KR101452292B1

KR101452292B1 - Hydrogel bead based biosensor

Info

Publication number: KR101452292B1
Application number: KR1020130004226A
Authority: KR
Inventors: 전태준; 정성호; 김영록; 김해영; 김선민; 장희수; 임민철
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2014-10-22
Also published as: KR20140092029A

Abstract

본 발명은 하이드로젤 기반 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명의 폴리디아세틸렌 베지클이 고정된 하이드로젤 비드는 검출 민감도가 우수하여 표적물질을 효과적으로 검출할 수 있어 GM 작물을 효과적으로 판별할 수 있고, 휴대성이 좋고 수거능이 우수하여 표적물질 검출 후 쉽게 수거할 수 있다.The present invention relates to a hydrogel-based biosensor, and more particularly to a hydrogel bead in which polydiacetylene bezlets of the present invention are immobilized, is excellent in detection sensitivity and can effectively detect a target substance, Can be easily collected after the detection of the target substance.

Description

[0001] Hydrogel bead based biosensor [0002]

본 발명은 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클이 내부에 포집된 하이드로젤 비드 기반 바이오센서에 관한 것이다.
The present invention relates to a hydrogel bead-based biosensor in which a reactor or a functional ligand-bound polydiacetylene bezle is collected.

세계인구가 급증함에 따라 식량부족이 심각해지고 있다. 2050년에는 세계인구가 92억 명에 다다라 더욱더 심각한 식량난을 초래할 것이다. 이러한 식량난을 해소하기 위해 유전자변형작물(GMO, Genetically modified organism)은 농작물의 생산증대와 품질 제고 등의 목적으로 국내외에서 활발히 개발되고 있으며 상업화되고 있다. 대표적인 유전자변형작물에는 면화, 콩, 옥수수, 쌀 등이 있고 이들 대부분은 제초제저항성 및 병충해저항성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Steptomyces viridochromogenes)의 pat 유전자가 도입되어 있다. 하지만 유전자변형작물의 생체 안정성의 논란으로 소비자, 비정부 기구 및 환경 단체들로부터의 우려의 목소리가 크고 더욱더 엄격한 안정성 평가를 요구하고 있다. As the world population soars, food shortages are becoming serious. By 2050, the world population will reach 9.2 billion people, leading to even more severe food shortages. Genetically modified organism (GMO) has been actively developed and commercialized at home and abroad for the purpose of increasing crop production and improving quality. Representative genetically modified crops include cotton, soybean, corn, rice and the like, and most of them have introduced the pat gene of Streptomyces viridochromogenes , which imparts herbicide resistance and pest resistance. However, the debate over the biostability of GM crops calls for greater and more stringent safety assessments from consumers, NGOs and environmental groups.

현재 GMO의 식품 안전성 평가를 위해 신규성, 항생제 내성, 독성, 그리고 알레르기 유발시험이 시행되고 있다. 특히, 식품 원재료 혹은 가공식품 내에 혼입된 유전자변형작물을 검출하기 위해서 핵산증폭검사법(PCR)이 이용되고 있다. 하지만 PCR은 많은 장비와 시간이 필요로 하기 때문에 현장 진단형 시스템으로써 활용하기에는 많은 제약이 있다. 단백질 탐지를 위한 S-ELISA 기법은 분석 시간이 오래 걸리고, 2차 항체 및 반응이 요구되어 비용이 비싼 단점이 있다.Currently, novelty, antibiotic resistance, toxicity, and allergy induction tests are being conducted to evaluate the food safety of GMOs. In particular, nucleic acid amplification (PCR) has been used to detect genetically modified crops incorporated into food raw materials or processed foods. However, since PCR requires a lot of equipment and time, there are many limitations to use as a field diagnostic system. The S-ELISA technique for protein detection has a disadvantage in that it takes a long analysis time, requires a secondary antibody and a reaction, and is expensive.

한편, 폴리디아세틸렌(Polydiacetylene, PDA)은 외부자극에 색 변화를 보이는 특징 때문에 센싱 소재로 많이 활용되고 있다. 하지만, PDA를 이용한 기존의 바이오센서들은 휴대성과 표적물질을 검출하기에 낮은 민감도와 신호비를 보이는 단점들이 있다.
Polydiacetylene (PDA), on the other hand, is widely used as a sensing material because of its color change characteristic to external stimuli. However, conventional biosensors using PDA have disadvantages in that they exhibit low sensitivity and signal ratio to detect portability and target material.

1. 대한민국 공개특허 제2012-0081762호, 2012.07.201. Korean Patent Publication No. 2012-0081762, 2012.07.20

본 발명의 목적은 신속하고 정확하며 현장 진단을 위해 휴대가 가능한 폴리디아세틸렌 베지클 기반의 하이드로젤 비드를 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a polydiacetylene bezle-based hydrogel bead that is fast, accurate and portable for on-site diagnosis.

본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로젤 비드를 이용한 새로운 비색형 바이오센서를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a novel colorimetric biosensor using the hydrogel bead.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤 비드를 이용하여 GM 작물을 신속하고 정확하게 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a method for rapidly and accurately detecting GM crops using the hydrogel beads.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클을 포함하는 하이드로젤 비드를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a hydrogel bead comprising a polydiacetylene bezle to which a reactor or a functional ligand is bound.

본 발명은 또한 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클 및 고분자 함유 전구용액 액적(droplet)을 제조하는 단계; 및 상기 전구용액 액적을 중합시키는 단계를 포함하는 상기 하이드로젤 비드의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a process for preparing polydiacetylene beads and a polymer containing precursor solution droplets to which a reactor or a functional ligand is bound; And polymerizing the precursor solution droplet. The present invention also provides a method for producing the hydrogel bead.

본 발명은 또한 상기 하이드로젤 비드를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.The present invention also provides a biosensor comprising the hydrogel bead.

본 발명은 또한 상기 하이드로젤 비드와 시료를 반응시키는 단계; 및 반응물의 비색변화 또는 형광변화를 측정하는 단계를 포함하는 표적물질의 탐지방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for preparing a hydrogel bead, comprising the steps of: reacting the hydrogel bead with a sample; And measuring a color change or fluorescence change of the reactant.

본 발명은 또한 상기 하이드로젤 비드와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 유전자변형작물의 판별방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for identifying a transgenic crop comprising the step of reacting the hydrogel bead with a sample.

본 발명은 폴리디아세틸렌 기반 하이드로젤 비드를 비색형 바이오센서로 제공하고, 상기 하이드로젤 비드는 어떠한 형광 표지나 신호 증폭을 위한 2차 반응을 필요로 하지 않으며, 빠르고 정확하게 GM 작물을 탐지할 수 있다.
The present invention provides a polydiacetylene-based hydrogel bead as a colorimetric biosensor, wherein the hydrogel bead does not require any secondary labeling for fluorescence labeling or signal amplification, and can detect GM crops quickly and accurately .

