KR101460245B1

KR101460245B1 - 비세포변성 간염바이러스의 정량화를 위한 발색 병소형성 검사방법 및 영상분석을 이용한 병소 개수 자동 산출방법

Info

Publication number: KR101460245B1
Application number: KR1020120043988A
Authority: KR
Inventors: 신의철; 강원석
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2014-11-10
Also published as: KR20130120820A

Abstract

본 발명은 비세포변성 간염바이러스를 보다 효율적이고 객관적으로 정량화할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체와 BICP/NBT 색원체를 사용하는 특징이 있는 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)과 자동 영상분석 기능을 이용한 병소 개수 자동산출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발색 병소형성 검사방법과 영상분석을 이용한 병소 개수의 자동 산출방법 (automated focus counting by image analysis)은 기존의 면역형광 병소형성 검사법 (immunofluorescence-based focus-forming assay)에 비하여 검사자의 판단이 배제되어 객관적이고, 시간과 노동력을 최소화하여 비세포변성 간염바이러스를 효과적으로 정량하는데 유용하다.

Description

비세포변성 간염바이러스의 정량화를 위한 발색 병소형성 검사방법 및 영상분석을 이용한 병소 개수 자동 산출방법 {Colorimetric Focus-Forming Assay with Automated Focus Counting by Image Analysis for Quantification of Non-cytopathic Hepatitis Viruses}

본 발명은 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)를 보다 효율적이고 객관적으로 정량화할 수 있는 발색 병소형성 검사방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체 (alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)와 BICP/NBT 색원체를 사용하는 것을 특징으로 하는 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)과 영상획득장치로 획득한 영상을 이용한 비세포변성 간염바이러스에 의해 형성된 숙주세포의 병소 개수를 자동으로 산출하는 방법에 관한 것이다.

바이러스가 숙주 세포에 침입시 숙주세포에 미치는 구조적 및 생화학적 효과의 범위는 광범위하며, 이러한 바이러스가 숙주세포에 미치는 영향을 세포변성 효과 (cytopathic effect)라고 한다. 대부분의 바이러스 감염은 숙주세포의 사멸을 초래하며 이러한 바이러스를 세포변성 바이러스 (cytopathic virus)라고 한다. 이러한 유형의 바이러스는 숙주세포의 용해와 세포의 표면 막에 대한 변형 및 apoptosis를 유발하여 결국 숙주 세포를 사멸시킨다. 일부 세포변성 바이러스의 경우에는 바이러스 유래 물질이 아닌 바이러스 특이적 반응을 보이는 숙주세포의 단백질 기능이 저해됨으로써 숙주세포의 정상적인 활동이 중단되어 숙주세포의 사멸을 초래하기도 한다.

그러나 일부 바이러스는 감염된 숙주세포에 대한 어떤 명백한 변화나 사멸을 일으키지 않는 경우도 있으며, 이러한 바이러스들을 비세포변성 바이러스 (non-cytopathic virus)라고 한다. 이러한 잠복성이거나 비활성적인 바이러스에 감염될 경우, 숙주세포는 극소의 징후만을 보이거나, 거의 정상적으로 기능을 한다. 이러한 비세포변성 바이러스에는 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)가 대표적이며, RNA 바이러스인 Flaviviridae과 Hepacivirus속에 속하는 C형 간염바이러스 (hepatitis C virus)와 Picornaviridae 과 Hepatovirus속에 속하는 A형 간염바이러스 (hepatitis A virus), 및 DNA 바이러스인 Hepadnaviridae과 Orthohepadnavirus속인 B형 간염바이러스 (hepatitis B virus) 등이 속한다.

특히 C형 간염바이러스 경우 (hepatitis C virus, HCV)에는 별다른 자각증상 없이 만성 감염 상태를 지속시킴으로써 만성 간염을 일으키고, 종종 간경변증 및 간세포암까지 유발하는 것으로 알려져 있어 공중보건학적으로 매우 중요하다고 할 수 있다. 서양의 경우 간 이식의 가장 중요한 원인은 C형 간염바이러스로 알려져 있다. 그러나 아직까지 C형 간염바이러스에 대한 예방백신은 개발되어 있지 않은 상태로 C형 간염바이러스에 대한 예방백신 및 새로운 치료제 개발이 시급한 상황이다. 하지만, 유일한 동물 모델인 침팬지는 가격이나 사육시설, 또한 연구윤리 문제 때문에 접근성이 매우 낮은 단점이 있기에, 이를 위해 C형 간염바이러스의 시험관내 세포배양 (in vitro cell culture-produced HCV [HCVcc]) 시스템의 이용은 연구개발에 있어 매우 중요한 과정이다.

