KR101475110B1 - 허수테논 화합물의 안정화를 위한 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 허수테논의 안정화를 위한 제형에 관한 것이다. 보다 상세하게는 허수테논과 항산화제가 포함된 액상 제형 조성물과, 지질 매질에 허수테논이 함입되어 있는 나노 수준의 크기를 갖는 지질나노입자 및 이 지질나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 허수테논 화합물을 항산화제와 함께 액상 제형으로 제조하거나, 지질 매질에 함입시켜 지질나노입자로 제조하면 허수테논의 산화적 안정성을 크게 개선시킬 수 있다. 이러한 산화 안정성 개선 효과는 허수테논의 의약 제품 개발에 크게 기여할 것으로 기대된다.

Description

허수테논 화합물의 안정화를 위한 제형{Formulation for Stabilization of Hirsutenone Compound}

본 발명은 허수테논 화합물의 안정화를 위한 제형에 관한 것이다. 보다 상세하게는 허수테논의 안정성이 증가된 액상 제형 조성물과, 지질 매질내에 허수테논이 함입되어 있는 나노 수준의 크기를 갖는 지질나노입자, 및 이 지질나노입자의 제조방법에 관한 것이다.

허수테논은 오리나무의 수피로부터 추출된 디아릴헵타노이드 계열 약물로(Askawa et al., 1970) 활성 T 세포 핵심 인자의 탈인산화를 차단함으로써 T 세포의 활성을 차단하여 아토피 피부염의 치료에 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Joo et al., 2009). 또한 카스파아제-8과 Bid-의존성 경로, 그리고 미토콘드리아 의존성 세포소멸 경로의 활성을 증진시킴으로써 카스파아제의 활성을 증진시키고, 이는 난소암 세포의 암 괴사인자 관련-암세포소멸 리간드(TRAIL)을 활성화시켜 암세포 소멸을 유도함이 확인되었다(Lee et al., 2010). 최근 아토피 피부염 유발 동물 모델을 대상으로 하여 허수테논의 다양한 제형과 접근 방법이 연구되고 있다. 1％ 허수테논을 함유한 크림 제형을 아토피 유발 NC/Nga 마우스 피부에 적용한 결과 Skin severity score의 감소와 IgE, 호산구 수치 감소, 이외에도 Th2 관련 면역 인자의 감소를 확인할 수 있었다(Jeong et al., 2010). 추가적으로 허수테논의 탄성 리포좀-크림 제형을 개발하였으며, 이에 Tat 펩티드를 추가하여 허수테논의 피부 투과율을 증진시키고 Skin severity score와 산화 질소의 합성, 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)-2, IL-4, IL-13, IgE, 호산구 등 각종 면역 관련 인자의 감소에 있어 뛰어난 효과를 보임을 확인하였다(Kang et al., 2011). 그러나 디아릴헵타노이드 계열 약물의 불안정성은 널리 알려져 있기 때문에, 허수테논의 안정성은 제제 개발에 있어 중요한 변수이다.

산화에 의해 분해되는 불안정한 약물의 안정화 방법으로는 빛 차단, 중금속 제거, 고온 조건의 회피, 질소 기체 치환, 항산화제 첨가, 포장 방법의 변화 등이 있다. 이 중 항산화제의 첨가는 산화로부터 제품을 보호하기 위해 실제로 제약과 식품 산업에서 가장 널리 이용되는 방법이다. 항산화제의 장점은 약물의 변화를 일으키지 않고 대신하여 분해된다는 것이다(Michael et al., 1985). 퀴나프릴(quinapril) HCl 정제 또는 캡슐에 아스코르빈산(ascorbic acid)을 첨가함으로써 안정성을 개선시켜 45℃에서 1개월 동안 안정성이 유지됨이 보고되었다(Murthy et al., 1988). 또한 카테킨(catechin)을 안정화하기 위해 아스코르빈산(ascorbic acid)을 첨가한 결과 에멀젼 상태에서 산화로 인한 분해를 억제함이 보고되었다(Watanabe et al., 2011). 이외에도 약물을 다양한 특수 제형에 봉입함으로써 약물과 산소와의 접촉을 차단함으로써 약물의 안정화를 개선시키는 기술 또한 다양하게 사용되고 있다. 고체 분산체, β-사이클로덱스트린, NLC(Nano-structured lipid carrier), SLN(Solid lipid nanoparticle) 등이 약물의 안정화를 개선시킨다는 사실이 이미 보고되었다(Cho et al., 2010; Hladon et al., 2000; Teeranachaideekul et al., 2007; Jee et al., 2006).

