KR101458922B1

KR101458922B1 - 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101458922B1
Application number: KR1020120075703A
Authority: KR
Inventors: 정광철
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-11-10
Also published as: KR20140008738A

Abstract

본 발명은 PINK1의 신규한 결합 파트너인 TRAF6 및 TAK1, 그리고 이를 이용한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 PINK1은 TRAF6의 자가-다이머화 및 자가-유비퀴틴화 뿐 아니라 TAK1의 폴리유비퀴틴화 및 자가-인산화를 촉진하고, TRAF6-TAK1 복합체(complex)의 형성을 증대시킨다. 그 결과, IL-1-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)가 촉진되어 NF-B(nuclear factor kappa B)를 활성화시키고 염증성 사이토카인의 생산을 증가시킨다. 따라서, PINK1의 발현을 억제시키는 물질, 또는 PINK1과 TRAF6 또는 TAK1의 결합을 억제시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 신경퇴행성 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{Screening Methods of a Substance for Preventing or Treating Neurodegenerative Disorders and Pharmaceutical Compositions Using the Same}

본 발명은 PINK1의 신규한 결합 파트너인 TRAF6 및 TAK1, 그리고 이를 이용한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta) 내 도파민 뉴런(neurons)의 점진적인 퇴행 및 사멸로 특징지워지는 신경퇴행성 질환이다[1]. PD의 병리학적 특징(hallmarks)은 루이 바디(Lewy bodies)로 알려진 세포질 봉입체(cytoplasmic inclusions)의 존재를 포함한다[2]. PD의 병인이 거의 알려지지 않았을 지라도, 여러 유전자 위치들(genetic loci)이 가족형 PD의 발병 과정(pathogenesis)에 포함되어 있다. 이들 중, PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 유전자는 세린/트레오닌 키나제를 인코딩하고[3, 4] TNF(tumor necrosis factor) 수용체-관계된 단백질 1 같은 기질들을 인산화시켜 산화적 스트레스-유도된 아팝토시스(apoptosis)로부터 세포 보호를 초래한다[5]. 배양된 세포에서, PINK1의 과다발현은 아팝토시스 자극들로부터 세포를 보호한다[6, 7].

염증은 병원체, 손상된 세포 또는 자극제(irritants) 같은 해로운 자극들에 대한 복잡한 생물학적 반응으로, 상기 해로운 자극들의 제거를 통해 보호 역할을 한다. 신경 시스템에서 염증성 이벤트는 미세아교세포 활성화(microglial activation), 성상교세포증(astrogliosis) 및 림프구 침윤을 포함한다. 많은 자극들은 성상세포 및 미세아교세포 모두에서 전사인자인 NF-B(nuclear factor kappa B)의 활성화를 유도하여[8], 케모카인 및 사이토카인을 포함하는 염증성 매개인자들의 생산을 초래한다[9]. 몇몇 조직 염증 반응이 손상된 조직의 복귀를 위해 필요할 지라도, 조직 특히, 중추신경계에서의 과도한 염증 반응은 상당한 세포 사멸을 야기하여 신경 퇴행을 초래한다. 이런 맥락과 유사하게도, 염증이 PD의 발병 과정과 밀접하게 연관되어 있다는 여러 증거들이 있다. 예를 들어, PD 환자의 뇌 조직 검시는 흑질 내에 염증의 징후(evidence)가 있음을 보여준다[10, 11].

IL-1(Interleukin-1)은 NF-κB 및 AP-1(activating protein 1)를 활성화시켜 다양한 면역 반응 및 염증 반응을 조정(orchestrate)하는 매개인자들을 유도하는 주된 사이토카인들 중 하나이다[12]. IL-1 시그널링은 IL-1 수용체(IL-1R) 및 IL-1R 보조 단백질로 구성된 수용체 복합체의 리간드-유도된 형성을 통해 개시된다. 이후, 세포질 어댑터 단백질인 MyD88(myeloid differentiation marker 88)은 상기 복합체로 회귀된다[13]. MyD88는 IRAK1(IL-1R-associated kinase-1) 및 IRAK4의 사멸 도메인과 상호작용함으로써 상기 키나제들을 순차적으로 회귀시킨다[14]. 아마도, IRAK1은 IRAK4에 의한 인산화를 통해 활성화되고 TRAF6(TNF receptor-associated factor 6)와 상호작용한다[15]. 이후, TRAF6는 세포막에서 세포질로 이동하여 MAP3K(mitogen-activated protein kinase(MAPK) kinase kinase)의 일종인 TAK1(transforming growth factor-β(TGF-β)-activated kinase 1)과 결합한다[16]. TRAF6는 하나의 RING 도메인을 포함하고 TRAF6 자체 및 IRAK1에 Lys63-링크된 폴리유비퀴틴 체인을 컨쥬게이션시키는 유비퀴틴 E3 리가제로 기능한다. 또한, IRAK1는 TRAF6의 다이머화(dimerization)를 촉진한다. TAK1은 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination)된 TRAF6에 의해 완전히 활성화되어 다른 다운스트림 시그널링 경로에 존재하는 조절성 키나제(regulatory kinases)를 인산화시키고 최종적으로 NF-κB를 활성화시켜 염증성 사이토카인을 생산한다[18, 19].

광범위한 연구에도 불구하고, PD-관계된(linked) 유전자들과 염증성 반응 간의 기능적 상관성(relationship)은 거의 이해되지 않고 있으며, 이에 대한 규명이 시급히 요구되고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경퇴행성 질환인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PINK1이 TRAF6 및 TAK1이 PINK1의 신규한 결합 파트너이며, 상기 PINK1에 의한 TRAF6 및 TAK1의 양성적 조절을 통해 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)를 촉진시킴으로써 NF-κB(nuclear factor kappa B)를 활성화시키고 염증성 사이토카인(예컨대, IL-8)의 생산을 촉진한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TRAF6-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TAK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열, TRAF6-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TAK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) TRAF6 단백질과 TAK1 단백질의 복합체 형성을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 PINK1 단백질의 억제를 통해 상기 TRAF6 단백질과 TAK1 단백질의 복합체 형성을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

본 발명자들은 신경퇴행성 질환인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PINK1이 TRAF6 및 TAK1이 PINK1의 신규한 결합 파트너이며, 상기 PINK1에 의한 TRAF6 및 TAK1의 양성적 조절을 통해 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 촉진시킴으로써 NF-κB를 활성화시키고 염증성 사이토카인(예컨대, IL-8)의 생산을 촉진한다는 사실을 발견하였다.

파킨슨병(Parkinson's disease)은 중추신경계의 진행형 퇴행성 질환으로, 중뇌(midbrain)의 한 부위인 흑질(substantia nigra)에 존재하는 도파민-발생 세포(예컨대, 도파민 뉴런)의 세포사멸로부터 야기된다. 상기 질환의 증상으로, 초기에는 운동과 관련된 증상(예컨대, 느린 운동, 정지시 떨림, 근육 강직, 질질 끌며 걷기, 굽은 자세 등)을 명확하게 나타내며, 진행됨에 따라 인식(cognitive) 및 행동 장애를 일으키고, 가장 진전된 단계에서는 공통적으로 치매(dementia) 증상을 나타낸다. 다른 증상으로는, 감각 장애, 수면 장애 및 감정 장애를 포함한다. 파킨슨병은 50세 이후에 발생되는 가장 보편적인 질환으로, 나이가 들어감에 따라 발병하는 가장 일반적인 질환이다.

PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)은 마이토콘드리아 세린/트레오닌 단백질 키나제로, 스트레스-유도된 마이토콘드리아 기능 장애를 보호하는 기능을 하는 것으로 생각되고 있다. 상기 PINK1 유전자의 돌연변이는 파킨슨병의 한 형태(예컨대, PARK7(autosomal recessive early-onset Parkinson disease))를 야기하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 신경퇴행성 질환(바람직하게는, 파킨슨병)과 염증 반응 사이의 밀접한 상관성에 대한 분자적 규명을 위해 PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 결합 파트너에 대한 스크리닝을 실시한 결과, PINK1의 신규한 결합 파트너로서 TRAF6 및 TAK1을 최초로 동정하였다.

PINK1 결합 파트너의 동정은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법을 통해 실시될 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al ., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al ., J. Biol. Chem. 268, 1204612054, 1993; Bartel et al ., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al ., Oncogene 8, 16931696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, PINK1 단백질을 베이트(bait) 단백질로 이용하여 PINK1 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드 시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, PINK1-인코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL-4)의 DNA 결합 도메인-인코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질("프레이" 또는 "시험물질")을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 인 비보에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, 루시퍼라제)의 전사를 촉발하게 된다. 그 결과 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 프레이가 PINK1 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 상기 프레이는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질로 이용될 수 있음을 의미한다.

예를 들어, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TRAF6-인코딩 뉴클레오타이드 서열(또는 TAK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1)의 결합을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)의 결합을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

상술한 본 발명의 방법에 있어서, PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TRAF6-인코딩 뉴클레오타이드 서열(또는 TAK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 포유동물의 뇌로부터 유래된 세포이고, 보다 바람직하게는 도파민 뉴런이다. 상기 세포는 바람직하게는 초기배양 세포(primary cultured cells), 구축세포주(established cell line) 또는 종양세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)의 결합 또는 TRAF6 단백질과 TAK1 단백질의 복합체 형성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA), miRNA, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 화학물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 또한, 화학물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예컨대, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고체상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al ., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al ., Science 261, 1303, 1993; Carell et al ., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al ., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al ., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