도 1은 EDC/NHS 화학을 이용하여 PDA 베지클에 항체를 결합시키는 공정을 도시한 것이다.
도 2는 T-자형 미세유체시스템 소자의 모식도(A)와 PDMS 미세유체시스템 소자에서 분홍색 잉크로 채운 T-자형 사진도(B)를 나타낸 것이다.
도 3은 SU-8 PR 몰드의 제조를 위한 포토리쏘그래피 과정을 도시한 것이다.
도 4는 PDA 베지클이 고정된 면역-하이드로젤 비드를 이용하여 PAT 단백질을 비색 검출하는 과정을 도시한 것이다.
도 5는 항체-PDA 베지클 및 PEG-DA 하이드로젤의 혼합물로부터 하이드로젤 액적을 제조하기 위한 미세유체시스템 모식도로, (A)는 하이드로젤 액적의 합성 모식도이고, (B-C)는 T-자형 미세유체시스템 소자에서 액적의 생성 과정을 보여준다.
도 6은 면역-하이드로젤 비드의 합성 및 광중합 모식도(A), PDMS 미세유체시스템 소자을 이용한 면역-하이드로젤 비드의 합성 모식도(B) 및 바이알에서 면역-하이드로젤 비드를 수거(C)하는 과정을 나타내는 사진도이다.
도 7은 항체-PDA 베지클을 포함하는 면역-하이드로젤 비드의 광학현미경사진도(A)와 (A)에서 보이는 면역-하이드로젤 비드의 형광 사진도(B)를 나타낸 것이다.
도 8은 PEG-DA 및 PDA(TCDA:DMPC=4:1) 베지클의 조성비에 따른 다양한 하이드로젤 용액을 나타낸 것으로, PEG-DA 용액(A), PEG-DA:PDA=4:1(B), PEG-DA: PDA= 2:1(C), PEG-DA: PDA= 1:1(D), PEG-DA: PDA= 1:2(E), PEG-DA: PDA= 1:4(F), PDA 베지클(G)을 나타낸다.
도 9는 PAT 단백질의 유무에 따른 항체-PDA 베지클(TCDA:DMPC=8:2)의 UV-Vis 흡수 스펙트럼 결과(A)와 PAT 단백질의 함량에 따른 항체-PDA 베지클의 비색 반응 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 10은 PAT(a-b) 및 BSA(c)의 농도별 (0~2μM)로 PDA 베지클(a)과 PDA 베지클이 고정된 하이드로젤의 반응의 비색 변화를 도시한 것으로, (a)는 항-PAT PDA(TCDA:DMPC=8:2) 베지클, (b)는 PAT 농도별로 반응된 항-PAT PDA 베지클이 고정된 PEG-DA 하이드로젤, (c)는 대조군으로 BSA와 반응된 항-PAT PDA 베지클이 고정된 PEG-DA 하이드로젤을 나타낸다.
도 11은 분석물질의 농도별로 PDA 베지클 및 PDA 베지클이 고정된 하이드로젤로부터 빨간색의 상대 강도 그래프를 나타낸다.
도 12는 PAT 및 BSA 단백질의 농도별로 PDA 베지클이 고정된 하이드로젤로부터 빨간색 형광 강도를 표준화한 그래프이다.
도 13은 PAT 농도별 반응에서 PDA 베지클(a)과 동일 부피의 PDA 베지클을 포함하는 면역-하이드로젤 비드(b: 직경이 2mm인 것을 사용함)의 비색 변화를 도시한 것이다.
도 14는 PAT 농도별로 반응시킨 PDA 베지클과 면역-하이드로젤 비드의 빨간색 상대 강도 그래프를 나타낸 것이다. Figure 1 illustrates the process of binding an antibody to a PDA bezle using EDC / NHS chemistry.
FIG. 2 is a schematic diagram (A) of a T-shaped microfluidic system element and a T-shaped photograph (B) filled with a pink ink in a PDMS microfluidic system element.
Figure 3 shows a photolithography process for the manufacture of SU-8 PR molds.
FIG. 4 illustrates the process of colorimetric detection of PAT protein using immune-hydrogel beads in which PDA bezel is immobilized.
FIG. 5 is a schematic diagram of a microfluidic system for preparing a hydrogel droplet from a mixture of an antibody-PDA bezle and a PEG-DA hydrogel, wherein (A) is a synthesis scheme diagram of a hydrogel droplet, (BC) It shows the process of droplet formation in a fluid system element.
FIG. 6 shows the synthesis and photopolymerization (A) of the immuno-hydrogel beads, the synthesis scheme (B) of immunohydrogel beads using the PDMS microfluid system device and the process of collecting the immune-hydrogel beads from the vial FIG.
FIG. 7 shows optical microscope photographs of immuno-hydrogel beads containing antibody-PDA bejes and fluorescence photographs (B) of immuno-hydrogel beads as shown in (A).
FIG. 8 shows various hydrogel solutions according to the composition ratio of PEG-DA and PDA (TCDA: DMPC = 4: 1) PDA = 1: 1 (D), PEG-DA: PDA = 1: 2 (E), PEG-DA: PDA = 1: (F), and PDA Vesicle (G).
FIG. 9 shows the result of the colorimetric reaction of antibody-PDA vesicle with the result of UV-Vis absorption spectrum (A) of the antibody-PDA vesicle (TCDA: DMPC = 8: 2) B).
FIG. 10 shows the color shift of the reaction of the hydrogel in which the PDA bezate (a) and the PDA bezle are immobilized by the concentration of PAT (ab) and BSA (c) (0 to 2 μM) (B) is a PEG-DA hydrogel immobilized with anti-PAT PDA vesicles reacted with PAT concentration, and (c) was reacted with BSA as a control group. PEG-DA hydrogel in which the anti-PAT PDA bezel is fixed.
FIG. 11 shows a graph of the relative intensity of red from the hydrogel in which the PDA bezle and the PDA bezle are fixed by the concentration of the analyte.
FIG. 12 is a graph showing a standardized red fluorescence intensity from a hydrogel in which a PDA bezle is fixed according to the concentration of PAT and BSA protein.
FIG. 13 shows the colorimetric change of immuno-hydrogel beads (b: having a diameter of 2 mm) containing PDA beads of the same volume as the PDA bean curd (a) in the reaction by PAT concentration.
FIG. 14 is a graph showing the red relative intensities of PDA beads and immuno-hydrogel beads reacted by PAT concentration.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명은 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클을 포함하는 하이드로젤 비드에 관한 것이다.The present invention relates to a hydrogel bead comprising a polydiacetylene beadlet to which a reactor or a functional ligand is bound.

또한, 본 발명은 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클 및 고분자 함유 전구용액 액적(droplet)을 제조하는 단계; 및 상기 전구용액 액적을 중합시키는 단계를 포함하는 상기 하이드로젤 비드의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a process for preparing a polymer-containing precursor solution droplet comprising a polydiacetylene bezle and a polymer-bound precursor solution solution to which a reactor or a functional ligand is bound; And polymerizing the precursor solution droplet. The present invention also provides a method for producing the hydrogel bead.

본 발명에 따른 하이드로젤 비드는 폴리디아세틸렌 베지클을 하이드로젤 매트릭스에 고밀도로 포집하여 만든 것으로, 휴대가 가능하고 센싱 소재인 폴리디아세틸렌 베지클의 구조적 안정성 및 생물학적 활성도를 유지시켜주며 3차원적인 생물학적 반응(bio-reaction) 공간을 제공하는 비색형 바이오센서(colorimetric biosensor)의 새로운 플랫폼(platform)으로 적용할 수 있다. The hydrogel beads according to the present invention are formed by collecting polydiacetylene beads in a hydrogel matrix at a high density. The hydrogel beads maintain the structural stability and biological activity of the polydiacetylene bezle, which is portable and sensing material, And can be applied as a new platform for colorimetric biosensors that provide a bio-reaction space.

