 자극을 느낀 지점에서 통증을 느끼는 직접적인 통증이다.

상기 용어 “심부통증(deep pain)"은 심부 기관에서 유래되는 통증으로 조직의 성격에 따라 통증의 특징과 정도가 다르다. 통각이 특히 예민한 부분은 건(tendon), 심부근만, 인대, 관절, 골막, 혈관 및 신경이다. 일반적으로 심부통증은 감각이 둔하고 주위로 퍼지며 느껴지는 부위가 넓다. 심부나 내장 등의 통증은 그 기전이 복잡하여 표면성 통증보다 통증의 위치를 찾기 어렵고, 오심, 발한, 혈압 상승 등의 문제도 함께 나타난다.

상기 용어 “신경병증성 통증(neuropathic pain)”은 본 명세서에서 말초 또는 중추신경계의 장애의 결과로 생기는 말초 또는 중추신경계에 의한 비정상적 과정(abnormal processing)의 감각 입력에서 비롯된 통증을 나타내는데 사용된다.

상기 용어 “시술 통증(procedural pain)”은 내과, 치과 또는 외과 시술에서 일어나는 통증을 나타내며 상기 시술은 보통 예정되어 있거나 또는 급성 외상과 관련되어 있다.

상기 용어 “가려움(itch)”은 본 명세서에서 넓은 의미로 사용되며, 국부에 제한하여 일반적으로 설명될 수 있는 급성 간헐성 및 지속성의, 모든 타입의 가렵고 찌르는 듯한 감각들을 의미한다. 상기 가려움은 특발성, 알러지성, 대사성, 감염성, 약물-유도성, 간, 신장 질환에 기인하거나 또는 암에 의한 것일 수 있다. “소양증(Pruritus)”은 중증 가려움증(severe itching)이다.

“환자”라 함은 임의의 동물을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 환자는 인간이다. 본 발명의 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 다른 동물들은 비-인간 영장류들(예컨대, 원숭이, 고릴라, 침팬지), 가축(예컨대, 말, 돼지, 염소, 토끼, 양, 소, 라마), 및 반려동물(예컨대, 기니피그, 래트(rats), 마우스(mice), 도마뱀, 뱀, 개, 고양이, 관상어, 햄스터 및 새)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

신경병증성(Neuropathic), 염증성(inflammatory) 및 통각수용성(nociceptive) 통증은 병인학(etiology), 병리생리학(pathophysiology), 진단 및 처치에 있어서 차이가 있다. 통각수용성 통증은 말초감각신경(peripheral sensory neurons)의 특이적 부분(specific subset), 즉 강렬한 또는 유해한 자극에 의해 통각수용기들의 활성화에 반응하여 일어난다. 통각수용성 통증은 일반적으로 민감하고, 자기제한적(self-limiting)이며 잠재적 또는 진행 중인 조직 손상의 경고로 작용함으로서 보호의 생물학적 기능을 제공한다. 통각수용성 통증은 전형적으로 국부에 매우 제한된다. 통각수용성 통증의 예들은, 외상성(traumatic) 또는 외과수술성(surgical) 통증, 분만 진통(labor pain), 염좌(sprains), 골절(bone fractures), 화상(burns), 충돌(bumps), 타박상(bruises), 주사(injections), 치과시술(dental procedures), 피부검사(skin biopsies) 및 폐색(obstructions)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

염증성 통증은 수술 후(postoperative), 외상 후(post-traumatic) 통증, 관절염(류마티스성(rheumatoid) 또는 골관절염(osteoarthritis)) 통증, 및 축성 하부요통(axial low back pain)의 경우와 같이 관절(joints), 근육 및 힘줄(tendons)의 손상과 관련된 통증을 포함하는 조직 손상 또는 염증이 있는 경우에 발생하는 통증이다.