SLN은 콜로이드 시스템 중 약물의 불안정성을 극복하기 위해 개발되었다. 그러나, SLN은 HPH(high pressure homogenization)와 같은 간단한 방법으로 제조할 수 있는 이점이 있으나, 봉입 가능한 약물의 양에 한계가 있고 보관기간 동안 외부로 쉽게 방출된다는 문제점이 보고되었다(Menhert et al., 2001). 이런 문제점을 개선하기 위하여 NLC(Nanostructured Lipid Carrier)가 개발되었다. NLC는 고형 지질과 액상 지질을 특정 비율로 조합하여 HPH 등의 방법으로 제조되는 분산 상태의 용액이다. NLC는 이런 특징으로 인해 높은 약물 봉입률과 저장 기간 중 약물의 방출이나 불안정성을 개선한다는 장점이 있으며 이로 인해 차세대 제형으로 주목받고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 산화에 의한 분해율이 높아 불안정한 약물인 허수테논의 안정성을 증가시키기 위한 다양한 형태의 제형을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 허수테논을 항산화제와 함께 용해시킨 액상 제형과, 지질 매질(lipid matrix)에 허수테논을 함입시켜 형성한 지질나노입자가 허수테논의 안정성을 크게 개선시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 허수테논 및 항산화제를 포함하는 액상 제형 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 지질 매질에 허수테논이 함입되어 있는 지질나노입자를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질나노입자의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 액상 제형 조성물 또는 상기 지질나노입자를 포함하는 난소암 또는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하기 화학식 1의 허수테논 화합물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함하는 액상 제형 조성물을 제공한다.

본 발명은 허수테논의 안정성을 크게 향상시킨 액상 제형 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 액상 제형 조성물에 포함되는 허수테논의 함량은 허수테논의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분하게 목적 및 경우에 따라 조절될 수 있으며, 바람직하게는 액상 제형 조성물 총 중량에 대해 0.01-50 중량％, 보다 바람직하게는 0.1-40 중량％, 보다 더 바람직하게는 0.1-30 중량％로 포함된다.

상기 허수테논의 안정성은 허수테논의 산화적 분해에 대한 안정성을 의미한다.

본 발명에서 상기 허수테논의 산화적 분해에 대한 안정성은 약제학적으로 허용되는 항산화제에 의해 달성된다.

본 발명에서 사용가능한 상기 항산화제는 허수테논의 활성을 저해하지 않고 함께 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않는다. 상기 항산화제는 예를 들어, 아스코르빈산(Ascorbic acid, AA), 아스코르빈산의 염(예컨대, 아스코르빈산-Na), 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate, AP), EDTA, EDTA의 염(예컨대, EDTA-Na), 부틸히드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, BHT), 부틸히드록시아니솔(Butylated hydroxyanisole, BHA), 알파-토코페롤(α-tocopherol, TC), 알파-리포산(alpha-lipoic acid), 프로필갈레이트(propyl gallate), 카로틴(carotene) 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 수용성 항산화제로서 아스코르빈산, 아스코르빈산의 염, EDTA, EDTA의 염이다.

상기 항산화제의 함유량은 상기 액상 제형 총 중량 대비 0.0001-30 중량％, 바람직하게는 0.001-20 중량％, 보다 바람직하게는 0.01-10중량％, 보다 더 바람직하게는 0.01-1 중량％이다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 허수테논 및 항산화제는 용매에 용해된 형태로 제조한다.

상기 “용매”는 허수테논 및 항산화제를 용해시킬 수 있는 극성 또는 비극성의 용매이며, 바람직하게는 극성 용매이며, 보다 바람직하게는 물이다.

본 발명의 액상 제형 조성물은 허수테논 또는 항산화제의 용해도를 향상시키기 위해 하나 이상의 보조용매를 포함할 수 있다. 이러한 보조용매로는 예를 들어 글리콜, 알코올(예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올 등), 올레산, 리놀레산 트리글리세리드, 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 카프릴산/카프르산 모노- 및 디글리세리드, 폴리옥시에틸렌 카프릴산/카프르산 모노- 및 디글레세리드와 같은 폴리옥시에틸렌 카프릴산/카프르산 글리세리드, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리에틸렌 글리세릴 트리올레에이트, 지방산의 저급알킬 에스테르, 에틸 카프릴레이트, 에틸 올레에이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 액상 제형 조성물은 허수테논, 항산화제 및 용매 이외에 약학적으로 허용되는 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 이러한 부형제는 예를 들어, 보조 용매, 감미제, 결정화 저해제, 보존제, 분산제, 에멀젼화제 등을 포함할 수 있다. 부형제의 선택 및 조합을 통해, 약물 허수테논의 농도, 용해도, 분산도, 에멀젼화도, 효능, 향미, 환자순응성 및 다른 특성들을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 지질 매질(lipid matrix)에 허수테논이 함입되어 있는 나노 수준의 크기를 갖는 지질나노입자를 제공한다.