상기 폴리디아세틸렌 베지클에는 표적물질을 탐지할 수 있는 항체 등의 반응기 또는 기능성 리간드가 결합되어 있어 표적물질과의 반응을 통해 파란색에서 빨간색으로 색이 변하는 정도가 증폭되며, 이는 육안 또는 간단한 면역학적 분석을 통해 모니터링할 수 있다. 또한, RGB 분석을 통해 최소 20 nM의 표적물질까지 정량적 분석이 가능하다. The polydiacetylene bezle is bound to a reactive group such as an antibody capable of detecting a target substance or a functional ligand, thereby amplifying the degree of color change from blue to red through reaction with the target substance, It can be monitored through analysis. In addition, quantitative analysis of at least 20 nM of target material is possible via RGB analysis.

따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤 비드는 현장 진단형 시스템에 활용하기에 적합하고, 의료, 제약, 식품 등 여러 분야에서 생물학적 분석물질을 진단 및 검출에 활용할 수 있다.Therefore, the hydrogel beads according to the present invention are suitable for use in a field diagnostic system and can be used for diagnosis and detection in biological, analytical, medical, pharmaceutical, and food industries.

상기 폴리디아세틸렌 베지클은 직경이 100 내지 500 nm이며, 더 구체적으로 130 nm 내지 155 nm 일 수 있으며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 중합체, 또는 상기 화학식 1의 화합물과 인지질(phospholipid)의 복합물로부터 유도된 것을 사용할 수 있다: The polydiacetylene bezle may have a diameter of 100 to 500 nm, more specifically 130 nm to 155 nm, and may be a polymer of a compound represented by the following formula (1) or a complex of a compound of the formula (1) and a phospholipid Can be used:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

상기 식에서, In this formula,

R₁는 탄소수 1 내지 30의 알킬기이고,R ₁ is an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms,

R₂는 탄소수 1 내지 30의 알킬렌기이며,R ₂ is an alkylene group having 1 to 30 carbon atoms,

R₃는 에폭시기, 아지리딘기, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON₃, CH₂C(NH²⁺)OCH₃, -OP(O² ^-)OH, 또는 -SH를 나타낸다.R ₃ represents an epoxy group, an aziridine group, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON ₃ , CH ₂ C (NH ²⁺ ) OCH ₃ , -OP (O ² ^- ) OH, .

본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.The terms used in the definition of substituents of the compounds of the present invention are as follows.

"알킬"은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 1 내지 30의 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리형의 포화 탄화수소를 가리킨다. C₁ _-30 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐 및 이소데실이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한 상기 알킬은 "시클로알킬"을 포함한다. 상기 시클로알킬은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 3 내지 12의 비방향족, 포화 탄화 수소환으로서 단일환 및 융합환을 포함한다. C₃ _-12 시클로알킬의 대표적 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다."Alkyl " refers to a straight chain or branched chain or cyclic saturated hydrocarbon of 1 to 30 carbon atoms, unless otherwise indicated. Examples of C ₁ _-30 alkyl groups are methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, isopropyl, isobutyl, sec- butyl and tert- butyl, isopentyl, neopentyl, isohexyl , Isoheptyl, iso-octyl, isononyl, and isodecyl. The alkyl also includes "cycloalkyl ". The cycloalkyl includes a single ring and a fused ring as a nonaromatic, saturated hydrocarbon ring having 3 to 12 carbon atoms, unless otherwise specified. Representative examples of C ₃ _-12 cycloalkyl is cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and cyclooctyl include, but are not limited to these.

"알킬렌"은 상기 알킬로부터 유도된 2가의 유기로서, 바람직한 탄소수의 범위는 상기 알킬과 동일하다."Alkylene" is a divalent organic group derived from the above-mentioned alkyl, and the preferred number of carbon atoms is the same as that of the alkyl.

상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로, The compound of formula (1)

R₁는 탄소수 3 내지 18의 알킬기이고,R ₁ is an alkyl group having 3 to 18 carbon atoms,

R₂는 탄소수 3 내지 18의 알킬렌기이며,R ₂ is an alkylene group having 3 to 18 carbon atoms,

R₃는 -COOH 또는 -COH를 나타내는 화합물일 수 있다.R ₃ may be -COOH or -COH.

보다 구체적으로, 화학식 1의 화합물은 More specifically, the compound of formula (I)

R₁는 탄소수 6 내지 16의 알킬기이고,R ₁ is an alkyl group having 6 to 16 carbon atoms,

R₂는 탄소수 4 내지 10의 알킬렌기이며,R ₂ is an alkylene group having 4 to 10 carbon atoms,

R₃는 -COOH를 나타내는 화합물일 수 있다. R ₃ may be a compound that represents -COOH.

가장 구체적으로, 10,12-트리코사디이노산(10,12-Tricosadiynoic acid, TCDA)일 수 있다.Most specifically, it may be 10,12-Tricosadiynoic acid (TCDA).

상기 화학식 1의 화합물은 양쪽성 성질에 의해 수용액과 계면을 형성하므로 리포좀, 마이셀, Langmuir Blodgett 또는 Langmuir Schaeffer 필름과 같이 자기 조립이 가능하다. 자기 조립 시, 디아세틸렌 단량체들 사이의 거리가 충분히 좁으면 254 nm의 UV 빛으로 고분자화될 수 있는데, 이때 새로 형성된 고분자 결합에 의해 파란색을 띠게 된다. 여기서 고분자 결합의 색은 결합에 참여하는 π-컨쥬게이션(conjugation)과 밀접한 관련이 있으며, 외부 자극에 의해 고분자의 단량체들의 재배열이 일어나 π-축합이 짧아지면서 자극의 정도에 따라 점차 빨간색으로의 색 전이 현상을 보인다.The compound of formula (1) forms an interface with an aqueous solution due to its amphoteric properties, and thus can be self-assembled such as liposome, micelle, Langmuir Blodgett or Langmuir Schaeffer film. During self-assembly, when the distance between the diacetylene monomers is sufficiently narrow, they can be polymerized by UV light at 254 nm, which is blue due to the newly formed polymer bonds. Here, the color of the polymer bond is closely related to the conjugation of π-conjugation involved in binding. As a result of the rearrangement of the monomers of the polymer due to the external stimuli, the π-condensation becomes shorter, Color transition phenomenon.

상기 폴리디아세틸렌 베지클은 구조 내에 하기 화학식 2로 표시되는 반복단위를 포함할 수 있다:The polydiacetylene bezle may include a repeating unit represented by the following formula (2) in the structure:

[화학식 2](2)

상기 식에서, In this formula,

R₃는 에폭시기, 아지리딘기, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON₃, CH₂C(NH²⁺)OCH₃, -OP(O² ^-)OH, 또는 -SH를 나타내고,R ₃ represents an epoxy group, an aziridine group, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON ₃ , CH ₂ C (NH ²⁺ ) OCH ₃ , -OP (O ² ^- ) OH, Lt; / RTI >

n은 정수를 나타낸다.n represents an integer.

또한, 폴리디아세틸렌 베지클은 광중합할 수 없는 인지질을 더 포함할 수 있다. 상기 인지질은 베지클의 형태, 크기 등에 영향을 주지 않으면서 외부 자극 시 색 전이에 대한 민감도를 향상시킬 수 있다. In addition, the polydiacetylene bezle may further include a phospholipid which can not be photopolymerized. The phospholipid can improve the sensitivity to color transfer in external stimulation without affecting the shape, size, etc. of the bezacl.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 디아세틸렌 단량체로 된 중합체에 비해 디아세틸렌 단량체와 인지질의 혼합 중합체의 색 전이에 대한 민감도가 더 높다.According to one embodiment of the present invention, the sensitivity of the mixed polymer of the diacetylene monomer and the phospholipid to the color transfer of the diacetylene monomer is higher than that of the polymer composed of the diacetylene monomer.