통각수용성 통증과 대조적으로, 신경병증성 통증은 실제 “타는 듯한(burning),” “감전된 듯한(electric),” “얼얼하거나 저린(tingling),” 또는 “쿡쿡 쑤시는(shooting)” 것으로 묘사된다. 신경병증성 통증은 종종 만성 이질통(chronic allodynia)(가벼운 터치와 같은, 보통 통증반응을 유발하지 않는 자극으로 인한 통증으로 정의된다) 및 감각과민(hyperalgesia)(정상적인 통증자극에 대한 높은 감수성으로 정의된다)에 의해 설명되며, 어떤 손상된 조직의 외관상 치료(apparent healing) 후 수개월 또는 수년 동안 지속될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법을 제공한다.

(b) 본 발명을 이용하면 실험 동물로부터 통증 반응 시 발생되는 초음파 음력대의 발생 횟수 및 지속기간을 정확하게 측정하여 객관적인 수치로 표현할 수 있어 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능을 평가하는데 매우 유용하다.

(c) 본 발명은 통증 반응의 측정에 있어서 종래의 방법이 갖는 실험자의 개별적 차이, 주관적 판단에 대한 오류를 최소화할 수 있다.

도 1은 피부 절개 모델(급성 통증 모델)의 제작 과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 신경 분지 결찰 손상 모델(만성 통증 모델)의 제작 방법에 관한 그림이다.
도 3은 신경 분지 결찰 손상 모델의 제작 과정을 나타낸 그림이다.
도 4는 기계적 이질통 평가 방법을 나타낸 그림이다.
도 5는 초음파 발성음 측정 방법을 나타낸 그림이다.
도 6은 초음파 발성음 측정 결과를 나타낸 그림이다.
(a) 대조군, (b) 통증 완화제 처리군
도 7은 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 5시간 후 수술 부위의 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10), *** p<0.001
도 8은 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 1일 후(POD1) 수술 부위의 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 9는 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 6시간 후 실험동물이 22-27 kHz 음력대의 초음파를 발생시키는 횟수를 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 10은 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 3.5시간, 6시간, 24시간 후 실험동물이 22-27 kHz 음력대의 초음파를 발생시키는 횟수를 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 11은 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 5시간 후 수술 부위의 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 12는 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 1일 후(POD1) 수술 부위의 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 13은 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 6시간 후 실험동물이 22-27 kHz 음력대의 초음파를 발생시키는 횟수를 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 14는 피부 절개 수술 직 후 실험동물에 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 3.5시간, 6시간, 24시간 후 실험동물이 22-27 kHz 음력대의 초음파를 발생시키는 횟수를 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 15는 신경 분지 결찰 손상 수술 후 14일 동안 실험동물에 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10), *** p<0.001
도 16은 신경 분지 결찰 손상 수술 전, 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 통증 역치값의 기저선을 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10)
도 17은 신경 분지 결찰 손상 수술 후 14일 동안 실험동물에 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10), ** p<0.01
도 18은 신경 분지 결찰 손상 수술 전, 통증 민감도를 기계적 이질통 평가를 통해 통증 역치값의 기저선을 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10)
도 19는 신경 분지 결찰 손상 수술 후 7일 동안 실험동물에 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 실험동물이 22-27 kHz 음력대의 초음파를 발생시키는 횟수를 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 가바펜틴(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05
도 20은 신경 분지 결찰 손상 수술 후 7일 동안 실험동물에 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 실험동물이 22-27 kHz 음력대의 초음파를 발생시키는 횟수를 측정한 결과이다.
대조군(n=10), 나프록센(30 mg/kg) 투여군(n=10), * p<0.05

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 실험동물

Sprague-Dawley(SD) 랫트(200-250 g, 웅성)는 (주)Samtako에서 분양받아 실험동물용 사육상자에 일주일간 적응된 후 실험에 사용되었다. 동물의 사육은 온도 22±1℃, 습도 55± 5%, 밤낮주기(12 시간 낮/ 12 시간 밤)가 조절되며, 조도 300 Lux의 조건하에 이루어졌으며, 사료 및 음수는 자유 급여하였다. 모든 동물들은 KFRI-IACUC(Korea Food Research Institute, Institutional Animal Care and Use Committee)의 실험동물 사용지침에 의해 관리되었다.

