KR101477781B1

KR101477781B1 - 바이러스 질병의 예방 또는 치료를 위한 긴 펜트락신 피티엑스３의 용도

Info

Publication number: KR101477781B1
Application number: KR1020087024835A
Authority: KR
Inventors: 파올로 카르미나티; 마리카 사사노; 프랑세스코 비스토니; 루이기나 로마니; 실비아 보짜
Original assignee: 씨그마-토 인더스트리에 파마슈티체 리유니테 에스. 피. 에이.
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2014-12-30
Also published as: US20110224132A1; SI1993585T1; AU2007224564B2; US20090286726A1; MX2008011413A; EP1993585A2; WO2007104646A3; HK1129301A1; AU2007224564A1; JP2009529563A; HK1173983A1; CY1115194T1; CN102657844B; WO2007104646A2; US8268304B2; CN101426516A; EP1993585B1; US7910092B2; CN101426516B; CN102657844A

Abstract

바이러스 질병의 예방 또는 치료 및/또는 바이러스 활성화의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3(PTX3) 또는 그의 작용성 유도체들 중 하나의 용도를 개시한다.

바이러스 질병, 펜트락신 PTX3

Description

바이러스 질병의 예방 또는 치료를 위한 긴 펜트락신 피티엑스３의 용도{USE OF THE LONG PENTRAXIN PTX3 FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF VIRAL DISEASES}

본 발명은 바이러스 질병의 예방 또는 치료 및/또는 바이러스 활성화의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3(PTX3) 또는 그의 작용성 유도체들 중 하나의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 바이러스는 헤르페스 바이러스, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV); 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H5N7 바이러스; 파라믹소바이러스, 예를 들어 홍역; 호흡기 세포융합 바이러스; 코로나바이러스, 예를 들어 SARS; HIV 바이러스; 간염 바이러스; 및 로타바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

인간 거대세포바이러스(HCMV)는 일반 인구의 약 50%에서 흔하게 발견되는 헤르페스바이러스이다. HIV를 갖는 사람의 약 90%가 HCMV를 갖는다. 상기 일반 인구에서, 상기 바이러스는 대개 초기 감염 후 체 조직 중에 잠복해 있다. 그러나, 상기 바이러스는 입, 소변, 및 생식기 관에 퍼져서, 다른 사람들에 대한 감염원으로 작용할 수 있다. HCMV에 의한 감염은 면역계가 어떠한 이유로 타협되는 경우 더욱 심각한 2차 감염을 발생시킬 수 있다.

수직 감염을 통해 HCMV를 획득한 유아의 대략 5%는 심각한 선천적 결손증이 있다. 여기에는 뇌 손상, 성장 장애, 실명, 및 다른 결함들이 있을 수 있다. 이러한 문제는 대개 모체가 임신중 최초로 HCMV에 감염되는 경우 발생한다.

일반적인 성인 인구에서, HCMV는 잠복해 있지만, 관상동맥 질환의 발생과 관련될 수 있다. HCMV에 의한 감염은 동맥 플라크 및 동맥경화증의 발생과 연관되었다.

HCMV는 면역계가 약한 사람에서 심각한 문제를 일으킬 수 있다.

이는 AIDS에 걸린 사람 또는 면역억제 요법 중인 환자에서 가장 흔한 문제이다. HCMV는 HIV 양성 환자의 75 내지 100%를 감염시킨다. HCMV와 관련된 가장 흔한 합병증은 맥락망막염; 위장관 감염, 예를 들어 간염, 식도염, 대장염, 위염 및 췌장염; 신경학적 병발, 예를 들어 뇌염 및 다발성척수근염; 폐 병발; 및 부고환염을 포함한다.

만연된 암에 걸린 사람들 또는 기관 또는 골수 이식을 받은 사람들이 통상적으로 걸린다. 감염은 HCMV에의 최초 노출로 인해 또는 재활성화된 HCMV의 결과로서 있을 수 있다. 이식 및 암 환자에서, HCMV는 대개 폐렴 또는 위장 감염을 일으켜 설사를 발생시키며, 이는 사망의 원인이 될 수 있다. 더욱 또한, HCMV는 고형 기관 이식 수용자에서 만성적인 동종이식편 기능이상의 발생에 기여한다. 폐 이식 수용자에서 HCMV 질병과 폐쇄세기관지염 발생 간의 관계는 잘 확립되어 있다. 또한, HCMV는 동종이식편 손상의 원인이 될 수 있는 다수의 위험 인자들 중 하나이다. 상기 동종이식편의 직접적인 바이러스 침입은 간 또는 신장 이식 환자에서 HCMV 간염을 유발할 수 있다. HCMV에 의해 생성된 직접적인 증후군들 이외에, 상 기 바이러스에 의한 감염은 진균 및 다른 기회감염, 예를 들어 폐포자충 폐렴 및 엡스타인 바 바이러스 관련된 이식 후 림프계증식 질환의 위험을 증가시킬 수 있다.

대부분의 사람들은 성인이 될 때까지 HCMV에 의해 감염되어 왔다. 수혈 또는 기관 이식을 받은 사람은 누구나 HCMV 감염의 위험이 있다.

더욱 또한, 면역계가 약한 사람들 및 아직 태어나지 않은 아이는 심각한 질병의 위험에 처해 있다.

면역계가 약한 사람들에서 활성 HCMV의 치료는 일반적으로 항바이러스제, 예를 들어 강시클로비어, 포스카넷 및 시도포비어에 의해 수행된다.

인플루엔자 바이러스는 인간에서 호흡기 관(코, 목 및 폐)을 감염시키는 전염성 질병인 독감을 유발시킨다. 인플루엔자는 대개 갑자기 나타나며 열, 두통, 으스스한 느낌(아프고 기력이 없는 듯한 느낌; 극단적일 수 있다), 기침, 인후통, 코막힘 및 몸살과 같은 증상이 있을 수 있다.

파라믹소비리다에 바이러스는 인간에서 광범위하게 다양한 독특한 임상 질환들을 유도하며, 홍역 바이러스; 귀밑샘염, 고환염 및 뇌염의 증상을 갖는 이하선염 바이러스; 및 호흡기 병원체인 파라인플루엔자 바이러스를 포함한다.

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 1 세 이하의 유아 및 아동에서 세기관지염 및 폐렴의 가장 흔한 원인이다. 병은 가장 흔히는 열, 콧물, 기침 및 때때로 헐떡임으로 시작한다. RSV는 또한 대개 경증에서 중증 감기와 같은 증상과 관련된, 생애 전체를 통해 반복된 감염을 유발하지만; 중증의 하기도 질병은 어떠한 연령에서 도 발생할 수 있으며, 특히 노인 또는 타협된 심장, 폐 또는 면역계를 갖는 사람들에서 발생할 수 있다.

코로나바이러스는 각종 포유동물과 조류를 감염시키며, 인간에서 상기 바이러스는 중중 급성 호흡기 증후군(SARS) 장 감염 및 신경학적 증후군을 비롯한 호흡기 감염을 일으킨다. 성인 감염은 덜 통상적이며 재감염이 생애 전체를 통해 발생하는 것으로 보인다.

인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 입자 중의 유전자 정보는 RNA에 의해 암호화된다. 숙주 세포 내로 침입 시 상기 RNA는 상기 바이러스 효소 역 전사효소에 의해 DNA로 복사된다. 상기 바이러스의 유전자 정보의 cDNA 사본은 핵 중의 숙주 세포 염색체에 통합될 수 있다. 상기 프로바이러스는 재활성화 전 및 보다 감염성인 레트로바이러스 입자의 생산 전에 많은 세포 분열을 위해 잠복해 있을 수 있다.

바이러스성 간염은 바이러스 감염에 의해 유발되는 임의의 유형의 간 염증이다. 현재 간 질병을 일으키는 것으로 인식되고 있는 3 개의 가장 통상적인 바이러스는 A형 간염, B형 간염, 및 비-A형 간염, 비-B형 간염(또한 C형 간염으로도 지칭됨)이다. 여러 가지 다른 유형들도 인식되었다: D형 간염, E형 간염, 및 최근에 동정된 G형 간염. 7 번째 유형(F형 간염)은 의심은 가지만 아직 확인되지 않고 있다.

