KR101472926B1 - 수용성 형광 공액화 고분자와 폴리아르지닌을 이용하여 제조된 마이크로캡슐 및 이를 이용한 트립신의 선택적 검출방법 - Google Patents

수용성 형광 공액화 고분자와 폴리아르지닌을 이용하여 제조된 마이크로캡슐 및 이를 이용한 트립신의 선택적 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 폴리아르지닌의 정전기적 상호작용을 이용한 수용성 형광 공액화 고분자-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐의 제조 및 이를 이용한 마이크로캡슐 상에서 트립신의 선택적 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하기는 이온성기를 가지는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 폴리아르지닌이 자기조립체를 형성하여 트립신의 농도에 따라 상기 고분자 화합물의 형광 색상이 변화하는 형광센서에 관한 것이다.

Description

수용성 형광 공액화 고분자와 폴리아르지닌을 이용하여 제조된 마이크로캡슐 및 이를 이용한 트립신의 선택적 검출방법{Prepared microcapsule composed of conjugated fluorescent polyelectrolyte and poly-L-arginine and method for selective detection of trypsin using the microcapsule}
본 발명은 마이크로캡슐 및 이를 이용한 트립신의 선택적인 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 폴리아르지닌과 수용성 형광 공액화 고분자를 이용하여 마이크로캡슐을 제조하고 이를 이용한 트립신의 선택적 검출방법에 관한 것이다.
진단, 의학연구, 임상실험 또는 화학분석 등 많은 경우에 시험 용액에 함유되어 있는 다양한 단백질의 농도를 신속 정확하게 분석할 필요가 있다. 이러한 분석에는 특정 단백질에 선택성이 있는 물질을 이용한 다양한 종류의 바이오센서물질 등이 사용되며, 센서의 일반적인 감지 신호는 전기, 저항, 전위차 등의 전기적 성질이나 색채, 형광 등의 광학적 성질을 이용한다. 이중에서 색의 변화 및 형광의 변화는 육안으로 쉽게 판별이 가능하므로 특별한 장비가 없어도 측정이 용이한 방법 중에 하나이다. 일반적으로 색채 및 형광의 변화를 나타내는 센서로 저분자 물질이 많이 이용되고 있으며, 측정대상물질도 이온뿐만 아니라 분자와 같은 다양한 화학종을 감지할 수 있다. 그러나 최근 공액화 고분자를 이용한 센서의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.
공액화 고분자는 화학신호를 측정 가능한 전기 또는 광신호로 변환할 수 있으며, 특히 피측정물과 상호작용에 대한 응답으로 신호를 발현할 때 감도가 증가한다는(증폭현상) 장점을 가지고 있어 금속이온 및 음이온 감지, 폭발물(방향족 나이트로 화합물) 감지 등의 센서재료로 널리 사용되고 있다(D. T. McQuade, A. E. Pullen, T. M. Swager, Chem. Rev. 100, 2537, 2000). 또한, 수용성 형광 공액화 고분자는 공액화 고분자의 신호 증폭 현상을 이용한 감도 향상의 장점과 물에 녹는다는 특징을 이용하여 바이오물질, 단백질, DNA 등에 대한 화학 또는 바이오 센서재료로 널리 사용되고 있다(C. Li, M. Numata, M. Yu, S. Wang, S. Shinkai, Angew. Chem. Ins. Ed. 42, 4803, 2003; I. B. Kim, J. N. Wilson, U. H. F. Bunz, Chem. Commun. 1273, 2005).
그 중 단백질을 감지하는 센서물질의 개발은 현재 많은 관심을 끌고 있으며, 특히 센서물질의 색이나 형광색의 변화에 의한 단백질의 감지는 그 감지 신호의 민감도 때문에 널리 사용되고 있다. 단백질 중에서도 트립신의 감지는 환경적, 생리적으로 중요한 요소가 되고 있다. 일반적으로 트립신은 췌액 중에 함유되어 있으며 염기성 아미노산을 함유하는 폴리펩티드에 작용한다. 장 안에서 단백질 중간 산물에 작용하여 아미노산을 생성함으로써 단백질의 소화에 있어 펩신과 함께 가장 중요한 효소이다. 그렇기 때문에 생물학적 환경의 유지와 인체 내 소화계의 조절을 위해 트립신의 감지가 반드시 필요하다. 단백질과 같은 양쪽성 전해질 물질은 고유의 등전점을 가지고 있어 pH에 따라 음전하 또는 양전하를 띄게 된다. 따라서 수용액 상태에서 pH를 조정하여 단백질이 음전하 또는 양전하를 띄게 할 수 있다.