2. 시료조제 및 투여

적응 후 정상으로 판단된 동물에 대하여 체중을 측정하고 무작위적으로 실험군을 분리하였으며, 실험동물의 개체식별은 피모색소표시법을 이용 실시하였다. 가바펜틴, 나프록센은 생리식염수(0.9% NaCl) 에 적정 농도로 용해하여 제조하였다. 제조된 시료는 수술 직 후 30 mg/kg/3 ml의 용량으로 복강 내 주사(intraperitoneal injection) 하였으며, 대조군은 동량의 생리식염수를 수술 직 후 복강 내 주사 하였다.

3. 통증 동물모델 제작

3-1. 피부 절개 모델(skin incision model)

랫트의 피부 절개 모델은 Brennan에 의해 제안되었다(Brennan, 1996). 일반적으로 수술 후 통증은 급성통증의 한 형태로 생각되고 있으며, 랫트의 피부 절개 모델은 인간의 수술 후 통증 상태와 유사하다고 생각되고 있다. SD 웅성 랫트(200-250 g)를 사용하였으며, 펜토바르비탈을 이용하여 전신마취 하였다.

왼쪽 발바닥을 10% 포비돈액으로 소독 후 발 뒷금치 끝부분 0.5 cm 떨어진 부분에서 시작하여 세로방향으로 1 cm 길이의 피부와 근막을 11번 수술용 칼로 절개하였다. 절개한 부분의 발바닥 근육(족저근)을 포셉으로 들어 올려 1 cm 길이를 분리하고 세로방향의 양쪽 끝부분은 발바닥 근육이 떨어지지 않게 조심해서 들어 올려 분리하였다. 절개된 부분을 부드럽게 압박하여 지혈한 다음, 지혈된 절개부위의 근막과 피부는 나일론 4-0 봉합사로 봉합 후 10% 포비돈액으로 소독하였다. 수술 후 감염방지를 위해 항생제 연고를 도포하고, 사육케이지에 옮겨 회복시켰다. 관찰기간 중 감염이 발생하거나, 봉합부위가 터진 동물과 부종이 생긴 동물은 실험에서 제외시켰다.

3-2. 신경 분지 결찰 손상(Spared nerve injury, SNI)

신경 분지 결찰 손상 동물모델은 Decosterd 및 Woolf에 의해 제안되었다(Decosterd & Woolf, 2000). SD 웅성 랫트(200-250 g)를 사용하였으며, 펜토바르비탈을 이용하여 전신마취하였다. 전신마취 하에서 흰쥐의 좌측 넓적다리의 측면 피부를 면도하고 절개하고 대퇴이둔근(biceps femoris)을 분리한 후 좌골신경의 세 말단분지를 노출시켰다. 좌골신경은 비복신경(sural nerve), 총비골신경(common peroneal never), 경골신경(tibial nerve)의 세 가닥의 신경으로 이루어져있다. 이중 비복신경은 손상을 가하지 않고 온전히 유지해야하는데 좌측다리 기준에서 관찰시 오른쪽으로 분기해 있으며, 가장 작은 신경이다. 총비골신경, 경골신경은 다리 방향으로 근육을 따라 분기해 있으며, 각각 분리하여, 나일론 4-0 봉합사를 이용하여 단단히 결찰한 후, 포셉과 가위를 이용하여 2-4 mm 길이를 절단하여 제거하였다. 신경절단을 마무리 한 후, 근육층을 봉합사로 상처를 봉합한 다음, 피부 절개부위를 다시 봉합하여 실험동물을 사육케이지로 옮겨 회복시켰다.