로타바이러스는 어린이들 사이에서 중증 설사의 가장 통상적인 원인으로, 미국에서 매년 대략 55,000 명의 어린이가 이로 인해 입원하고 전 세계적으로 매년 600,000 명 이상의 어린이가 사망한다.

PTX3은 염증성 사이토킨 인터류킨베타(IL-1베타) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 노출 후 다양한 세포 유형(Bottazzi, et al., J. Biol. Chem, 1997; 272; 32817-32823), 특히 단핵성 식세포 및 내피세포에서 발현되는 단백질이다.

상기 단백질은 2 개의 구조 도메인, 즉 어떠한 공지된 분자와도 관련되지 않은 N-말단, 및 C-반응성 단백질(CRP)과 같은 짧은 펜트락신과 유사한 C-말단으로 이루어진다. 인간 PTX3(hPTX3)와 동물 PTX3 사이에 상당한 유사성이 밝혀졌다.

상기 PTX3 유전자는 인간 3q 부위(q24-28)와 유사한 부위 중의 마우스 염색체 3 상에 위치하며, 이는 상기 3q 25 부위 중의 hPTX3의 입증된 위치와 일치한다. 더욱이, 마우스 PTX3(mPTX3)(Introna, M., et al.: Blood, 87(1996); 1862-1872)은 조직, 위치 및 서열을 근거로 hPTX3과 매우 유사하다(Breviario, F., et al.: J. Biol. Chem., 267.22190, 1992).

특히, 서열들 간의 일치 정도는 인간 유전자와 마우스 유전자 간에 82%이고, 보존 치환을 고려한다면 92%에 달한다.

hPTX3의 서열과 mPTX3의 서열 간의 고도의 유사성은 진화 과정에서 펜트락신이 고도로 보존된 표시이다(Adv. Immunol. 34:141, 1983).

상기 펜트락신의 개관에 대해서, 문헌[H. Gewurz, et al., Current Opinion in Immunology, 1995, 7.54-64]을 참조하시오.

PTX3의 선행 용도는 이미 공지되어 있다.

본 출원인의 이름으로 출원된 국제 특허 출원 WO99/32516(가장 밀접한 종래 기술이다)은 감염(진균, 세균, 원생동물 또는 바이러스), 염증 또는 종양 질병의 치료를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도를 개시한다. WO99/32516에는 PTX3이 HCMV 또는 인플루엔자 바이러스의 치료에 유용함이 결코 언급되어 있지 않다.

WO02/38169에는 성장 인자 FGF-2의 비정상적인 활성화와 관련된 질병의 치료에 유용한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도가 개시되어 있다.

WO02/36151에는 자가면역 질병의 치료를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도가 개시되어 있다.

WO03/011326에는 여성 불임의 치료를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도가 개시되어 있다.

WO03/084561에는 성장 인자 FGF-8의 비정상적인 활성화와 관련된 종양 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도가 개시되어 있다.

WO03072603에는 종양 치료용 자가 백신의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도가 개시되어 있다.

WO2005060988에는 뼈 또는 연골 질병의 치료 및 여성 불임의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3, 및 TSG-6과 그의 조합의 용도가 개시되어 있다.

WO2005060997에는 자가면역 질병 및 뼈 및 연골의 퇴행성 질병의 예방 및 치료를 위한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 억제제의 용도가 개시되어 있다.

WO2005107791에는 진균 감염 및 특히 아스퍼질러스 푸미가투스에 의해 유발된 감염의 치료를 위한 펜트락신 PTX3와 항진균제와의 조합이 개시되어 있다.

문헌[Blood, 1 January 2006, Volume 107, Number 1]에는 PTX3가 염증 조건 하의 조직 손상 및 자가반응 세포의 활성화를 제한하는데 기여함이 개시되어 있다.

놀랍고도 뜻밖으로, 본 발명에 이르러 긴 펜트락신 PTX3이 바이러스 활성화의 억제 및/또는 바이러스 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 유용함이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 목적은 포유동물 환자에서 헤르페스 바이러스, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV); 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H5N7 바이러스; 파라믹소바이러스, 예를 들어 홍역; 호흡기 세포융합 바이러스; 코로나바이러스, 예를 들어 SARS; HIV 바이러스; 간염 바이러스; 및 로타바이러스 질병을 포함한 그룹 중에서 선택된 바이러스 질병의 활성화의 억제를 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 긴 펜트라신 PTX3의 용도이다.

본 발명의 추가의 목적은 포유동물 환자에서 헤르페스 바이러스, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV); 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H5N7 바이러스; 파라믹소바이러스, 예를 들어 홍역; 호흡기 세포융합 바이러스; 코로나바이러스, 예를 들어 SARS; HIV 바이러스; 간염 바이러스; 및 로타바이러스를 포함한 그룹 중에서 선택된 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 긴 펜트락신 PTX3의 용도이다.

본 발명의 추가의 목적은 거대세포바이러스 유발된 증후군의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 긴 펜트락신 PTX3의 용도이며, 이때

-상기 증후군은 CMV 단핵구증이고;

-상기 증후군은 면역타협된 숙주와 연관되며;

-상기 면역타협된 숙주는 AIDS를 갖고;

-상기 면역타협된 숙주는 기관 이식 수용자이다.

본 발명의 추가의 목적은 인플루엔자 유발된 증후군의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 긴 펜트락신 PTX3의 용도이며, 이때 상기 증후군은 H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N7 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바이러스에 기인한다.

하기의 비 제한적인 실시예는 본 발명을 예시한다.

물질 및 방법

사용된 약어:

HCMV: 인간 CMV; MCMV: 쥐 CMV; DC: 수지상 세포; gB: 당단백질 B; pDC: 형질세포모양 DC; PTX3: 펜트락신 3.

마우스

8 내지 12주 된 야생형(WT) 동종교배한 C57BL6, 129/Sv 및 BALB/c 암컷 마우스를 찰스 리버 브리딩 레보라토리즈(Charles River Breeding Laboratories)(Calco, Italy)로부터 구입하였다. 동종접합 TLR9-(TLR9-/-), TLR4- (TLR4-/-), TLR2-(TLR2-/-), MyD88-(MyD88-/-) 및 IL-12 p40(IL-12p40-/-)-결핍 마우스(모두 C57BL6 배경에 대해), 및 IFN-γ-결핍 마우스(IFN-γ-/-)(BALB/c 배경에 대해)의 번식 쌍(Science 2003, 301:640)(Nature Immunol. 2001, 2:1144)(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:3516)(Immunity 2004, 21:107)(J. Exp. Med. 2002, 195:517). PTX3-결핍 마우스(PTX3-/-)(생성된 129/Sv-C57BL6 혼합된 배경에 대해)(Nature 2002, 420:182). IFN-αβ 수용체가 결핍된 마우스(IFN-αβR-/-)를 사용하였다(J. Exp. Med. 2003, 197:885).

병원체, 감염 및 치료

스미스(Smith) 균주 MCMV 침샘 추출물의 스톡을 BALB/c 마우스로부터 준비하고 BALB/c 쥐 배 섬유모세포(MEF) 상에서 표준 플라크 분석으로 적정하였다(J. Gen. Virol. 2002, 83:2983).

인플루엔자 바이러스 A/시드니/5/97(H3N2) 균주를 자충포장란에서 증식시키고 매딘 다비(Madin Darby) 개 신장(MDCK) 상에서 표준 플라크 분석으로 적정하였다(Virology 2005, 340:296).

