KR101456205B1

KR101456205B1 - 면역조절성 및 항-종양 펩티드

Info

Publication number: KR101456205B1
Application number: KR1020087023166A
Authority: KR
Inventors: 마리벨 구엘라 발레스피; 이시스 델 카르멘 토르렌스 마드라소; 오스발도 레예스 아코스타; 일다 엘리사 가라이 페레스; 게랄도 엔리께 구일렌 니에토; 보리스 엘네스토 아세베도 카스트로; 라이문도 우비에타 고메스
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-23
Publication date: 2014-10-31
Also published as: CU23582A1; AU2007218671A1; EP1992638B1; BRPI0708148A2; AR059608A1; CN101426813B; JP5069250B2; US8283324B2; US20090221508A1; ATE493434T1; ES2358845T3; MX2008010893A; RU2430109C2; CA2638828A1; ZA200807034B; EP1992638A1; AU2007218671B2; CN101426813A; KR20080106446A; BRPI0708148B1

Abstract

본 발명은 서열 HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW로부터 유래된 펩티드의 개선에 관한 것으로, 아미노산 치환이 도입되며, 지질다당류-결합 능력의 분리를 보증하고 항-종양 및 면역조절 효과를 증가시킨다. 상기 펩티드 및 이의 조합은 암의 치료 뿐만 아니라 다른 표준 치료와 함께 시너지 효과를 위해 사용할 수 있다.

항-종양 펩티드, LPS, 헤파린

Description

면역조절성 및 항-종양 펩티드{IMMUNOMODULATORY AND ANTI-TUMOUR PEPTIDES}

본 발명은 암 면역치료 분야에 포함된다. 좀더 정확하게는, 리물루스(Limulus) 항-LPS 인자 단백질의 서열 32-51로부터 유래된 펩티드 또는 이의 조합은 지질다당류에 결합할 수 있으며 암 및 전이를 치료하는데 유용하다.

치료의 이익을 강화하기 위한 최근 치료요법과 주로 병용되는 암을 치료하기 위한 생물학적 반응의 조절제의 용도가 최근에 보고되었다(US 2004/0101511). 다른 한편으로, 톨-유사 수용체 9(Toll-like receptor 9; TLR9)의 작동체인 CpG 서열의 용도는 다중 치료 징후의 일부로서 암, 즉 비-소 세포(non-small cell) 폐암, 흑색종 및 신장 암종의 치료, 제어 및 예방을 위한 신규한 약물로서 개선되었다(Klinman D. M., et al, (2004) Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nat Rev Immunol . 4:249-258). 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작동체는 흑색종 및 그외 종양을 치료하기 위한 신규한 약물로서의 결과를 기대하는, 면역계를 활성화시키기 위한 I 단계 임상 실험에서 현재 실험되었다 (Dudek A. Z., et al (2005) ASCO Annual Meeting). TLRs 7 및 9의 상기 언급된 작동체는 또한 숙주에서의 효과적인 면역 반응을 촉진하기 위한 이의 능력에 기초한, 바이러스성 감염에서 평가되었다. 게다가, TLR4에 결합하는 명명된 열 쇼크 단백질(Heat shock proteins; Hsp)은 인간 파필로마바이러스(human papillomavirus; HPV) E7 종양단백질(oncoprotein)로의 융합 단백질로서 개선되고 제조되었다. 이러한 신규한 면역치료학적 접근은 인간 파필로마바이러스-관련 질환을 치료하기 위한 광범위한 관점을 갖는 치료학적 백신으로서도 알려져있다 (Chu N. R. et al., (2000) Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin Exp Immunol 121:216-225). 톨-유사 수용체는 LPS, 리포테이코산, 비메틸화 CpG 서열 및 바이러스성 이중- 및 단일-가닥 RNA와 같은, 병원체-관련 분자성 패턴을 인식하는, 면역계의 세포에 존재하는 수용체 분자이다. TLRs에 의한 병원체의 침입의 인식은 생물의 외부 감염을 효과적으로 근절하기 위한 균형잡힌 Th1/Th2 면역 반응을 야기하는 면역계를 돕는다. 암을 치료하기 위한 약물로서의 TLRs 작동체의 용도는 주요 메커니즘으로서 I 유형 인터페론(예를 들어, α & β IFNs) 및 인터루킨 12 (IL-12)에 의해 매개되는 Th1 면역 반응을 활성화함에 의해, 본래 면역계 및 적응성 면역계를 활성화시킴에 기초한다. 그러므로, 고도로 특이적이고 유지되는 면역 반응이 이루어진다(Switaj T., Jalili A., et al., (2004) CpG Immunostimulatory oligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 gene-modified tumor vaccine in a melanoma model in mice. Clinical Cancer Research, Vol. 10:4165-4175). 면역계의 이러한 이중 활성화는 순차적인 바람직하지 않은 효과를 수반하는 적응성 면역 반응에서 유지되는 효과를 생성하지 못하는 다른 여러 면역치료학적 접근과 대조된 다 (Speiser D. E, et al. (2005) Rapid and strong human CD8+T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. The Journal of Clinical Invest . Vol. 115 (3)).