본 발명에서 허수테논이 지질 매질에 함입된 지질나노입자의 형태로 제조되면 산화적 안정성이 크게 향상된다.

본 발명의 지질나노입자에 함입되는 허수테논의 함량은 허수테논의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분하도록 목적 및 경우에 따라 조절될 수 있으며, 바람직하게는 지질나노입자 총 중량에 대해 0.001-50 중량％, 보다 바람직하게는 0.01-40 중량％, 보다 더 바람직하게는 0.01-30 중량％로 포함된다.

본 발명에서 상기 지질 매질은 고상지질(solid lipid)의 매질, 액상지질(liquid lipid)의 매질 또는 고상지질과 액상지질로 이루어지는 혼합 매질이며, 바람직하게는 고상지질의 매질 또는 고상지질과 액상지질로 이루어지는 혼합 매질이며, 보다 더 바람직하게는 고상지질과 액상지질로 이루어지는 혼합 매질이다.

본 발명의 지질나노입자가 고상지질로 이루어지는 경우 고체지질나노입자(Solid Lipid Nanoparticle, SLN), 고상지질과 액상지질을 혼합하여 이루어지는 경우 나노구조지질담체(Nanostructured Lipid Carrier, NLC)으로 통상적으로 지칭한다.

SLN 형태의 경우 0.1-30 중량％의 고상지질이 수성매질에 분산되어 있으며, 필요한 경우 상기 수성매질에는 계면활성제가 0.1-5 중량％ 함량으로 포함된다. NLC 형태의 경우 고상지질은 액상지질과 1:99 내지 99:1의 비율로 혼합된다.

본 발명의 지질나노입자는 고상지질과 액상지질로 이루어지므로, 나노입자의 내부는 고상지질, 액상지질, 또는 고상지질과 액상지질의 혼합물이 혼재되어 있는, 덜 규칙적이고 덜 정렬된 지질 매질 구조를 가지는데, 허수테논은 이러한 지질 매질 구조에 함입되어 있다(도 9 참조).

본 발명의 지질나노입자를 구성하는 매질의 지질(matrix lipid)은 트리글리세라이드(triglyceride)계열, 부분 글리세라이드(partial glyceride)계열, 지방산(fatty acid)계열, 왁스(wax)계열, 스테로이드 계열의 성분을 사용할 수 있다. 매질을 구성하는 지질의 선별은 지질나노입자의 약물전달능을 결정하는 중요한 요소이므로, 허수테논의 안정성, 독성, 생체적합성, 약물의 로딩능, 저장기간 동안의 약물 누출의 최소화, 지질 매질의 결정화 및 정렬된 구조화의 최소화능, 약물의 방출능 등을 고려하여 선택한다.

본 발명에서 사용되는 고상지질(solid lipid)은 다수 화합물의 혼합된 물질로서, 비교적 높은 녹는점을 가지며(예컨대 40℃ 이상), GRAS(generally recognized as safe) 기준에 적합하고, 인 비보 생분해특성을 갖는 지질이 선택된다.

이러한 고상지질의 적합한 예로는 Apifil(GattefossGmbH, Weil am Rhein, Germany), Beeswax (Caelo, Hilden, Germany), Carnauba wax 2442 L (Trittau, Germany), CompritolATO (GattefossGmbH, Weil am Rhein, Germany), Cutina CP(Cognis Deutschland GmbH, D, Germany), Dynasan(Sasol Germany GmbH, Witten, Germany), ElfacosC 26 (Akzo Nobel, Amsterdam, Netherlands), Imwitor 900(Sasol Germany GmbH, Witten, Germany)등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 액상지질(liquid lipid) 또는 오일(oil)은 GRAS 기준에 적합하며 인체에 사용가능한 물질이 선택되며, 이러한 액상지질의 적합한 예로는 Cetiol V (Gognis Deutschland GmbH, D, Germany), Miglyol812 (Caelo GmbH, Hilden, Germany), Labrafil, 아몬드 오일 (Henry Lamotte Oils, Germany), 올리브 오일 (Glatter-Koller, Austria), Speziol EOL (Cognis, Germany), 옥수수 오일 [Super Refined Corn NF-NP (Croda, Germany)], 올레산 [Super Refined Oleic Acid NF (Croda, Germany)], 땅콩오일 [Super Refined Peanut NF (Croda, Germany)], 참깨오일 [Super Refined Sesame NF (Croda, Germany)], 대두오일 [Super Refined Soybean USP-LQ-(MH) (Croda, Germany)]등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 지질나노입자는 통상의 고압균질화공정(High Pressure Homogenization, HPH)을 통해 제조된다. 융해된 상태의 지질에 허수테논을 용해시켜, 허수테논을 포함하는 융해된 지질상(molten lipid phase)을 얻는다. 상기 허수테논을 포함하는 융해된 지질상은 먼저 액상지질에 허수테논을 첨가한 후 고상지질을 첨가하여 가열하거나, 또는 액상지질과 고상지질을 혼합하고 가열하여 융해된 상태의 지질상을 제조한 후 여기에 허수테논을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 얻어진 허수테논 포함 융해된 지질상을 계면활성제가 포함된 수성 용액(aqueous solution)과 혼합하고 강하게 교반하여 지질상이 수성 용액상에 고르게 분산된 분산액을 얻는다. 상기 분산액을 균질화기를 사용하여 균질화시켜 허수테논이 함입된 지질나노입자를 얻는다.