상기와 같은 단백질의 특성으로 색변화에 의한 컬러센서를 제조하여 단백질을 감지하려는 노력이 다양하게 시도되었다. 이들은 수용액 상태에서 양전하나 음전하의 이온성질을 갖고 반대 전하의 단백질이 접근할 때 회합을 통해 색이나 형광색의 변화를 유도하는 것으로 알려져 있다(S. W. Thomas Ⅲ, G. D. Joly, T. M. Swager, Chem. Rev. 107, 1339, 2007).
본 발명에서 감지하고자 하는 트립신은 이자액 속에 들어있는 소화 효소 중의 하나로, 음식물 속의 단백질을 폴리펩타이드와 소수의 아미노산으로 분해하는 효소이다. 이자에서 트립신의 전구 물질인 트립시노젠이 만들어지고, 이자액에 포함되어 분비된 트립시노젠은 장액 속에 들어있는 엔테로키네이스에 의해 트립신으로 활성화 된다. 트립신은 단백질 소화에 있어서 펩신과 함께 가장 중요한 효소로, 위에서 펩신에 의해 가수 분해된 폴리펩타이드는 소장에서 트립신에 의하여 더욱 가수 분해되어 작은 펩타이드가 되고, 최종적으로 아미노산으로 분해된다.
본 발명에서는 실시예에서 제조된 자기조립 다층 마이크로캡슐을 이용하여 단백질 분해 효소인 트립신을 선택적으로 감지하는 형광 바이오센서에 대한 내용을 다룬다. 더욱이 본 발명에서는 고체상의 자기조립 다층 마이크로캡슐을 이용하여 트립신을 감지할 수 있기 때문에 이를 응용하여 다양한 분야에 활용할 수 있는 가능성이 매우 큰 것을 장점으로 한다.
또한 이제까지 연구된 대부분의 트립신 감지 방법은 색이나 형광색의 변화가 아닌 형광의 증가 및 감소의 형태로 측정한 것이 많은데, 이러한 경우 매우 적은 농도 차이를 쉽게 구별할 수 없기 때문에 민감도 및 선택성의 문제를 갖는다. 트립신을 인지하는 리간드를 고분자 내에 도입하기 위한 합성 방법은 복잡하기 때문에, 트립신 감지를 위한 단순화 된 방법을 본 발명에서 제시하고자 한다.
본 발명은 화학 및 바이오센서로서 넓은 응용이 가능한 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 폴리아르지닌을 이용한 고분자-폴리아르지닌 마이크로캡슐을 형성시키고, 이를 이용하여 트립신을 선택적으로 검출하는 방법을 제공하여 보다 쉽고 정확하게 트립신을 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 한다.
본 발명은 단백질을 선택적으로 감지하는 센서의 개발과 그 검출방법에 있어서, 수용성 형광 공액화 고분자와 폴리아르지닌의 자기조립 마이크로캡슐을 이용하여 간단하고 효과적인 트립신의 선택적인 검출방법을 제공하는 데 그 목적을 두고 있다.
본 발명의 적절한 실시예에 따르면, 트립신의 검출방법은
a) 칼슘카보네이트 입자를 제조하는 단계
b) 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 용액을 제조하는 단계
c) 폴리아르지닌 용액을 제조하는 단계
d) 칼슘카보네이트 입자에 b)와 c)의 두 용액을 차례로 첨가, 교반하여 고분자 화합물과 폴리아르지닌의 정전기적 상호작용을 통한 자기조립 입자를 제조하는 단계
e) EDTA를 처리하여 자기조립 입자의 코어부분을 제거하여 마이크로캡슐을 제조하는 단계
f) 마이크로캡슐의 1차 형광을 측정하는 단계
g) 상기 마이크로캡슐에 트립신을 첨가하여 2차 형광을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 적절한 실시예에 따르면, 수평균 분자량(Mn)이 3,000 내지 100,000인 상기 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 하기 화학식 1 및 2에서 선택되는 중합단위를 가지고 있다.