상기 인지질은 1,2-디미리스토일 포스파티딜 콜린(1,2-dimyristoyl phosphatidyl choline), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylserine), 포스파티딕엑시드(phosphatidic acid), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티오에탄올(1,2-dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphothioethanol), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-바이오티닐(1,2-dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Biotinyl))등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The phospholipid may be selected from the group consisting of 1,2-dimyristoyl phosphatidyl choline, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, Phosphatidic acid, 1,2-dipalmitoyl- sn -Glycero-3-Phosphothioethanol, or 1,2-dipalmitoyl- - sn - glycero-3-phospho-ethanolamine biotinyl -N- (1,2-dipalmitoyl- sn -Glycero-3 -Phosphoethanolamine-N- (biotinyl)) , but can use the above alone or in combination of two or the like, whereby And is not particularly limited.

상기 인지질은 폴리디아세틸렌 베지클에 대하여 1 내지 80 몰%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내일 경우, 외부 자극 시 베지클의 색 전이에 대한 민감도를 높일 수 있다. The phospholipid may be contained in an amount of 1 to 80 mol% based on the polydiacetylene bezle. Within the above range, the sensitivity to the color transition of the bezuge at the time of external stimulation can be increased.

상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합할 수 있는 반응기 또는 기능성 리간드는 표적 분자와 결합할 수 있는 항체, 앱타머, DNA 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, 바이오틴, 또는 단백질 기반의 수용체 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The reactive group or the functional ligand capable of binding to the polydiacetylene bezle may be an antibody, an aptamer, a DNA probe, an RNA probe, a PNA probe, a biotin, or a protein-based receptor capable of binding to a target molecule, However, the present invention is not limited thereto.

상기 항체로 유전자변형작물의 마커 단백질인 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(PAT), 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신테이즈(CP4EPSPS), 바네이즈(Ms8), 또는 크리스탈 단백질(Crystal protein((Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2A, Cry 1C, Cry1F, Cry3B, Cry9C, 또는 Cry3Bb1) 등에 특이적인 단클론 또는 다클론 항체를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The antibody can be used as a marker protein of a transgenic crop, such as phosphinotricin acetyltransferase (PAT), 5-enolpyruvyl chymate-3-phosphate synthase (CP4EPSPS), barnase (Ms8) a monoclonal or polyclonal antibody specific to a protein (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2A, Cry1C, Cry1F, Cry3B, Cry9C, or Cry3Bb1) can be used.

상기 반응기 또는 기능성 리간드는 특별히 제한하는 것은 아니라 카보디이미드 반응을 통해 폴리디아세틸렌 베지클에 결합될 수 있다.The reactor or the functional ligand is not particularly limited and can be bound to polydiacetylene bezle through a carbodiimide reaction.

본 발명의 일 구체예에 따르면, EDC/NHS 하에서 폴리디아세틸렌 베지클을 항체와 반응시키면, EDC는 폴리디아세틸렌의 카르복실기와 반응하여 아민-반응성(석신이미딜) 중간체를 형성하고, NHS는 상기 아민-반응성 중간체를 아민-반응성 에스테르로 전환하여 상기 중간체를 안정화하여 항체의 아민기와 카보디이미드(carbodiimide) 결합을 통해 항체는 폴리디아세틸렌 베지클에 결합될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, when polydiacetylene bezle is reacted with an antibody under EDC / NHS, EDC reacts with the carboxyl group of polydiacetylene to form an amine-reactive (succinimidyl) intermediate, The antibody can be conjugated to polydiacetylene vesicles via carbodiimide linkage with the amine group of the antibody by converting the amine-reactive intermediate to an amine-reactive ester to stabilize the intermediate.

상기 폴리디아세틸렌이 고정되는 매트릭스를 형성하는 하이드로젤은 폴리디아세틸렌 베지클의 색을 유지할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지는 않으며, 구체적으로는 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리(N,N-에틸아미노에틸 메타크릴레이트), 히알루론산, 아가 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 고분자로부터 제조될 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜인 것이 좋다.The hydrogel forming the matrix to which the polydiacetylenes are fixed is not particularly limited as long as it can maintain the color of the polydiacetylene bezle, and specific examples thereof include polyacrylic acid, polyacrylamide, polyhydroxyethyl methacrylate, polyethylene Glycol, poly (N, N-ethylaminoethyl methacrylate), hyaluronic acid, agar and chitosan. More specifically, it may be polyethylene glycol.

상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 575 내지 2000인 것을 사용할 수 있다. 또한 말단에 아크릴레이트 작용기가 결합되어 있어 UV 광원 조사 시 광개시제에 의해 자유라디칼 중합이 일어나 중합체를 형성할 수 있다.The polyethylene glycol having a molecular weight of from 575 to 2000 can be used. In addition, since an acrylate functional group is bonded to the terminal, free radical polymerization can be performed by a photoinitiator upon UV light irradiation to form a polymer.

상기 하이드로젤의 기공 크기는 직경이 0.1 내지 10 nm인 것이 좋은데, 상기 범위인 경우 검출 또는 반응시키고자 하는 물질이 하이드로젤의 그물망을 통과하여 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드와 결합하여 색 변화를 유도할 수 있다.It is preferable that the pore size of the hydrogel is 0.1 to 10 nm in diameter. When the range is within the above range, the substance to be detected or reacted is passed through the network of the hydrogel to be combined with the reactive group or the functional ligand bonded to the polydiacetylene bezle So that the color change can be induced.

따라서, 본 발명의 하이드로젤 비드는 폴리디아세틸렌 베지클 및 고분자 함유 전구용액 액적(droplet)을 제조하는 단계; 및 상기 전구용액 액적을 중합시키는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.Thus, the hydrogel beads of the present invention can be prepared by preparing a polydiacetylene bezle and a polymer containing precursor solution droplet; And polymerizing the precursor solution droplets.

상기 전구용액은 증류수 또는 완충용액 중 어느 하나의 용매에 고분자 및 폴리디아세틸렌 베지클을 1:1 내지 1:4의 중량비로 혼합하여 제조할 수 있다. 본 발명의 하이드로젤 비드의 경우, 파란색을 띠는 폴리디아세틸렌 베지클과 고분자를 섞었을 때 파란색이 유지되어야 하는데, 상기 고분자가 폴리디아세틸렌 베지클과의 1:1 혼합비를 초과하는 양으로 혼합되는 경우, 폴리디아세틸렌 베지클의 구조에 영향을 미쳐 표적물질과 반응시키기 전에 색이 변하여 센서물질로 활용하기 어렵고, 상기 폴리디아세틸렌 베지클이 고분자와의 4:1 혼합비를 초과하는 경우, 상대적으로 고분자가 너무 묽어져 UV(365nm)를 조사했을 때 가교형성이 안되어 젤로 경화가 잘 안될 수 있다.The precursor solution may be prepared by mixing a polymer and polydiacetylene bezle in a solvent of distilled water or buffer solution at a weight ratio of 1: 1 to 1: 4. In the case of the hydrogel bead of the present invention, blue should be kept when the polymer is mixed with the polydiacetylene bezle having a blue color. When the polymer is mixed in an amount exceeding the mixing ratio of 1: 1 with polydiacetylene bezle , It is difficult to use the polymer material as a sensor material because its color changes before reacting with the target material due to the influence of the structure of the polydiacetylene bezle. When the polydiacetylene bezle exceeds the 4: 1 blend ratio with the polymer, , The polymer is too thin, and when irradiated with UV (365 nm), crosslinking can not be formed, and gelation hardly occurs.