수지상 세포(Dendritic cells; DCs)는 세포-대-세포 상호작용 및 사이토킨 생산을 통한 본래 및 적응성 면역 반응에 관련된 전문 항원 제시 세포이다. DCs는 일련의 표면 분자 마커 및 또한 TLRs의 차별된 발현에 기초한, 미엘로이드 또는 이들의 기원으로 수행되는 림프구로 분류된다. 형질세포모양(plasmacytoid) DCs로서도 알려진 림프구 DCs는 I 유형 인터페론의 주요 원천이다. 이러한 특성을 고려하여, DCs는 암 및 만성 바이러스 감염에 대한 치료학적 백신을 개선하기 위해 세포성 아쥬반트로 기대되도록 조작되었다(Santini S.M., et al (2003) A new type I IFN-mediated pathway for rapid differentiation of monocytes into highly active dendritic cells. Stem Cells, 21:357-362). 그러나, 이는 개선 하에서 다른 좀더 실용적이고 비용이 적게 드는 치료학적 전략을 수반하는, 매우 고비용의 어려운 기술이다(Van Epps H.L. (2005) New hope for tumor vaccines. The Journal of Experimental Medicine , Vol.202:1615).

이들의 항바이러스 활성에 의해 원래 기술된, 유형 I 인터페론(a,b IFNs)은 DCs에서 이들의 아쥬반트 시스템을 통해 세포성 및 체액성 면역 반응을 촉진하는, 면역계에 걸친 중요한 효과를 나타냄이 최근에 보여졌다 (Bogdan, C. (2000) The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr , Opin Immunol. 12:419-424). 최근 작업은 고도의 면역원성 시너지 마우스 육종의 퇴화의 매개 및 일차 발암성 종양의 발생에 대한 숙주의 보호 과정에서 내인성 유형 I 인터페론의 임상적 역할을 명백히 했다 (Gavin P. Dunn, et al. (2005) A critical function for type I interferons in cancer immunoediting. Nature Immunology, June 12). 게다가, IFN-α은 인플루엔자와 같은 바이러스 감염에서 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구의 직접 활성화를 통한 항바이러스 T-림프구 반응을 시작하는 중요한 역할을 수행한다 (Fonteneau J.F, et al. (2003) Activation of influenza virus-specific CD⁺4 and CD⁺8 T cells: a new role for plasmacytoid dendritic cells in adaptive immunity. Immunobiology, 101: 3520-3526).

Hoess의 문헌(WO 95/ 05393)은 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아-매개 패혈증과 같은 감염, 일반적인 박테리아 감염 및 곰팡이 감염을 치료하거나 예방하는데 유용한, 고 친화성을 갖는 LPS에 결합하는 물질에 대해 기술하고 있다(Hoess A., et al, (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A⁰ resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). 원조 리물루스 항-LPS 인자(Limulus anti-LPS factor; LALF) 단백질의 결정 구조는 양성적으로 변화된 양친매성 및 소수성 및 방향성 잔기를 나타내도록 포함하는 폴리믹신 B와 유사한 루프를 나타낸다. 이러한 원칙에 기초하여, 이 문헌에서 내피 및 종양 세포 증식의 항-응고, 맥관형성 및 저해와 같은, 헤파린으로 결합하는 효과를 중화시키고 결합하기 위한 LALF 단백질에서 아미노산 31 내지 52에 상응하는 서열의 능력을 기술했다. 그러나, 상기 언급된 특허에서 이러한 언 급을 뒷받침하는 실험 데이터는 없다. 사실, 승인된 청구항은 용액에서 LPS를 제거하기 위한 장치에 대해 언급하며, 상기 장치는 고형 지지체에서 고정화된 펩티드를 포함한다(US 6,384,188).

반면에, Vallespi의 문헌(US 6,191,114)은 α 및 γ 인터페론의 생성에 의해 매개되는 Hep-2 및 MDBK 상의 LALF₃₁ _-52 펩티드의 항바이러스 효과에 관한 것이며, 또한 바이러스 감염 및 면역억제-관련 질환을 치료하기 위한 이 펩티드의 용도에 관한 것이다. 게다가, 동일한 저자는 패혈증의 동물 모델에서 이 단백질의 항-감염 효과를 증명했다(Vallespi M.G., et all (2003) A Limulus anti-LPS factor-derived peptide modulates cytokine gene expression and promotes resolution of bacterial acute infection in mice. International Immunopharmacology, 3:247-256).