MCMV의 10⁵(BALB/c), 5 x 10⁵(C57BL6, PTX3+/+ 및 PTX3-/-) 플라크 형성 단위(PFU)의 복강 내 주입에 의해 감염을 개시시켰다. 제거된 조직을 개별적으로 균질화하고, 상등액을 -80 ℃에서 보관하고, 바이러스 역가를 표준 플라크 분석에 의해 MEF 상에서 후속적으로 정량분석하였다. PTX3을 내독소 비 함유 조건 하에서 PTX3(Nature 2002, 420:182)로 형질감염시킨 CHO 세포의 배양 상등액의 면역친화성 에 의해 수득하고 상기 감염일에 시작하여 7 내지 14일 동안 복강 내 투여하였다(1 또는 4 ㎎/㎏). 강사이클로비어(GCV)(Cymevene; Recordati, Milan, Italy로부터)를 감염 후 6 시간째에 시작하여, 1 주일에 3 회, 40 ㎎/㎏으로 복강 내 투여하였다. 대조군에게는 희석제만이 제공되었다. 조직분석을 위해서, 파라핀-매몰된 조직의 절편들을 퍼요오드산-쉬프 과정으로 염색하였다. 에이 푸미가투스의 균주 및 배양 조건은 개시된 바와 같았다(Blood 2003, 102:3807).

동시-감염을 위해서, MCMV-감염된 마우스에게 상기 바이러스 감염 후 2 주째에 5 x 10⁵ 아스퍼질러스 코니디아를 정맥 내로 제공하였으며 후속적으로 1주일간 매일 PTX3(1 ㎎/㎏, 복강 내)으로 처리하였다. 진균 생육에 대한 정량분석을 키틴 분석에 의해 수행하였으며 결과를 글루코사민/기관의 마이크로그램으로 나타낸다(Blood 2003, 102:3807).

실험 HSCT 모델

수용자 마우스를 8 Gy의 치사량에 노출시키고 문헌[Blood 2003, 102:3807]에 개시된 바와 같이, 동종이계 공여 마우스로부터 T 세포-고갈된 공여 세포(<1%의 오염 T 세포) 10⁷/㎖을 주입하였다.

HSCT 에 따른 MCMV 재활성화

마우스를 상기와 같이 MCMV로 감염시켰다. 3 개월 후에, 비장(J Immunol 2005, 174:1587) 및 폐(J Virol 1997, 71:2980)(상기 두 기관은 모두 분자 MCMV 잠복의 주요 부위로 간주된다)에서 급성 MCMV 감염의 부재에 의해, MCMV 잠복이 확인 되었다. 감염된 마우스를 동종이계 공여체 비 감염된 골수 세포의 수용자(MCMV⁺ 수용자) 또는 비 감염된 수용자에게 주입되는 골수 세포의 공여자(MCMV⁺ 공여자)로서 사용하였다. PTX3(1 ㎎/㎏/복강 내)을 HSCT 후 당일에 시작하여 2 주간 매일 제공하였다. 죽거나 살아있는 마우스(HSCT 후 30일째에 죽였다)를 상기 플라크 분석에 의해 폐 중의 MCMV 바이러스 부하에 대해 평가하였다.

DC 서브세트 생성

쥐 DC를, 150 U/㎖ 마우스 rGM-CSF(Sigma) 및 75 U/㎖ rIL-4(R&D Systems)의 존재 하에서 7일간 아이스코베(Iscove)의 변형된 배지(Blood 2003, 102:3807)에서 배양하여 CD11⁺DC를 획득하거나 또는 200 ng/㎖ FLT3-L(Immunex Corporation, Seattle, WA)의 존재 하에서 9일간 배양하여 pDC를 획득함으로써 골수 세포로부터 획득하였다(Blood 2003, 102:3087). 최종 성숙을 문헌[Blood 2003, 102:3807]에 개시된 바와 같이 수행하였으며, CD11⁺DC는 CD11c^high 발현 시 식별되었고 명백히 CD8α⁺ DC 및 CD11b⁺ DC로 구성되었다. pDC를 CD11c^low, Ly6G⁺ CD8α^+/- 세포로서 정의하였다. 비장 DC를 CD11c 마이크로비즈(MicroBeads) 및 미디맥스(Midimacs)(Miltenyi Biotec)를 사용하여 자기-활성화된 분류에 의해 정제하였다. 고 분해능 현미경검사 컬러 카메라 액시오캠(AxioCam)을 사용하여, 액시오비전(AxioVision) 소프트웨어 Rel. 3.1(Carl Zeiss S.p.A., Milano, Italy)로 사진을 촬영하였다.

유식 세포측정 분석

모든 FACS 분석에 대해서, 세포를 먼저 항-CD16/32(2.4G2)와 함께 배양하여 FcRs를 확실히 차단하고, CELLQuest^TM 소프트웨어가 구비된 FACScan 유식 세포형광강도 측정계(Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 항원 발현에 대해 분석하였다. 관련이 없는 Ab에 의한 세포의 대조용 염색을 사용하여 배경 형광 값을 얻었다. Ab는 BD 파밍겐(Pharmingen)으로부터의 것이었다. 획득된 데이터를 양성 세포의 퍼센트로서 평가하였다. 막대그래프는 4 개의 독립적인 실험 중 하나를 나타낸다.

플라크 분석

플라크 분석을 융합점 이하로 증식시킨 세포 상에서 측정하고 37 ℃에서 2 시간 동안 일련의 희석된 바이러스 샘플들과 함께 배양하였다(Science 2001, 292:934).

감염되지 않은 동물로부터의 모든 기관은 음성 바이러스였다. 바이러스 역가를 log₁₀(평균 ± 표준 오차, SE)으로서 나타낸다.

고정화된 바이러스에 대한 PTX3 결합 분석

96-웰 플레이트를 10⁴ PFU MCMV 또는 H3N2 인간 인플루엔자 바이러스를 함유하는 0.05M 카보네이트 용액(Na₂CO₃ 0.159 g 및 NaHCO₃ 0.293 g, pH 9.8)(Sigma)으로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 비 특이적인 결합 부위를 PBS 중의 5% 소 혈청 알 부민으로 차단하였다. HCMV에 대한 PTX3 결합을 HCMV Ag-코팅된 플레이트(AID GmbH, Germany)를 사용하여 측정하였다. 결합을 37 ℃에서 2 시간 동안 비오틴-표지된 PTX3(PTX3bio⁺) 0.5, 1 또는 5 ㎍/㎖을 사용하여 수행하였다. 억제를 PTX3bio⁺의 첨가 전에 37 ℃에서 2 시간 동안 비오틴화되지 않은 PTX3(PTX3bio^-) 0.5 또는 5 ㎍/㎖과 함께 배양함으로써 수행하였다. 450 ㎚에서의 광학 밀도를 양고추냉이 퍼옥시다제 기질 키트(Bio-Rad Laboratories, Life Science Group, Segrate Italy)를 사용하여 판독하였다. 바이러스-코팅되지 않은 플레이트에 대한 PTX3의 비 특이적 결합은 최소였다.

바이러스 복제의 억제

융합점 이하까지 증식한 MEF 세포(2 x 10⁴/웰)를 무 혈청 DMEM에 희석된 PTX3 5 내지 0.5 ㎍/㎖과 함께 37 ℃에서 2 시간 동안 예비 배양시키고 이어서 10⁴ PFU MCMV를 가하거나, 또는 처리하지 않은 채로 두고 37 ℃에서 2 시간 동안 PTX3 5 내지 0.5 ㎍/㎖로 미리 처리한 10⁴ PFU MCMV로 감염시켰다. 선택된 실험에서, PTX3 중화 단클론 항체(70 ng/100 ㎕)(Clin. Exp. Immunol. 2000, 119:196)를 사용하여 이월 효과를 최소화하였다. 감염성을 초기 실험에 의해 지시된 바와 같이, 37 ℃에서 72 시간 배양 후 측정하였다. 플레이트당 하나의 웰을 모의 감염시키고 세포 대조군으로서 사용하였다. DC의 경우에, 10⁶/세포/웰을 무 혈청 DMEM으로 희 석한 PTX5 5 ㎍/㎖과 함께 37 ℃에서 2 시간 동안 예비 배양시키고 이어서 10⁵ PFU MCMV를 가하거나, 또는 처리하지 않은 채로 두고 37 ℃에서 2 시간 동안 PTX3 5 ㎍/㎖로 미리 처리한 10⁵ PFU MCMV로 감염시켰다. 세포를 48 시간 배양 후에 감염성에 대해 분석하였다. H3N2 복제의 억제를 위해서, 3 x 10⁴ PFU 비리온을 융합성 MDCK 세포에 첨가하기 전에 37 ℃에서 2 시간 동안 PTX3 5 내지 0.5 ㎍/㎖에 노출시켰다. 감염성을 플라크 분석에 의해 감염 후 상이한 날짜에 평가하였다.