HCVcc를 만들고, 이를 이용하여 실험을 하는 경우에 있어 감염성 C형 간염 바이러스를 정량화하는 것은 매우 중요하다. 바이러스 정량법은 기존의 몇몇 연구에 따르면, ELISpot reader 및 영상분석을 통한 자동화가 이루어져 효율적으로 발전해 왔다. 그러나 이러한 영상분석은 플라크 형성 검사법 (plaque-forming assay)으로 정량할 수 있는 세포변성 바이러스 (cytopathic virus)에 국한되어 적용되는 것으로 알려졌다 (Zielinska E. et al ., Virology Journal, 2:84, 2005; Rodrigo W. S. et al ., Am . J. Trop . Med . Hyg ., 80:1, 2009). 한편, 감염성 C형 간염바이러스와 같은 비세포변성 바이러스 (non-cytopathic virus)에서는 플라크 형성 검사법 (plaque-forming assay)을 대신하여 면역형광 염색을 이용한 병소형성 검사법 (immunofluorescence-based focus-forming assay)이 정량방법으로 사용되어 왔다. 그러나 이 방법의 경우 자동화 영상분석이 불가능하여 형성된 병소의 개수를 검사자가 직접 형광 현미경으로 관찰하여 산출하여야 하므로 노동 및 시간을 많이 투자해야 하는 어려움이 있을 뿐 아니라, 편향된 결과를 보일 수 있어 감염성 C형 간염바이러스 연구의 한계로 작용되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체 (alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)와 BICP/NBT 색원체를 사용하는 것을 특징으로 하는 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)과 자동 영상분석을 이용한 비세포변성 간염바이러스에 의해 형성된 숙주세포의 병소 개수를 자동으로 산출하는 방법을 개발하였고, 이를 적용할 경우 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)를 객관적이고 효율적으로 정량화할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 발색반응을 이용한 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료에서 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)를 정량하는 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)과 자동 영상분석을 이용한 숙주세포의 병소 개수 자동 산출방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 숙주세포를 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료로 감염시키는 단계; (b) 감염된 숙주세포를 바이러스 특이적 일차 항체로 염색하는 단계; (c) 이차 항체와 발색기질을 첨가하여 발색반응을 시키는 단계; 및 (d) 발색의 유무로 병소 형성 유무를 검출하는 단계를 포함하는 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)의 정량화를 위한 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 숙주세포를 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료로 감염시키는 단계; (b) 감염된 숙주세포를 바이러스 특이적 일차 항체로 염색하는 단계; (c) 이차 항체와 발색기질을 첨가하여 발색반응을 시키는 단계; (d) 발색의 유무로 병소 형성 유무를 검출하는 단계; (e) 병소가 형성된 간암세포주의 영상을 획득하는 단계; 및 (f) 상기 획득된 영상을 이용하여 병소의 개수를 자동 산출하는 단계를 포함하는 자동 영상분석을 이용한 비세포변성 간염바이러스에 의해 형성된 숙주세포의 병소 개수 자동 산출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)과 영상분석을 이용한 병소 개수의 자동 산출 방법에 의한 비세포변성 간염바이러스의 정량법은 기존의 면역형광 병소형성 검사법에 비하여 검사자의 판단이 배제되어 객관적이고, 시간과 노동력을 최소화하여 비세포변성 간염바이러스를 효과적으로 정량하는데 유용한 방법으로 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)뿐만 아니라 최소 세포변성 바이러스 (minimally cytopathic virus)에도 폭 넓게 적용될 수 있다.