화학요법, 방사선 및 유전자 치료를 포함하는, 암에 직접적인 많은 치료가 있다. 독성은 이러한 모든 치료의 주요 단점이며, 고투여량으로 일부 치료 효과를 최종적으로 이루는 연장된 기간 동안 투여되었다. 그러므로, 좀더 효과적인 치료를 얻기위한 신규한 약물의 개발이 여전히 요구된다.

종양에 대한 유효한 반응을 검출하고 향하기 위한 면역계의 기본 역할에 기초하여, 숙주 본래 및 적응성 방어 메카니즘을 활성화하기 위해 설계된 약물은 암 치료를 위한 강력한 도구가 된다.

LPS-결합 능력을 제거하고 면역조절 효과를 강화시키며 또한 여러 종양에 대 해 생체내 항-종양 효과를 수여하는, LAF 단백질의 서열 HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW에 대해 기술된 이전의 아미노산 치환은 없었다.

본 발명은 LALF 단백질 서열 HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 13)의 32-51 영역으로부터 유래된 펩티드를 제공하여, 상기 언급된 문제점들을 해결하며, 여기에서 아미노산은 LPS-결합 능력을 근절하고 항종양 및 면역조절성 효과를 강화시키기 위해 치환되었다.

LPS- 또는 헤파린-결합을 방해하고 또한 원래 펩티드에 비해 증가된 항-종양 및 면역조절 효과를 제공하는 치환에 의해 상기 서열로부터 유래된 유사성 펩티드은 다음 서열로 구성된다:

HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 1)

HYRIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 2)

HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 3)

HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 4)

Hoess 및 Vallespi에 의해 기술된 LPS-결합 펩티드는 암 환자에게 불리한, 우세한 Th2 프로파일로 향하는 혼합된 Th1/Th2 프로파일로부터 벗어나 있어 불리하다. 이러한 환자들은 혈중 LPS 입자의 존재를 제외하지 않는, 면역억제에 기인한 부수되는 감염을 갖는다. LPS의 존재시 우세한 Th2 프로파일을 포함하는 펩티드의 투여는 환자의 면역학적 상태를 저하시키고 종양에 대한 숙주 반응을 악화시키는, 부작용을 야기할 것이다. 게다가, Vallespi에 의해 기술된 펩티드의 LPS로의 결합은 이러한 펩티드의 면역조절 효과를 최소화시킬 것이다.

반면에, 본 발명에서 기술된 펩티드의 헤파린으로의 결합의 결핍은 Hoess 및 Vallespi에 의해 이전에 기술된 것보다 더 우수하게 만든다. 허혈성 심장병, 대뇌혈관 질환, 정맥 혈전색전증 질환(venous thromboembolic disease) (깊은 정맥 혈전증 및 폐색전증; deep vein thrombosis and pulmonary embolism) 및 뒷다리 허혈을 갖는 환자들과 같은 실제 환자에서, 헤파린은 치료제로서 나타난다(D. Cabestrero Alonso, et al (2001) Heparinas de bajo peso molecular en pacientes criticos: usos, indicaciones y tipos. Medicina Intensiva, Vol.95:18-26). 그 후에, 헤파린-결합 펩티드의 투여에 의해 이러한 맥락에서 금기를 나타낼 것이며 이는 이 약물의 효과로 방해하기 때문이다. 암 및 혈전색전증의 연관은 깊은 정맥 혈전증 및 폐색전증과 같은, 암 환자에서의 질병률 및 사망률에 상당히 기여할 수 있는 널리 알려진 증상이다. 상기 언급된 이러한 이유에 기초하여, 헤파린에 결합을 불가능하게 하고 암 환자의 치료에서 항-종양 및 면역조절 효과를 보이는 펩티드의 이용효율은 일반적으로 수술을 받았고 과응고와 같은 다른 장애를 나타내는 이러한 환자에서 유용하고 상당한 비율로 나타난다 (Castelli R., et al (2004) The heparins and cancer:Review of clinical trials and biological properties. Vascular Medicine, Vol.9:1-9).