NK 세포 세포독성 활성

DX5 미세비드(Miltenyi Biotec)에 의해 비장으로부터 정제한 NK 세포를 NK1.1⁺CD3^- 세포로서 정의하였다. NK 세포용해 활성을 ⁵¹Cr-표지된 YAC-1 림프종 세포(Blood 2005, 106:4397)에 대해 평가하였다.

MCMV mRNA 의 정량분석을 위한 실시간 RT - PCR

고감도 RT-PCR 분석을 MCMV 당단백질 B(gB) DNA(Virus Res 2003, 98:17)의 356-bp 단편의 증폭에 대해 사용하였다.

전체 세포 RNA를 액체 질소 중에서 세포 파괴 후 TRIzol 추출에 의해 수득하였다(Invitrogen Life Technologies, Milan, Italy). cDNA의 합성 및 PCR을 개시된 바와 같이 수행하였다(Blood 2003, 102:3807). 합성 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 MCMV gB 유전자의 공개된 서열 중에서 선택하였다(J. Immunol. 2005, 175:6723).

센스 프라이머는 cDNA 번호 2416-2443: 5'-AAG-CAG-CAC-ATC-CGC-ACC-CTG-AGC-GCC-3'을, 안티센스는 번호 2745-2772: 5'-CCA-GGC-GCT-CCC-GGC-GGC-CCG-CTC-TCG-3'을 기본으로 하였다. 각 실험에서 DNA의 존재를 입증하기 위해, 나란한 액틴 증폭을 하기의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하였다: 5'-GAG-ACC-TTC-AAC-ACC-CCA-GCC(센스) 및 5'-GGC-CAT-CTC-TTG-CTC-GAA-GTC(안티센스). PCR을 열 주기(MasterCycler 구배; Eppendorf)에서 수행하였으며, 주기 조건은 95 ℃에서 3 분간 초기 변성, 이어서 95 ℃에서 1 분, 50 ℃에서 1 분, 및 72 ℃에서 20 초의 주기 및 72 ℃에서 10 분간 최종 연장이었다.

ELISA 및 ELISPOT 분석에 의한 사이토킨의 정량분석

마이토젠-자극된 비장 세포(ConA 10 ㎍/㎖로 48 시간 자극) 또는 MCMV-펄스화된 DC(24 시간)의 배양 상등액 중의 사이토킨의 수준을 ELISA(R&D Systems and PBL, Biomedical Lab, Milan, Italy)에 의해 측정하였다. 상기 분석의 검출 한계(pg/㎖)는 IL-12 p70의 경우 <16, IFN-γ의 경우 <10, IL-10의 경우 <3, 및 IFN-α의 경우 <10이었다. IFN-γ-생산 NK 세포를 개시된 바와 같이 비장으로부터 정제된 NK 상에서의 ELISPOT 분석에 의해 세었다(Blood 2003, 102:3807). 결과를 세포의 일련의 2 배 희석 복제물을 사용하여 계산된, 10⁵ 세포당 사이토킨-생산 세포(±SE)의 평균 수로서 나타낸다.

ELISA 에 의한 PTX3 의 정량분석

혈청 및 폐 균질물(감염 후 1 주일째) 중의 PTX3의 정량분석을 개시된 바와 같이 ELISA에 의해 수행하였다(Eur. J. Immunol. 2003, 33:2886).

통계적 분석

스튜던츠 페어드 t 시험을 사용하여 실험 그룹에서의 값들의 유의수준을 측정하였다(유의수준은 P<0.05로서 정의되었다). 생존 데이터를 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험을 사용하여 분석하였다. 생체 내 그룹은 6 마리의 동물로 이루어졌다. 달리 나타내지 않는 한, 데이터는 평균±SE이다.

결과

PTX3 은 시험관 내에서 CMV 감염을 억제한다

PTX3이 시험관 내에서 CMV 감염에 영향을 미치는지의 여부를 시험하기 위해서, i) HCMV 또는 MCMV에 결합하는 PTX3의 능력, ii) 복제를 허용하는 MEF 세포 내로의 생산적인 감염에 대한 PTX3의 바이러스 노출의 효과, 및 iii) 후속의 바이러스 감염에 대한 PTX3에 의한 MEF 세포 치료의 효과를 평가하였다. PTX3는 HMCV 및 MCMV 모두에 용량 의존적인 방식으로 결합하며, 상기 결합은 표지되지 않은 PTX3의 존재 하에서 현저하게 감소되었다(도 1A). HCMV에 대한 PTX3의 결합은 150(말기), 65 및 52(초기) 또는 28(특이적) kDa 항원에 대한 인간 항체의 존재 하에서 억제되었으며, 이는 PTX3 및 인간 특이 항체에 의해 인식된 바이러스 분자의 다양성을 암시한다. PTX3에의 노출은 감염된 세포에서 MCMV gB 전사물의 감소된 수준에 의해 72 시간 후에 평가 시, 바이러스 감염을 용량 의존적인 방식으로 강하게 억제하였다(도 1A). 상기 억제 효과는 신속하였으며 30 내지 45 분 노출 후 이미 불활성화가 획득되었다. 흥미롭게도, 최고 농도의 PTX3에 의한 세포의 전처리가 또한 상기 감염을 억제시켰다. 잔류 PTX3를 특이 항체에 의해 중화시키는 실험은 세포 또는 바이러스에 대한 유리 PTX3의 가능한 이월 효과를 방해하기 때문에, 상기 발견은 PTX3이 바이러스 감염성 및 상기 감염에 대한 세포의 복제 허용성에 영향을 미침을 암시한다. PTX3이 다른 외막 바이러스와 유사하게 결합하는지의 여부를 평가하기 위해서, H3N2 인간 인플루엔자 바이러스에 결합하고 시험관 내에서 감염성을 억제하는 PTX3의 능력을 평가하였다. 도 1B는 PTX3이 사용된 최고 PTX3 농도에서 관찰된 완전히 감소된 세포변성 효과에 의해 측정 시, 일정한 농도에서 특이적인 방식으로 상기 바이러스에 강하게 결합하고 시험관 내에서 그의 감염성을 크게 억제함을 보인다. PTX3은 또한 세포의 전처리 시 감염을 약간 지연시켰으며, 이는 상기 감염에 대한 세포 허용성에 대한 PTX3의 가능한 효과를 입증한다. 상기 두 가지 유형의 세포 모두에서, PTX3은 세포 단층의 융합성 및/또는 세포 형태에 대해 가시적인 영향을 미치지 않았으며, 이는 PTX3이 무독성임을 입증한다.

MCMV에 의한 급성 감염은 민감성 BLAB/c 마우스에서 일시적이지만, 현저한 면역억제를 유도하며, 이를 CD11⁺DC의 감염과 연계될 수 있다(Nat Immunol 2001, 2:1077). CD11⁺DC는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 MCMV의 생산적인 감염을 지원하는 반면, MCMV는 pDC에서 복제하지 않는다(J. Exp. Med. 2002, 195:517).