도 1은 다양한 2차 항체와 색원체 기질을 사용한 발색 병소형성 검사결과를 비교한 것이다.
도 2는 다양한 2차 항체와 색원체 기질을 사용한 감염성 C형 간염바이러스에 의한 병소 형성을 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 3은 제 1형 콜라겐 사용으로 인한 세포 탈락 방지효과를 나타낸 것이다.
도 4는 감염성 C형 간염바이러스에 의한 병소 형성을 이미지 분석을 통하여 자동 산출한 결과이다.
도 5는 발색 병소형성 검사방법과 면역형광 병소형성 검사법을 비교한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일관점에서, 본 발명은 (a) 숙주세포를 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료로 감염시키는 단계; (b) 감염된 숙주세포를 바이러스 특이적 일차 항체로 염색하는 단계; (c) 이차 항체와 발색기질을 첨가하여 발색반응을 시키는 단계; 및 (d) 발색의 유무로 병소 형성 유무를 검출하는 단계를 포함하는 비세포변성 간염바이러스 (non-cytopathic hepatitis virus)의 정량화를 위한 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)에 관한 것이다.

본 발명에서는, 병소란 하나의 바이러스 입자 감염에 의해 유래된 바이러스 감염 숙주세포들의 모여있는 세포군을 의미하며, 한 개의 병소는 한 개의 바이러스 입자감염에 의해 유래 되었다고 추정할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 숙주세포를 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료로 감염시키는 단계; (b) 감염된 숙주세포를 바이러스 특이적 일차 항체로 염색하는 단계; (c) 이차 항체와 발색기질을 첨가하여 발색반응을 시키는 단계; (d) 발색의 유무로 병소 형성 유무를 검출하는 단계; (e) 병소가 형성된 간암세포주의 영상을 획득하는 단계; 및 (f) 상기 획득된 영상을 이용하여 병소의 개수를 자동 산출하는 단계를 포함하는 자동 영상분석을 이용한 비세포변성 간염바이러스에 의해 형성된 숙주세포의 병소 개수 자동 산출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 간염바이러스 감염에 취약한 간암세포주인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 제1형 콜라겐으로 코팅된 세포배양 플레이트에서 배양하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 상기 숙주세포로 간암세포주인 Huh-7.5 세포주를 사용하였으나, 상기 숙주세포로는 간염바이러스에 감염이 되는 세포라면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료는 계열희석 (serial dilution) 된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 비세포변성 간염바이러스는 감염성 간염바이러스인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 감염성 간염바이러스의 바람직한 예는 감염성 C형 간염바이러스로 감염성이 높은 세포배양 형태의 JFH-1 HCV strain (genotype 2a)이나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 발색 반응을 유도하기 위하여 alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체 (alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)와 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) 및 nitro blue tetrazolium (NBT)의 색원체를 함유하는 발색기질을 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 영상은 영상획득장치로 획득하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 영상획득장치의 가장 바람 직한 예는 ELISpot reader이나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 병소의 개수의 자동 산출은 영상 분석 소프트웨어를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 영상 분석 소프트웨어의 가장 바림직한 예는 BioSpot 5.0 Professional software이나, 이에 국한되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

1. 비세포변성 간염바이러스의 정량을 위한 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus - forming assay )

1-1 감염성 C형 간염바이러스의 제조

본 발명에는 비세포변성 간염바이러스의 대표적인 예인 감염성 C형 간염바이러스를 사용하였으며 사용된 감염성 C형 간염바이러스는 JFH-1 HCV strain (genotype 2a)으로 JFH-1 HCV 전체 유전체를 포함하는 플라스미드를 시험관 내에서 전사하여 합성된 RNA를 Huh-7.5 세포에 도입시킴으로써 만들어졌다. 도입과정은 DMRIE-C시약 (Invitrogen)을 이용하였다. RNA를 세포에 도입시킨 뒤, HCV 생성이 최고점에 이르렀을 때의 세포 배양액을 모아 새로운 Huh-7.5 세포에 감염시켰다. HCV에 감염된 Huh-7.5 세포를 계대 배양하면서 HCV 생성이 가장 높은 시점의 세포 배양액을 모아 0.45μm 규격의 필터로 여과를 한 뒤 -70°C에 보관하여 필요 시 사용하였다.