4. 평가방법

4-1. 기계적 이질통 평가(von frey filament test)

동물통증모델 제작 후 기계적 이질통의 정도를 측정하기 위한 방법으로 Chaplan 등에 의해 기술되었다(Chaplan et. al, 1994). 랫트를 그물눈의 크기가 2×2 mm 인 철망 실험대 위에 설치된 아크릴 상자에 넣고 15분 이상 적응시킨 뒤, 쥐의 움직임 등이 조용해지면 연속된 굵기의 본 프레이 필라멘트(Stoelting, 미국)를 사용하여 통증 역치(g) 값을 평가하였다. 필라멘트를 좌측 환부 발바닥에 수직으로 접촉시키고 5-6초간 유지시켜 랫트가 신속한 회피반응을 보이거나 또는 hairs를 떼면서 즉시 움찔하거나 발바닥을 핥으면 양성반응을 보인 것으로 간주한다. 중앙부의 본 프레이 필라멘트부터 자극하여 양성반응을 보이면 약한 필라멘트로 자극하고, 양성반응이 없으면 강한 필라멘트로 자극하며 진행한다. 양성반응을 나타내는 최소의 자극 크기를 역치로 하며, 15 g 이상에서도 반응이 없을 때를 상한선으로 하여 더 이상 적용하지 않는다.

4-2. 초음파 발성음(ultrasound vocalization calls)

랫트는 통증, 고통, 위축, 스트레스 상태에 있을 때 초음파를 발생시키며, 그 초음파 범위는 22-27 kHz 로 보고되고 있다(Portfors, 2007). 수술 3.5 시간, 6 시간 및 24 시간 후 통증의 정도를 알아보기 위하여 각 10분 동안 USV 측정 시스템(Sonotrack, 네덜란드) 장비를 이용하여 통증을 느낄 때 랫트가 내는 초음파(22-27 kHz) 발성음을 측정하였다. 초음파를 측정할 수 있는 아크릴 상자에 랫트를 넣어두고 15분 동안 안정화 시킨 후 10분 동안 초음파 측정 실험을 진행하였다.

실험결과

피부 절개 모델에서 기계적 이질통 평가(von frey filament test)를 통한 양성대조군 가바펜틴(gabapentin)의 통증 완화 효과 확인

피부 절개 수술 5시간 후에 수술 부위의 통증 민감도를 측정하기 위하여 기계적 이질통 평가를 하였다. 그 결과, 대조군의 통증 역치(Withdrawal threshold) (g) 값이 0.141±0.049(g)인데 비하여 양성대조군 가바펜틴 30 mg/kg 군은 7.486±1.308(g)로 통증을 느끼는 힘의 크기가 유의적(p<0.001)으로 증가함을 확인하였다. 또한, 수술 1일 후(POD1) 기계적 이질통 평가 결과 대조군의 통증 역치(g) 값이 0.087±0.027(g)인데 비하여 양성대조군 가바펜틴 30 mg/kg 군은 4.924±2.163(g)으로 통증을 느끼는 힘의 크기가 유의적(p<0.05)으로 증가함을 확인하였다.

피부 절개 모델에서 초음파 발성음(ultrasound vocalization calls) 측정을 통한 양성대조군 가바펜틴(gabapentin)의 통증 완화 효과 확인

피부 절개 수술 후 3.5시간, 6시간, 24시간(POD1) 시간대 별로 실험동물이 통증을 느낄 때 유발하는 초음파 음력대(22-27 kHz)를 측정 후, 그 횟수를 정량화하여 양성대조군 가바펜틴의 통증 완화 효과를 확인하였다. 수술 3.5시간 후, 대조군 6.857±1.37(calls), 양성대조군 가바펜틴 30 mg/kg군 2.143±1.37(calls) (* p<0.05), 수술 6시간 후, 대조군 19.286±5.432(calls), 양성대조군 가바펜틴 30 mg/kg군 3.714±1.672(calls)(* p<0.05), 수술 24시간 후, 대조군 24.143±6.967(calls) 양성대조군 가바펜틴 30 mg/kg군 5.286±1.229(calls)(* p<0.05), 기록하여 유의적(p<0.05)으로 감소함을 확인하였다.