PTX3이 또한 DC의 MCMV 감염에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해서, PXT3-처리된 MCMV를 BALB/c 마우스로부터의 CD11⁺DC 및 pDC에 가하고 감염성을 상기와 같이 평가하였다. DC를 또한 감염 전에 PTX3으로 전처리하였다. 결과는 MCMV 가 CD11⁺DC에서 복제하지만 바이러스나 세포의 PTX3 전처리는 바이러스 복제를 크게 감소시킴을 보였다. 어쨌든 간에 바이러스 복제는 pDC에서 드러날 수 없었다(도 1C). PTX3은 또한 C57BL6 마우스로부터의 CD11⁺CD에서 바이러스 복제를 감소시켰다. 이러한 결과는 PTX3이 바이러스 감염성의 억제 및 상기 감염의 후속 단계를 단축시킴으로써 MCMV 감염을 방지할 수 있음을 암시한다.

PTX3 은 생체 내에서 CMV 감염 및 재활성화를 막는다

상기 결과는 PTX3이 생체 내에서 바이러스 억제 효과를 가질 수 있음을 예견할 수 있다. 민감성(BALB/c) 또는 내성(C57BL6) 마우스의 급성 1차 감염뿐만 아니라 HSCT의 실험 모델에서 재활성화에 대한 PTX3의 투여 효과를 평가하였다. 마우스를 치사량 이하의 MCMV로 복강 내 감염시키고, 상이한 용량의 PTX3 또는 GCV로 처리하고, 신장, 폐, 간 및 침샘에서의 역가 부하를 표준 플라크 분석 적정에 의해 상기 감염 후 1, 2 및 4 주째에 측정하였다(도 2A). 선행 보고들(Virus Res 2003, 98:17)과 일치되게, MCMV는 C57BL6 마우스보다 민감성 BALB/c의 내장 기관에서 높은 역가로 복제하였다. 그러나, PTX3은 상기 초기 단계에서, 특히 그 효과가 상기 감염 후 1 주일째에 GCV의 경우와 유사한 폐 및 비장에서 바이러스 부하를 현저하게 감소시켰다. 상기 바이러스 억제 효과는 내성 마우스보다 민감성 마우스의 폐 및 비장에서 더욱 뚜렷하였다(2 로그 초과의 차이). 상기 바이러스 역가는 민감성 BALB/c 마우스보다 C57BL6 내성 마우스의 간에서 더 낮았으며 PTX3 치료에 의해 거의 영향을 받지 않았다. PTX3에 의한 연장된 처리(2 주)는 특히 폐 및 비장에서 더욱 유효하였다(도 2A). PTX3에 의한 처리는 또한 민감한 마우스의 폐, 비장 및 간에서 염증성 병리상태 및 세포 보충을 개선시켰다. 이러한 결과는 PTX3이 숙주 바이러스 억제 면역 반응의 중요한 성분일 수 있음을 암시한다. 이러한 쟁점을 직접적으로 다루기 위해서, 감염중 생산된 PTX3의 수준을 측정하고 MCMV에 대한 PTX3-/- 마우스의 민감성뿐만 아니라 외부 PTX3 투여에 대한 반응성을 평가하였다. PTX3의 순환 수준은 감염 후 증가하지 않았다(BALB/c에서 16.0에서부터 16.7 ng/㎖까지, 및 C57BL6 마우스에서 14.0에서부터 16.0 ㎖ 까지). 그러나, 폐에서의 국소적인 수준은 특히 BALB/c 마우스에서 현저하게 증가하였다(0.5에서부터 2.13 ng/㎖ 까지). 이러한 발견과 일치되게, PTX3-/-는 특히 PTX3 처리 시 바이러스 역가가 크게 감소한 폐에서 PTX3+/+ 마우스보다 감염에 더 민감하였다. PTX3은 PTX3-/- 마우스의 간에서 낮은 바이러스 역가를 변경시키지 않았다(도 2B). 흥미롭게도, PTX3은 상기 마우스들의 침샘에서 바이러스 부하를 크게 감소시켰다. 감염된 마우스의 폐 조직 검사는 PTX3+/+ 마우스에서보다 PTX3-/- 마우스에서 더욱 심한 염증 병리상태를 밝혀내었으며, 상기 병리상태는 연조직 파괴, 기관지 주위 섬유증, 및 글로벳 세포 과형성의 징후와 관련된 무거운 세포 보충으로 이루어진다. 그러나, 상기 두 가지 유형의 마우스 모두에서, PTX3에 의한 처리는 염증 반응을 크게 개선시켰다(도 2C). 함께, 상기 데이터는 PTX3이 MCMV에 대한 숙주 면역 반응에 기여하고 PTX3의 외부 공급은 결정적인 바이러스 억제 효과를 가질 수도 있음을 암시한다.

동종이계 이식에 따른 잠복성 HCMV의 재활성화는 주요한 임상적 문제이므로, 상기 PTX3의 효과를 또한 실험적인 HSCT에서 MCMV 재활성화에서 평가하였다. 공여자 또는 수용자의 HCMV 혈청반응 양성은 면역 매개된 합병증의 증가된 위험과 관련이 있을 수 있다(Lancet 2004, Infect Dis. 4:725). PTX3의 활성을 민감성 또는 내성 마우스를 사용하여 MCMV⁺ 수용자 또는 MCMV⁺ 공여자에서 평가하였다. 각각의 조합에서, MCMV 재활성화는 폐에서 감소된 생존 및 상승된 바이러스 복제에 의해 밝혀진 바와 같이, 조직이식 후 10 내지 20일 이내에 발생하였다. 그러나, PTX3에 의한 처리는 장기적인 생존 및 거의 존재하지 않는 바이러스 복재에 의해 밝혀진 바와 같이, 바이러스 재활성화를 완전히 방지하였다(도 2D).

PTX3 은 침습성 폐 아스페르길루스증으로부터 MCMV -감염된 마우스를 보호한다

HCMV 재활성화는 아스퍼질러스(Aspergillus) 스페시즈에 의한 초감염을 포함하여, 중증 합병증에 걸리기 쉽게 만든다(Oncology(Williston Park) 2000, 14:1701).

이미 입증된 바와 같이, PTX3은 숙주 진균억제 면역성에서 중복적이지 않은 역할을 수행하며, PTX3 처리는 실험적인 HSCT에서 아스페르길루스증을 예방하였다(Nature 2002, 420:182). PTX3에 의한 MCMV-감염된 마우스의 처리가 또한 침습성 아스페르길루스증의 위험을 감소시키는지의 여부를 평가하기 위해서, MCMV-감염된 마우스를 1주일 동안 PTX3로 처리하고 1주일 후에 아스퍼질러스 코니디아로 기관 내 감염시켰다. 결과는 MCMV에 의한 사전 감염이 표적 기관에서 증가된 진균 부하에 의해 입증된 바와 같이, 진균 감염성을 증가시킴을 보였다. 그러나, PTX3- 처리는 진균 성장을 거의 완전히 감소시켰으며 진균 억제 내성을 복원시켰다(도 2E).

PTX3 은 DC / NK 반응성을 회복시키고 MCMV 감염에서 사이토신 생산을 촉진시킨다

민감성 BALB/c 마우스의 MCMV 감염의 가장 현저한 특징들 중 하나는 비장으로부터 CD8α⁺DC의 조기 소멸이며, 이는 상기 DC 서브세트를 지지하는 NK 세포의 결여에 기인하는 듯하다(Nat. Immunol. 2001, 2:1077; Nat. Immunol. 2003, 4:175).

CD8α⁺DC 및 Ly49H NK 세포 집단 모두의 팽창은 실제로 감염 시 상호적으로 조절된다(Mol. Immunol. 2005, 42:547).

따라서 우리는 MCMV-감염된 마우스의 비장 및 폐에서 DC 서브세트 및 NK 세포의 팽창 및 작용 활성에 대한 PTX3의 효과에 대해 조사하였다. 도 3은 PTX3 처리가, 상기 두 기관 모두에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포의 팽창에 영향을 미치지 않지만(A), 비장에서 CD11c⁺DC 및 CD8α⁺DC 서브세트를 팽창시키고(B) 비장과 폐 모두에서 NK1.1⁺NK 세포를 팽창시킴(C)을 보인다. NK 세포는 활성화 마커 CD69의 증가된 발현에 의해 나타난 바와 같이 완전히 활성화되었다(D). IFN-γ-생산 세포의 빈도 및 생체 외 정제된 비장 NK 세포의 세포독성 활성은 모두 PTX3 처리 시 현저하게 상향조절되었다(도 3E). PTX3 처리는 감염되지 않은 마우스에서 NK 세포를 팽창 및 활성화시키지 못했다.