1-2 발색 병소형성 검사방법( colorimetric focus - forming assay )의 적정화

병소형성을 위해 감염성 C형 간염바이러스에 취약한 세포인 간암세포주 Huh-7.5 세포를 각 well당 1 × 10⁴/100 μl Complete-DMEM의 농도로 배양하였으며, 이때 96-well flat-bottom tissue culture의 경우 5 μg/cm²의 농도의 레트 (rat) 꼬리에서 유래 된 제 1형 콜라겐으로 미리 코팅을 한 후 세포배양에 사용하였다. 37°C (5% CO₂)에서 overnight동안 배양을 한 뒤 각 well로부터 배양액을 50 μl/well씩 제거한 후, 바이러스를 10배씩 계열희석 (serial dilution) 시킨 배양액을 100 μl/well씩 각 well에 첨가하였다. 37°C에서 72 h 추가 배양을 한 뒤 배양액을 완전히 제거하고, 차가운 100% 메탄올을 50 μl/well씩 넣어 -20°C에서 15분간 고정 (fixation) 및 투과화 (permeabilization)를 시켰다. 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 고정 및 투과화 된 세포를 두 차례 세척한 뒤 blocking buffer (1% BSA, 0.25mM EDTA in PBS)를 50 μl/well씩 넣고 실온에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 후 blocking buffer를 제거하고 일차 항체인 mouse monoclonal anti-HCV core IgG1 (clone C7-50, Thermo Scientific/Affinity BioReagents, 1:300 in blocking buffer)을 40 μl/well 씩 넣고 한 시간 동안 실온에서 염색을 한 뒤 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 세 차례 세척하였다.

다음으로, 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)을 최적화하기 위하여 이차 항체의 경우 alkaline phosphatase가 결합된 rabbit anti-mouse IgG (1:200 in blocking buffer) 혹은 horseradish peroxidase가 결합된 goat anti-mouse Ig (1:1,000 in blocking buffer)을 사용하거나 biotin이 결합된 goat anti-mouse Ig (1:400 in blocking buffer)과 스트렙타비딘이 결합된 alkaline phosphatase (streptavidin-conjugated alkaline phosphatase) (1:5,000 in blocking buffer)을 사용하였다. 또한, 발색반응을 위해서는 AP Conjugate Substrate Kit (Bio-Rad)을 사용하거나 DAB 혹은 TMB 색원체를 100 μl/well 씩 사용하였다. 발색반응은 실온에서 진행되었으며, 적절한 반응이 나타났을 때 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 두 차례 세척함으로써 반응을 중지시켰다.

다양한 효소와 색원체 (chromogenic substrate)를 사용하여 시험해 본 결과, 도 1에서와 같이 biotin이 결합된 이차항체 (biotin-conjugated secondary antibody)에 스트렙타비딘이 결합된 alkaline phosphatase 효소 (streptavidin-conjugated alkaline phosphatase) 및 BICP/NBT 색원체를 사용한 경우 비특이적 반응이 너무 강하여 발색 병소를 배경으로부터 구분하기가 쉽지 않았다. 또한, horseradish peroxidase 효소가 결합된 이차항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)에 DAB나 TMB 색원체를 사용한 경우에는 발색 병소가 명확하게 관찰되지 않았다. 이에 반해, 도 2의 B에서 alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체(alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)와 BICP/NBT 색원체를 사용한 경우 배경의 비특이적 발색 반응이 적고 발색 병소도 명확하게 구분되는 등 결과가 가장 좋았으며, 기존의 면역형광 병소형성 검사법 (immunofluorescence assay)인 도 2의 E와 본 발명의 발색 병소형성 검사방법인 도 2의 B와 비교하여 볼 때 높은 수준의 정확성이 유지되는 것으로 나타났다.

또한, 상기 발색 병소형성 검사방법에서 여러 단계의 세척과정을 거치는 동안 플레이트에 부착된 Huh-7.5 세포가 탈락 될 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 pre-coating reagent를 최적화해 본 결과, 도 3에서와 같이 제 1형 콜라겐이 가장 적합하며, 이 과정을 통해 세포 탈락을 방지하여 정확한 정량이 가능함을 확인하였다.