상기 수성의 계면활성제 용액에서의 계면활성제는 예컨대, Miranol ultra 32 (Henkel, D, Germany), PlantaCare2000 UP (Cognis, D, Germany), Tego450 (Goldschmidt AG, Essen, Germany), Tween™80, MaquatSC 18 (Mason Chemical Company, Illinois, USA). MaquatBTMC-85％ (Mason Chemical Company, Illinois, USA) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 지질나노입자의 평균입경은 바람직하게는 1-1000 nm, 보다 바람직하게는 1-700 nm, 보다 더 바람직하게는 1-500 nm이고, 가장 바람직하게는 1-300nm이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 지질나노입자는 지질매질에 약제학적으로 허용되는 항산화제가 함입되어 있다. 상기 항산화제를 지질나노입자에 추가로 함입시킴으로써 허수테논의 산화 안정성을 더욱 개선시킬 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 항산화제는 허수테논의 활성이나 효능을 저해하지 않고 함께 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않는다. 상기 항산화제는 예를 들어, 아스코르빈산(Ascorbic acid, AA), 아스코르빈산의 염(예컨대 아스코르빈산-Na), 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate, AP), EDTA, EDTA의 염(예컨대, EDTA-Na), 부틸히드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, BHT), 부틸히드록시아니솔(Butylated hydroxyanisole, BHA), 알파-토코페롤(α-tocopherol, TC), 알파-리포산(alpha-lipoic acid), 프로필갈레이트(propyl gallate), 카로틴(carotene) 등을 포함하며, 바람직하게는 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate, AP), 아스코르빈산, 아스코르빈산의 염, EDTA, 또는 EDTA의 염이다.

상기 항산화제의 함유량은 지질나노입자 총 중량 대비 0.0001 - 30 중량％, 바람직하게는 0.001-20 중량％, 보다 바람직하게는 0.01-10중량％, 보다 더 바람직하게는 0.01-1 중량％이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 허수테논이 함입된 지질나노입자의 제조방법을 제공한다.

(a) 융해된 지질(molten lipid)에 허수테논을 혼합하여 허수테논이 함유된 융해된 지질을 제조하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 허수테논이 함유된 융해된 지질을 계면활성제가 포함된 수용액에 분산시켜 분산액을 제조하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 분산액을 균질화(homogenization)시켜 허수테논이 함입된 지질나노입자를 제조하는 단계.

본 발명의 지질나노입자는 고압균질화공정(High Pressure Homogenization, HPH)을 통해 제조될 수 있다. 먼저, 융해된 상태의 지질에 허수테논을 용해시켜, 허수테논을 포함하는 융해된 지질상(molten lipid phase)을 얻는다. 상기 허수테논을 포함하는 융해된 지질상은 먼저 액상지질에 허수테논을 첨가한 후 고상지질을 첨가하여 가열하거나, 또는 액상지질과 고상지질을 혼합하고 가열하여 융해된 상태의 지질상을 제조한 후 여기에 허수테논을 첨가하고 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 얻어진 허수테논 포함 융해된 지질상을 계면활성제가 포함된 수성용액(aqueous solution)과 혼합하고 강하게 교반하여 지질상이 수성용액에 고르게 분산된 분산액을 얻는다. 상기 분산액을 균질화기를 사용하여 균질화시켜 허수테논이 함입된 지질나노입자를 얻는다.

본 발명의 또 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 허수테논이 포함된 액상 제형 조성물 또는 지질나노입자의 약제학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아토피 피부염 또는 난소암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

허수테논은 종래의 다양한 선행 연구결과에 의해 T 세포의 활성을 차단하여 아토피 피부염의 치료에 효능이 있고(Joo et al., 2009), 난소암 세포에서 암세포만을 선별적으로 사멸을 유도함(Lee et al., 2010)이 입증되었으므로, 허수테논의 안정성을 향상시킨 본 발명의 액상 제형 조성물 및 지질나노입자는 아토피 피부염 및 난소암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용된다.