본 발명은 또한 다음의 아미노산 서열을 포함하는, 알라닌에 의해 치환된 둘 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 펩티드를 포함하며:

HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)

HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9)

HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10)

HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11)

HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)

합성 또는 재조합 과정에 의해 수득된 이러한 이전 펩티드의 다른 상동성 또는 유사성 변이체 및 융합 펩티드의 부분으로서 포함한다. 상사성 변이체는 LPS- 또는 헤파린-결합 능력이 결여되고 항-종양 및 면역조절 효과를 나타내는 모든 펩티드를 나타낸다. 유사하게, 상기 유사체 변이체는 구조가 LPS- 또는 헤파린-결합 능력이 결여되고 항-종양 및 면역조절 효과를 유지하는 화학적 기원(비-단백질)의 모든 분자로서 나타낸다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 펩티드 및 화학적 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이들의 반응성 염 뿐만 아니라 약학적으로 용인가능한 보형제 또는 부형제를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물은 박테리아성, 바이러스성 또는 암 항원을 포함하는 군에서 선택한 항원을 추가로 포함한다.

유사하게, 본 발명의 펩티드는 화학요법, 수술, 방사선 등과 같은 암에 대한 통상적인 치료와 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 효과적인 Th1 면역 반응이 요구되는 면역학적 장애를 치료하고/치료하거나 예방하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 이러한 펩티드 및 화학적 화합물의 용도; 박테리아 또는 바이러스 기원의 감염에 대한 효과적 면역 반응을 개선한 암의 치료 또는 예방을 포함한다.

기술된 펩티드는 LPS 결합을 위한 공통 최적 도메인으로서 이미 기술된, 원래의 서열 대신, LPS-결합 능력이 결핍된 것으로 정의되었다(Hoess et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A⁰ resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). 동일한 방식에서, 본 발명에서 기술된 펩티드는 Vallespi가 자신의 특허 문헌(US 6,191,114)에서 항바이러스성 및 면역조절성 펩티드로서 언급한 아미노산 31 내지 51을 포함하는 LALF 단백질로부터 유래된 펩티드에 비교되는, IFN-α의 분비에 의해 매개되는, 면역조절성 효과를 강화시킨다.

유사하게, 본 발명에서 기술된 펩티드는 후천성 면역결핍증(acquired immunodeficiency syndrome; AIDS)을 앓고 있는 환자 및 복합 수술을 받은 환자와 같은, 이들의 면역 상태의 활성화가 요구되는 면역억압 환자에게 투여할 수 있다.

실험적 생체내 데이터는 마우스에 이식된 종양에서 상사성 펩티드의 효과를 증명하며, 이 종양들은 마우스 흑색종 B16 세포; C57Bl/6 마우스로부터의 악성 폐 상피 세포 및 마우스 폐암으로부터 수득된 3LL-D122 세포로부터 유래된 것이다.

다른 실시형태에서, 펩티드를 전이성 사건을 최소화시키기 위해 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 결과는 기술된 펩티드가 암 세포에 걸친 직접적인 세포독성 효과를 증명하는, 다양한 조직학적 기원의 종양 세포주에서 항-증식 효과를 보임을 나타낸다.

원칙적으로, 기술된 펩티드는 단독으로 또는 수술, 방사선 또는 화학요법과 같은, 암을 치료하기 위한 치료법과 함께 사용할 수 있다.

유사하게, 본 발명에서 기술된 펩티드는 예방적으로 투여됐을 때 종양에 대해 급격한 본래 면역 반응을 생성시켜 적응성 항원-특이 면역 반응을 나타나게 하고 암에 대한 예방적 또는 치료적 백신에서 이들의 사용을 강조했다.

도 1: 박테리아 지질다당류(LPS)-결합 능력에서의 펩티드의 효과. 도 1a, 이 실험들은 삼중으로 구성된 것이다; 한 실험의 저해 곡선이 보여진다. 도 1b에 보여진 저해의 백분율은 세 독립된 실험의 평균을 나타낸다.

도 2: 음이온성 화합물 헤파린에 결합하는 능력에서의 펩티드 효과. 독립적인 세 실험의 평균을 나타낸다.

도 3: 인간 단핵 세포에서 α 및 γ 인터페론 및 IL-12의 생성에서 펩티드의 효과. 세 실험은 상기 중 하나를 야기함을 보이는 다른 공여체에서 구성됐다.

도 4: TC-1 종양 모델에서 펩티드의 항-종양 효과.

도 5: 흑색종 모델에서 L-2 펩티드의 항-종양 효과.

도 6: TC-1 종양 모델의 예방적 투여 스케줄에서 상사성 L-2 펩티드의 항-종양 효과.

도 7: TC-1 종양 모델의 이중 투여 스케줄에서 상사성 L-2 펩티드의 항-종양 효과.

도 8: 상사성 펩티드 L-2의 항-흑색종 능력.

도 9: TC-1, H125 및 L929 세포의 증식에서 상사성 펩티드 L-2의 효과.