[화학식 1]
Figure 112013005179820-pat00001
[화학식 2]
Figure 112013005179820-pat00002
[상기 화학식 1 내지 2에서, R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이 할 수 있으며, 말단에 서로 독립적으로 술폰산염 또는 트리(C1 내지 C7)알킬암모늄염으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1 내지 C6의 알킬기이고; Ar은 (C6 내지 C20)아릴렌이고; a, b, c 및 d는 몰분율로, a 및 c는 0.1이고, b 및 d는 0.9이다.]
본 발명의 또다른 적절한 실시예에 따르면, 상기 고분자의 자기조립체의 붕괴를 통한 형광색 변화를 이용하는 것을 특징으로 하며, 형광색의 변화는 형광광도계를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 한다.
이상과 같이 본 발명에 따른 수용성 형광 공액화 고분자-폴리아르지닌 마이크로캡슐을 바탕으로 하는 감지 시스템은 트립신에 대한 인지물질로 사용할 수 있다. 폴리아르지닌의 경우 10.76의 등전점을 가지고 있어 중성 상태에서 양전하를 갖는다. 따라서, 수용성 형광 공액화 고분자 측쇄의 음이온성기와 정전기적인 상호작용을 통해 자기조립 마이크로입자가 형성되며, 고분자와 회합체 형성시 고분자 종류에 따라 청색형광에서 녹색형광 또는 적색형광으로 형광색의 변화를 유발한다. 추가적으로 첨가되는 트립신은 마이크로캡슐을 분해하여 형광색을 다시 청색으로 변화시킴에 따라 효율적인 형광/화학/바이오 센서로서 트립신을 감지할 수 있다.
지금까지 기술한 본 발명의 수용성 형광 공액화 고분자-폴리아르지닌 마이크로캡슐은 화학센서 재료, 바이오센서 재료 등 다양한 기술 분야에 응용이 가능하며, 특히 상호 물질간 공유결합이 아닌 폴리아르지닌과의 정전기적인 상호작용을 이용한 센서 기능에 부합되는 응답성, 선택성을 가지고 있다.
본 발명에 의한 트립신 검출방법은
a) 칼슘카보네이트 입자를 제조하는 단계
b) 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 용액을 제조하는 단계
c) 폴리아르지닌 용액을 제조하는 단계
d) 칼슘카보네이트 입자에 b)와 c)의 두 용액을 차례로 첨가, 교반하여 자기조립 입자를 제조하는 단계
e) EDTA를 처리하여 자기조립 입자의 코어부분을 제거하는 단계
f) 마이크로캡슐의 1차 형광을 측정하는 단계
g) 상기 마이크로캡슐에 트립신을 첨가하여 2차 형광을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따른 트립신의 검출은 f)단계와 g)단계에서 측정 된 형광스펙트럼 패턴을 비교하여 형광 피크, 형광 강도 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 적절한 실시예에 따르면, 상기 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 하기 화학식 1 및 2에서 선택되는 중합단위를 가지고 있다.
[화학식 1]
Figure 112013005179820-pat00003
[화학식 2]
Figure 112013005179820-pat00004
[상기 화학식 1 내지 2에서, R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이 할 수 있으며, 말단에 술폰산염 또는 트리(C1 내지 C7)알킬암모늄염으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1 내지 C6의 알킬기이고; Ar은 (C6 내지 C20)아릴렌이고; a, b, c 및 d는 몰분율로, a 및 c는 0.1이고, b 및 d는 0.9이다.]