상기 용어 “약제학적 유효량”은 허수테논의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 “약제학적으로 허용되는 담체”는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 허수테논의 안정화를 위한 제형에 관한 것이다. 보다 상세하게는 허수테논과 항산화제가 포함된 액상 제형 조성물과, 지질 매질에 허수테논이 함입되어 있는 나노 수준의 크기를 갖는 지질나노입자 및 이 지질나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 허수테논 화합물을 항산화제와 함께 액상 제형으로 제조하거나, 지질 매질에 함입시켜 지질나노입자로 제조하면 허수테논의 산화적 안정성을 크게 개선시킬 수 있다. 이러한 산화 안정성 개선 효과는 허수테논의 의약 제품 개발에 크게 기여할 것으로 기대된다.

도 1은 허수테논의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 상이한 온도에서 수용액내의 허수테논의 분해에 관한 1차속도 플롯이다. 값은 평균 ± SD(n=3)으로 나타내었다.
도 3은 절대온도 역수에 대한 분해속도상수(k)의 아레니우스 플롯(Arrhenius plot) 결과를 보여준다.
도 4는 40℃ 수용액상에서 허수테논의 화학적 안정성에 대한 항산화제 및 질소가스 주입에 대한 영향을 측정한 결과이다. 값은 평균±SD(n=3)을 나타내었다.
도 5는 아스코르빈산(AA)의 농도에 대한 허수테논의 안정성 의존성을 보여준다. 값은 평균±SD(n=3)으로 나타내었다.
도 6은 40℃에서 NLC(nanostructured lipid carrier) 제형의 허수테논의 안정성 향상에 미치는 영향을 보여준다. 값은 평균±SD(n=3)으로 나타내었다.
도 7은 40℃에서 NLC(nanostructured lipid carrier) 제형에 항산화제를 혼입시킨 경우에 허수테논의 안정성 프로파일을 보여준다. 값은 평균±SD(n=3)으로 나타내었다.
도 8은 다양한 항산화제 농도에서 HST-NLC 최종 안정화 제형에 대한 안정성 측정결과이다. 값은 평균±SD(n=3)으로 나타내었다.
도 9는 본 발명의 약물 허수테논이 함입된 지질나노입자의 구조를 모식적으로 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법

1. 실험 재료

허수테논(순도 95%, HPLC)은 중앙대학교 약학대학 생약학 실험실로부터 제공되었다. 아스코르빈산(Ascorbic acid, AA), 부틸히드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, BHT), EDTA, EDTA-Na, 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate, AP), 알파-토코페롤(α-tocopherol, TC)는 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였다. Compritol 888 ATO와 Labrafil M 1944는 Gattefosse (Korea)에서 제공받았으며, 트윈 80(Tween 80)은 대정화공(Korea)에서 구입하여 사용하였다. HPLC 분석용 아세토니트릴(acetonitrile)과 메탄올(methanol)은 J.T. Baker(USA)에서 구입하였다.

2. HPLC 정량

다음의 HPLC 분석 조건을 통해 허수테논을 정량하였다. 이동상의 유속은 1.0mL/분 이고, 농도구배(gradient) 방법으로 LC 물(water) (A)와 아세토니트릴 (B) 두 가지 이동상을 이용하여 진행하였다. 첫 시작은 A 90％, B 10％로 시작하였으며 24분 동안 A 60％, B 40％로 직선적으로 비율이 변화하였고 이후 30분까지는 다시 A 90％, B 10％로 되돌아갔다. HPLC 컬럼은 Capcell Pak C18, 0.5 ㎛, 4.6 x 150 mm (Shiseido, Japan)을 사용하였고, HPLC 시스템은 펌프 (L-2130), UV detector (L-2400), 데이터 처리부(LaChrom Elite, Hitachi, Japan)으로 구성되었다. 측정 파장은 280nm 이었고 허수테논의 피크는 약 21분의 보유시간(retention time)을 나타내었다. 하루내(intra-day), 일간(inter-day) 분석의 정확도와 정밀도는 10, 20, 100, 200μg/mL 4가지 농도에서 각각 3번의 반복 실험을 통해 평가하였다.

3. 허수테논 용액의 제조

허수테논을 200ug/mL 농도로 증류수와 메탄올(MeOH)의 9:1 비율의 공용매(cosolvent)에 녹여 제조하였다. 허수테논은 수용액 중의 용해도가 낮으나 메탄올과 같은 보조용매를 가할 경우 용해도가 크게 증가된다. 본 발명에서는 10％ MeOH 용액을 선택하여 사용하였다. 허수테논(HST)의 산화 안정성 시험을 위해 다양한 항산화제 첨가된 허수테논 용액을 제조하였다. 항산화제가 첨가되지 않은 용액(대조군)을 제조하여, AA, EDTA-Na, AP 등의 항산화제를 첨가하여 용액을 제조하였다. 수용성 항산화제가 첨가된 AA와 EDTA-Na 용액의 경우 0.01％ 부터 1％ 까지 다양한 농도의 용액을 대상으로 실험을 진행하였고, 지용성 항산화제인 AP의 경우 낮은 용해도로 인해 0.001％ 에서 0.01％ 농도의 용액을 제조하여 평가하였다.