이어, 시험물질이 처리된 세포 용해물에서 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)의 결합 여부를 측정한다. 상기 결합 여부의 측정은 하기 기재한 바와 같이 통상적인 방법을 통해 실시하며, 상기 시험물질이 상기 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)의 결합을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 억제시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 단계 (b)에서 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)의 결합은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)의 양의 변화 및 결합 여부는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 통해 검출될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 본 발명의 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질(또는 TAK1 단백질)을 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 용해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차항체로서의 타겟(예컨대, 본 발명의 PINK1 또는 TRAF6(또는 TAK1))에 대한 항체와 상기 세포 용해물을 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟(예컨대, 본 발명의 PINK1 또는 TRAF6(또는 TAK1))에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 세포 용해물을 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 본 발명의 PINK1 또는 TRAF6(또는 TAK1)에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, -갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PINK1과 TRAF6(또는 TAK1)의 결합 능력을 조사하기 위해 본 발명의 스크리닝 방법은 검출 가능한 표지인자(tag)로 태깅된 PINK1(예컨대, Myc-PINK1) 및 TRAF6(예컨대, Flag- 또는 V5-TRAF6)(또는 Flag-TAK1)를 포함하는 세포를 이용하여 면역침전을 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 PINK1 단백질은 TRAF6의 자가-다이머화(autodimerization) 및 자가-유비퀴틴화(autoubiquitination)를 촉진하고, TAK1의 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 및 자가-인산화(autophosphorylation)를 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 PINK1 단백질은 TRAF6-TAK1 복합체(complex)의 형성을 증대시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 PINK1은 TRAF6 및 TAK1 활성의 양성적 조절을 통해 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 촉진시킨다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 과다발현된 PINK1은 TRAF6 및 TAK1과 특이적으로 결합하고 TRAF6 및 TAK1 단백질의 활성을 양성적으로 조절하거나 또는 TRAF6 및 TAK1 단백질의 복합체 형성을 촉진한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 PINK1 단백질은 TRAF6 및 TAK1과 선택적으로 결합하였으며(참고: 도 1a-도 1f), 야생형 PINK1 단백질에 의한 TRAF6 단백질의 자가다이머화가 대조군과 비교하여 2.6배 증가하였고(참고: 도 3b), TRAF6 단백질의 Lys-63-의존성 자가유비퀴틴화는 투여량-의존적으로 증가하였다(참고: 도 4b). 또한, 본 발명의 PINK1 단백질은 대조군(키나제-부재 PINK1)과 비교하여 TAK1의 폴리유비퀴틴화를 현저하게 상향-조절하였으며(참고: 도 6b), 야생형 PINK1 단백질에 의한 TAK1의 자가-인산화가 3.6배 증가되었다(참고: 도 7a).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 PINK1은 NF-κB를 활성화시키고 염증성 사이토카인의 생산을 촉진한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 PINK1은 IL(interleukin)-1, IL-2, TNF(tumor necrosis factor)-α, TGF(transforming growth factor)-β, INF(interferon)-γ, IL-6, IL-8 또는 IL-12의 생산을, 보다 더 바람직하게는 IL-1, TNF-α, IL-6, IL-8 또는 IL-12의 생산을, 그리고 가장 바람직하게는 IL-8의 생산을 증가시킨다.

따라서, 본 발명의 PINK1과 TRAF6(또는 TAK1) 간의 결합 억제를 통해 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 차단하여 염증 반응을 감소시킴으로써 신경퇴행성 질환의 진행 및/또는 악화를 억제할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 뇌졸중(stroke), 근위축성측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 빈스완거병(Binswangers disease), 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 및 피크병(Pick's disease)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 파킨슨병이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PINK1 유전자에 특이적으로 결합하는 RNAi(RNA interference) 분자, 또는 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합 또는 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서의 용어 "신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)"은 신경 조직이 낮은 또는 덜 기능적인 활성 형태로 변하는 것을 특징으로 하는 신경 조직(특히, 뉴런)의 파괴 상태(deterioration conditions)를 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 자극으로부터 뉴런을 보호하기 위한 유전자의 과다발현 및/또는 넉-다운(knock-down), 또는 단백질 간의 결합 억제(예컨대, PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합 또는 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합 억제)에 의해 신경퇴행과 연관된 상태의 치료에 유용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 PINK1 유전자에 특이적으로 결합하는 RNAi(RNA interference) 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 서열목록 제3서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 siRNAs를 포함한다.

본 발명에서 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al ., 2002; Degot S, et al ., 2004; Ballut L, et al ., 2005).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(PINK1 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(PINK1 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 PINK1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 서열목록 제3서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명에 따르면, 세포(예: 293 IL-1RI 세포)에 PINK1-siRNA를 처리함에 따라 정상 레벨의 절반 이하의 수준으로 TAK1의 자가인산화를 감소시켰다(참조: 도 7b).

본 발명에서 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제시키는 데 이용될 수 있다. 통상적으로, shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다. 또한, shRNA는 식물 및 다른 시스템에서도 이용될 수 있으며 U6 프로모터가 반드시 필요한 것은 아니다. 식물의 경우에는 매우 강력한 연속적인 발현 능력을 보유한 전통적인 프로모터인 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터가 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 PINK1에 상보적이고 PINK1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, PINK1 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

본 명세서의 용어 "miRNA(microRNA)"는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로써, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 이러한 miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNase type 효소에 의해 70-90 염기 정도의 스템-루프 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 염기의 성숙한 miRNA로 만들어진다. 이렇게 생성된 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여한다.

한편, 본 발명의 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합 또는 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 분석하는 것은 상술한 본 발명의 스크리닝 방법과 동일한 것이므로, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 두개강 내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다. 바람직하게는, 뇌에 직접 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 1일 당 0.0001 ng/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 PINK1의 신규한 결합 파트너인 TRAF6 및 TAK1, 그리고 이를 이용한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명에 따르면, 본 발명의 PINK1은 TRAF6의 자가-다이머화 및 자가-유비퀴틴화 뿐 아니라 TAK1의 폴리유비퀴틴화 및 자가-인산화를 촉진하고, TRAF6-TAK1 복합체(complex)의 형성을 증대시킨다.

(d) 그 결과, IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)가 촉진되어 NF-κB(nuclear factor kappa B)를 활성화시키고 염증성 사이토카인의 생산을 증가시킨다.