실시예 1. 펩티드 합성

본 발명의 펩티드를 고형상 과정에 따라 합성했다. 정제하지 않은 펩티드를 30% 아세트산 용액으로 추출하고 동결건조한 후 추가로 RP-HPLC로 정제했다. 정제된 펩티드의 분자량을 FAB 건(gun)을 갖는 질량분석계 JEOL JMS-HX110HF 를 사용하여 확인했다. 결과적으로 생성된 제제는 비-발열성이며 동물 및 인간에게 투여하기에 약학적으로 허용가능하다. 펩티드의 원조 서열의 각 위치로 알라닌 아미노산을 삽입하여 치환을 실시했다

실시예 2. 지질다당류(LPS)-결합 능력이 결여된 상사성 펩티드의 선별.

이 검정은 경쟁시스템에서 구성된다(Hardy E., et al (1994) Enhanced ELISA sensitivity using TCA for efficient coating of biologically active LPS or Lipid A to the solid phase. J. Immunol . Meth. Vol.176:111-116). 폴리스티렌 플레이트(Costar, USA)를 0.2% 트리클로로아세트산(TCA)를 갖는 E. coli 0111:B4로부터의 LPS(1 ㎍/ml)로 코팅했다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새 항온하고 추가로 0.1% 트윈-20이 더해진 1X 인산염-완충 식염수(1X PBS) (세척 용액)로 10회 세척했다. 고형상 표면에 고정된 LPS로의 상사성 펩티드의 결합은 0.2 μM에서 비오틴화 LALF_32-51를 갖는 경쟁 ELISA로 평가했으며, 90%의 최대 LPS 결합을 나타낸다. 저해 곡선을 측정하기 위해, 10 μM 내지 0.01 μM의 다른 농도의 상사성 펩티드를 사용했으며 LALF₃₂ _-51의 곡선을 실험 대조로서 사용했다. 비오틴화 LALF₃₂ _-51을 37 ℃에서 2시간 동안 상사성 펩티드의 존재 하에서 항온하고 플레이트를 세척 용액으로 5회 세척했다. LPS에 결합된 비오틴화 LALF₃₂ _- ₅₁를 1:2,000 희석에서 스트렙타비딘-페록시다제 접합체와 함께 37 ℃에서 45분 동안 항온하여 검출했다. 플레이트를 세척 용액으로 5회 세척하고 기질 용액을 첨가했다(0.05 M 시트르산염-인산염 완충용액, pH 5.5, 3,3',5,5'테트라메틸벤지딘 및 025 % 과산화수소의 1개 정제). 15분간의 항온 후, 2 M 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 흡광도를 플레이트 판독기(Sensident Scan)에서 45 nm에서 정량했다. 상사성 펩티드의 LPS-결합 능력 및 광밀도 수치 사이의 상관관계가 있다. 더 높은 LPS-결합 능력을 갖는 상사성 펩티드가 LALF₃₂ _-51펩티드의 저해 곡선에 비해 더 낮은 O.D.의 저해 곡선을 보인다.

낮은 LPS-결합 능력을 갖는 상사성 펩티드는 LALF₃₂ _-51펩티드의 저해 곡선에 비해 O.D. 수치를 갖는 저해 곡선을 나타낸다. 결과는 도 1a에 나타냈으며 이는 L-2, L-8, L-12 및 L-20으로 명명된 펩티드가 LALF₃₂ _-51 펩티드와 유사한, 능력을 유지하는 펩티드 L-9 및 L-19를 갖는, LPS에 결합하는 능력을 잃었음을 증명한다. 반면에, L-3 펩티드는 더 높은 LPS 결합 능력을 나타낸다.

도 1b는 고형 표면으로 흡착된 LPS로의 비오틴화 LALF₃₂ _-51 (0.2 μM)의 결합을 치환하는 이들의 능력에 따라, 고정된 0.5 M 농도에서 상사성 펩티드의 저해 백 분율을 나타낸다.

저해 % = {1-(( [O.D.]_시료 - [ O.D.]_최소)/( [O.D.]_최대- [ O.D.]_최소))} x 100

[O.D.] _시료: 상사성 펩티드의 고정된 농도의 존재에서 광밀도 수치;

[O.D.] _최소: ELISA 배경;

[O.D.] _최대: 상사성 펩티드가 없는 광밀도 수치.

이러한 분석으로부터의 결과로서, LPS-결합 능력이 결여된 펩티드로부터 시작하는 이중, 삼중 및 사중 돌연변이가 일어났다:

HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)

HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9)

HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10)

HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11)

HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)

실시예 3: 상사성 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20의 헤파린-결합 능력의 평가.