상기 전구용액 액적은 유중수형 또는 수중유형 에멀젼 내에서 형성될 수 있다.The precursor solution droplets can be formed in a water-in-oil type or an underwater type emulsion.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 하이드로젤 비드는 미세유체시스템 칩(microfluidic chip)을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 미세유체시스템 칩은 마이크로리터(㎕) 혹은 그 보다 적은 양의 샘플 혹은 시약이면 충분하고 마이크로 사이즈의 채널 폭 조절 및 유속 조절로 채널 내부의 유체를 마음대로 가공 및 조작이 가능하다. According to one embodiment, the hydrogel beads of the present invention can be prepared using microfluidic chips. The microfluidic system chip is sufficient for microliter (μl) or less of the sample or reagent, and it is possible to freely process and manipulate the fluid in the channel by controlling the microchannel channel width and the flow rate.

따라서, 본 발명의 하이드로젤 비드의 크기는 유체 속도 및 서로 다른 크기의 튜브를 연결함으로써 조절될 수 있다. Thus, the size of the hydrogel beads of the present invention can be controlled by connecting fluid velocity and tubes of different sizes.

미세유체시스템 칩을 이용한 액적(droplet) 제작 방법에는 colliding jets, cross-flowing (T-junctions: T-자형) 그리고 flow-focusing 등이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 서로 다른 채널에 수용상과 오일상을 흘러주어 연속적이고 자동적인 액적을 제작하는 T-자형을 이용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 수용상은 폴리디아세틸렌 베지클 및 폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액이고, 상기 오일상은 쿠킹 오일(Cooking oil), 헥세인(Hexane), 데칸(decane), n-데칸(n-decane), 도데칸(dodecane), 스쿠알렌(Squalene), 콜레스테롤, 테트라데칸(tetradecane), 헥사데칸(hexadecane), 노난(nonane), 사이클로헥산, 폴리비닐알코올, 라우르산, 아세트산, 포름산, 벤젠, 나프탈렌, 니트로벤젠, 페놀 또는 에틸렌 브로마이드 등의 유기용매를 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 데칸일 수 있다.Colliding jets, cross-flowing (T-junctions: T-shaped) and flow-focusing can be used for droplet fabrication using a microfluidic system chip. More specifically, it is possible to use a T-shape in which continuous and automatic droplets are produced by flowing an acceptance phase and an oil phase to different channels, but the present invention is not limited thereto. In the present invention, the aqueous phase is a precursor solution containing polydiacetylene bezle and polyethylene glycol, and the oil phase is selected from the group consisting of Cooking oil, Hexane, decane, n-decane, But are not limited to, dodecane, squalene, cholesterol, tetradecane, hexadecane, nonane, cyclohexane, polyvinyl alcohol, lauric acid, acetic acid, formic acid, benzene, naphthalene, , Phenol, or ethylene bromide, may be used alone or in combination of two or more. More specifically, it may be decane.

상기와 같이 형성된 전구용액 액적은 UV 광원(λ=365nm)에 노출시킬 경우 라디칼중합이 유도되어 하이드로젤 비드가 형성될 수 있다.When the precursor solution droplet formed as described above is exposed to a UV light source (? = 365 nm), radical polymerization may be induced to form hydrogel beads.

상기 광중합을 유도하기 위해 광개시제를 추가로 포함할 수 있는데, 예컨대, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone, DMPA), 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropipphenone, HOMPP), 다로큐어 1173(Darocur 1173), 또는 어가큐어 2959(Irgacure 2959) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.The photoinitiator may further include a photoinitiator to induce the photopolymerization. For example, 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA), 2-hydroxy- 2-methylpropiphenone (HOMPP), Darocur 1173 (Darocur 1173), or Irgacure 2959 (Irgacure 2959) can be used singly or in combination of two or more.

상기 광개시제는 전구용액 내 포함된 폴리에틸렌글리콜의 함량을 고려하여 폴리에틸렌글리콜 1 중량부에 대하여 0.001 내지 0.02 중량부로 포함되는 것이 좋다.The photoinitiator may be included in an amount of 0.001 to 0.02 part by weight based on 1 part by weight of polyethylene glycol in consideration of the content of polyethylene glycol contained in the precursor solution.

상기 미세유체시스템 칩을 통해 경화된 폴리디아세틸렌 베지클이 고정된 하이드로젤 비드는 완충용액에서 침전되어 오일상과 쉽게 분리할 수 있다. The hydrogel beads in which the cured polydiacetylene bezle is immobilized through the microfluidic system chip can be easily separated from the oil phase by being precipitated in the buffer solution.

분리된 폴리디아세틸렌 베지클이 고정된 하이드로젤 비드는 직경이 1㎛ 내지 1mm 일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
The hydrogel beads to which the separated polydiacetylene beads are immobilized may have a diameter of 1 탆 to 1 mm, but are not particularly limited thereto.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하이드로젤 비드를 포함하는 바이오 센서에 관한 것이다. The present invention also relates to a biosensor comprising a hydrogel bead according to the present invention.

본 발명의 하이드로젤 비드는 표면에 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클이 고정된 하이드로젤 비드로서, 표적물질이 제공되면, 하이드로젤 비드 내 반응기 또는 기능성 리간드에 표적물질이 결합하면서 폴리디아세틸렌의 응집이 생긴다. 상기 응집은 폴리디아세틸렌 백본의 유의적인 틸팅을 유발하여 결합 길이를 효과적으로 감소시킨다. 이러한 폴리디아세틸렌의 π-π 밴드 갭에서의 변화는 폴리디아세틸렌 베지클의 광학적 특성에 영향을 미치게 된다. 즉, 파란색이 빨간색으로의 색 전이를 나타내고, 이는 육안으로 관찰할 수 있다. The hydrogel bead of the present invention is a hydrogel bead having polydiacetylene beads fixed to its surface with a reactor or a functional ligand bonded thereto. When a target substance is provided, the target substance binds to the reactor or the functional ligand in the hydrogel bead, Aggregation of diacetylene occurs. The aggregation causes significant tilting of the polydiacetylene backbone, effectively reducing the bond length. The change in the π-π band gap of the polydiacetylenes affects the optical properties of the polydiacetylene bezle. That is, blue represents the color transition to red, which can be observed with the naked eye.

또한, 빨간색으로의 변화는 형광으로도 검출이 가능하다. 여기파장 540 nm, 방출파장 620 nm에서 표적물질의 농도 의존적으로 형광 강도가 증가하므로 표적물질을 선택적으로 검출할 수 있다.In addition, changes to red can be detected by fluorescence. The target substance can be selectively detected because the fluorescence intensity is increased depending on the concentration of the target substance at the excitation wavelength of 540 nm and the emission wavelength of 620 nm.

이러한 색 변이의 정도를 수치화하면 표적물질의 농도를 계산할 수 있다.By quantifying the degree of such color variation, the concentration of the target substance can be calculated.

상기 반응기 또는 기능성 리간드는 표적물질에 대한 특이성을 갖는 것일 수 있어, 표적물질을 특이적이고, 선택적으로 검출할 수 있는 특징이 있다. The reactor or the functional ligand may have specificity for the target substance, and the target substance can be specifically and selectively detected.