(e) 따라서, PINK1의 발현을 억제시키는 물질, 또는 PINK1과 TRAF6 또는 TAK1의 결합을 억제시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 신경퇴행성 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 PINK1이 포유동물 HEK293 세포에서 TRAF6 및 TAK1와 상호작용한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 1a. HEK293 세포에 Myc-태깅된 PINK1 및/또는 V5-태깅된 TRAF6를 인코딩하는 플라스미드들을 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. 지정된 바와 같이, 항-Myc 항체를 이용하여 세포 용해물의 면역침전(Immunoprecipitation, IP)을 실시하고 항-V5 항체로 면역 블롯팅을 실시하였다. 일과성으로 트랜스펙션된 단백질의 적절한 발현이 지시된 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 확인되었다. 별표는 IgG 중쇄(heavy chains)를 나타낸다. 시료들의 동량 로딩은 항-액틴 항체로 면역 블롯팅을 실시하여 확인하였다. 도 1b. 지시된 바와 같이, HEK293 세포 용해물에 대한 면역침전이 항-PINK1 항체로 실시된 후, 항-TRAF6 항체로 면역 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로서, 세포 용해물은 전면역 IgG(IgG)을 이용하여 면역침전되었다. 세포 추출물에서 PINK1 및 TRAF6의 발현은 항-PINK1 또는 항-TRAF6 항체를 이용한 면역 블롯팅을 통해 확인하였다. 도 1c. HEK293 세포가 고정되고 투과화된 후, 항-PINK1 또는 항-TRAF6 항체로 24시간 동안 표지화되었다. 이후, 세포는 TRITC-컨쥬게이션된 및 FITC-컨쥬게이션된 2차 항체 및 DAPI로 염색되었다. 면역염색된 제조물이 공초점 현미경으로 조사되었다. 축척막대(Scale bar) = 20 μm. 도 1d는 HEK293 세포에서 Myc-PINK1 및 Flag-TAK1 간의 특이적 결합을 보여준다. 도 1e. 지시된 바와 같이, HEK293 세포 용해물에 대한 면역침전이 항-TAK1 항체로 실시된 후, 항-PINK1 IgG를 이용하여 면역 블롯팅 분석을 실시하였다. 도 1f는 HEK293 세포에서 PINK1 및 TAK1의 공동-위치화를 나타낸다. 축척막대 = 20 μm.
도 2는 TRAF6 및 TAK1과 PINK1의 결합(association)이 IL-1β 자극 하에서 증가한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 2a-2b. 293 IL-1RI 세포에 Myc-PINK1 및 V5-TRAF6(a) 또는 Flag-TAK1(b)를 42시간 동안 공동-트랜스펙션시키고 지시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 세포 용해물을 항-Myc(a) 또는 항-Flag(b)으로 면역침전시킨 후, 지시된 바와 같이 항-V5(a) 또는 항-Myc IgGs(b)로 면역 블롯팅을 실시하였다. 별표는 IgG 중쇄를 나타내고 액틴은 로딩 대조군으로 이용되었다.
도 3은 PINK1이 TRAF6 자가다이머화를 증가시킨다는 것을 나타내는 결과이다. 도 3a. 293 IL-1RI 세포에 Flag-TRAF6, V5-TRAF6s 또는 Myc-PINK1을 단독으로 또는 조합하여 42시간 동안 트랜스펙션시키고 지시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 항-FLAG 항체를 이용하여 세포 용해물의 면역침전을 실시하였으며 항-V5 항체를 이용하여 상기 면역복합체에 대한 면역 블롯팅을 실시하였다. 시료들의 동량 로딩은 항-액틴 항체로 면역 블롯팅을 실시하여 확인하였다. 시료의 상대적인 결합 친화도를 정량하여 위쪽 패널의 아래 부분에 표기하였다. 도 3b. 293 IL-1RI 세포에 Flag-TRAF6 및 V5-TRAF6을 단독으로 또는 Myc-태깅된 야생형 PINK1(WT) 또는 키나제-결핍 돌연변이(KD)와 조합하여 42시간 동안 공동-트랜스펙션시킨 후, 10 ng/ml IL-1β를 15분 동안 처리하였다. 세포 추출물을 항-V5 항체로 면역침전시키고 상기 면역복합체를 항-Flag 항체로 면역 블롯팅 하였다. 별표는 IgG 중쇄를 나타낸다(a 및 b).
도 4는 PINK1이 TRAF6 자가유비퀴틴화를 증가시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 도 4a. HEK293 세포에 HA-유비퀴틴, Flag-TRAF6 또는 Myc-PINK1를 단독으로 또는 조합하여 지시된 바와 같이 트랜스펙션시켰다. 항-Flag 항체로 세포 용해물을 면역침전시킨 후, 항-HA 항체로 면역 블롯팅 하였다. 일과성으로 트랜스펙션된 단백질의 적절한 발현이 항-HA, 항-Flag 또는 항-Myc 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 확인되었다. 별표는 IgG 중쇄를 나타내고 액틴을 로딩 대조군으로 이용되었다. 도 4b. HEK293 세포에 HA-유비퀴틴 또는 Flag-TRAF6을 단독으로 또는 Myc-PINK1의 증가하는 양과 함께 48시간 동안 공동-트랜스펙션시켰다. 항-Flag 항체를 이용하여 세포 용해물을 면역침전시킨 후, 항-HA 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 실시하였다. 도 4c. HEK293 세포에 HA-유비퀴틴 또는 Flag-TRAF6를 단독으로 또는 Myc-태깅된 야생형 PINK1(WT) 또는 키나제-결핍된 돌연변이(KD)와 조합하여 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. 항-Flag 항체를 이용하여 세포 용해물을 면역침전시킨 후, 항-HA 항체로 면역 블롯팅을 실시하였다. 도 4d. PINK1-/- 또는 +/+ MEF 세포에 V5-TRAF6를 42시간 동안 트랜스펙션시키고 지시된 시간 동안 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 항-V5 항체를 이용하여 세포 용해물을 면역침전시키고 지시된 시간에 항-Lys63-특이적 유비퀴틴 항체로 면역 블롯팅 하였다.
도 5는 PINK1이 TRAF6-TAK1 복합체의 형성을 증가시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 도 5a. 293 IL-1RI 세포에 FLAG-TAK1, V5-TRAF6 또는 Myc-PINK1을 단독으로 또는 조합하여 42시간 동안 트랜스펙션시키고, 지시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 항-FLAG 항체를 이용하여 세포 용해물을 면역침전시키고, 상기 면역복합체를 항-V5 항체로 면역 블롯팅함으로써 분석하였다. 상기 복합체의 상대적인 레벨을 정량하여 위쪽 패널의 아래 부분에 표기하였다. 정량하여 위쪽 패널의 아래 부분에 표기하였다. PINK1-/- 또는 +/+ MEF 세포에 지시된 시간 동안 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 항-TAK1 항체로 세포 용해물을 면역침전시키고 항-TRAF6 항체를 이용하여 면역 블롯팅 하였다. 별표는 IgG 중쇄를 나타낸다. 각 시료 로딩양은 항-액틴 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 확인하였다.
도 6은 PINK1이 TAK1 폴리유비퀴틴화를 촉진시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 도 6a. 보다 상세하게는, HEK293 세포에 HA-유비퀴틴, Flag-TAK1, V5-RAF6 또는 Myc-PINK1를 단독으로 또는 조합하여 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. 항-Flag 항혈청을 이용하여 세포 용해물을 면역침전시킨 후, 항-HA 항체로 면역 블롯팅을 실시하였다. 각 세포 용해물에서 트랜스펙션된 단백질의 적정한 발현이 지정된 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 확인되었다. 별표 및 검은 동그라미(closed circle)는 각각 IgG 중쇄 및 비-특이적 밴드를 나타내고 액틴은 로딩 대조군으로 이용되었다. 도 6b. HEK293 세포에 HA-유비퀴틴 및 Flag-TAK1를 단독으로 또는 Myc-태깅된 야생형 PINK1(WT) 또는 우성-음성 돌연변이(KD)와 함께 48시간 동안 공동-트랜스펙션시켰다. 항-Flag 면역침전물 및 세포 용해물이 항-HA 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 분석되었다. 도 6c. PINK1-/- 또는 +/+ MEF 세포에 지정된 시간 동안 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 항-TAK1 항체를 이용하여 세포 용해물을 면역침전시키고 항-Lys63-특이적 유비퀴틴 항체로 면역 블롯팅 하였다.
도 7은 PINK1이 TAK1 자가인산화를 증대시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 도 7a. 293 IL-1RI 세포가 42시간 동안 목(mock)-트랜스펙션되거나 또는 Myc-태깅된 PINK1로 트랜스펙션된 후, 지시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 세포 용해물이 항-TAK1 또는 항-포스포-TAK1-T187 항체를 이용하여 면역 블롯팅 되었다. 액틴은 로딩 대조군으로 이용되었다. 포스포-TAK1의 상대적인 레벨이 정량되어 위쪽 패널의 아래에 표시되었다. 도 7b. 293 IL-1RI 세포에 스크램블 대조군 siRNA 또는 PINK1에 대한 siRNA를 42시간 동안 트랜스펙션시킨 후, 지시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 도 7c. PINK1-/- 또는 +/+ MEF 세포에 지시된 시간 동안 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 비인산화된(unphosphorylated) TAK1 및 Thr187에 인산화된 TAK1의 레벨이 항-TAK1 또는 항-포스포-TAK1 항체를 이용한 면역 블롯팅을 통해 결정되었다.
도 8은 PINK1이 TRAF6 인산화에 관여하지 않는다는 것을 보여주는 결과이다. 보다 상세하게는, 293 IL-1RI 세포가 42시간 동안 목(mock)-트랜스펙션되거나 또는 V5-TRAF6 단독으로 또는 Myc-hPINK1-WT(WT) 또는 Myc-hPINK1-KD(KD)와 조합하여트랜스펙션되었다. 세포에 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하지 않거나 또는 15분 동안 처리한 후, 항-V5 항혈청을 이용하여 세포 용해물을 면역침전시키고 항-포스포-트레오닌 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 실시하였다. 각 세포 용해물에서 트랜스펙션된 단백질들의 적절한 발현이 지시된 항체를 이용한 면역 블롯팅을 통해 확인되었다. 별표 및 빈 화살표(open arrow)는 각각 IgG 중쇄 및 비-특이적 밴드를 나타내고 액틴은 로딩 대조군으로 이용되었다.
도 9는 키나제-결핍 PINK1 돌연변이가 TRAF6 및 TAK1과 여전히 결합한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 9a 및 9b. 지시된 바와 같이, 293 IL-1RI 세포가 42시간 동안 목(mock)-트랜스펙션되거나 또는 Flag-TRAF6(a) 또는 Flag-TAK1(b) 단독으로 또는 Myc-hPINK1-WT 또는 Myc-hPINK1-KD와 함께 조합하여 트랜스펙션되고 15분 동안 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하였다. 항-Flag 항혈청(a 및 b)을 이용하여 세포 용해물을 면역침전시킨 후, 항-Myc 항체로 면역 블롯팅 하였다. 각 세포 용해물에서 트랜스펙션된 단백질의 적절한 발현은 지시된 항체를 이용한 면역 블롯팅을 통해 확인되었다. 별표는 각각 IgG 중쇄를 나타내고 액틴은 로딩 대조군으로 이용되었다.
도 10은 PINK1이 인 비트로에서 TAK1을 직접 인산화시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 293 IL-1RI 세포에 MychPINK1-WT 또는 Myc-hPINK1-KD을 42시간 동안 트랜스펙션시키고 10 ng/ml의 IL-1β를 처리하지 않거나, 또는 15분 동안 자극시켰다. 인 비트로 키나제 어세이를 위해, 세포 용해물로부터 제조된 항-Myc 면역침전물이 박테리아에서 발현된 GST-융합된 TAK1 및 6 mM의 ATP와 혼합되었고, 항-포스포-트레오닌 항체를 이용하여 상기 반응 산물을 면역 블롯팅 하였다.
도 11은 PINK1이 IL-1에 반응하여 NF-κB 활성화 뿐 아니라 IL-8의 생산을 촉발한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 11a. 지시된 바와 같이, 293 IL-1RI 세포에 NF-B-반응성 루시퍼라제 리포터 및 대조군 레닐라 루시퍼라제 리포터를 인코딩하는 플라스미드를 단독으로 또는 Myc-hPINK1-WT와 함께 조합하여 36시간 동안 트랜스펙션시켰다. 이후, 세포에 1 μg/ml의 IL-1ra를 2시간 동안 전-처리하였으며, 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하지 않거나, 또는 12시간 동안 처리하였다. 상대적인 루시퍼라제 활성을 측정하고 레닐라 활성을 기준으로 표준화시켰다. 오차 막대는 세 쌍으로 이루어진 실험들에서의 ± 표준편차(S.D.)를 나타낸다. 목(mock)과 비교하여 **P < 0.01. 도 11b. 293 IL-1RI 세포에 NF-κB-반응성 루시퍼라제 리포터 벡터 및 대조군 레닐라 루시퍼라제 리포터를 인코딩하는 플라스미드를 단독으로 또는 Myc-태깅된 야생형 PINK1(WT) 또는 우성-음성 돌연변이(KD)와 함께 조합하여 36시간 동안 트랜스펙션시켰다. 이후, 세포에 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하지 않거나, 또는 6시간 동안 처리하였다. IL-1β-처리된 목 시료와 비교하여 **P < 0.01. 도 11c. 293 IL-1RI 세포가 목-트랜스펙션되거나, 또는 Myc-PINK1로 36시간 동안 트랜스펙션된 후, 지시된 바와 같이 50 ng/ml의 IL-1β를 12시간 동안 처리하였다. 이후, 총 RNA를 추출하여 역-전사를 통해 cDNA를 제조하였다. IL-8 mRNA에 대한 실-시간 PCR 분석은 IL-8 프라이머를 이용하여 실시하였다. IL-1β-처리된 목 시료와 비교하여 **P < 0.01. 도 11d. 상기 도 11c로부터 얻어진 배지 내의 IL-8 단백질의 양은 ELISA를 이용하여 측정하였다. IL-1β-처리된 목 시료와 비교하여 **P < 0.01. 상술한 결과는 3개의 독립적인 실험들 중 대표적인 예이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험재료

DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium), FBS(fetal bovine serum), FCS(fetal calf serum) 및 LipofectAMINE PLUS 시약은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)으로부터 구매하였다. 단백질 A-세파로오스는 GE Healthcare Biosciences(Piscataway, NJ, USA)로부터 얻었다.

항-PINK1 항체는 Abgent(San Diego, CA, USA)로부터 구매하였고, 항-HA, 항-c-Myc, 항-TAK1, 항-TRAF6, 항-액틴 항-유비퀴틴 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구매하였다. 이차 염소 항-IgG 및 호스래디쉬 퍼록시다제-컨쥬게이션된 항-래빗 및 항-마우스 IgGs는Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구매하였으며, 항-포스포-트레오닌 IgG, 항-플랙(Flag) 항혈청 및 재조합 인간 IL-1β는 Sigma(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 재조합 인간 IL-1 수용체 길항제(antagonist; IL-1ra)는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)으로부터 구매하였고, ECL(enhanced chemiluminescence) 시약은 Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences(Waltham, MA, USA)로부터 구매하였다. Lys63-특이적 항-유비퀴틴 항체는 Millipore(Temecula, CA, USA)로부터 얻었다. 본 연구에서 이용된 모든 다른 화합물들은 Sigma로부터 구매된 분석 등급의 상업적 산물들이다.