이 검정은 상기에 기술된 것과 유사한 경쟁 ELISA 시스템 상에서 구성되었다. 비오틴화 LALF_32-51 펩티드를 1X PBS 내의 폴리스티렌 플레이트(Costar, USA)에 흡착시키고 4 ℃에서 밤새 항온했다. 상사성 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20를 0.1%의 우혈청 알부민(BSA)가 첨가된 1X PBS 내에서 250 유닛의 헤파린(Sodic Heparin, 5,000 U/ml, Liorad)과 함께 2 μM에서 혼합했다. 그 후에, 혼합물을 0.02 μM의 고형 표면에 흡착된 비오틴화 LALF₃₂ _-51 펩티드를 포함하는 ELISA 플레이트에 첨가했다. 실온에서 1 시간 동안 항온한 후, 플레이트를 세척 용액으로 5회 세척하고 고형 표면에 고정된 비오틴화 LALF₃₂ _-51 펩티드를 1:2,000에서 스트렙타비딘-페록시다제와 함께 37 ℃에서 45분간 항온하여 검출했다. 그 후에, 플레이트를 세척 용액으로 5회 세척하고 기질 용액을 첨가했다. 15분간의 추가 항온 후, 2 M 황산 용액으로 반응을 중지시켰다. 상사성 펩티드로 결합하는 헤파린의 부족은 이들이 고형 표면에 흡착되는 비오틴화 LALF₃₂ _-51 펩티드에 결합하는 헤파린을 치환할 수 없기 때문에, 감소된 광밀도와 서로 관련된다. 100 X 몰 초과량에서 표지되지 않은 LALF_32-51 펩티드를 검정의 대조로서 사용했다. 표지되지 않은 LALF₃₂ _-51 펩티드의 헤파린 결합은 냉 펩티드의 초과량이 헤파린으로의 결합으로 인해 경쟁하므로, 증가된 광밀도 수치에 의해 증명되었다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, 결과는 본 발명의 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20이 헤파린에 결합할 수 없음을 나타낸다.

실시예 4. 인간 단핵 세포에서의 IFN-α, IFN-γ 및 IL-12의 발현에서 상사성 펩티드의 효과.

이러한 검정에서, 인간 단핵 세포를 공여체의 백혈구 농축물 또는 "버피 코트(Buffy Coat)"로부터 피콜-히파크(Ficoll-Hypaque) 기울기에 의해 분리했다. 5x10⁶ 까지 10% 송아지 우혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서의 24-웰 플레이트에 접종했다. 각 펩티드를 0.1 ml 부피의 RPMI 배지에서 40 ㎍/ml로 첨가하고 세포를 37 ℃ 및 5 % of CO₂에서 18시간 동안 항온했다. 총 RNA를 TriReagent 방법을 사용하여 추출했다. 그 후에, the expressions of IFN-α, IFN-γ 및 IL-12 유전자의 발현을 역전사 작용 및 PCR 증폭(RT-PCR kit, Perkin Elmer)으로 결정했다. 결과를 b-액틴 하우스키핑 유전자의 발현 수준에 대한 일반화된 메신저 RNA의 상대량으로서 나타냈다. 이러한 검정에서 수득된 결과는 본 발명에 기재된 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20이 도 3a에서 보여지는 바와 같이 IFN-α, IFN-γ 및 IL-12 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 증명한다. 상사성 펩티드 L-2, L8 및 L-12은 특히 도 3b에서 보여지는 바와 같이 LALF₃₂ _-51 펩티드보다 IFN-α 유전자의 발현의 유도에 특히 더 효과적이다. 이 실시예는 원조 LALF₃₂ _-51 서열에서 아미노산 치환이 LPS에 결합하는 능력을 제거하고, 그로 인해 결과적으로 생성된 펩티드의 면역조절 효과를 강화시킨다.

실시예 5. TC-1 종양 모델에서 상사성 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20의 항-종양 효과 .

8 내지 10 주령 C57Bl/6 암컷 마우스를 이 검정에서 사용했다(실험군 당 n=10 마리 동물). 종양 이식편에서, C57Bl/6 악성 상피 폐 세포로부터 유래된 TC-1 세포를 인산염-완충 식염수(PBS)에 현탁하여 사용했다. 200 ㎕ 부피 내 50,000개 세포의 양을 피하 경로로 마우스의 오른쪽 뒷다리에 접종했다. 첫 번째 펩티드를 종양이 100 mm³ 부피에 이르면 오른쪽 옆구리에 피하 경로를 통해 투여하고, 두 번째 펩티드를 10일 후에 투여했다. 이 검정에서, 중량의 kg 당 4 mg의 투여량을 평가했다(80 ㎍/마우스). 동물 생존율 및 종양 크기를 도 4a 및 도 4b에서 보여지는 바와 같이, 관심 펩티드의 항-종양 효과를 측정하기 위해 평가했다. 상사성 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20은 각각 마우스의 종양 진행을 저해하고 생존을 연장시키는데 효과적이다. 이러한 결과들은 마우스의 충실성 종양 모델에서 상사성 펩티드의 항-종양 효율을 증명한다. 로그 랭크(Log Rank) 방법을 그룹 사이의 유의차를 위한 통계학적 분석으로서 사용했다. 결과는 상사성 펩티드 L-2, L-8, L-12 및 L-20이 LALF_32-51 펩티드(^*p< 0.05)에 비해 동물의 생존율을 상당히 증가시킴을 증명한다. 이러한 결과들은 LALF 단백질의 원조 32-51 서열에서의 아미노산의 치환이 펩티드의 항-종양 능력을 상당히 증가시킬 수 있음을 증명한다.