피부 절개 모델에서 기계적 이질통 평가를 통한 양성대조군 나프록센(Naproxen)의 통증 완화 효과 확인

피부 절개 수술 5시간 후에 수술 부위의 통증 민감도를 측정하기 위하여 기계적 이질통 평가를 하였다. 그 결과, 대조군의 통증 역치(g) 값이 0.122±0.025 (g)인데 비하여 양성대조군 나프록센 30 mg/kg 군은 4.8±1.528(g)로 통증을 느끼는 힘의 크기가 유의적(p<0.05)으로 증가함을 확인하였다. 또한, 수술 후 1일째기계적 이질통 평가 결과, 대조군의 통증 역치(g) 값이 0.107±0.025(g)인데 비하여 양성대조군 나프록센 30 mg/kg 군은 3.993±1.698(g)로 통증을 느끼는 힘의 크기가 유의적(p<0.05)으로 증가함을 확인하였다.

피부 절개 모델에서 초음파 발성음 측정을 통한 양성대조군 나프록센의 통증 완화 효과 확인

피부 절개 수술 후 3.5시간, 6시간, 24시간(POD1)에 시간대 별로 실험동물이 통증을 느낄 때 유발하는 초음파 음력대(22-27 kHz)를 측정 후, 그 횟수를 정량화하여 양성대조군 나프록센의 통증 완화 효과를 확인하였다. 수술 6시간 후, 대조군 19.286±5.432(calls), 양성대조군 나프록센 30 mg/kg 군 5.667±1.382(calls)(* p<0.05), 수술 24시간 후, 대조군 24.143±6.967(calls) 양성대조군 나프록센 30 mg/kg 군 3.833±1.195(calls)(* p<0.05)을 기록하여 유의적(p<0.05)으로 감소함을 확인하였다. 수술 3.5시간 후에는 대조군에 비하여 나프록센 30 mg/kg 군의 22-27 kHz 초음파 측정 기록이 감소하는 경향을 확인하였다.

SNI 모델에서 기계적 이질통 평가를 통한 양성대조군 가바펜틴의 통증 완화 효과 확인

SNI 수술 후 14일 동안 장기적으로 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 통증 민감도를 측정하기 위하여 기계적 이질통 평가를 실시하였다. 그 결과, 대조군의 통증 역치(g) 값이 0.429±0.123(g)인 것과 비교하여 가바펜틴 30 mg/kg 군은 6.0±0.882(g)으로 통증을 느끼는 힘의 크기가 유의적(p<0.001)으로 증가함을 확인하였다. 본 실험을 통해 가바펜틴이 단기모델 뿐 만 아니라 장기모델에서도 통증완화 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. SNI 수술 전 두 실험군간의 통증에 대한 기저선(baseline)을 확인하기 위하여 기계적 이질통 평가를 실시하였다. 그 결과, 두 실험군 사이의 수술 전 통증 역치(g) 값이 같음을 확인하였다.

SNI 모델에서 기계적 이질통 평가를 통한 양성대조군 나프록센의 통증 완화 효과 확인

SNI 수술 후 14일 동안 장기적으로 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 통증 민감도를 측정하기 위하여 기계적 이질통 평가를 실시하였다. 그 결과, 대조군의 통증 역치(g) 값이 0.333±0.08(g)인 것과 비교하여 나프록센 30 mg/kg군은 3.88±1.014(g)으로 통증을 느끼는 힘의 크기가 유의적(p<0.01)으로 증가함을 확인하였다. 본 실험을 통해 나프록센이 단기모델 뿐 만 아니라 장기모델에서도 통증완화 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. SNI 수술 전 두 실험군간의 통증에 대한 기저선을 확인하기 위하여 기계적 이질통 평가를 실시하였다. 그 결과, 두 실험군 사이의 수술 전 통증 역치(g) 값이 같음을 확인하였다.