4. NLC (Nanostructured Lipid Carrier) 분산액의 제조

NLC 분산액은 고압균질화 (HPH, high pressure homogenization) 방법으로 제조하였다(Met al., 1996). 고형 지질로는 Compritol 888 ATO를 사용하였고 액상 지질로 Labrafil M 1944를 사용하여 고체 지질 1.75g과 액상 지질 0.75mL를 90℃에서 중탕하였다(총 지질의 양은 총량 대비 5 w/v ％). 수상은 트윈 80(Tween 80) 1.25 mL을 함유하였고 지질을 포함한 총량이 50 mL가 되도록 증류수를 가하고 동일하게 90℃에서 가온하였다. 이후 허수테논 50mg을 지질에 가하고 수상을 지질에 천천히 가하여 흰색의 현탁액을 형성하였다. 이를 마이크로플루이다이저(microfluidizer)를 이용하여 나노 입자 현탁액을 제조하였다. 완성된 NLC 제형은 냉장 상태로 보관하였다. 항산화제가 포함된 제형의 경우 지용성 항산화제는 지질에, 수용성 항산화제는 수용액에 녹여 NLC를 제조하였다.

5. 안정성 시험

수용액의 안정성 평가는 2ml의 용액을 5ml 용량의 테플론 마개 바이얼(teflon-capped vial)에 담아 파라필름(parafilm)을 이용하여 밀봉함으로써 용매의 증발을 차단한 후에 항온 캐비닛(Shaking incubator, SI-900R, JEIO-TECH, Korea)을 이용하여 실험을 진행하였다. 허수테논의 안정성에 온도가 미치는 영향을 파악하기 위하여 대조군 용액을 25, 40, 50℃에 보관하였으며, 이후에 모든 항산화제가 첨가된 용액들은 40℃에서 보관하여 안정성 효과를 비교하였다. 정해진 시간마다 200μL의 시험 용액을 취하여 200μL의 메탄올로 희석한 후에 이 용액 50μL를 취하여 HPLC를 이용하여 분석을 진행하였다. 질소 기체를 이용한 실험은 대조군 용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 모든 안정성 시험은 위에서 언급된 방법을 따랐으나, 질소 기체를 이용한 실험의 경우 10분간 질소 기체를 20 ml/s의 속도로 가하여 가능한 한 산소를 제거한 후 실험을 진행하였다.

NLC 분산액 중의 허수테논의 안정성 평가는 용액의 경우와 동일하게 2 ml의 분산액을 5ml 용량의 테플론 마개 바이얼(teflon-capped vial)에 담아 파라필름(parafilm)으로 밀봉하여 처리한 후, 항온 캐비닛을 이용하여 실험을 진행하였다. 모든 샘플은 40℃에서 보관하여 안정성을 평가하였으며 정해진 시간마다 100μL의 시험 용액을 취하여 900μL의 메탄올로 희석하고, NLC 내에 봉입된 약물을 석출시키기 위해 10분간 소니케이션(sonication) 하였다. 이후 용액 50μL를 취하여 HPLC를 이용하여 분석을 진행하였다.

실험결과

1. 분석 벨리데이션 ( Assay Validation )

허수테논의 크로마토그래프는 도 1에서 보이는 바와 같다. 피크의 분리도는 충분하였으나, 작은 간섭 피크가 존재하여, 이를 제거하기 위해 이동상의 비율과 유속을 변경하였으나 분리가 되지 않았으며, 면적값을 계산할 경우 간섭 피크가 정량성을 저해할 것으로 보여 피크 높이를 이용하여 정량하였다. 허수테논 농도 대비 허수테논의 피크 높이를 이용하여 캘리브레이션 곡선(calibration curve)를 작성한 결과 10-200 μg/mL 범위에서 유의성 있는 결과를 얻을 수 있었다(y=184.06x-12.32; r2 = 0.9994). 이 때 정량한계(LOQ)는 Signal to noise (S/N) 비율이 10.8:1을 나타내는 10μg/ml로 계산되었다. 하루내(intra-day), 일간(inter-day) 분석의 정확도와 정밀도를 평가한 결과는 표 1과 같다. 정확도 값은 200 μg/mL에서 하루내(intra-day) 값은 9.61％, 일간(inter-day) 값은 -6.66％가 최대였고 정밀도 값은 일간(inter-day) 정밀도 값이 6.17％로 다소 큰 값이었을 뿐 전체적으로 5％ 범위내에 모든 값이 존재하였다. 모든 벨리데이션(validation) 값을 계산한 결과, 정확도에 있어 15％ 범위, 정밀도 값 또한 15％ 범위 내에 존재함으로써 유의성 있는 값을 나타내었다(United States Pharmacopeia, 2008; Shah et al., 1992).