상기 R1 및 R2의 알킬기의 말단은 서로 독립적이고 구체적으로 술폰산염으로부터 선택되거나 조합하여 선택하는 것을 포함한다. 또한 R1 및 R2의 알킬기는 서로 독립적으로 메틸, 에틸, i-프로필, n-프로필, i-부틸, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸 또는 n-헥실로부터 선택되어지며, 상기 Ar은 2가의 페닐렌이다. 상기 수용성 형광 공액화 고분자의 분자량은 원칙적으로 제한이 없으나, 수평균 분자량(Mn)으로 3,000 내지 100,000이 바람직하고, 그 용도에 요구되는 특성에 따라 범위를 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 벤조싸이아다이아졸 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸을 에너지 받개로 사용하고 페닐렌을 에너지 주개로 사용하여 회합에 따라 형광색의 변화가 다르게 나타나는 특징을 갖는다. 본 발명에서 사용한 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 본 발명자에 의하여 출원된 대한민국 특허 출원번호 제 10-2008-0103701호에 기재되어 있고, 에너지 주개와 받개의 종류와 비율을 달리하여 회합에 의한 형광의 변화가 나타나는 특징을 가진다.
상기 수용성 형광 공액화 고형분자 화합물은 수용액 상태에서는 고분자 화합물 내에 90%를 차지하는 큰 에너지 밴드갭을 갖는 페닐렌 구조의 단파장 형광(청색)만이 나타나는 반면, 고체 상태로 회합이 일어나면 10%를 차지하는 작은 에너지 밴드갭을 갖는 벤조싸이아다이아졸 혹은 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸로 엑시톤의 이동이 활발해져 장파장 형광(녹색 또는 적색)이 나타난다.
상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 또는 이를 구성 성분으로 하는 화학센서는 트립신을 검출하는데 유용하다. 칼슘카보네이트 입자를 코어 물질로 하여 상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물이 폴리아르지닌과 정전기적 상호작용을 통해 자기조립 마이크로입자를 형성한다. 수용성 형광 공액화 고분자와 폴리아르지닌의 자기조립을 통하여 본 발명에서 요구하는 형광색의 변화를 나타내며, 추가적인 EDTA 처리를 통하여 마이크로입자의 코어 부분을 제거함으로써 마이크로캡슐이 제조된다. 이러한 자기조립 마이크로캡슐에 트립신을 첨가하면 폴리아르지닌을 구성하는 아르지닌 부분에 선택적 분해거동이 유발되며 즉, 트립신의 첨가가 수용성 형광 공액화 고분자-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐의 분해를 야기하고, 이에 따라 수용액에서 고분자의 용해성이 증가되어 장파장 형광(적색 또는 녹색)이었던 형광색이 회합체가 형성되기 전 형광색인 단파장 형광(청색)으로 다시 회복되어 트립신을 감지하는 신호로 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하도록 하되, 본 발명이 하기 실시예에서 사용한 고분자 화합물에 국한된 것은 아니며, 엑시톤 이동에 의하여 수용액 상태의 형광색과 자기조립 마이크로캡슐 상태에서의 형광색이 서로 다른 광학적 성질을 갖는 에너지 주개와 받개가 같은 분자쇄 내에 존재하는 고분자 화합물이면 가능하다.
[제조예] 수용성 형광 공액화 고분자 화합물의 제조
제조예 1
화학식 1의 벤조싸이아다이아졸계 고분자화합물(R1=R2=4-술포네이토부틸, Ar=1,4-페닐렌)의 제조
4,7-다이브로모-2,1,3-벤조싸이아다이아졸 26.5 mg (0.090 mmol)과 1,4-다이브로모-2,5-비스-(4-술포네이토부톡시)벤젠소듐염 474.4 mg (0.812 mmol)과 1,4-벤젠다이보론산비스(피나콜)에스터 297.7 mg (0.902 mmol), 그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매 3.5 mg (0.003 mmol)을 습기가 제거된 6 ml의 DMF와 9 ml의 2 M Na2CO3 혼합용액에 용해시키고 90 ℃에서 48시간 동안 환류하였다. 반응 후 상온으로 냉각하고 500 ml의 부피비가 10:40:50인 메탄올/아세톤/에테르 혼합 용액에 부어 결정을 석출시킨 다음 석출물을 여과하였다. 여과하여 얻어진 고체를 3차 증류수에 녹인 후 삼투막을 이용한 여과로 분자량이 12,400 이상인 화학식 1의 고분자를 얻었다. 이를 원소분석한 결과 a를 통해 10%의 몰분율을 차지하는 것을 알 수 있었다.