2-1 발색 반응을 이용한 C형 간염바이러스에 의해 형성된 병소 검출

상기 적정화된 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay)을 이용하여 다음과 같은 단계를 거쳐 C형 간염바이러스에 의해 형성된 병소를 검출하였다. 먼저, Huh-7.5 세포를 각 well당 1 × 10⁴/100 μl Complete-DMEM의 농도로 배양하였으며, 이때 96-well flat-bottom tissue culture의 경우 5 μg/cm²의 농도의 레트(rat) 꼬리에서 유래 된 제 1형 콜라겐으로 미리 코팅을 한 후 세포배양에 사용하였다. 37°C (5% CO₂)에서 overnight동안 배양을 한 뒤 각 well로부터 배양액을 50 μl/well씩 제거한 후, 바이러스를 10배씩 계열희석 (serial dilution) 시킨 배양액을 100 μl/well씩 각 well에 첨가하였다. 37°C에서 72 h 추가 배양을 한 뒤 배양액을 완전히 제거하고, 차가운 100% 메탄올을 50 μl/well씩 넣어 -20°C에서 15분간 고정 (fixation) 및 투과화 (permeabilization)를 시켰다. 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 고정 및 투과화 된 세포를 두 차례 세척한 뒤 blocking buffer (1% BSA, 0.25mM EDTA in PBS)를 50 μl/well씩 넣고 실온에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 후 blocking buffer를 제거하고 일차 항체인 mouse monoclonal anti-HCV core IgG1 (clone C7-50, Thermo Scientific/Affinity BioReagents, 1:300 in blocking buffer)을 40 μl/well 씩 넣고 한 시간 동안 실온에서 염색을 한 뒤 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 세 차례 세척하였다.

발색반응을 유도하기 위해 실온에서 alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체 (alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)와 BICP/NBT 색원체를 사용하였고, 적절한 발색이 유도되었을 때 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 두 차례 세척함으로써 반응을 중지시켰다.

2-2 영상 분석을 통한 병소 개수의 자동 산출

상기 발색반응이 유도된 세포 플레이트에서 완충용액을 완전히 제거한 뒤 ELISpot reader (ImmunoSpotS5 Versa Analyzer, Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)로 스캔하여 영상을 획득하였다. 그 다음, BioSpot 5.0 Professional software (Cellular Technology Ltd.)를 이용하여 병소 개수를 자동 산출하였다. 도 4의 A에서와 같이, 병소 개수의 자동 산출을 위하여 영상 분석 소프트웨어에서 다양한 변수 즉, 병소 크기, 민감도, 배경 색 균형 등을 조정하였다. 이렇게 인식된 병소는 도 4의 B에서와 같이 표시되었으며, 각 well 당 병소 크기의 분포는 도 4의 C와 같다. 따라서, 상기 실시예에서 수행한 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay) 및 영상 분석을 통하여 감염성 C형 간염바이러스에 감염된 병소의 개수를 상당한 노동력과 시간을 투여하지 않고 효율적으로 정확하게 산출할 수 있음을 확인하였다.

3-1 면역형광 병소형성 검사법을 이용한 C형 간염바이러스의 병소 검출

Huh-7.5 세포를 각 well당 1 × 10⁴/100 μl Complete-DMEM의 농도로 배양하였으며, 이때 96-well flat-bottom tissue culture의 경우 5 μg/cm²의 농도의 레트 (rat) 꼬리에서 유래 된 제 1형 콜라겐으로 미리 코팅을 한 후 세포배양에 사용하였다. 37°C (5% CO₂)에서 overnight동안 배양을 한 뒤 각 well로부터 배양액을 50 μl/well씩 제거한 후, C형 간염바이러스를 10배씩 계열희석 (serial dilution) 시킨 배양액을 100 μl/well씩 각 well에 첨가하였다. 37°C에서 72 h 추가 배양을 한 뒤 배양액을 완전히 제거하고, 차가운 100% 메탄올을 50 μl/well씩 넣어 -20°C에서 15분간 고정 (fixation) 및 투과화 (permeabilization)를 시켰다. 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 고정 및 투과화 된 세포를 두 차례 세척한 뒤 blocking buffer (1% BSA, 0.25mM EDTA in PBS)를 50 μl/well씩 넣고 실온에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 후 blocking buffer를 제거하고 일차 항체인 mouse monoclonal anti-HCV core IgG1 (clone C7-50, Thermo Scientific/Affinity BioReagents, 1:300 in blocking buffer)을 40 μl/well 씩 넣고 한 시간 동안 실온에서 염색을 한 뒤 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 세 차례 세척하였다.