Myc-태깅된 야생형 hPINK1(pBOS-3X-myc-hPINK1-WT)을 인코딩하는 포유동물 컨스트럭트는 서울대학교 정종경 박사(Seoul National University, Seoul, Korea)로부터 제공되었다. 2개의 돌연변이 위치(K219A 및 D362A)를 가지는 Myc-태깅된 키나제-결핍 hPINK1 돌연변이를 포함하는 플라스미드(pBOS-3Xmyc hPINK1-KD)는 제조자의 프로토콜에 따라 QuikChangeXL 위치-지정된 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 제조되었다. PCR은 다음과 같은 프라이머들을 이용하여 실시하였다(각 프라이머의 밑줄친 부분은 돌연변이된 코돈을 표시한다): K219A 정방향 프라이머, 5'-CCCTTGGCCATCGCGATGATGTGGAAC-3'; K219A 역방향 프라이머, 5'-GTTCCACATCATCGCGATGGCCAAGGG-3'; D362A 정방향 프라이머, 5'-ATCGCGCACAGAGCCCTGAAATCCGAC-3'; 및 D362A 역방향 프라이머, 5'-GTCGGATTTCAGGGCTCTGTGCGCGAT-3'. Flag-TAK1 및 Flag-TRAF6를 인코딩하는 플라스미드들은 Giichi Takaesu 박사(Keio University, Tokyo, Japan)에 의해 친절하게도 제공되었다. GST-융합된(fused) TAK1을 인코딩하는 플라스미드는 pCMV-Flag-TAK1 벡터로부터 얻어진 TAK1을 EcoRI 및 XhoI 위치를 이용하여 pGEX4T-1 벡터로 서브클로닝하여 제조하였다.

세포 배양 및 DNA 트랜스펙션

PINK1-null(PINK1-/-) 및 대조군(PINK1+/+) 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts; MEFs) Jie Shen 박사(Harvard Medical School, Boston, USA)에 의해 제공되었으며, 제1형 IL-1 수용체(type 1 IL-1 receptor)를 안정적으로 발현하는 293 IL-1RI 세포는 G. Takaesu 박사(Keio University, Tokyo, Japan)로부터 제공되었다. HEK293(Human embryonic kidney cells) 및 PINK1-/- 및 +/+ MEF 세포는 10% FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃로 5% CO₂ 조건 하에서 배양되었다. 293 IL-1RI 세포는 10% FCS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃로 5% CO₂ 조건 하에서 배양되었다. DNA 트랜스펙션은 제조자의 프로토콜에 따라 LipofectAMINE PLUS 시약을 이용하여 실시하였다. 개별 시료에서 트랜스펙션에 이용된 DNA의 총 양은 공벡터 DNA를 이용하여 조절되었다.

DNA 트랜스펙션 및 RNA 간섭

인간 PINK1(GenBank Accession Number, AB053323.1; 서열목록 제1서열) mRNA 서열(5'-GAAAUCCGACAACAUCCUUUU-3'; 서열목록 제3서열)에 대한 인간 PINK1에 상응하는 siRNAs 및 포유동물 상동체가 알려지지 않은 음성 대조군(NT-siRNA; siCONTROL Non-Targeting siRNA #1)은 Bioneer(Seoul, Korea)로부터 구매하였다. 293 IL-1RI 세포로의 siRNA 트랜스펙션은 제조자의 지시에 따라 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)을 이용하여 실시하였다.

면역침전 및 웨스턴 블랏 분석

세포는 냉장(ice-cold) PBS(phosphate-buffered saline)으로 두 번에 걸쳐서 세척하고 1% Nonidet P40 용해 완충액(lysis buffer; 50 mM Tris(pH 7.5), 1% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM Na₃VO₄, 1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml aprotinin, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10 mM NaF 및 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)에 수거한 후, 간단히 소니케이션시켰다. 용해물은 4℃에서 13,000 x g로 20분 동안 원심분리시켰다. 면역침전을 위해, 1 μg의 적정한 항체가세포 용해 완충액으로 준비된 0.5-1 mg의 세포 추출물과 4℃에서 하룻밤 동안 반응되었다. 단백질 A-세파로오스 비드가 1:1로 혼합된 30 μl의 현탁액이 첨가되어 부드럽게 로테이션시키면서 4에서 2시간 동안 반응하였다. 상기 비드는 4℃에서 10,000 x g로 30초 동안 원심분리시켜 펠렛팅하고 1% Nonidet P40 용해 완충액으로 세 번에 걸쳐서 세척하였다. 면역복합체(Immunocomplexs)를 SDS-PAGE 시료 완충액(sample buffer) 내에서 끓여서 해리시킨 후, SDS-PAGE 젤에 분리하여 나이트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 이후, 상기 막을 5% 탈지 분유(nonfat dry milk)를 포함하는 TBST 완충액(20 mM Tris(pH 7.5), 137 mM NaCl 및 0.1% Tween 20)으로 상온에서 1시간 동안 블롯킹시키고 3% 탈지분유 및 적절한 1차 항체를 포함하는 TBST 완충액으로 4에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 막을 TBST 완충액으로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, 적절한 2차 IgG-커플된 호스래디쉬 퍼록시다제 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 막을 TBST 완충액으로 세 번에 걸쳐서 세척시키고 시그널들을 ECL 시약으로 시각화시켰다.

면역세포화학 분석

DNA 트랜스펙션 후, 세포는 냉장 PBS(pH 7.4)로 두 번에 걸쳐서 세척하고 PBS에 녹여진 3.7% 포름알데하이드로 15분 동안 고정시킨 후, 0.2% Triton X-100으로 20분 동안 투과화시키고 1% BSA(bovine serum albumin)으로 30분 동안 블랏킹시켰다. 최종적으로, 상기 블랏킹된 세포는 적절한 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS로 세척시킨 후, 상기 세포는 FITC- 또는 TRITC-컨쥬게이션된 2차 항체와 2시간 동안 반응시켰다. 특별한 경우에, 시료들은 SlowFade Antifade kit(Invitrogen)를 이용하여 DAPI(4, 6-diamidino-2-phenylindole)로 염색되었다. 고정된 세포는 LSM-510 META 공초점 현미경(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)을 이용하여 시각화하였다.

인 비트로 PINK1 키나제 어세이

293 IL-1RI 세포는 Myc-태깅된 hPINK1-WT 또는 hPINK1-KD 돌연변이로 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. 상기 세포는 1% Nonidet P40 용해 완충액으로 용해시키고 용해물은 항-Myc 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 면역침전시켰다. 이후, 상기 항-Myc 면역복합체는 키나제 반응 완충액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT) 내 박테리아에서 발현된 2 μg의 GST-TAK1, 6 mM ATP 및 포스파타제 억제제들과 최종 용량 50 μl로 30에서 2시간 동안 반응시킨 후, 상기 반응 산물은 항-포스포트레오닌 항체로 면역 블랏팅하여 분석하였다.

루시퍼라제 리포터 어세이

HEK293, 293 IL-1RI, 그리고 PINK1+/+ 및 -/- MEF 세포들을 웰 당 3 x 10⁵ 세포 밀도로 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양시켰다. NF-κB-의존성 반딧불이 루시퍼라제 리포터 및 이펙터 플라스미드를 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 플라스미드와 함께 세포에 공동-트랜스펙션시켰다. 48시간 동안 트랜스펙션시킨 후, 세포를 수동성 용해 완충액(passive lysis buffer; Promega, Madison, WI, USA)으로 수거하고 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)을 이용하여 루시퍼라제 어세이를 실시하였다. 상대적인 루시퍼라제 활성은 반딧불이 루시퍼라제 활성을 레닐라 루시퍼라제 활성으로 나누어서 산출되었다. 데이터는 세 쌍(triplicate)으로 실시된 3개의 독립적인 실험들을 표시한 결과였다.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)

세포가 특정 조건 하에서 지정된 시간 동안 배양된 후, 배지 내 배출된 IL-8의 양은 제조자의 지시에 따라 상업적으로 유용한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(Biosource International, Camarillo, CA, USA)를 이용하여 결정하였다.

IL-8 mRNA 발현 분석을 위한 실-시간(real-time) PCR

총 RNA는 임의적 헥사머 및 바이러스 역전사 효소(reverse transcriptase; Promega)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 상기 cDNA는 10 pg/ml의 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 SYBR Green 실-시간 PCR 마스터 믹스(Toyobo Co. Ltd., Osaka. Japan)와 반응시키고 Light-Cycler PCR system(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)을 이용하여 증폭하였다. 각각 IL-8 및 -액틴을 증폭하기 위한 인간-특이적 프라이머는 다음과 같았다: IL-8 정방향 프라이머, 5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3'; 역방향 프라이머, 5'-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCT-3'; 및 β-액틴 정방향 프라이머, 5'-ACCAACTGGGACGACATGGAG-3'; 역방향 프라이머, 5'-GTGAGGATCTTCATGAGGTAGTC-3'. 상술한 프라이머들은 IL-8의 경우 297-bp 산물을, 내적 대조군으로 기능하는 β-액틴의 경우 349-bp PCR 산물을 생산하였다.

통계 분석

통계적 차이는 Tukey post test와 함께 일원분산분석(one-way ANOVA)으로 결정되었다. 모든 값들은 평균±표준편차(S.D.)로 표시되었다.

실험결과

PINK1 는 포유동물 세포에서 TRAF6 및 TAK1 와 상호작용한다

PINK1의 기능적 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 베이트(bait)로서 전장 PINK1을 이용하는 이스트 투-하이브리드(yeast two-hybrid) 어세이를 실시하였다. 5 x 10⁶개의 인간 태아 뇌 cDNA 라이브러리 클론들을 스크리닝한 결과, 이전에 보고된 PINK1-결합 파트너들(예컨대, parkin[20]) 뿐 아니라 알려지지 않은 파트너들(예컨대, TRAF6 및 TAK1)이 동정되었다(결과를 보이지 않음). TRAF6는 IL-1R 복합체의 업스트림 어댑터 분자로, TAK1의 다운스트림 유비퀴틴화 및 IL-1β-유도된 염증성 시그널링의 활성화를 담당하는 유비퀴틴 E3 리가제로서 기능한다. 또한, MAP3K 패밀리의 한 멤버이고 TRAF6 시그널링의 다운스트림 구성성분인 TAK1은 IL-1β- 및 TNF-매개된 시그널링 동안 JNK, p38 및 IB 키나제(IKK)의 활성화에 중요한 기능을 한다[21]. 이후, 본 발명자들은 IL-1β-매개된 염증성 시그널링 경로의 조절에 초점을 맞춰 PINK1과 TRAF6 및 TAK1 간의 상호작용 및 이들의 기능적 중요성을 조사하였다. 먼저, 본 발명자들은 PINK1이 포유동물 세포에서 TRAF6와 결합하는 지 여부를 조사하기 위해 공동-면역침전(coimmunoprecipitation) 어세이를 이용하였다. HEK293 세포가 Myc-태깅된 PINK1 및 V5-태깅된 TRAF6로 공동-트랜스펙션된 후, 항-Myc 항체를 이용하여 세포 용해물의 면역침전을 실시하고 항-V5 항체로 면역 블롯팅 분석을 실시하였다. 도 1a에서 볼 수 있듯이, HEK293 세포에 일과성으로 트랜스펙션된 PINK1은 TRAF6과 선택적으로 결합한다. 또한, 이전의 보고들에서 나타난 결과들과 일치하게도 PINK1은 2개의 밴드들로 검출되었다(도 1a)[3, 4].