2. 수용액 중 허수테논의 안정성 평가

2.1. 온도 의존성

허수테논의 안정성을 평가하기 위하여 대조군 용액 시료를 3가지 온도에 보관하여 온도 분해에 따른 동력학과 온도 의존성을 평가하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 허수테논은 매우 빠르게 분해되었으며, 아래 식 1과 같은 일차 속도식을 따랐다:

C/C₀=exp(-kt) (1)

C/C₀는 시간 t에서 수용액 중의 허수테논이 남아 있는 비율이며, k는 속도 상수를 의미한다. 분해 속도 상수는 최적의 계산값을 구할 수 있는 Microsoft Excell 2007 추세선 기능의 기울기 값으로부터 계산하였다. 상온 중에서 반감기를 계산한 결과 5.78일로 일주일에도 미치지 못하는 값을 나타내었으며 분해 속도는 온도가 증가할수록 빨라짐을 확인할 수 있었다.

2.2. 질소 가스 주입을 통한 산화 영향 평가

허수테논이 분해되는 주된 원인은 산화 반응에 의한 것이므로, 질소 가스 치환을 통한 산소의 제거가 허수테논 용액을 안정화하는 결과를 보일 것이라고 가정하였다. 도 4에서는 질소 가스 치환 전후에 따른 약물 잔존량의 차이를 확인할 수 있는데, 거의 효과가 없음을 알 수 있다. 따라서, 다른 안정화 방법으로 항산화제를 사용하여 실험을 진행하였다.

2.3. 항산화제의 안정화 효과

항산화제는 약물이나 기타 첨가물이 산소에 노출되거나 활성 산소와의 접촉하는 것을 차단해준다. 허수테논의 수용액 상태 제형의 실험에는 수용성 항산화제인 아스코르빈산(Ascorbic acid, AA), EDTA-Na, 그리고 지용성 항산화제로 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate, AP)를 사용하였다. 도 4에서 나타나는 바와 같이 40℃에서 AA와 EDTA-Na를 0.1％ 가했을 때 허수테논의 안정성이 크게 증가하였다. 이 용액들의 열역학적 파라미터는 표 2에 정리하였으며, AP를 가한 용액의 안정성 파라미터 또한 함께 정리하였다. 수용성 항산화제를 가하였을 때 반감기가 약 10배 가량 증가하였으며, AA가 EDTA-Na에 비해 다소 우수한 결과를 보였다. AP를 가한 수용액의 경우 지용성 항산화제의 수용액에 대한 낮은 용해도로 인해 최대 0.01％의 낮은 농도의 용액밖에 제조하지 못하였다. AA와 AP 모두 0.01％ 농도에서는 안정화 효과를 보이지 않았으며, 이를 고려하였을 때 항산화제의 종류에 관계없이 최소 0.1％ 농도 이상에서만 항산화 효과를 나타내는 것으로 추정되었다.

2.4. 항산화제 농도의 영향

40℃에서 AA의 농도가 안정화에 미치는 영향을 도 5에 도식화하였다. 그 결과 0.01％ 농도에서는 거의 효과가 없었으나, 최대 농도인 1％ 용액에서는 약물이 3주 동안 안정하였다. 중간 농도인 0.1％ AA 수용액은 일주일 동안 안정하며, 이후 분해가 시작되었다. 이는 AA가 허수테논을 대신하여 산화를 차단하며 분해된 것을 의미한다. 40℃에서 AA의 분해는 1차 속도식을 따르며 분해 속도 상수는 0.348/일로 알려져 있다(Yang et al., 2006). 이는 AA의 반감기가 약 2일임을 의미하고 일주일 후부터 허수테논이 분해되는 것은 AA의 농도가 감소했기 때문일 것이며 위의 분해 속도 상수에 따른 일주일 후의 AA의 양을 계산해보면 0.01％ 이하만이 남아 있음을 알 수 있다. 반면에 가하는 AA의 농도에 비례하여 안정성 또한 개선되는 것으로 보이며, 이는 AA의 농도가 0.1％에서 1％로 10배 증가하였을 때 분해속도상수가 약 10배 감소하는 사실로부터 알 수 있다. 최종적으로, 항산화제가 허수테논의 안정화에 기여함을 확인할 수 있었다.

3. NLC 분산액 중 허수테논의 안정성 평가

3.1. NLC 분산액의 물리적 특성

NLC 분산액에 대해 입자크기, 다분산지수(polydispersity index), 제타포텐셜(zeta potential) 등을 측정하여 이의 물리적 특성을 분석하였다. 이들 특징 중에서 매우 중요한 특성인 입자크기를 측정한 결과, 평균 입경이 약 100-160 nm인 것으로 측정되었다.