이차 항체인 AlexaFluor-488-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (1:1,000 in blocking buffer)를 40 μl/well 씩 넣고 한 시간 동안 실온에서 차광한 상태로 염색을 한 뒤 다시 완충용액 (PBS) 200 μl/well로 세 차례 세척하였다. 이후 PBS 50 μl/well을 넣고 형광염색된 감염 병소를 형광현미경으로 관찰하였다. 감염된 세포의 병소는 Zeiss 도립현미경 (Carl Zeiss, Thornwood, NY)으로 관찰하였다.

3-2 발색 병소형성 검사방법 ( Colorimetric focus - forming assay )과 면역형광 병소형성 검사법 ( immunofluorescence - based focus - forming assay )의 비교

본 발명에서 개발된 발색 병소형성 검사법 (colorimetric focus-forming assay) 및 영상분석을 이용한 병소 개수의 산출 방법이 기존의 면역형광 병소형성 검사법 (immunofluorescence-based focus-forming assay)을 대체할 수 있는 효과적인 방법인지를 확인하기 위하여 상기 두 가지 방법으로 계산된 병소의 개수를 비교해보았다. 두 검사법의 상관관계분석에는 Pearson’s correlation coefficient가 사용되었다. 발색 병소형성 검사법 (colorimetric focus-forming assay)과 면역형광 병소형성 검사법 (immunofluorescence-based focus-forming assay)로부터 각각 산출된 바이러스 농도의 통계적 차이 유무는 two-tailed Student’s t-test로 분석하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 이루어졌으며 P value 가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 정의하였다.

총 6번에 걸쳐 제조한 서로 다른 배치(batch)의 감염성 C형 간염바이러스 (JFH-1 HCV)를 샘플로 하여 상기 두 가지 병소형성 검사법의 상관관계를 분석한 결과, 도 5의 A에서와 같이 두 방법상 산출된 병소의 개수는 강한 상관성을 나타내었다. 또한, 도 5의 B와 C에서 나타난 바와 같이, 병소의 개수로부터 계산된 바이러스 양 또한 두 방법 간에 강한 상관성을 나타내었으며, 두 방법 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 발색 병소형성 검사방법 (colorimetric focus-forming assay) 및 영상분석을 통한 감염성 C형 간염바이러스의 정량법은 기존의 방법과 비교할 때 월등히 효율적인 반면 높은 정확성은 유지되는 것으로 나타났으므로 기존의 면역형광 병소형성 검사법을 대체할 수 있는 효과적인 정량법임을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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다음 단계를 포함하는 자동 영상분석을 이용한 비세포변성 간염바이러스에 의해 형성된 숙주세포의 병소 개수 자동 산출방법:
(a) 숙주세포를 비세포변성 간염바이러스 또는 이를 함유하는 시료로 감염시키는 단계;
(b) 감염된 숙주세포를 바이러스 특이적 일차 항체로 염색하는 단계;
(c) 이차 항체와 발색기질을 첨가하여 발색반응을 시키는 단계;
(d) 발색의 유무로 병소 형성 유무를 검출하는 단계;
(e) 병소가 형성된 간암세포주의 영상을 획득하는 단계; 및
(f) 상기 획득된 영상을 이용하여 병소의 개수를 자동 산출하는 단계.
제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 간암세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 간암세포주는 Huh-7.5 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 제1형 콜라겐으로 코팅된 세포배양 플레이트에서 배양된 것임을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 비세포변성 간염바이러스는 감염성 C형 간염바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 비세포변성 간염바이러스 감염 시료는 계열희석 (serial dilution) 된 것임을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 이차 항체는 alkaline-phosphatase 효소가 결합된 이차항체 (alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 발색기질은 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) 및 nitro blue tetrazolium (NBT)의 색원체를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 영상은 영상획득장치로 획득하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 병소 개수의 자동 산출은 영상 분석 소프트웨어로 산출하는 것을 특징으로 하는 방법.