실시예 6. 흑색종 모델에서의 상사성 펩티드 L-2의 항-종양 효과.

8 내지 10주령의 C57Bl/6 암컷 마우스를 이 검정에서 사용했다(실험군 당 n=10 마리 동물). 종양 이식편으로, MB16-F10 종양 세포가 인산염-완충 식염수(PBS)에 재현탁되어 사용됐다. 15,000 개 세포의 양을 200 ㎕ 부피로 피하 경로를 통해 오른쪽 뒷다리에 접종했다. 4일 후, L-2 펩티드를 일차 투여 7일 후에 투여된 이차 주입 및 그 후 14일 후에 투여된 삼차 면역화를 통해 투여했다. 이 검정에서 동물 중량 kg 당 4 mg의 투여량을 평가했다. 이 검정 동안 주어진 펩티드의 항-종양 효과를 측정하기 위해 평가된 파라미터는 종양 이식의 시간 및 동물의 생존율이다. 도 5a에서 보여진 바와 같이, L-2 상사성 펩티드는 종양 이식을 상당히 지연시켰다 (^*p< 0.05, 로그 랭크 방법). 로그 랭크 방법에 의한 생존율 분석은 L-2 펩티드가 도 5b에서 보여진 바와 같이, LALF₃₂ _-51 펩티드에 비해 좀더 효과적으로 동물의 생존을 상당히 증가시켰음(^*p< 0.05)을 증명했다. 이러한 결과는 폐 상피 암 세포 뿐만 아니라 흑색종과 같은 신체의 다른 조직학적 및 해부학적 부분으로부터의 암 세포에 대한 항-종양 효율을 증명한다.

실시예 7. TC-1 종양 모델에서의, 치료의 예방 스케줄에서 L-2 상사성 펩티드의 항-종양 효과.

8 내지 10주령의 C57Bl/6 암컷 마우스를 이 검정에서 사용했다(실험군 당 n=10 마리 마우스). 종양 이식편으로, TC-1 종양 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시켰다. 마우스에게 L-2 펩티드(체중의 kg 당 4 mg의 펩티드)를 일차 주입했다. 7일 후, 마우스에게 동일 투여량을 2차 주입했다; 펩티드의 일차 주입한지 14일 후에, 동물에게 200 ㎕ 부피 내의 50,000 개 세포를 오른쪽 뒷다리에 피하 경로로 접종했다. 종양 이식 시간(도 6a) 및 동물의 생존(도 6b)을 포함하는 펩티드의 항-종양 효과를 측정하기 위해 파라미터를 평가했다. 이 검정에서 얻어진 결과는 본 발명의 L-2 펩티드가 종양의 발달을 예방하는데 효과적이며 또한 동물의 생존율을 증가시킴을 증명했다. 이러한 결과는 본 발명의 펩티드가 종양의 수립을 예방하는 예방적 효과를 나타냄을 증명한다.

실시예 8. 이중 항원투여 스케줄에서 L-2 상사성 펩티드의 항-종양 효과.

상기 실시예의 스케줄에서 수립된 종양이 없는 동물(n=6)에게 추가로 PBS 내에서 200 ㎕ 부피 내의 50,000 TC-1 세포를 왼쪽 뒷다리에 피하 경로로 이차로 항원투여했다(일차 항원우텨 후 49일째). 연령에서의 상동성을 보증하기 위해 동량의 종양 세포를 실험의 대조군으로서 같은 한배 새끼인 "투여하지 않은" 마우스에게 접종하고 펩티드를 투여하지 않고 동일 조건 하에서 유지시켰다(n=10 animals). 종양 이식 시간 및 동물 생존을 포함하는 L-2 펩티드의 항-종양 효과를 측정하기 위해 파라미터를 평가했다. 이 검정에서 얻어진 결과는 L-2 펩티드가 종양의 수립을 방해하고(도 7a) 동물 생존율을 증가시켜(도 7b), 종양 세포로의 이차 항원투여로부터 마우스를 보호할 수 있음을 증명한다. 이 결과는 본 발명의 펩티드가 지속적인 항-종양 반응을 유도할 수 있고 항원-특이 적응성 면역 반응의 발달을 증명하는 종양 세포로의 이차 항원투여에 대해 여전히 기능적임을 증명한다.