3.2. NLC 분산액의 안정화 효과

허수테논을 NLC에 봉입하여 40℃에서 보관하며 NLC 제형이 약물의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다. 40℃에서 NLC 분산액 내의 허수테논은 반감기가 약 6.28일로 수용액 중 허수테논의 반감기 2.86일에 비해 두 배 이상 안정성이 개선되었음을 확인할 수 있었다.

3.3. 항산화제 첨가에 의한 안정화 효과

수용액 내에서 허수테논의 안정화에 항산화제가 뛰어난 효과가 있음이 밝혀졌기 때문에, 허수테논의 안정성을 더 향상시키기 위해, NLC와 항산화제의 조합하여 안정화 제형을 제조하였다. 수용액에서 안정화 효과를 나타내었던 AA와 EDTA-Na (약물과 NLC의 지용성을 고려하여 EDTA로 대체) 뿐만 아니라, 알파-토코페롤(α-tocopherol, TC), 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate, AP), 부틸히드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, BHT) 등 다양한 지용성 항산화제도 실험에 사용하여 효과를 평가하였다. 그 결과 도 7에서 보는 바와 같이, 지용성 항산화제들 중 일부가 수용성 항산화제에 비해 뛰어난 안정화 효과를 나타내었다. 가장 뛰어난 효과를 보인 항산화제는 AP로, 40℃ 조건에서 NLC에 0.1％ 농도로 봉입하였을 때 반감기가 6.28일에서 26.8일로 안정성이 크게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이외에도 EDTA가 반감기 17.2일, AA가 12.0일로 안정화 효과를 보였다. 그러나 TC와 BHT의 경우 기존 NLC와 큰 차이를 보이지 않아 별다른 효과를 나타내지 못했는데, 이는 약물의 안정화에 있어 모든 항산화제가 효과를 보이진 않음을 의미한다. 사용된 5가지 항산화제 중 가장 뛰어난 효과를 보인 AP와 EDTA를 사용하여 최종적으로 안정화된 제형을 제조하였다.

3.4. 최적 제형 선정

상술한 실험결과에서, 뛰어난 항산화 효과를 보인 AP와 EDTA를 3가지 구성으로 조합하여 안정화 효과를 비교하였다. 첫 번째 조합은 AP 단독으로 1％ 농도로 제형을 제조하였고, 두 번째 조합은 AP 1％와 EDTA 0.5％, 세 번째 조합은 AP 1％와 EDTA 1％를 사용하여 안정화를 측정한 실험결과를 도 8에 나타내었다. 그 결과 가장 많은 양의 항산화제가 첨가된 AP 1％와 EDTA 1％가 함유된 NLC 제형이 117.1일의 반감기로 가장 뛰어난 안정성을 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (11)

1. (a) 하기 화학식 1의 허수테논; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 아스코르빈산, 아스코르빈산의 염, EDTA, 또는 EDTA의 염 중에서 선택된, 수용성 항산화제를 함유하는 액상 제형 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 삭제
3. 삭제
4. (a) 하기 화학식 1의 허수테논; 및 (b) 아스코르빌팔미테이트 및 EDTA의 조합으로 이루어진, 항산화제가 지질매질에 함입되어 있는 나노수준의 크기를 갖는 지질나노입자.
   [화학식 1]
   

   

   
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 지질 매질은 고상지질(solid lipid) 및 액상지질(liquid lipid)로 이루어진 지질 매질인 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 고상지질은 Apifil, Beeswax, Carnauba wax 2442 L, CompritolATO, Cutina CP, Dynasan, ElfacosC 26, Imwitor 900으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 액상지질은 Cetiol V, Miglyol812, Labrafil, 아몬드 오일(Almond Oil), 올리브 오일(Olive oil), Speziol EOL, 옥수수 오일(Corn oil), 올레산(Oleic Acid), 땅콩오일(Peanut oil), 참깨오일(Sesame Oil), 대두오일(Soybean Oil)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. a) 제 1항 또는 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 조성물 또는 지질나노입자의 약제학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아토피성 피부염 또는 난소암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
    
11. (a) 융해된 지질(molten lipid)에 허수테논 및 항산화제를 혼합하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 허수테논 및 항산화제가 혼합된, 융해된 지질을 계면활성제가 포함된 수용액에 분산시켜 분산액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 분산액을 균질화(homogenization)시켜 허수테논이 함입된 지질나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 제 4항의 지질나노입자 제조방법으로서,
    상기 단계 (a) 및 (b)에서 상기 항산화제는 아스코르빌팔미테이트 및 EDTA의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
    
    

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