1H-NMR(300 MHz, D2O) δ=8.1 ~ 7.3(2H, 방향족), 7.2 ~ 6.7(2H, 방향족), 3.9(4H, 알킬기), 2.8(4H, 알킬기), 1.7 ~ 1.3(7.8H, 알킬기) ppm.
제조예 2
화학식 2의 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계 고분자 화합물(R1=R2=4-술포네이토부틸, Ar=1,4-페닐렌)의 제조
4,7-비스(5-브로모싸이오펜-2-일)벤조-2,1,3-싸이아다이아졸 21.6 mg (0.057 mmol)과 1,4-다이브로모-2,5-비스(4-술포네이토부톡시)벤젠소듐염 300.0 mg (0.514 mmol)과 1,4-벤젠다이보론산비스(피나콜)에스터 188.0 mg (0.571 mmol), 그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매 3.5 mg (0.003 mmol)을 습기가 제거된 8 ml의 DMF와 12 ml의 2M Na2CO3 혼합용액에 용해시키고 100 ℃에서 48시간 동안 환류하였다. 반응 후 상온으로 냉각하고 500 ml의 부피비가 10:40:50인 메탄올/아세톤/에테르 혼합 용액에 부어 결정을 석출시킨 다음 석출물을 여과하였다. 여과하여 얻어진 고체를 3차 증류수에 녹인 후 투석방법을 이용하여 분자량이 12,400 이상인 화학식 2의 고분자를 얻었다. 이를 원소분석 한 결과 c는 8%의 몰분율을 차지하는 것을 알 수 있었다.
1H-NMR(300 MHz, D2O) δ=8.1 ~ 7.3(3.1H, 방향족), 7.2 ~ 6.7(2H, 방향족), 4.0(2.8H, 알킬기), 3.0(3H, 알킬기), 2.0 ~ 1.5(5H, 알킬기) ppm.
제조예 3
자기조립 마이크로캡슐의 제조
칼슘클로라이드 3.7g (33.3 mmol)과 폴리소듐-4-스타이렌설포네이트 0.2g (2.85 nmol)을 100 ml 증류수에 용해시킨다. 소듐카보네이트 3.53g (33.3 mmol)을 100 ml 증류수에 용해시킨 후 미리 만들어 놓았던 칼슘클로라이드 수용액에 빠르게 첨가하여 30분 동안 교반한다. 칼슘카보네이트 입자가 생성된 후 원심분리법을 이용하여 회수하고, 증류수를 이용하여 수세과정을 3회 반복한다.
① 제조된 마이크로입자를 폴리아르지닌과 소듐클로라이드가 각각 1 mg/ml와 0.5 M 농도인 수용액에 첨가하여 20분간 교반 후 원심분리법으로 회수한다. 회수된 칼슘카보네이트 입자에 0.5 M 농도의 소듐클로라이트 수용액을 첨가하여 10분 동안 교반하여 수세하고 원심분리법을 이용하여 회수하는 과정을 2회 반복한다.
② 제조된 마이크로입자를 수용성 공액화 고분자와 폴리소듐-4-스타이렌설포네이트, 소듐클로라이드가 각각 1mg/ml와 0.5 M 농도인 수용액에 첨가하여 20분간 교반 후 원심분리법으로 회수한다. 회수된 칼슘카보네이트 입자에 0.5 M 농도의 소듐클로라이드 수용액을 첨가하여 10분 동안 교반하여 수세하고 원심분리법을 이용하여 회수하는 과정을 2회 반복한다.