MCMV 감염에서 NK 세포의 초기 활성화는 NK 세포 및 세포독성의 증식을 촉진하는 IFN-α/β, 및 IFN-γ 생산을 유도하는 IL-12에 의해 매개되므로(J. Exp. Med. 2003, 197:885), PTX3의 존재 하에서 MCMV에 노출된 DC 서브세트에 의한 사이토킨 생산 패턴을 평가하였다. 감염되지 않은 BALB/c 마우스로부터 골수 유도된 CD11⁺DC 및 pDC 서브세트를 재분류하여 DC에 대한 PTX3의 효과와 바이러스 자체에 대한 효과를 구분할 수 있게 하였다. DC를 바이러스 감염 전에 PTX3로 전 처리하거나 처리하지 않았으며 PTX3-처리된 MCMV로 감염시켰다. 선행 발견(Nat. Immunol. 2005, 1011)과 일치되게, DC 서브세트는 둘 다 상기 바이러스에 반응하여 IFN-α 및 IL-12p70을 생성시켰지만, pDC가 CD11⁺DC보다 더 많이 생성시켰다. PTX3은 상기 두 사이토킨 생산을 모두 증가시켰지만, 특히 CD11c⁺DC에만 세포 또는 바이러스 처리 후, IL-12p70을(도 4A), 보다 적은 정도이기는 하지만, C57BL6 마우스로부터 DC에 의해 유도하였다. 상기 데이터는, 도 1의 데이터와 함께, PTX3이, 감염성 및 사이토킨 생산이 PTX3에 의해 크게 영향을 받은 CD11⁺DC와 상반되게, MCMV에 반응하여 감염성에도, pDC의 활성화 프로그램에도 영향을 미치지 않음을 가리킨다.

시험관 내에서 사이토킨 생산 패턴을 생체 내에서 발생하는 패턴으로 보정하기 위해서, 1차 MCMV 감염되고 PTX3로 처리한 마우스로부터 비장 세포의 배양 상등액 중에서 IL-12p70, IFN-α, IFN-γ 및 IL-10 생산을 측정하였다. 또한 민감한 마우스와 내성 마우스뿐만 아니라 PTX3-/-와 PTX3+/+ 마우스 간의 사이토킨 생산 수준을 비교하였다. PTX3로 처리한 결과 민감한 마우스(BALB/c 및 PTX3-/-) 및 내성 마우스(C57BL6 및 PTX3+/+) 모두에서, 비록 후자의 경우 보다 적은 정도이기는 하지만, 모든 사이토킨의 생산이 증가된 것으로 밝혀졌다(도 4B). 함께, 상기 데이터는 PTX3이 MCMV에 반응하여 IFN-α 의존적인 경로보다 더 IL-12-를 촉진함을 암시한다. 이는 또한 PTX3에 의한 보호가 특히 수용자의 혈청반응 양성 조건에서, IL-12p70/IFN-γ-의존적인 경로의 활성화와 상관이 있는 재활성화 모델에서 입증되었다(도 4C).

PTX3 의 효능은 IL -12 p70 / IFN -γ-의존적인 경로에 의존한다

급성 MCMV 감염에 있어서 PTX3의 보호 효능에서 IFN-α, IL-12p70 및 IFN-γ 생산의 상대적인 역할을 직접 평가하기 위해서, IFN-γ, IL-12 p40 및 IFN-αβR이 결핍된 마우스에서 PTX3의 상대적인 효능을 평가하였다. 이미 보고된 바와 같이(J. Exp. Med. 2003, 197:885), IFN-γ 또는 IFN-αβR의 결핍은, 상응하는 WT 마우스와 비교 시 폐에서의 바이러스 부하의 1 로그 초과 증가에 의해 밝혀진 바와 같이, 감염에 대한 감수성을 크게 증가시켰다. 대조적으로, IL-12 p40의 결핍은 바이러스 부하를 현저하게 증가시키지 않았다(3.4 x 10³에서부터 4.2 x 10³으로, WT 대 IL-12 p40-/- 마우스)(도 5A). PTX3은 IFN-αβ-/-에서 바이러스 부하를 1 로그 초과까지 억제시켰으며, 그 효과는 WT 마우스에서 보인 것보다 더 우수하였다. 대조적으로, 상기 억제 활성은 상응하는 WT 대조용 마우스에 비해 IFN-γ-/- 또는 IL-12p40-/-에서 현저하게 감소되었다(IFN-γ-/-에서 6.3에서부터 6 log₁₀으로 대 BALB/c WT에서 4.8에서부터 3.4 log₁₀으로, 및 PTX3 처리 후 IL-12p40-/-에서 3.6에서부터 3.4 log₁₀으로 대 C57BL6 WT에서 3.4에서부터 2.9 log₁₀으로)(도 5A). IL-12 및 IFN-γ 모두가 PTX3로 처리된 IFN-αβR-/- 마우스에서 높은 수준으로 생산되었으며, 이는 PTX3의 보호 효과에서 IL-12p70/IFN-γ 축의 탁월한 역할을 입증한다.

PTX3 은 MCMV 의 TLR9 / MyD88 -의존성 감각을 활성화한다

유효한 항-MCMV 면역 감시는 작용성 TLR 신호를 필요로 하며, 특히 TLR9/MyD88 신호전달 경로는 신속한 MCMV 제거에 중요한 역할을 하는 반면, TLR2, TLR3, 및 TLR4는 의미 있는 역할을 하는 것으로 보이지 않았다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:3516). 급성 감염에 있어서 PTX3의 효능에서 TLR의 역할을 평가하기 위해서, TLR 신호전달이 결핍된 마우스를 MCMV로 시험감염시키고 폐에서 바이러스 복제에 대해 추적하였다. 공개된 데이터(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:3516)에 따르면, TLR9-/- 및 특히 MyD88-/- 마우스는 C57BL6 마우스보다 MCMV에 더 민감한 반면, TLR2 및 TLR4의 결핍은 마우스 내성에 현저한 영향을 미치지 않았다(도 5B). PTX3는 TLR9-/- 및 MyD88-/- 마우스에서 여전히 유효할 뿐만 아니라 그의 효능은 C57BL6 마우스에 비해, 특히 MyD88-/- 마우스에서 명백히 증가하였다(WT에서 3.4에서부터 2.9 log₁₀으로 대 MyD88-/- 마우스에서 4.8에서부터 3.2 log₁₀으로, 및 PTX3 처리 후 TLR9-/- 마우스에서 3.9에서부터 3 log₁₀으로). 흥미롭게도, PTX3은 TLR2-/- 및 TLR4-/- 마우스에서 완전히 효과가 없었으며, 이는 PTX3에 의한 바이러스 억제 면역 반응의 활성화에 있어서 상기 TLR들의 가능한 연루를 암시한다. 여기에서 다시, PTX3의 효능은 이미 다른 것들에 의해 입증된 바와 같이(J. Immunol. 2005, 175:6723), MyD88-/- 및 TLR9-/- 마우스로부터의 비장세포의 상등액에서 현저하게 증가하였고(그렇지 않으면 그의 생산은 낮다) TLR2-/- 및 TLR4-/- 마우스에서는 제거된 IL-12 및 IFN-γ의 수준과 직접적으로 상관이 있다(도 5). 이러한 발견은, 혈청 중의 극적인 결핍에도 불구하고, 지연되었지만 현저하게 높은 수준의 IFN-γ가 MyD88-/- 및 TLR9-/- 마우스에서 생산될 수 있음을 나타내는 공개된 데이터와 일치한다(J Immunol. 2005, 175:6723). 따라서, MyD88 연결기가 TLR3을 제외한 다른 모든 TLR의 신호 전달에 필요하기 때문에(Annu. Rev. Immunol. 2003, 21:335), TLR9 이외의 TLR 경로는 MCMV 감각 및 PTX3에 의해 유도된 후속 반응에 연루된다.