내인성(endogenous) PINK1가 내인성 TRAF6와 결합하는 지 여부를 확인하기 위해, 항-PINK1 IgG를 이용하여 HEK293 세포 용해물에서 면역침전을 실시한 후 항-TRAF6 항체로 면역 블롯팅 분석을 실시하였다. 도 1b에서 확인할 수 있듯이, 내인성 PINK1은 내인성 TRAF6와 상호작용한 반면에 대조군인 전면역(preimmune) IgG로 제조된 항-면역복합체 시료들에서는 어떠한 상호작용 밴드도 검출되지 않았다. 상기 결과는 PINK1과 TRAF6 간의 특이적인 상호작용이 DNA 트랜스펙션의 오류(artifact)가 아니라 포유동물 시스템에 존재하는 상호작용이라는 것을 의미한다. 더 나아가, 면역세포화학 분석은 내인성 PINK1가 내인성 TRAF6와 주로 HEK293 세포의 세포질 부위에서 공동-위치한다(co-localizes)는 것을 확인시켜 주었다(도 1c).

다음으로, 본 발명자들은 공동-면역침전/면역 블롯팅 어세이를 이용하여 포유동물 세포에서 PINK1이 TAK1과 결합하는 지 여부를 조사하였다. HEK293 세포가 Myc-PINK1 및 Flag-TAK1으로 일과성으로 트랜스펙션된 후, 세포 용해물로부터 얻어진 항-Myc 면역침전물(immunoprecipitates)이 항-Flag 항체를 이용하여 면역 블롯팅되었다. 도 1d에서 볼 수 있듯이, 일과성으로 과다발현된 PINK1이 HEK293 세포에서 TAK1과 선택적으로 결합하였다. 유사한 실험에서, 본 발명자들은 내인성 PINK1이 포유동물 세포에서 내인성 TAK1과 상호작용하는 지 여부를 평가하였다. 항-TAK1 면역복합체에 대한 항-PINK1 IgG의 면역 블롯팅 분석은 내인성 PINK1이 HEK293 세포에서 내인성 TAK1과 결합한다는 것을 보여줬다(도 1e). 상기 특이적인 상호작용은 비-특이적 IgG로 실시한 면역침전에서는 검출되지 않았다. 마지막으로, 면역세포화학 분석은 내인성 PINK1이 내인성 TAK1과 주로 HEK293 세포의 세포질에서 공동-위치한다는 것을 보여줬다(도 1f).

종합해 보면, 상술한 결과들은 PINK1이 포유동물 세포에서 TRAF6 및 TAK1과 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.

PINK1 과 TRAF6 / TAK1 간의 상호작용은 IL -1β 자극 하에서 증가한다

이후, 본 발명자들은 PINK1과 TRAF6 간의 산호작용이 IL-1β 자극에 의해 변화하는 지 여부를 탐구하였다. 본 발명자들은 제I형 IL-1β 수용체를 안정적으로 발현하는 293 IL-1RI 세포를 이용하였는데[22], 이로 인해 상기 세포는 IL-1β 자극에 대해 보다 더 높은 반응성을 나타낸다. Myc-PINK1 및 V5-TRAF6의 공동-트랜스펙션 후, 293 IL-1RI 세포에 IL-1β를 처리하였다. 항-Myc 면역복합체에 대한 항-V5 항체를 이용한 면역 블롯팅 분석은 IL-1β 자극이 PINK1와 TRAF6의 결합(association)을 유도한다는 것을 보여줬다(도 2a). 또한, 상기 복합체의 형성은 IL-1β 자극 후 30분 동안 꾸준히 증가하고 그 이후에 감소하였는데(도 2a), 이는 PINK1이 IL-1β-유도된 다운스트림 시그널링에서 PINK1-TRAF6 복합체의 일시적 형성을 통해 TRAF6의 기능에 영향을 미친다는 것을 의미한다.

다음으로, 본 발명자들은 PINK1와 TAK1 간의 결합(association)이 IL-1β 자극에 의해 영향받는 지 여부를 조사하였다. 세포가 Myc-PINK1 및 Flag-TAK1으로 트랜스펙션시키고 동일한 방식으로 IL-1로 자극된 후, 항-Myc 면역복합체에 대한 항-Flag 항체를 이용한 면역 블롯팅 결과는 PINK1은 293 IL-1RI 세포에서 IL-1β 자극의 부재 하에서 TAK1과 결합한다는 것을 확인시켰다(도 2b). 더 나아가, IL-1β의 첨가가 PINK1와 TAK1의 상호작용을 야기하였는데, 상기 상호작용은 10분에 최대치에 도달하였으며 자극 후 60분까지 차츰 감소하였다(도 2b).

종합해 보면, 상술한 결과들은 PINK1의 TRAF6 및 TAK1에 대한 PINK1의 결합은 IL-1β 자극 하에서 실질적으로 증가한다는 것을 보여준다.

TRAF6 의 자가다이머화는 PINK1 과다발현에 의해 상향-조절된다

TRAF6의 자가다이머화(autodimerization)가 Lys63-의존성 자가폴리유비퀴틴화(autopolyubiquitination)를 초래하여 IL-1R 관여(engagement)로 이어진다는 사실이 잘 알려져 있는데, 이는 TRAF6의 유비퀴틴 리가제 활성이 다이머화 및/또는 올리고머화(oligomerization)에 의해 활성화된다는 것을 의미한다[23, 24]. 이에, PINK1이 TRAF6의 자가다이머화를 촉진하는 지 여부를 테스트하기 위해, 293 IL-1RI 세포가 PINK1의 존재 또는 부존재 하에서 FLAG-태깅된 및/또는 V5-태깅된 TRAF6로 트랜스펙션된 후, IL-1β로 자극시켰다. 항-FLAG 면역복합체에 대한 항-V5 항체를 이용한 면역 블롯팅 분석은 TRAF6가 PINK1의 부존재 하에서 약하게 자가다이머화한다는 것을 보여줬다(도 3a). 하지만, PINK1의 과다발현은 IL-1β 처리에 따라 293 IL-1RI 세포에서 TRAF6 자가다이머화의 촉진(potentiation)을 초래하였다(도 3a).

다음으로, 본 발명자들은 TRAF6의 다이머화가 IL-1 처리에 따라 활성화되는 PINK1의 키나제 활성에 의존적인 지 여부를 조사하였다. Myc-태깅된 야생형 PINK1 또는 이의 우성-음성(dominant negative) 돌연변이가 FLAG- 및 V5-태깅된 TRAF6와 함께 293 IL-1RI 세포에 도입된 후, 항-V5-항체로세포 용해물에 대한 면역침전이 실시되었다. 항-Flag 항혈청으로 실시한 면역 블롯팅 분석은 TRAF6 자가다이머화가 야생형 PINK1의 존재 하에서 2.6배까지 증가한 반면에(도 3b), 상기 증가는 우성-음성 PINK1 돌연변이의 존재 하에서는 일어나지 않는다는 것을 보여줬다. 상술한 결과들은 PINK1가 TRAF6 자가다이머화를 양성적으로 조절한다는 것을 보여주고, 이는 PINK1의 키나제 활성에 의존적인 것으로 보인다.

PINK1 은 TRAF6 의 자가유비퀴틴화를 자극한다

IL-1 시그널링에 있어서 TRAF6 유비퀴틴화의 중요성을 고려하여[23], 본 발명자들은 TRAF6 자가다이머화를 증가시킨 후에 PINK1가 TRAF6의 폴리유비퀴틴화를 촉발시킬 수 있는 지 여부도 조사하였다. 본 발명자들은 V5-TRAF6 및 HA-유비퀴틴을 Myc-PINK1와 함께 또는 Myc-PINK1 없이 HEK293 세포에 공동-트랜스펙션시키고 PINK1의 존재 또는 부존재 하에서 TRAF6의 유비퀴틴화 패턴을 비교하였다. 도 4a에서 볼 수 있듯이, 세포 용해물의 인 비보 유비퀴틴화 어세이는 PINK1의 존재가 TRAF6 유비퀴틴화를 현저하게 증가시켰다는 것을 보여줬다. TRAF6 폴리유비퀴틴화에 대한 PINK1의 양성 효과는 투여량-의존적인 것으로 나타났다(도 4b). 더욱이, 야생형 PINK1은 TRAF6 유비퀴틴화를 촉진하였으나 키나제-결핍 PINK1 돌연변이는 이를 촉진하지 않았다(도 4c). 상술한 결과들은 PINK1이 TRAF6의 자가유비퀴틴화(autoubiquitination)를 자극한다는 것을 의미한다.

이후, 본 발명자들은 PINK1-유도된 Lys63-의존성 TRAF6의 자가유비퀴틴화의 증가가 PINK1-/- 및 PINK1+/+ MEF 세포에서 IL-1β-자극된 TRAF6의 유비퀴틴화의 정도와 비교함으로써 생리학적 조건 하에서 실질적으로 발생하는 지 여부를 조사하였다. V5-TRAF6로 PINK1-/- 및 +/+ MEF 세포가 일과성으로 트랜스펙션된 후, 항-V5 항체를 이용하여 세포 용해물의 면역침전을 실시하고 항-Lys63-특이전 유비퀴틴 항체로 면역블롯팅을 실시하였다. 도 4d에서 확인할 수 있듯이, PINK1-/- MEF 세포에서 TRAF6 유비퀴틴화는 IL-1β 자극 10분 이후에 약간 증가한 후 감소하였다(도 4d). 이와 대조적으로, TRAF6 자가유비퀴틴화는 PINK1+/+ MEF 세포에서 IL-1β 자극에 의해 현저하게 증가하였으며 상기 증가는 IL-1β 자극 후 30분 동안 유지되었다. 종합해 보면, 상술한 결과들은 PINK1이 HEK293 및 293 IL-1RI 세포 뿐 아니라 PINK1-/- 및 PINK1+/+ MEF 세포에서 TRAF6의 자가다이머화 및 Lys63-의존성 자가유비퀴틴화를 촉진함으로써 TRAF6 활성을 증가시킨다는 것을 의미한다.