따라서, 상기 반응기 또는 기능성 리간드는 항체, 앱타머, DNA 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, 바이오틴, 또는 단백질 수용체 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.Thus, the reactors or functional ligands can be used alone or in combination of two or more, but not particularly limited thereto, such as an antibody, an aptamer, a DNA probe, an RNA probe, a PNA probe, a biotin or a protein receptor.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 하이드로젤 비드의 검출한계(the limits of detection, LOD)는 20 nM 로서 매우 낮은 농도의 표적물질을 검출할 수 있다. 이는 기존에 보고된 S-ELISA와 CI-ELISA 방법의 검출한계가 각각 0.01㎍/mL과 1.0㎍/mL 임을 감안할 때 면역-하이드로젤 비드는 표적물질에 대한 민감도가 뛰어나다고 할 수 있다. 식물조직 안에 유전 형질전환체(transgenic materials)의 일반적인 농도는 10㎍/g 이상이고 GM 피망(pepper)의 PAT 단백질 농도는 3-5㎍/g tissue이라고 보고된바 있어 본 발명의 하이드로젤 비드의 검출한계(0.14㎍/300㎕ reaction)는 GMO의 표적 단백질을 검출하기에 충분히 낮다고 할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the limits of detection (LOD) of the hydrogel beads is 20 nM, so that a very low concentration of the target substance can be detected. Considering that the detection limits of the previously reported S-ELISA and CI-ELISA methods are 0.01 μg / mL and 1.0 μg / mL, respectively, the immune-hydrogel beads have excellent sensitivity to the target substance. It has been reported that the general concentration of transgenic materials in plant tissues is 10 / / g or more and the concentration of PAT protein in GM pepper is 3-5 / / g tissue. Thus, hydrogel beads of the present invention The detection limit (0.14 μg / 300 μl reaction) is low enough to detect the target protein of GMO.

또한, 본 발명의 하이드로젤 비드는 휴대성이 좋고 쉽게 수거가 가능하여 현장 진단용으로 사용이 가능하고 구조체 형태의 고체 타입이기 때문에 쉽게 가라앉아서 원심분리와 같은 부가적인 장비 없이도 표적물질을 검출 후 쉽게 수거할 수 있다. Since the hydrogel bead of the present invention has good portability and can be easily collected, it can be used for on-site diagnosis and it is a solid type of structure. Therefore, it is easy to sit down and collect target substances easily without any additional equipment such as centrifugation can do.

본 발명의 바이오센서는 표적물질을 검출하고자 하는 시료용액과 혼합하여 표적물질의 유무 및 농도를 확인할 수 있는 통상의 키트로 제공될 수 있다.
The biosensor of the present invention can be provided as a conventional kit capable of checking the presence or concentration of a target substance by mixing the target substance with a sample solution to be detected.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하이드로젤 비드와 시료를 반응시키는 단계; 및 반응물의 비색변화 또는 형광변화를 측정하는 단계를 포함하는 표적물질의 탐지방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for preparing a hydrogel bead, comprising the steps of: reacting a sample with a hydrogel bead according to the present invention; And measuring the color change or fluorescence change of the reactant.

본 발명의 하이드로젤 비드는 수용액 하에서 쉽게 분산할 수 있고, 표적물질과 특이적인 상호작용에 의해 색 전이를 나타내기 때문에, 시료 용액과 본 발명의 하이드로젤 비드를 반응시키면 하이드로젤 비드 내에 있는 반응기 또는 기능성 리간드가 표적물질과 특이적으로 결합하여 용액의 색이 파란색에서 빨간색으로 전이됨을 육안으로 관찰함으로써 표적물질을 확인할 수 있다. Since the hydrogel beads of the present invention can easily be dispersed in an aqueous solution and exhibit color transfer due to specific interaction with the target material, when the sample solution is reacted with the hydrogel bead of the present invention, The target substance can be identified by visual observation that the functional ligand specifically binds to the target substance and the color of the solution changes from blue to red.

또한, 상기 색 변화는 디지털 이미지 분석 소프트웨어, 예를 들어, ImageJ 소프트웨어에서 프로그램된 RGB 모듈을 통해 정량화할 수 있다. In addition, the color change can be quantified through digital image analysis software, for example RGB modules programmed in ImageJ software.

빨간색으로의 변화는 형광으로도 검출이 가능하다. 여기파장 540 nm, 방출파장 620 nm에서 표적물질의 농도 의존적으로 형광 강도가 증가하므로 형광 방출 거동을 이용하여 표적물질의 신호를 정량화할 수 있다.
Changes in red can be detected by fluorescence. Since the fluorescence intensity increases at the excitation wavelength of 540 nm and the emission wavelength of 620 nm depending on the concentration of the target substance, the fluorescence emission behavior can be used to quantify the signal of the target substance.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하이드로젤 비드와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 유전자변형작물의 판별방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for identifying a transgenic crop comprising the step of reacting a sample with a hydrogel bead according to the present invention.

상기 반응기 또는 기능성 리간드로 유전자변형작물 마커 단백질에 대한 항체를 사용함으로써, 미지의 시료가 상기 단백질을 포함할 경우, 하이드로젤 비드 내에 있는 항체와 특이적으로 결합함에 따른 용액 내 색 전이를 확인하거나, 형광 강도의 증가를 측정하여 유전자변형작물을 판별할 수 있다.By using an antibody against the transgenic crop marker protein as the reactor or the functional ligand, it is possible to confirm the in-solution color transition due to the specific binding with the antibody in the hydrogel bead when the unknown sample contains the protein, Genetically modified crops can be identified by measuring the increase in fluorescence intensity.

상기 유전자변형작물 마커 단백질의 종류는 상술한 바와 같다.
The genetically modified crop marker protein is as described above.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

하기 실시예에서 사용된 10,12-Tricosadiynoic acid (TCDA)는 GFS Chemicals (Columbus, OH, USA)에서 구입하였다. 1,2-Dimyristoyl phosphatidyl choline (DMPC)는 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다. N-hydroxysuccinimide (NHS), Bovine serum albumin (BSA), N-ethyl-N-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) powder, Poly(ethylene glycol) diacrylate molecular weight (MW) 700g mol^-1 (PEG-DA 700), 2-hydroxy-2-methylpropiophenon (Darocur 1173), 및 Tris-EDTA (1×, pH 7.4) (TE) buffer는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 클로로포름은 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 항-PAT 항체 및 PAT 단백질은 경희대학교 김해영 교수님으로부터 제공받았다. 모든 실험에서 사용된 물은 2차 증류수이다.
10,12-Tricosadiynoic acid (TCDA) used in the following examples was purchased from GFS Chemicals (Columbus, OH, USA). 1,2-Dimyristoyl phosphatidyl choline (DMPC) was purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). N-hydroxysuccinimide (NHS), Bovine serum albumin (BSA), N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (TE) buffer was added to Sigma (Sigma) at a dilution ratio of ¹ : ¹ , and the concentration of the conjugated dienes -Aldrich (St. Louis, Mo., USA). Chloroform was purchased from Junsei Chemical (Tokyo, Japan). Anti-PAT antibody and PAT protein were obtained from professor Kim Hae Young of Kyung Hee University. The water used in all experiments is secondary distilled water.