SNI 모델에서 초음파 발성음 측정을 통한 양성대조군 가바펜틴의 통증 완화 효과 확인

SNI 수술 후 7일(POD7) 동안 장기적으로 가바펜틴을 복강 내 주사한 다음, 실험동물이 통증을 느낄 때 유발하는 초음파 음력대(22-27 kHz)를 측정하고, 그 횟수를 정량화하여 가바펜틴의 통증 완화 효과를 확인하였다. 대조군 19.778±5.482(calls), 가바펜틴 30 mg/kg군 4.571±0.948(calls)(* p<0.05), 기록하여 가바펜틴 처리군에서 22-27 kHz 음력대 초음파 발생이 유의적(p<0.05)으로 감소함을 확인하였다.

SNI 모델에서 초음파 발성음 측정을 통한 양성대조군 나프록센의 통증 완화 효과 확인

SNI 수술 후 7일(POD7) 동안 장기적으로 나프록센을 복강 내 주사한 다음, 실험동물이 통증을 느낄 때 유발하는 초음파 음력대(22-27 kHz)를 측정하고, 그 횟수를 정량화 하여 나프록센의 통증 완화 효과를 확인하였다. 대조군 17.556±3.783(calls), 나프록센 30 mg/kg군 4.714±0.808(calls)(* p<0.05), 나프록센 처리군에서 22-27 kHz 음력대 초음파 발생이 유의적(p<0.05)으로 감소함을 확인하였다.

결론

이상의 결과로 본 발명은 통증의 단기모델인 피부 절개 모델 및 장기모델인 SNI 모델에서도 초음파 발성음 측정 방법이 통증의 정도 및 정량하는 방법에서 우수한 실험 방법임을 규명하였다. 통증 예방 및 치료에 있어서 통증의 유무 및 정도의 크기를 판단하는 실험방법으로 기계적 이질통 평가를 단독으로 진행할 경우의 단점인 실험자의 개별적 차이, 주관적 판단에 대한 오류를 본 발명의 방법을 통해 최소화하고 극복할 수 있음을 주장하는 바이다.

본 발명에 사용한 양성대조군 가바펜틴, 나프록센의 통증 완화 효능은 기계적 이질통 평가뿐만 아니라 초음파 발성음 측정법을 통하여 명확히 입증을 하였다. 본 발명을 이용하면 통증 반응을 보다 객관적, 과학적인 방법으로 측정할 수 있으며, 실험 결과의 신뢰성 또한 높일 수 있다.

참고문헌

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Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods 53:55-63(1994).

Portfors CV. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 46(1): 28-34(2007).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에 대한 평가방법:
(a) 인간을 제외한 동물에게 통증을 유발시키는 단계;
(b) 상기 동물에 분석하고자 하는 시료를 투여하는 단계; 및
(c) 상기 시료를 투여한 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파를 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 동물로부터 발생되는 22-27 kHz의 초음파를 감소시키는 경우에 상기 시료는 통증의 완화, 예방 또는 치료 효능이 있는 것으로 판정된다.
제 1 항에 있어서, 상기 시료의 통증 완화, 예방 또는 치료 효능에서 통증은 체성 통증(somatic pain), 내장성 통증(visceral pain), 염증성 통증, 기능장애 통증, 특발성 통증, 신경병증성 통증, 표면성 통증(superficial pain), 심부 통증(deep pain), 가려움, 편두통 및 암 통증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 평가방법.
제 1 항에 있어서, 상기 통증 유발은 약물투여, 피부 절개 또는 신경 결찰에 의한 것을 특징으로 하는 평가방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 초음파 측정은 22-27 kHz의 초음파 발생 횟수 또는 지속기간(duration)을 측정하는 것을 특징으로 평가방법.
제 1 항에 있어서, 상기 동물은 설치류 동물인 것을 특징으로 하는 평가방법.
제 5 항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스(Mus musculus) 또는 랫트(Rattus norvegicus)인 것을 특징으로 하는 평가방법.