PINK1 은 TRAF6 - TAK1 복합체의 형성을 증가시킨다

IRAK1 및 TRAF6의 Lys63-연결된 폴리유비퀴틴화는 TAK1 및 IKK 복합체의 회귀를 촉진시킨다[24]. 이후, TAK1은 E2 효소인 Ubc13-Uev1A의 도움으로 TRAF6의 유비퀴틴 타겟이 된다. 또한, IL-1β 처리는 TAK1 촉매 활성(catalytic activity) 활성화의 중요한 단계인 TRAF6 복합체로의 내인성 TAK1의 회귀를 유도하고 이후에 NF-B 및 MAPK 활성화를 자극한다. 상술한 이전의 발견들을 토대로, 본 발명자들은 PINK1이 IL-1β 자극 하에서 TAK1-TRAF6 복합체의 형성에 영향을 미치는 지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 293 IL-1RI 세포에 Myc-PINK1와 함께 또는 Myc-PINK1 없이 V5-TRAF6 및 Flag-TAK1를 일과성으로 트랜스펙션시켰고, 상기 세포에 IL-1β를 처리하였다. 항-V5 항체를 이용한 항-Flag 면역복합체의 면역 블롯팅 분석은 TRAF6-TAK1 복합체가 IL-1β 자극의 부존재 하에서 형성된다는 것을 나타냈다(도 5a). 또한, 본 발명자들은 IL-1β가 TRAF6-TAK1 상호작용의 정도를 증가시키는 반면에, PINK1 발현이 대조군과 비교하여 상기 복합체의 형성을 보다 높은 레벨로 증가시키고 IL-1β 자극 이후에 상기 복합체를 보다 안정적으로 유지시킨다는 것을 발견하였다(도 5a). 더 나아가, TAK1에 대한 TRAF6의 결합(association)은 PINK1의 부존재 하에서 10분에 최대에 이르고 IL-1β 자극 후에 30분 동안 지속되는 반면에, PINK1의 존재 하에서는 IL-1β 자극 후에 60분까지 안정적으로 유지되었다(도 5a).

PINK1이 내인성 TAK1에 대한 내인성 TRAF6의 결합을 실질적으로 자극하는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 PINK1-/- 및 PINK1+/+ MEF 세포에서 IL-1β 자극에 대한 반응으로 상기 단백질 복합체의 형성 패턴 및 레벨을 비교하였다. 2종류의 MEF 세포에 50 ng/ml의 IL-1β를 처리하고 항-TAK1 항체를 이용하여 세포 용해물의 면역침전을 실시하였다. 항-TRAF6 항체를 이용한 상기 복합체의 면역블롯팅 분석은 상기 결합이 IL-1β 자극의 부존재 하에서조차 일어난다는 것을 보여줬다(도 5b). 또한, 내인성 TRAF6가 PINK1-/- MEF 세포에서 보다 PINK1+/+ MEF 세포에서 IL-1β 자극 10분 후에 내인성 TAK1과 보다 강력하게 결합하였다(도 5b). 종합해 보면, 상술한 결과들은 PINK1이 TRAF6와 TAK1의 상호작용을 증가시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링을 촉진한다는 것을 나타낸다.

PINK1 TAK1 의 폴리유비퀴틴화를 촉진시킨다

최근에, 여러 연구자 그룹들은 Lys63-연결된 TAK1의 폴리유비퀴틴화가 특정(proper) TNF-α, IL-1 및 TGF-β 시그널링에 필요하다는 것을 보였다[25, 26].

TRAF6에 의해 촉매되는 Lys-34 위치에서의 TAK1 폴리유비퀴틴화는 TAK1 키나제 활성을 활성화시킨다. 하지만, TAK1이 NF-κB을 활성화시키는 생리학적 자극들에 대한 반응으로 유비퀴틴화되는 지 여부는 불분명한 상태이고, 만약 그렇다면 사이토카인-유도된 염증성 시그널링 동안 TAK1 유비퀴틴화의 기능적 역할이 무엇인지는 알려져 있지 않다. 상기 의문점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 PINK1이 TAK1 폴리유비퀴틴화를 촉진하는 지 여부를 우선적으로 조사하였다. HEK293 세포에 Myc-PINK1, Flag-TAK1, V5-TRAF6 또는 HA-유비퀴틴을 단독으로 또는 조합하여 트랜스펙션시킨 후, 세포 용해물은 항-Flag IgG로 면역침전시키고 상기 면역복합체는 HA 택(tag)에 대한 항체로 면역 블롯팅을 실시하여 분석하였다. 이전에 보고된 바와 같이, TRAF6 과다발현은 TAK1 폴리유비퀴틴화의 증가를 야기하였다(도 6a). 또한, PINK1은 TAK1 폴리유비퀴틴화의 상향-조절(up-regulation)을 초래하였다. 더 나아가, TRAF6과 PINK1이 모두 트랜스펙션된 경우는 상기 분자 단독으로 트랜스펙션된 경우보다 TAK1 폴리유비퀴틴화를 더욱 극적으로 증가시켰다(도 6a). TAK1 폴리유비퀴틴화 상의 상기 현저한 효과는 키나제-결핍 PINK1 돌연변이에서는 관찰되지 않았다(도 6b).

이후, 본 발명자들은 PINK1이 생리학적 자극에 대한 반응으로 내인성 TAK1의 Lys63-연결된 폴리유비퀴틴-컨쥬게이션을 촉진할 수 있는 지 여부를 탐구하였다. PINK1+/+ MEF 세포에 IL-1β를 첨가한 경우, 자극 후 30분 째에 최대에 이르는 TAK1의 Lys63-의존성 폴리유비퀴틴화의 증가가 나타났다. 하지만, TAK1 폴리유비퀴틴화는 IL-1β-처리된 PINK1-/- MEF 세포에서 증가 없이(without a peak) 매우 감소하였다(도 6c). 상술한 데이터는 PINK1이 IL-1β 시그널링에서 TAK1의 키나제 활성을 증가시킴으로써 TAK1을 조절한다는 것을 의미한다.

PINK1 은 TAK1 자가인산화를 증가시킨다

다음으로, 본 발명자들은 정상적인(basal) TAK1 활성 및 IL-1β-유도된 TAK1 활성 상에 PINK1 과다발현의 효과를 조사하였다. 293 IL-1RI 세포가 목(mock)-트랜스펙션되거나 또는 Myc-태깅된 PINK1으로 트랜스펙션된 후, IL-1β를 처리하였다. TAK1 활성이 Thr187 위치의 인산화 상태와 밀접하게 연과되어 있다[27, 28]는 이전 보고들과 일치하게도, 포스포-특이적 TAK1(Thr187) 항체를 이용한 면역 블롯팅 분석은 IL-1β의 부존재 하에서는 어떠한 유의한 TAK1의 활성화를 보이지 않는다는 것을 보여줬다. IL-1β의 첨가는 293 IL-1RI 세포에서 TAK1 활성의 현저한 유도를 초래하였는데, 자극 후 30분 째에 최대치에 이르렀다. 무엇보다도, PINK1 과다발현은 기본(baseline) TAK1 활성을 증가시켰으며, IL-1β-유도된 TAK1 활성의 정도를 3.6배까지 증대시켰다(도 7a). 이후, 본 발명자들은 PINK1-특이적 RNAi를 이용하여 TAK1 활성의 조절에 있어 PINK1의 생리학적 중요성을 조사하고자 하였다. 대조군 세포에서, PINK1-siRNA는 PINK1 단백질 레벨을 효과적으로 감소시켰다(도 7b). IL-1β 자극 후, 포스포-TAK1 항혈청을 이용한 면역 블롯팅 분석은 비-타겟팅 siRNA가 처리된 대조군 세포에서 30분까지 TAK1 활성이 증가되어 유지된다는 것을 보여줬다(도 7b). 하지만, PINK1-siRNA-처리된 세포에서 TAK1 활성은 현저하게 감소되었고 일시적으로만 유지되었다(도 7b). PINK1의 넉-다운(knock-down) 효과 이 외에도, 본 발명자들은 PINK1-/- 및 +/+ MEF 세포를 이용하여 TAK1 인산화가 내인성 PINK1에 의해 영향받는 지 여부를 추가적으로 확인하였다. 2개의 세포 용해물에 대한 면역 블롯팅 분석을 통해, 본 발명자들은 TAK1 인산화가 PINK1-/- MEF 세포와 비교하여 PINK1+/+ MEF 세포에서 현저하게 증가하였음을 확인하였다(도 7c).

TAK1 이 외에도, 본 발명자들은 PINK1이 IL-1β에 대한 반응에서 TRAF6의 인산화를 자극하는 지 여부를 조사하였다. 293 IL-1RI 세포에 V5-TRAF6, Myc-hPINK1-WT 또는 Myc-hPINK1-KD를 단독 또는 조합하여 42시간 동안 트랜스펙션시키고 IL-1β를 15분 동안 처리한 후, 세포 용해물을 항-V5로 면역침전시켰다(도 8). 항-포스포-트레오닌 항체를 이용한 상기 복합체의 면역 블롯팅 분석은 TRAF6의 인산화된 형태의 크기에 상응하는 TRAF6 밴드 상의 뚜렷한 증가가 나타나지 않았음을 확인시켜 주었다(도 8). 상술한 데이터는 PINK1이 TRAF6 인산화 상에 어떠한 효과도 가지지 않는다는 것을 의미한다.

전체적으로, 상술한 데이터는 PINK1이 TAK1 인산화의 상향-조절을 통해 TAK1 활성화에 중요한 기능을 한다는 것을 제시한다.

PINK1 은 인 비보에서 TAK1 을 직접 인산화시킨다

본 발명자들은 PINK1의 키나제 활성이 TRAF6 및 TAK1의 양성적 조절에 필요한 지 여부를 조사하였다. 먼저, 본 발명자들은 hPINK1-KD가 IL-1β 처리 조건에서 TRAF6 또는 TAK1과 여전히 결합할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 세포에 Flag-TRAF6을 단독으로 또는 Myc-hPINK1-WT 또는 Myc-hPINK1-KD 돌연변이와 함께 트랜스펙션시킨 후, 항-Myc 항혈청을 이용한 항-Flag 면역복합체의 면역 블롯팅 분석 결과, 본 발명자들은 키나제-결핍 PINK1 돌연변이가 야생형 PINK1과 비교하여 유사한 정도로 TRAF6 및 TAK1과 결합한다는 것을 확인하였다(도 9a 및 도 9b).

PINK1이 TAK1의 인산화를 자극하고(도 7a) TRAF6의 인산화에는 관여하지 않는다(도 8)는 발견에 기초하여, 본 발명자들은 인 비트로 키나제 어세이를 이용하여 PINK1이 TAK1을 직접적으로 인산화시키는 지 여부를 추가적으로 조사하였다. 세포에 Myc-hPINK1-WT 또는 Myc-hPINK1-KD을 트랜스펙션시키고 IL-1β를 처리한 후, 항-Myc-PINK1 면역복합체는 박테리아에서 발현된 GST-융합 재조합 TAK1과 반응시켰다. 항-포스포-트레오닌 항혈청을 이용한 반응 혼합물의 면역 블롯팅 분석을 통해, 본 발명자들은 야생형 PINK1의 존재 하에서 인산화된 GST-TAK1의 크기에 상응하는 명확한 밴드가 나타남을 확인하였다(도 10). 대조군으로서, 포스포-TAK1 밴드는 키나제-결핍 PINK1 돌연변이의 존재 하에서 완벽하게 사라졌는데(도 10), 이는 PINK1이 TAK1을 직접 인산화시킨다는 것을 의미한다. 종합해 보면, 상술한 데이터는 PINK1이 TAK1의 직접적인 인산화를 통해 TAK1 활성 조절에서 양성적인 효과를 나타낸다는 것을 제시해 준다.