<제조예 1> 폴리디아세틸렌 베지클의 제조PREPARATION EXAMPLE 1 Preparation of polydiacetylene bezle

PDA 베지클을 만들기 위해 두 종류의 지질 단량체, TCDA(10,12- Tricosadiynoic acid)와 DMPC(1,2-Dimyristoyl phosphatidyl choline)를 바이알에 최종 농도 2mM에 맞추어 8:2 몰 비율로 클로로포름(chloroform)에 녹였다. Ar gas jet으로 클로로포름을 날려서 제거하고, 남아있는 용매를 완전히 제거하기 위해 진공상태에서 오버나이트 동안 정치하였다. 최종 2mM 지질 농도에 맞춰 HEPES 용액(5mM, pH 7.4)을 가하였다. 이 용액을 80℃의 수조에 1시간 동안 가열한 뒤 15분 동안 초음파처리(probesonicator, Sonics & Materials, INC, VCX 500)하였다. 초음파처리 후 지질 응집물을 제거하기 위해 0.8㎛ 시린지 필터를 이용하여 용액을 여과하고, 지질 멤브레인의 결정화를 4℃에서 냉장 보관하여 오버나이트 동안 정치하였다. 254 nm 파장의 UV (Vilber Lourmat, VL-4.LC)를 조사함으로써 배열된 디아세틸렌 단량체는 1,4-첨가(1,4-addition)에 의한 중합을 이루게 되고 파란색의 PDA 베지클 용액을 얻었다.Two types of lipid monomers, TCDA (10,12-Tricosadiynoic acid) and DMPC (1,2-Dimyristoyl phosphatidyl choline), were added to the vials to a final concentration of 2 mM to form PDA beads, and chloroform was added at an 8: Respectively. Chloroform was blown off with an Ar gas jet and allowed to stand overnight in a vacuum to completely remove the remaining solvent. HEPES solution (5 mM, pH 7.4) was added to the final 2 mM lipid concentration. The solution was heated in a water bath at 80 ° C. for 1 hour and then sonicated for 15 minutes (probesonicator, Sonics & Materials, INC, VCX 500). After the ultrasonic treatment, the solution was filtered using a 0.8 μm syringe filter to remove lipid aggregates, and the crystallization of the lipid membrane was kept at 4 ° C. in the refrigerator and allowed to stand over night. By irradiating UV (Vilber Lourmat, VL-4. LC) with a wavelength of 254 nm, the diacetylene monomer was polymerized by 1,4-addition, and a blue PDA bezel solution was obtained .

<제조예 2> 표면에 항체가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클의 제조PREPARATION EXAMPLE 2 Preparation of Polydiacetylene Vesicles Having Antibodies Bonded to Surfaces

PDA 베지클 표면에 항체를 부착하기 위해 bio-conjugation 방법인 EDC/NHS coupled reaction을 이용하였다(도 1). TCDA 헤드 그룹의 카르복실산은 과량의 NHS 및 EDC에 의해 석신이미딜 활성 에스테르(succinimidyl active esters)로 바뀐다. 먼저, 카르복실산의 활성화를 위해 PDA 베지클 용액을 20mM EDC와 40mM NHS를 녹인 5mM HEPES 완충용액(pH 7.4)과 섞어 상온에서 2시간 이상 반응시켰다. 과량의 NHS 및 EDC는 13,000×g(Eppendorf 5415R, Eppendorf Geratebau, Hamburg, Germany)에서 원심 분리하여 제거하였다. An EDC / NHS coupled reaction, a bio-conjugation method, was used to attach the antibody to the surface of the PDA bezle (Fig. 1). The carboxylic acid of the TCDA head group is converted to succinimidyl active esters by excess NHS and EDC. First, to activate the carboxylic acid, the PDA bezel solution was mixed with 5 mM HEPES buffer (pH 7.4) in which 20 mM EDC and 40 mM NHS were dissolved, and reacted at room temperature for 2 hours or more. Excess NHS and EDC were removed by centrifugation at 13,000 x g (Eppendorf 5415R, Eppendorf Geratebau, Hamburg, Germany).

PAT 단백질을 준비하기 위해 PAT 단백질을 코딩하는 pat 유전자를 GM 옥수수 Bt11에서 추출하여 pET15b 벡터에 클로닝한 후 이 콜라이(E. coli) BL21에서 과발현하였다. 항-PAT 항체는 앞서 얻은 PAT 단백질을 토끼에 주입하여 세 번의 면역반응을 통해 얻었다.To prepare the PAT protein, the pat gene encoding the PAT protein was extracted from GM corn Bt11 and cloned into the pET15b vector and overexpressed in E. coli BL21. The anti-PAT antibody was obtained by three immunizations by injecting the above-obtained PAT protein into the rabbit.

항체를 PDA 베지클 표면의 석신이미딜 활성 에스테르에 펩티드 결합으로 부착시키기 위해 항-PAT 항체 (300㎍/mL)가 들어있는 HEPES 완충용액에 활성화된 PDA 베지클을 재현탁시켰다. 이 혼합용액을 4℃에서 섞어주면서 오버나이트 동안 정치하였다. 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 원심분리용 필터(centrifugal filter, MWCO, 30,000 Da, Microcon, Millipore, Bedford, MA, USA)를 이용하여 HEPS 완충용액으로 2번 세척하였다. PDA 베지클 표면에 남아있는 석신이미딜 활성 에스테르는 2mM 에탄올아민(ethanolamine)으로 비활성화시켰다. 이후 254nm 파장의 UV를 조사함으로써 PDA 베지클은 중합체를 형성하고 파란색으로 바뀌었다.The activated PDA vesicles were resuspended in HEPES buffer containing anti-PAT antibody (300 [mu] g / ml) to attach the antibody to the succinimidyl active ester on the PDA bezle surface as a peptide bond. The mixed solution was allowed to stand over night while being mixed at 4 ° C. The cells were washed twice with HEPS buffer using a centrifugal filter (MWCO, 30,000 Da, Microcon, Millipore, Bedford, Mass., USA) to remove unbound antibody. The remaining succinimidyl active ester on the PDA bezle surface was inactivated with 2 mM ethanolamine. By irradiating UV with a wavelength of 254 nm, the PDA bezle formed a polymer and turned blue.

<제조예 3> PDMS 미세유체시스템 칩의 제조 및 셋업PREPARATION EXAMPLE 3 Preparation and Setup of a PDMS Microfluidic System Chip

T-자형 PDMS 미세유체시스템 칩의 개략도는 도 2A와 같다. 채널 높이는 100 ㎛이고 오일과 수용상 채널 폭은 각각 1000 ㎛와 750 ㎛이다. 미세유체시스템은 표준 포토리쏘그래피 기술(standard photolithography techniques)을 이용하여 만들었다(Duffy DC, McDonald JC, Schueller OJA, Whitesides GM: Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem 1998, 70(23):4974-4984).A schematic diagram of a T-shaped PDMS microfluidic system chip is shown in FIG. 2A. The channel height is 100 占 퐉, and the oil and accommodating channel widths are 1000 占 퐉 and 750 占 퐉, respectively. Microfluidic systems made using a standard photo lithographic techniques (standard photolithography techniques) (Duffy DC , McDonald JC, Schueller OJA, Whitesides GM:. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly (dimethylsiloxane) Anal Chem 1998, 70 (23): 4974-4984).