본 발명은 하나 이상의 단위 용량; 및 완성된 약학 용기를 포함하는, 바이러스 질병을 치료하려는 환자에게 분배하거나 또는 분배에 사용하기 위한(또는 상기 바이러스의 활성화를 억제하기 위해서) 치료제 패키지를 고려하며, 이때 상기 각각의 단위 용량은 상기 단위 용량 중 하나 이상의 주기적인 투여가 예를 들어 HCMV의 치료에 유효하도록 하는 양의 긴 펜트락신 PTX3를 상기 중에 포함하고; 상기 용기는 표지를 함유하거나 포함하며, 상기 표지는 상기 긴 펜트락신 PTX3가 예를 들어 HCMV를 갖는 환자의 치료에 사용이 지시됨을 가리킨다.

또한, 본 발명은 패키징 물질 및 상기 패키징 물질 내에 함유된 긴 펜트락신 PTX3를 포함하는 제품을 고려하며, 여기에서 상기 긴 펜트락신 PTX3은 HCMV의 치료에 치료학적으로 유효하고, 상기 패키징 물질은 상기 긴 펜트락신 PTX3가 HCMV의 치료에 사용될 수 있음을 가리키는 표지를 포함한다.

본 발명에 따른 용도에서, "처리" 또는 "처리하는"이란 용어는 바이러스 질병의 예방, 방지, 경감, 억제, 개선, 중지, 제지, 지체 또는 상기 질병의 진행, 활성화의 역전 또는 상기 질병의 중증도의 감소를 포함하는 그의 통상적인 의미를 갖는다.

본 발명에 따른 용도에서, "유효량"이란 용어는 의도된 결과를 수행할 수 있는 화합물의 양을 지칭한다. 예를 들어 바이러스 질병을 치료하기 위한 노력의 일환으로 투여되는 긴 펜트락신 PTX3의 유효량은 상기 바이러스 질병의 예방, 방지, 경감, 개선, 중지, 제지, 지체 또는 상기 질병의 진행의 역전 또는 상기 질병의 중증도의 감소를 위해 필요한 양이며, 투여되는 매일 용량은 주치의의 판단, 환자의 체중, 연령 및 일반적인 조건에 따라 변할 것이다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 긴 펜트락신 PTX3를, 약학 담체와 함께 함유하는 약학 제형을 사용하는 방법을 포함한다. 숙련가는 상기와 같은 제형 및 그의 제법을 알 것이다. 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16th ed. 1980)]을 참조하시오.

상기 제형을 바람직하게는 활성 성분의 단위 투여형으로 제형화한다. "단위 투여형"이란 용어는 인간 환자에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별도의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제와 함께, 목적하는 치료 효과를 생성시키는 것으로 계산된 소정 량의 활성 물질을 함유한다.

긴 펜트락신 PTX3를 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 약학 조성물의 형태로 투여할 수 있으며, 그의 비율 및 성질은 선택된 담체 및/또는 부형제에 대한 상기 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 선택된 투여 경로, 및 표준 약학 관행에 의해 결정된다.

약학 조성물을 제약 분야에 널리 공지된 방식으로 제조하며, 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16th ed. 1980)]을 참조하시오.

상기 담체 또는 부형제는 고체, 반-고체 또는 액체 물질일 수 있으며, 상기 물질은 활성 성분에 대한 비히클 또는 매질로서 작용할 수 있다. 적합한 담체 또는 부형제는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 약학 조성물은 경구, 흡입, 비 경구 또는 국소 용도로 적합할 수 있으며 상기 조성물을 환자에게 정제, 캡슐, 에어로졸, 흡입제, 좌약, 용액, 현탁액, 리포솜 등의 형태로 투여할 수 있다.

도 1

PTX3 은 시험관 내에서 CMV 및 인플루엔자 바이러스에 결합하여 이들의 복제를 억제한다

(A) 인간(HCMV) 또는 쥐(MCMV) 바이러스에 대한 비오틴-표지된 PTX3(PTX3bio⁺)의 결합. 상이한 농도의 비오틴화되지 않은 PTX3(PTX3bio^-)를 37 ℃에서 2 시간 동안 HCMV Ag-코팅되거나 MCMV-코팅된 플레이트에 가한 다음 상이한 농도의 PTX3bio⁺를 37 ℃에서 추가로 2 시간 동안 가하였다. 450 ㎚에서 광학 밀도를 양고추냉이 퍼옥시다제 기질 키트를 사용하여 판독하였다. *P < 0.05, 1 또는 0.5 ㎍/㎖ 대 5 ㎍/㎖ PTX3bio⁺; **P <0.05, PTX3bio^-의 존재 및 부재 하의 PTX3bio⁺. 막대는 표준 오차를 가리킨다. 바이러스 복제를 억제하기 위해서, MEF 세포를 처리하지 않고 처리되지 않은 MCMV로 감염시키거나(O), 처리하지 않고 5 내지 0.5 ㎍/㎖의 PTX3로 전 처리한 MCMV로 감염시키거나(V) 또는 5 내지 0.5 ㎍/㎖의 PTX3로 사전 배양시키고(C) 이어서 처리되지 않은 MCMV를 첨가하였다. -, 감염되지 않은 세포. MCMV gB 전사물 발현을 감염 후 72시간째에 실시간 PCR에 의해 평가하였다. 나타낸 결과는 3 개의 독립적인 실험들 중 전형적인 하나의 실험을 나타낸다. (B) 인간 H3N2 인플루엔자 바이러스에 대한 PTX3bio⁺의 결합. H3N2-코팅된 플레이트에 상기와 같이 PTX3bio^-에 이어서 PTX3bio⁺를 첨가하였다. 막대는 표준 오차를 가리킨다. 바이러스 복제의 억제를 위해서, MDCK 세포를 0.5 내지 5 ㎍/㎖의 PTX3로 전 처리한 H3N2로 감염시키고, 바이러스 복제를 표준 플라크 분석에 의해 평가하였다. 나타낸 결과는 3 개의 독립적인 실험들 중 전형적인 하나의 실험을 나타낸다. (C) DC를 GM-CSF(CD11⁺DC) 또는 Flt3L(혈장 세포, pDC)의 존재 하에서 BALB/c 마우스의 골수 선조세포로부터 생성시키고, MCMV(MCMV로서 표시됨)로 감염시키고, 48 시간 후에, 광 현미경검사에 의해 형태를 평가하고 상기와 같이 실시간 PCR에 의해 바이러스 복제를 평가하였다. 세포를 감염 전에 37 ℃에서 2 시간 동안 PTX3 5 ㎍/㎖에 노출시키거나 또는 PTX3-처리된 비리온(PTX3+MCMV^b로 표 시됨)에 노출시켰다. -, 감염되지 않은 세포.