위의 ①, ② 과정을 통하여 한 쌍의 자기조립체가 형성된다. 위의 과정을 5회 반복하여 5쌍의 자기조립체를 제조하였다. 회수된 마이크로입자를 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA) 3.72g (1 mmol)을 100 ml 증류수에 용해시킨 수용액에 첨가하여 1시간 교반함으로써 중심 기반을 이루던 코어 부분인 칼슘카보네이트가 제거되고 자기조립 마이크로캡슐을 얻을 수 있다.
[실시예] 트립신 센서로 성능 평가
실시예 1
벤조싸이아다이아졸 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸을 포함하고 음이온성을 띄는 고분자 화합물을 이용한 트립신의 검출
제조예 1, 제조예2에서 제조된 벤조싸이아다이아졸계 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 폴리아르지닌 자기 조립 마이크로캡슐의 트립신에 대한 화학적 검출 능력을 확인하기 위하여, 다양한 층수를 가지는 자기 조립 마이크로캡슐을 제조하였다. 여기에 형광 변화를 확인하기 위하여 1층에서 5층까지 각기 다른 층의 마이크로캡슐을 제조하였고, 각 자기 조립 마이크로캡슐의 형광 변화를 형광 광도계를 이용하여 관찰하였다.
형광 광도계를 이용하여 관찰한 결과, 제조예 1, 제조예 2의 화합물들을 이용하여 형성된 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기 조립 마이크로캡슐은 제조된 캡슐 층에 따라 점차적인 형광의 변화를 나타냈다. 우선 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 폴리아르지닌 자기 조립 마이크로캡슐의 층수가 증가할수록 녹색과 적색형광이 증가하였으며 그 증가폭도 일정하였다. 수용성 공액화 고분자 화합물과 폴리아르지닌이 자기 조립하며 발생되는 형광의 변화는 다음과 같다. 제조예 1의 화합물을 이용한 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐 제조시 발생되는 형광 변화는 1층에서 5층으로 늘어나는 과정에서 417nm의 청색 형광이 1층에서의 형광에 비하여 층수가 늘어날수록 1층의 형광 세기의 71%, 56%, 47%, 40%로 조금씩 감소해 나가는 것을 확인할 수 있었고, 530nm의 녹색형광이 1층에서의 형광에 비하여 층수가 늘어날수록 1층의 형광세기의 110%, 127%, 138%, 145%로 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 제조예 1 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로 캡슐의 층수의 증가는 청색영역의 형광 감소와 녹색영역의 형광 증가를 유발하게 되고 이 과정을 통하여 녹색형광을 내는 마이크로캡슐을 제조 할 수 있었다. 제조예 2의 화합물을 이용한 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로 캡슐 제조시 발생되는 형광 변화는 1층에서 5층으로 늘어나는 과정에서 417nm의 청색 형광이 1층에서의 형광에 비하여 층수가 늘어날수록 1층의 형광 세기의 70%, 53%, 43%, 36%로 조금씩 감소해 나가는 것을 확인할 수 있었고, 634nm의 적색형광이 1층에서의 형광에 비하여 층수가 늘어날수록 1층의 형광세기의 113%, 130%, 142%, 150%로 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 제조예 2 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐의 층수의 증가는 청색영역의 형광 감소와 적색영역의 형광 증가를 유발하게 되고 이 과정을 통하여 적색형광을 내는 마이크로캡슐을 제조 할 수 있었다.
수용성 공액화 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로 캡슐 층수의 증가별 형광 변화를 확인 한 후, 트립신을 160μg/ml 농도로 첨가하여 35℃, 60분간 진행 결과 트립신을 넣지 않았을 때와 비교하여 제조예 1의 화합물을 이용한 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐을 417nm의 청색형광이 237% 증가하고, 530nm의 녹색형광이 32% 감소하였다. 제조예 2의 화합물을 이용한 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐은 417nm의 청색형광이 243% 증가하고, 634nm의 적색형광의 적색형광이 35% 감소하였다. 즉, 고분자와 자기조립되어 있던 폴리아르지닌을 구성하고 있는 아르지닌이 첨가하는 트립신에 의하여 분해되면서 고분자 화합물과 폴리아르지닌간의 정전기적 상호작용이 약화되어 자기조립 캡슐이 붕괴됨을 확인하였다. 트립신의 농도가 증가할수록 장파장 형광 (녹색 또는 적색) 단파장 형광 (청색)으로 형광색의 변화가 나타났으며, 이는 육안으로도 식별이 가능하였다.