PINK1 은 IL -1β에 대한 반응에서 NF -κB 활성화 및 IL -8 생산을 촉발시킨다

TAK1이 TNFR1-, IL-1R- 및 TLR-유도된 NF-κB 활성화에 필수적이라는 발견[25, 26]에 기반하여, 본 발명자들은 IL-1β 자극의 부존재 또는 존재 하에서 NF-κB 활성에 미치는 PINK1의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 NF-κB 루시퍼라제 리포터 유전자 어세이를 이용하여, PINK1이 293 IL-1RI 세포에서 NF-κB의 활성을 현저하게 증가시킨다는 것을 발견하였다(도 11a). 또한, 야생형 PINK1은 IL-1β 자극에도 불구하고 투여량-의존적으로(결과를 보이지 않음) NF-κB를 자극하였다(도 11a). PINK1-유도된 NF-κB 활성의 상향-조절이 IL-1R-의존성 시그널링 경로를 경유하여 일어나는 지 여부를 추가적으로 확인하기 위해, 본 발명자들은 PINK1 기능(action) 상에 IL-1ra(interleukin-1 receptor antagonist)의 효과를 테스트하였다(도 11a). Myc-PINK1-WT 또는 Myc-PINK1-KD로 트랜스펙션시킨 후, 세포에 IL-1ra를 단독으로 또는 IL-1β와 함께 처리하였다. 도 11a에서 볼 수 있듯이, IL-1ra의 첨가는 IL-1β 처리 하에서 PINK1의 촉진 효과를 억제하였다. 이전의 발견과 일치하게도, 키나제-결핍 PINK1 돌연변이는 IL-1β에 대한 NF-κB 반응을 활성화시키지 않았다(도 11b). 상술한 결과들은 PINK1이 NF-κB 활성을 양성적으로 조절하고 상기 조절은 PINK1의 키나제 활성과 밀접하게 연관되어 있다는 것을 의미한다.

마지막으로, 본 발명자들은 IL-1R 시그널링 상에 PINK1의 양성적 효과가 IL-1β 자극의 부존재 또는 존재 하에 293 IL-1RI 세포에서 IL-8 같은 염증성 사이토카인의 생산 및 이후의 배출로 이끄는 지 여부를 조사하였다. IL-1R 시그널링의 업스트림 구성성분에 대한 PINK1의 자극 효과와 일치하게도, PINK1은 실-시간 PCR로 확인한 바와 같이 IL-8 mRNA의 레벨을 증가시킬 뿐 아니라(도 11c), ELISA에서 보여지듯이 IL-8 단백질의 배출을 촉진하였다(도 11d). 상술한 결과들은 PINK1이 IL-1β 시그널링의 양성 조절자로서 기능하여 IL-1β 자극에 대한 반응에서 염증성 사이토카인의 상향-조절을 초래한다는 것을 의미한다.

추가논의사항

도파민 뉴런의 손실은 미세아교세포의 활성화, 성상교세포증 및 림프구 침윤 같은 염증의 징후들과 연관되어 종종 관찰된다[10, 11]. 더 나아가, 활성화된 미세아교세포 및 산화질소(NO), 활성산소종(reactive oxygen species, ROS), IL-1β, TNF-α, IL-6 및 케모카인을 포함하는 친염증성 매개인자들은 PD 환자의 부검 조직 중 흑질 및 PD 동물 모델로부터 얻어진 뇌 조직에서 관찰되었다. 또한, 인 비보 연구들은 PD 환자의 혈청 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)은 증가된 레벨의 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 뿐 아니라 높은 레벨의 IL-1β, TNF-α 및 IL-2을 가진다는 것을 증명하였는데[29, 30], 이는 림프구의 말초성 활성화(peripheral activation)를 의미한다. 상술한 염증성 이벤트들은 다음의 보고들에 기반하여 PD의 발병 과정에 직접적으로 기여하는 것으로 생각되고 있다. 미세아교세포의 마비를 유도하는 미노사이클린(minocycline)의 투여는 MPTP-처리된 동물에서 도파민 뉴런의 손실을 감소시키고 PD의 증상을 개선시킨다[31]. PD의 다른 동물 모델에서, TLR4의 리간드인 리포폴리사카라이드(LPS)의 두개강 내 주입은 염증을 활성화시켜 도파민 뉴런의 소실을 유도한다는 것이 알려져 있었다[32]. 상술한 보고들은 뇌 염증과 PD 발병 과정 간의 밀접한 관계를 증명한다. 하지만, 포함된 상세한 기작 및 시그널링 경로는(들은) 확실하게 알려져 있지 않다. 본 발명자들의 연구는 가족성 PD와 연관되어 있는 PINK1이 IL-1β-개시된 다운스트림 시그널링 및 염증성 이벤트들에 영향을 미친다는 증거를 제공한다. 본 발명자들은 PINK1이 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로의 2개의 멤버인 TRAF6 및 TAK1와 직접 상호작용하고 이들의 활성화를 양성적으로 조절하여 IL-1β-매개된 사이토카인 생산의 증대를 초래한다는 것을 보인다.

여러 PD-관계된 유전자 산물들도 염증성 시그널링 이벤트들과 일정 정도 연관되어 있다고 알려져 있다. 예를 들어, parkin은 미세아교세포를 직접적으로 활성화시키고 도파민-생산 뉴런에 신경독성을 가진다[33]. 활성화된 후, 미세아교세포는 선천성 면역 반응(innate immune response)을 촉진시키는, 염증성 사이토카인, 케모카인, 프로스타글란딘 및 류코트리엔(leukotrienes)을 포함하는 매우 많은 염증성 매개인자들, NO, ROS 및 글루타메이트를 생산한다. 또한, α-시뉴클레인(synuclein)은 PD에서 염증의 개시인자로 기능할 수 있다. 비록 α-시뉴클레인-포함 응집체(aggregates)가 세포 내에서 형성될 지라도, 본 발명자들은 이전에 α-시뉴클레인이 세포 외에서 검출될 수 있다는 것을 확인하였다[34]. 세포로부터 α-시뉴클레인의 배출을 담당하는 기작들이 완전히 이해되지 않을 지라도, 세포 외 α-시뉴클레인은 미세아교세포를 활성화시키고 친염증성 매개인자들의 생산을 유도하는데[35], 이는 α-시뉴클레인 병리학과 잠재적인 병원성 염증성 반응의 개시 간의 타당한 연결점을 제공한다. 더 나아가, 낮은-투여량의 LPS의 만성 투여는 흑질 내 DA 뉴런의 지연된 퇴행 및 선택적 퇴행이 발병되는 parkin-결핍 마우스의 흑질에서 신경염증성 반응 및 산화적 스트레스 반응을 유사한 정도로 유도한다. 또한, 기본 및 염증성 사이토카인-유도된 NF-κB 활성은 PINK1-결핍 MEF 세포에서 감소된다[36, 37]. 본 발명의 연구는 PINK1와 TRAF6 및 TAK1 간의 직접적인 상호작용에 대한 추가적인 증거를 제공하고 상기 상호작용은 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링의 양성적 조절을 초래한다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명자들은 PINK1이 TAK1을 직접 인산화시키지만(도 10) TRAF6를 인산화시키지 않는다(도 8)는 것을 발견하였다. 하지만, PINK1과 TRAF6 간의 상호작용은 PINK1의 키나제 활성에 의존적이지 않고 키나제-결핍 PINK1 돌연변이는 여전히 TRAF6와 결합한다(도 9a). 야생형 PINK1의 키나제-결핍 돌연변이가 아니라 야생형 PINK1은 IL-1β 처리에 대해 TRAF6의 자가-다이머화 또는 자가-유비퀴틴화를 증가시킨다는 본 발명의 발견 및 이전의 관찰에 기반하여, 본 발명자들은 키나제-부재(kinase-dead) PINK1 돌연변이가 아니라 야생형 PINK1에 선택적으로 결합하는 다른 동정되지 않은 단백질(들)이 TRAF6의 자가-다이머화 또는 자가-유비퀴틴화의 상향-조절에 기여할 수 있다고 추론한다. 다른 추론으로는, K219A 및 D362A의 이중 치환을 가지는 키나제-결핍 PINK1-KD 돌연변이가 여전히 TRAF6에 결합할 지라도, TRAF6와 결합 후에 PINK1의 구조 변화(conformational change)가 TRAF6 활성의 양성적 조절에 필요할 것이다. 야생형 PINK1와 비교하여, 키나제-결핍 PINK1-KD 돌연변이는 상기 과정을 적절하게 실시할 수 없어 TRAF6 활성을 자극할 수 없다.

또한, 본 발명자들은 PINK1이 사이토카인 배출을 포함하는 염증성 이벤트들에서 NF-κB 활성을 조절한다는 것을 확인하였는데, 이는 많은 다양한 PINK1의 '기능 상실(loss-of-function)' 돌연변이가 PD의 발병 과정(pathogenesis)에 기여할 수 있다는 것을 의미한다.

PINK1은 촉매성 세린-트레오닌 키나제 도메인을 가지고 인 비트로에서 자가인산화 활성을 가지지만[38], 대부분 인 비보에서 PINK1의 키나제 활설을 테스트하는 데 있어 기술적인 어려움으로 인해 PINK1의 결합 파트너 및/또는 잠재적인 기질에 대해 거의 알려져 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 재조합 PINK1은 인 비트로에서 TRAP1을 직접 인산화시키고 PINK1 과다발현은 PC12 세포에서 H₂O₂-유도된 TRAP1 인산화를 증가시킨다[5]. 또한, TRAP1 결실은 산화적 스트레스를 받은 PC12 세포에서 마이토콘드리아 사이토크롬 c 배출 및 아팝토시스를 현저하게 증가시키는 데, 이는 TRAP1이 PINK1의 기질이고 PINK1의 세포보호 활성(action)을 매개하는 핵심 구성성분으로 기능한다는 것을 의미한다. 또한, 다른 샤페론인 Cdc37/Hsp90은 PINK1과 상호작용하는 것으로 알려졌다[39]. 더 나아가, PINK1은 마이토콘드리아 막간 공간(mitochondrial intermembrane space)에 위치하는 세린 프로테아제인 HtrA2과 상호작용하여[40], 마이토콘드리아에서 PINK1-HtrA2 복합체를 형성한다. Omi/HtrA2는 손상된 마이토콘드리아로부터 세포질로 배출되어 아팝토시스 유발 단백질(pro-apoptotic proteins)을 활성화시킨다. 비록 HtrA2가 PINK1 인산화의 직접 타겟인지 여부는 불명확할 지라도, PINK1과의 상호작용은 p38 스트레스-시그널링 경로의 활성화에 대한 반응에서 HtrA2 인산화를 증가시킨다. PINK1 및 이의 다양한 결합 파트너들의 기능 외에도, 본 연구는 PINK1이 TRAF6 및 TAK1과 결합하고, 이를 통해 IL-1β-매개된 시그널링 및 다운스트림 염증성 반응을 조절한다는 것을 증명한다. 하지만, PINK1이 기질로서 TRAF6 및/또는 TAK1를 직접 인산화시키는 지 여부는 아직 확인되지 않은 상태이다.