실시예 9. 루이스 암종의 전이 모델에서 L-2 상사성 펩티드의 항-종양 효과.

8 내지 10주령 C57Bl/6 암컷 마우스를 이 검정에 사용했다(실험 그룹 당 n=8 마리 동물). 이러한 동물들의 뒷다리 풋패드(footpad)에 250,000개 마우스 폐암 3LLD122 세포를 접종했다. 7일 후에, L-2 상사성 펩티드의 체중 당 4 mg/kg의 투여량을 피하로 주입했다. 종양의 직경이 8 mm가 되었을 때, 초기 종양을 운반체 다리로부터 수술로 제거했다. 이 수술 과정 후 21일째에 마우스를 희생시켰다. 폐의 무게를 측정하여 폐에서의 전이의 양을 나타냈다. 도 8에 보여지는 결과는 본 발명의 L-2 상사성 펩티드가 전이성 종양 발생을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 10. 종양 세포의 성장에서 L-2 상사성 펩티드의 효과.

이 검정에서, TC-1, H-125 (비소 인간 폐암 세포) 및 L929 마우스 섬유아세포를 우태아 혈청(Gibco)이 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)(Gibco) 내에서 2x10⁴ 세포/ml로 96-웰 배양 플레이트(Costar)에 접종했다. 24시간 후, 펩티드를 9 μM 내지 300 μM의 범위로 배양에 첨가했다. 플레이트를 72시간 동안 5 % CO₂ 하에서 접종한 후, 검정을 크리스탈 바이올렛으로 나타냈다. 플레이트를 수돗물로 광범위하게 세척하고 플레이트를 562 nm에서 판독했다. 결과는 도 9에 나타냈다. 생체외에서 현저한 항-증식 효과를 갖는 아폽토시스성 펩티드를 양성 대조로서 사용했다(Perea, S., et al (2004) Antitumor Effect of a Novel Proapoptotic Peptide that Impairs the Phosphorylation by the Protein Kinase 2 Cancer Research 64: 7127-7129). 얻어진 결과는 L-2 펩티드가 TC-1 및 H-125 세포에서 투여량-의존 항-증식 효과를 생성함을 증명한다. 그러나, 마우스 섬유아세포 L929 세포주에서 본 발명의 펩티드에 의한 효과는 검출되지 않았다. 이 결과는 본 발명의 펩티드가 생체외에서 종양 세포에 선택적 세포독성 효과를 보임을 증명한다.

SEQUENCE LISITING <110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia <120> "IMMUNOMODULATERY AND ANTI-TUMOR PEPTIDES". <130> Anti-tumoral <140> <141> <150> CU 2006-0047 <151> 24-02-2006 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 33 by Alanine <400> 1 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 39 by Alanine <400> 2 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 43 by Alanine <400> 3 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 51 by Alanine 51 <400> 4 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Ala 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 34 by Alanine <400> 5 His Tyr Ala Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 40 by Alanine <400> 6 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Ala Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 50 by Alanine <400> 7 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Ala Trp 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 39 and 43 by Alanine <400> 8 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 33 and 39 by Alanine <400> 9 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 33 and 43 by Alanine <400> 10 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 33, 39 and 43 by Alanine <400> 11 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide from a.a. 32 to 51 of the LALF protein, modified by substituting the a.a. 33, 39, 43 and 51 by Alanine <400> 12 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Ala 20 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Peptide from a.a. 32 to 52 of the LALF protein <400> 13 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Tyr 1 5 10 15 Lys Gly Lys Phe Trp 20

Claims

아미노산 서열 SEQ. ID. NO. 1 내지 4에서 선택되는 아미노산 서열로 구성되고, LPS-결합 및 헤파린 결합 능력이 결여되며, LALF 단백질의 32-51 영역으로부터 유래된 항-종양 및 면역조절 능력을 갖는 펩티드.
삭제
제1항에 따른 펩티드의 하나 또는 그 이상; 및 보형약 또는 약학적으로 용인가능한 부형제를 포함하는 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 면역원을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 면역원은 박테리아 기원의 단백질성 운반체 또는 바이러스성 입자이고; 펩티드성 면역원, 강글리오사이드성 면역원 또는 단백질 성질의 면역원 중에서 선택되는 약학적 조성물.
삭제
제3항에 있어서, 인체에서 본래 면역 반응을 자극하기 위한 상기 펩티드의 유효량을 포함하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 전이를 저해하기 위해 적용됨을 특징으로 하는 약학적 조성물.