상기의 트립신 검출을 위한 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐의 파괴에 따른 형광색의 변화는 고분자 화합물의 농도를 매층 1mg/ml로 폴리아르지닌을 1mg/ml로 설정하고 제조예 1, 제조예 2를 이용한 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐의 형광색의 변화를 측정한 결과, 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐과 반응할 수 있는 트립신의 농도가 많이 설정될수록 장파장 형광에서 단파장 형광으로의 변화가 나타났다.
비교예
본 발명의 트립신 검출의 선택성을 확인하기 위하여 트립신 사용 대신 같은 몰농도의 펩신, 글루코오스 산화 효소를 사용하였다. 제조예 2에서 제조된 비스싸이에닐벤조싸이아디이아졸계 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐을 제조하고, 펩신 또는 글루코오스 산화 효소를 첨가하여 배양하였다. 그 결과 펩신 또는 글루코오스 산화 효소를 이용한 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-폴리아르지닌 자기조립 마이크로 캡슐의 417nm의 청색형광은 각각 3.5% 및 2.8%로 큰 변화 없이 소량 증가를 보였으며, 634nm의 적색형광은 각각 2.1% 및 3.6% 감소하여 펩신과 글루코오스 상화 효소의 농도의 증가에 따른 적색형광에서 청색형광으로의 색변화가 나타나지 않았다.
이상의 결과로 보아 제조된 수용성 형광 공액화 고분자-플리아르지닌 자기조립 마이크로캡슐은 트립신의 존재와 농도에 따라 형광색의 변화가 나타나며, 트립신에 대하여 선택적인 화학/바이오센서로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 특정의 실시예와 관련하여 도시 및 설명하지만, 첨부 특허청구의 범위에 나타난 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 개조 및 변화가 가능하다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 쉽게 알 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. a) 칼슘카보네이트 입자를 제조하는 단계
    b) 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 용액을 제조하는 단계
    c) 폴리아르지닌 용액을 제조하는 단계
    d) 칼슘카보네이트 입자에 b)와 c)의 두 용액을 차례로 첨가, 교반하여 고분자 화합물과 폴리아르지닌의 정전기적 상호작용을 통한 자기조립 입자를 제조하는 단계
    e) EDTA를 처리하여 자기조립 입자의 코어부분을 제거하여 마이크로캡슐을 제조하는 단계
    f) 마이크로캡슐의 1차 형광을 측정하는 단계
    g) 상기 마이크로캡슐에 트립신을 첨가하여 2차 형광을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 이온성기를 갖는 화합물로, 하기 화학식 1 내지 2에서 선택되는 중합단위를 갖는 것을 특징으로 하는 트립신의 선택적 검출방법.
    [화학식 1]
    Figure 112014062007802-pat00005

    [화학식 2]
    Figure 112014062007802-pat00006

    [상기 화학식 1 내지 2에서, R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이 할 수 있으며, 말단에 서로 독립적으로 술폰산염으로 치환되는 것이 특징인 직쇄 또는 분지쇄의 C1 내지 C6의 알킬기이고; Ar은 (C6-C20)아릴렌이고; a, b, c 및 d는 몰분율로, a 및 c는 0.1이고, b 및 d는 0.9이다.]
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 수평균 분자량(Mn)이 3,000 내지 100,000인 것을 특징으로 하는 트립신의 선택적 검출방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    g)단계에서 트립신의 첨가로 인해 상기 고분자의 자기조립체의 붕괴를 통한 형광색 변화를 이용하는 것을 특징으로 하는 트립신의 선택적 검출방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    f) 및 g) 단계에서 형광을 측정하는 도구로 형광광도계를 이용하는 것을 특징으로 하는 트립신의 선택적 검출방법.
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