도 2

PTX3 는 생체 내에서 CMV 감염 및 재활성화를 막는다

(A 및 B) 동물들을 10⁵(BALB/c), 5 x 10⁵(C57BL6, PTX3+/+ 및 PTX3-/-) PFU의 MCMV로 복강 내로 감염시켰다. 바이러스 역가를 상이한 시점에서 제거한 조직들에 대해 표준 플라크 분석에 의해 MEF 세포 상에서 정량분석하였다. PTX3 및 GCV를 상기 감염 당일에 시작하여 투여하였다. 대조군에게는 희석제만을 제공하였다. 바이러스 역가를 log₁₀(평균 ± 표준 오차, SE)으로서 나타낸다. 결과는 4 개의 독립적인 실험들을 나타낸다. (C) MCMV로 감염시키고 상기와 같이 PTX3(+) 또는 희석제(-)로 1 주일 동안 처리한 PTX3+/+ 및 PTX3-/- 마우스로부터의 퍼요오드산-쉬프-염색된 폐 절편의 조직 분석. 연조직 파괴, 기관지 주위 섬유증, 및 글로벳 세포 과형성의 징후와 관련된 세포 보충이 PTX3+/+에서보다 PTX3-/-에서 더 많이 보였으며 PTX3 처리에 의해 개선되었다. 처리 후 하루 째에 조직분석을 수행하였다. 모든 패널에서 배율 x 10. (D) BALB/c 또는 C57BL6 마우스를 상기와 같이 MCMV로 감염시켰다. 3 개월 후에, MCMV 잠복성이 비장 및 폐 중의 급성 MCMV 감염의 부재에 의해 확인되었다. 감염된 마우스를 동종이계 공여자 비 감염된 골수 세포의 수용자(MCMV⁺ 수용자)로서 또는 비 감염된 수용자에 주입되는 골수 세포의 공여자(MCMV⁺ 공여자)로서 사용하였다. PTX3(1 ㎎/㎏/복강 내)을 HSCT 후 당일에 출 발하여 2 주간 매일 제공하였다. 죽거나 살아있는 마우스(HSCT 후 30일째에 죽였다)를 상기 플라크 분석에 의해 폐 중의 MCMV 바이러스 부하에 대해 평가하였다. MST, 중간 생존 시간(일수). 막대는 표준 오차를 가리킨다. *P < 0.05, 처리 및 비 처리된 마우스 간의 폐 중 바이러스 부하. (E) MCMV-감염된 BALB/c 마우스에게 바이러스 감염 후 2 주일째에 아스퍼질러스 코니디아를 정맥 내로 제공하고 후속적으로 1 주일 동안 매일 PTX3(1 ㎎/㎏/복강 내)로 처리하였다. 진균 성장의 정량분석을 키틴 분석에 의해 감염 후 3일째에 수행하였으며 결과를 키틴 함량(글루코스아민의 마이크로그램/기관)으로서 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. * P < 0.05, MCMV-감염된 마우스의 진균 부하 대 비 감염된 마우스의 진균 부하. **P < 0.05, PTX3-처리된 마우스의 진균 부하 대 비 처리된 MCMV-감염된 마우스의 진균 부하.

도 3

PTX3 은 생체 내에서 수지상 세포 및 NK 세포 활성화를 지지한다

PTX3(1 ㎎/㎏/복강 내)에 의해 처리되지 않은(-) MCMV-감염된 BALB/c 마우스 또는 처리(+) 1 주일 후 어느 날의 마우스로부터의 전체 비장 및 폐 세포(A,C), 비장 DC(B), 비장 및 폐 NK 세포(D)에 대한 표현형 분석. 감염되지 않은 마우스는 없음. 숫자는 FACS 분석에 대한 양성 세포의 퍼센트를 지칭한다. (E) 세포독성 활성(YAC-1 표적에 대한 표준 ⁵¹Cr-방출 분석에 의해) 및 상기와 같이 감염되고 처리된 BALB/c 마우스로부터의 ELISPOT 분석에 의한 IFN-γ-생산 비장 NK 세포의 빈 도. 막대는 표준 오차를 나타낸다. *P < 0.05, 감염된 마우스 대 비 감염된 마우스. **P<0.05, PTX3-처리된 감염된 마우스 대 처리되지 않은 감염된 마우스. 나타낸 결과는 5 개의 독립적인 실험 중 3 개의 전형적인 실험을 나타낸다.

도 4

PTX3 은 사이토킨 생산을 촉진한다

(A) DC는 GM-CSF(CD11c⁺) 또는 Flt3L(pDC)의 존재 하에서 BALB/c 마우스의 골수 선조세포로부터 생성되었다. 사이토킨 생산을 위해서, DC를 감염 전에 5 ㎍/㎖ PTX3에 미리 노출시키거나(a) 또는 처리하지 않고 PTX3-처리된 바이러스로 감염시켰다(b). 사이토킨을 ELISA 분석에 의해 배양 상등액에서 측정하고 gp/㎖로 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. *P < 0.05, MCMV-감염된 DC 대 감염되지 않은 DC에서의 사이토킨 생산. **P < 0.05, PTX3-처리된 바이러스로 감염된 DC 대 PTX3-처리된 DC. (B) MCMV 감염 중 마우스에서 사이토킨 생산. 2차 MCMV 감염되고 PTX3로 처리된 마우스로부터의 비장 세포의 배양 상등액 중의 사이토킨 수준(pg/㎖로서). *P < 0.05, PTX3 처리된 마우스 대 비 처리된 마우스. (C) MCMV 재활성화 모델에서 사이토킨 생산. BALB/c 또는 C57BL6 마우스를 MCMV로 감염시켰다. 감염된 마우스를 동종이계 공여자 비 감염된 골수 세포의 수용자(MCMV⁺ 수용자)로서 또는 비 감염된 수용자에게 주입되는 골수 세포의 공여자(MCMV⁺ 공여자)로서 사용하였다. PTX3(1 ㎎/㎏/복강 내)을 HSCT 후 당일에 출발하여 2 주간 매일 제공하였다. 비장 세포의 배양 상등액 중의 사이토킨(pg/㎖) 수준을 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 막대는 표준 오차를 가리킨다. *P < 0.05, PTX3 처리된 마우스 대 처리되지 않은 마우스.

도 5

PTX3 활성은 IL -12/ IFN -γ-의존성이고 TLR9 / MyD88 -독립적이다

(A) MCMV 감염 및 PTX3 처리 시 BALB/c, IFN-γ-/-, C57BL6, IL-12p40-/- 및 IFN-αβ-/- 마우스의 감염 및 바이러스 부하. 동물들을 10⁵(BALB/c, IFN-γ-/-), 5 x 10⁵(C57BL6, IL-12p40-/- 및 IFN-αβ-/-) PFU의 MCMV로 복강 내로 감염시켰다. 바이러스 역가를 감염 후 7일째에 제거한 폐 조직들에 대해 표준 플라크 분석에 의해 MEF 세포 상에서 정량분석하였다. PTX3(1 ㎎/㎏/복강 내)을 상기 감염 당일에 시작하여 1주일간 매일 투여하였다. 대조군에게는 희석제만을 제공하였다. 바이러스 역가를 log₁₀으로서 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. *P < 0.05, MCMV 처리된 마우스 대 MCMV 비 처리된 마우스. 결과는 4 개의 독립적인 실험들을 나타낸다.

(B) PTX3로 처리한 C57BL6, TLR2-/-, TLR4-/-, TLR9-/- 및 MyD88-/- 마우스에서 MCMV 복제. 마우스를 5 x 10⁵(C57BL6, TLR2-/-, TLR4-/-, TLR9-/-, MyD88-/-) PFU의 MCMV로 복강 내 접종하고 상기와 같이 PTX3 처리하였다. 폐 MCMV 역가를 감염 후 1 주일째에 플라크 분석에 의해 측정하였다. 대조군에게는 희석제만을 제공하였다. 바이러스 역가를 log₁₀으로서 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. *P < 0.05, MCMV 처리된 마우스 대 MCMV 비 처리된 마우스. 결과는 4 개의 독립적인 실험들을 나타낸다.

Claims

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긴 펜트락신 PTX3을 포함하는 헤르페스 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,

상기 헤르페스 바이러스가 거대세포바이러스(CMV)이고; 상기 인플루엔자 바이러스가 H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
긴 펜트락신 PTX3을 포함하는 거대세포바이러스 유발된 증후군 치료용 약제학적 조성물로서,

상기 증후군이 CMV 단핵구증이고;

상기 증후군이 면역타협된 숙주와 연관되며;

상기 면역타협된 숙주가 AIDS를 갖고;

상기 면역타협된 숙주가 기관 이식 수용자인

약제학적 조성물.
긴 펜트락신 PTX3을 포함하는 인플루엔자 유발된 증후군 치료용 약제학적 조성물.