최근에, PINK1 및 parkin이 마이토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction)을 억제하고 자식작용(autophagy)을 통해 손상된 마이토콘드리아의 분해를 촉진시킴으로써 마이토콘드리아 네트워크의 완전성(integrity)을 유지하는 공통 경로에서 기능하는 것으로 알려졌다. PINK1은 직접 parkin을 인산화시켜 세포질로부터 마이토콘드리아로의 parkin의 현격한 재분포(redistribution)를 초래하여[41], 자식작용을 통한 탈분극화된 마이토콘드리아의 선택적 제거(clearance)를 촉진시킨다[42]. 상술한 발견들과는 상충되게, 본 발명자들은 최근에 PINK1과 parkin이 서로의 안정성, 용해성 및 세포보호성 아그레좀(aggresomes)을 형성하는 경향에 영향을 미친다는 것을 증명하였다[20]. 또한, 본 발명자들은 병리학적 PD 조건 하에서 상기 서로 간의 상호작용(mutual interaction)의 기능적 관련성을 확인하였다[43]. parkin과 PINK1 사이에서 관찰된 서로 간의 상호작용의 상술한 다른 패턴은 다른 세포 내 맥락에 의해 설명될 수 있다[43]. 증가된 parkin 응집체 형성에 동반되는 PINK1 축적은 PD-모방(mimicking) 조건인 상술한 단백질들의 독특한 마이토콘드리아 위치 하에서 발생하고, 마이토콘드리아 역학 상에 이의 효과는 정상적인 세포 내 조건에서 발생할 수도 있다[43]. 상술한 전제를 지지하기 위해, 본 연구는 PINK1이 동반하는 염증성 반응에 영향을 미침으로써 PD의 발병 과정에 기여한다는 것을 보여주는 추가적인 증거를 제시한다.

PINK1의 세포 내 위치(subcellular location)와 관련하여, 많은 증거들이 마이토콘드리아 및 세포질의 공동-위치화(co-localization)를 나타내고 있다[3, 5, 7, 44]. 상술한 결과들은 전장 PINK1이 마이토콘드리아 막 포텐셜에 따라 마이토콘드리아로 전위되고(translocates) 상기 포텐셜의 파괴는 전장 PINK1의 마이토콘드리아 축적을 야기한다는 것을 의미한다. 한편, PINK1의 절단된 형태는 일차적으로 세포질에 위치한다. PINK1은 N-말단 타겟팅 모티프를 통해 마이토콘드리아 막으로 위치한다. 또한, 마이토콘드리아 위치화 시그널(mitochondria localization signal)이 결핍된 세포질 PINK1은 마우스 및 세포 배양에서 MPTP 독성에 대한 보호 기능을 나타낸다. 상술한 보고들은 모두 세포 내 위치 구획(subcellular compartment)에 따라 이중 위치를 가져 2개의 다른 기능을 가질 수 있는 PINK1을 지적하고 있다[44, 45]. 세포질에서 PINK1의 기능적 역할의 측면에서, parkin, PINK1 및 DJ-1은 세포질 내에서 주로 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있고, 상기 복합체는 신경모세포종 세포(neuroblastoma cells)에서 parkin 기질들의 유비퀴틴화 및 분해를 촉진한다[46]. 더 나아가, PINK1은 mTORC2 및 Akt의 활성화를 통해 마이토콘드리아 뿐 아니라 세포질에서 세포보호 기능을 한다[47]. 이 외에도, 본 연구는 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링에 영향을 미치는 세포질 내 PINK1의 추가적인 기능을 제공한다.

TRAF6 및 TAK1의 여러 결합 파트너들이 동정되었고 이들은 TRAF6 및 TAK1의 기능을 조절하거나 또는 기질인 것으로 알려져 있다. 예를 들어, RING 도메인 유비퀴틴 리가제 패밀리의 한 멤버인 TRAF6는 IKK와 결합하고 IKK의 Lys-63-연결된 폴리유비퀴틴화를 촉매한다[23]. TAK1은 활성화를 위해 어댑터 단백질인 TAK1-관계된 결합 단백질-1, -2 및 3(TAB1, 2 및 3)과 결합한다[48]. TAK1의 활성화를 위한 TAB1의 필요는 TAK1의 사이토카인-촉발된(evoked) 활성화가 아니라 삼투 충격(osmotic shock) 같은 세포 내 자극에 의존적인 것으로 보인다[49]. TAB2/3 단백질들도 TAK1과의 결합을 통해 동정되었으며, IL-1β 또는 TNF-α에 대한 반응에서 TAK1 활성화에 중요한 것으로 알려졌다. 상술한 단백질들 외에도, 본 연구는 PINK1이 TRAF6 및 TAK1과 결합함으로써, IL-1β-매개된 염증성 시그널링 이벤트들과 연결된다는 것을 확증한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Screening Methods of a Substance for Preventing or Treating Neurodegenerative Disorders and Pharmaceutical Compositions Using the Same <130> PN120273 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2700 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (95)..(1837) <400> 1 cgcagaggca ccgccccaag tttgttgtga ccggcggggg acgccggtgg tggcggcagc 60 ggcggctgcg ggggcaccgg gccgcggcgc cacc atg gcg gtg cga cag 109 Met Ala Val Arg Gln 1 5 gcg ctg ggc cgc ggc ctg cag ctg ggt cga gcg ctg ctg ctg cgc ttc 157 Ala Leu Gly Arg Gly Leu Gln Leu Gly Arg Ala Leu Leu Leu Arg Phe 10 15 20 acg ggc aag ccc ggc cgg gcc tac ggc ttg ggg cgg ccg ggc ccg gcg 205 Thr Gly Lys Pro Gly Arg Ala Tyr Gly Leu Gly Arg Pro Gly Pro Ala 25 30 35 gcg ggc tgt gtc cgc ggg gag cgt cca ggc tgg gcc gca gga ccg ggc 253 Ala Gly Cys Val Arg Gly Glu Arg Pro Gly Trp Ala Ala Gly Pro Gly 40 45 50 gcg gag cct cgc agg gtc ggg ctc ggg ctc cct aac cgt ctc cgc ttc 301 Ala Glu Pro Arg Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro Asn Arg Leu Arg Phe 55 60 65 ttc cgc cag tcg gtg gcc ggg ctg gcg gcg cgg ttg cag cgg cag ttc 349 Phe Arg Gln Ser Val Ala Gly Leu Ala Ala Arg Leu Gln Arg Gln Phe 70 75 80 85 gtg gtg cgg gcc tgg ggc tgc gcg ggc cct tgc ggc cgg gca gtc ttt 397 Val Val Arg Ala Trp Gly Cys Ala Gly Pro Cys Gly Arg Ala Val Phe 90 95 100 ctg gcc ttc ggg cta ggg ctg ggc ctc atc gag gaa aaa cag gcg gag 445 Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ile Glu Glu Lys Gln Ala Glu 105 110 115 agc cgg cgg gcg gtc tcg gcc tgt cag gag atc cag gca att ttt acc 493 Ser Arg Arg Ala Val Ser Ala Cys Gln Glu Ile Gln Ala Ile Phe Thr 120 125 130 cag aaa agc aag ccg ggg cct gac ccg ttg gac acg aga cgc ttg cag 541 Gln Lys Ser Lys Pro Gly Pro Asp Pro Leu Asp Thr Arg Arg Leu Gln 135 140 145 ggc ttt cgg ctg gag gag tat ctg ata ggg cag tcc att ggt aag ggc 589 Gly Phe Arg Leu Glu Glu Tyr Leu Ile Gly Gln Ser Ile Gly Lys Gly 150 155 160 165 tgc agt gct gct gtg tat gaa gcc acc atg cct aca ttg ccc cag aac 637 Cys 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Claims

다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TRAF6-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합을 분석하는 단계로서,
상기 시험물질이 상기 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TAK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 분석하는 단계로서,
상기 시험물질이 상기 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
다음의 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) PINK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열, TRAF6-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 TAK1-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) TRAF6 단백질과 TAK1 단백질의 복합체 형성을 분석하는 단계로서,
상기 시험물질이 PINK1 유전자의 발현 억제 또는 PINK1 단백질의 활성 억제를 통해 상기 TRAF6 단백질과 TAK1 단백질의 복합체 형성을 억제시켜 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로를 차단시키면 신경퇴행성 질환의 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson’s disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 뇌졸중(stroke), 근위축성측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 빈스완거병(Binswanger’s disease), 헌팅톤 무도병(Huntington’s chorea), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 또는 피크병(Pick’s disease)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물의 뇌 조직으로부터 유래한 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PINK1은 NF-κB(nuclear factor kappa B)를 활성화시키고 염증성 사이토카인의 생산을 촉진하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL(interleukin)-1, IL-2, TNF(tumor necrosis factor)-α, TGF(transforming growth factor)-β, IL-6, IL-8 또는 IL-12인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합 또는 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 PINK1 단백질과 TRAF6 단백질의 결합 또는 PINK1 단백질과 TAK1 단백질의 결합을 억제하는 물질은 화학물질, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA), miRNA, 펩타이드 또는 천연 추출물이고, 상기 약제학적 조성물은 NF-κB(nuclear factor kappa B)를 활성화시키고 염증성 사이토카인의 생산을 촉진하는 IL-1β-매개된 다운스트림 시그널링 경로(downstream signaling pathway)를 억제하는 약제학적 조성물.
삭제
제 9 항에 있어서, 상기 PINK1 단백질은 TRAF6 또는 TAK1을 양성적으로(positively) 조절하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 조절은 IL-1β 자극에 의해 촉진되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 PINK1 단백질은 TRAF6의 자가-다이머화(autodimerization) 또는 자가-유비퀴틴화(autoubiquitination)를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 PINK1 단백질은 TAK1의 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 또는 자가-인산화(autophosphorylation)를 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 PINK1 단백질은 TRAF6-TAK1 복합체(complex)의 형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
삭제
삭제
제 9 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-8 또는 IL-12인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.