먼저, SU-8 PR 몰드를 만들기 위해 4 인치 실리콘 웨이퍼 표면에 네거티브 PR (포토레지스트)(SU-8 2050, Microchem, MA, USA)을 1000 ㎛ 두께로 스핀-코팅하였다. PR 코팅된 웨이퍼를 90℃에서 20분간 프리베이크(prebake)하고 미세채널(CAD/Art Services, Ind. Bandon, OR)이 패턴된 필름 마스크를 웨이퍼 위에 올렸다. 365nm 파장의 UV (150mJ/cm²)를 조사하여 필름 마스크의 노출된 형상만 선택적으로 경화시켰다. 포스트-베이크(Post-bake) 후 경화되지 않은 PR을 제거하는 디벨럽(development) 과정을 거쳐 SU-8 PR 몰드를 제작하였다(도 3). First, a negative PR (photoresist) (SU-8 2050, Microchem, MA, USA) was spin-coated on a 4 inch silicon wafer surface to a thickness of 1000 μm to make the SU-8 PR mold. The PR coated wafer was prebaked at 90 DEG C for 20 minutes and a patterned film mask with microchannels (CAD / Art Services, Ind. Bandon, OR) was placed on the wafer. Exposure of the film mask was selectively cured by irradiation with UV (150 mJ / cm ² ) at a wavelength of 365 nm. After the post-bake, the SU-8 PR mold was fabricated through a development process to remove uncured PR (FIG. 3).

PDMS 전중합체(prepolymer)(Sylgard 184, Dow corning Corp., MI, USA)와 경화제를 10:1 비율로 섞은 혼합액을 SU-8 PR 몰드 위에 부었다. 진공오븐(BF-30VO, BioFree, Korea)에서 기포를 제거하고 70℃에서 2시간 동안 경화시켰다. PDMS 레플리카를 주형(mold)으로부터 떼어내고 미세채널 내부로 용액을 넣을 수 있도록 주입구(inlet)과 배출구(outlet)에 구멍을 뚫었다. PDMS 레플리카와 세척된 슬라이드 글라스(1mm 두께)를 플라즈마 장치(CUTE-100LF, FEMTO Science)에서 1분간 처리한 후 접합시켰다. 미세채널 내부 PDMS 표면의 소수성 회복을 위해 접합시킨 장치를 65℃에서 오버나이트 동안 정치하였다. 이렇게 완성한 T-자형 PDMS 미세유체시스템 칩은 도 2B와 같다.
A mixed solution of a PDMS prepolymer (Sylgard 184, Dow Corning Corp., MI, USA) and a curing agent in a ratio of 10: 1 was poured onto the SU-8 PR mold. The bubbles were removed from the vacuum oven (BF-30VO, BioFree, Korea) and cured at 70 ° C for 2 hours. The PDMS replica was removed from the mold and a hole was drilled in the inlet and outlet to allow the solution to flow into the microchannel. The PDMS replica and washed slide glass (1 mm thick) were treated for 1 minute in a plasma device (CUTE-100LF, FEMTO Science) and then bonded. For hydrophobic recovery of the surface of the PDMS inside the microchannel, the bonded device was allowed to stand at 65 ° C over night. The completed T-shaped PDMS microfluidic system chip is shown in FIG. 2B.

<실시예 1> 면역-하이드로젤 비드의 제조Example 1 Preparation of Immune-Hydrogel Beads

PAT 단백질을 검출하기 위해 항-PAT 항체가 결합된 PDA 베지클이 PEG-DA 하이드로젤 내부에 포집된 면역-하이드로젤 비드를 제작하였다(도 4). 먼저, 50% PEG-DA와 1% Darocur 1173 (photoinitiator)를 1×Tris-EDTA 완충용액에 섞어서 PEG-DA 용액을 제조하였다. PEG-DA 용액과 항체 PDA 베지클 컨쥬게이트를 섞어 PEG-DA 전구용액을 준비하였다. 이때, 최적의 PEG-DA와 PDA 베지클 조성비를 찾기 위해 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4 로 다양하게 준비하였다. In order to detect the PAT protein, an immunohydrogel bead in which a PDA bead conjugated with an anti-PAT antibody was captured inside a PEG-DA hydrogel was prepared (FIG. 4). First, PEG-DA solution was prepared by mixing 50% PEG-DA and 1% Darocur 1173 (photoinitiator) in 1x Tris-EDTA buffer solution. The PEG-DA solution was prepared by mixing the PEG-DA solution and the antibody PDA-Vesicle conjugate. In order to find optimal PEG-DA and PDA beige composition ratios, various preparations were prepared at 4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2 and 1: 4.

하이드로젤 액적(droplet)은 미세유체시스템 칩(microfluidic chip) 내부에 90°를 이루는 T-자형에서 오일상과 수용상 플로우가 만나면서 만들어진다(도 5A). 도 5A는 항체-PDA 베지클 컨쥬게이트와 PEG-DA 전구용액이 T-자형에서 액적으로 만들어지는 과정을 나타낸 모식도이고, 도 5B-C는 PDMS 미세유체시스템 칩 내부에서 액적이 실제로 만들어지는 과정을 촬영한 사진이다. The hydrogel droplets are made in a T-shape at 90 ° inside the microfluidic chip, while meeting the oily and aqueous phase flows (Fig. 5A). FIG. 5A is a schematic diagram showing a process in which an antibody-PDA bead complex conjugate and a PEG-DA precursor solution are made into a droplet in a T-shape, and FIG. 5B-C shows a process in which a droplet is actually formed in a PDMS microfluid system chip It is a photograph taken.

액적의 크기는 시린지 펌프를 이용한 각 채널의 유속으로 조절될 수 있고, 배출구에 서로 다른 내경의 튜브를 연결함으로써 조절이 가능하다. 따라서, 메인 채널의 주입구로 오일상을 주입하고, 또 다른 주입구로는 수용상을 주입하며, 이때 유속(flow rate)은 시린지 펌프(22 I/W, Harvard Apparatus Inc., Holliston, MA, USA)로 조절하였는데 수중유형 유속비(oil-to-water flow rate ratio)는 25로 고정하였다. 그리고 오일상과 수용상은 각각 n-데칸과 PEG-DA 전구용액으로 구성하였다. T-자형에서 만들어진 하이드로젤 액적은 메인 채널의 배출구에 연결된 튜브를 통해 빠져나오게 된다(도 6A). PEG-DA 하이드로젤 액적은 UV 광원(λ=365nm)에 의해 광중합을 거쳐 면역-하이드로젤 비드로 완성되었다. The size of the droplets can be controlled by the flow rate of each channel using a syringe pump and can be adjusted by connecting different inner diameter tubes to the outlet. The syringe pump (22 I / W, Harvard Apparatus Inc., Holliston, MA, USA) was used to inject the oily phase into the injection port of the main channel, And the oil-to-water flow rate ratio was fixed at 25. The oily phase and the aqueous phase were composed of n-decane and PEG-DA precursor solution, respectively. The hydrogel droplets made in T-shape exit through the tube connected to the outlet of the main channel (FIG. 6A). The PEG-DA hydrogel liquid was light-cured by a UV light source (? = 365 nm) and was completed as an immuno-hydrogel bead.

도 6B는 PDMS 미세유체시스템 칩을 이용하여 면역-하이드로젤 비드를 제작중인 실험사진이다. 미세유체시스템 칩의 배출구에 연결된 튜브를 통해 아직 중합과정을 거치지 않은(unpolymerized) 하이드로젤 액적이 빠져나오는 것을 확인할 수 있다. 이때 PEG-DA 하이드로젤 액적이 경화되는 노출 시간을 찾기 위해 포토마스크를 통해 UV 광원을 30, 60, 120, 180초 노출시켜 보았다. 최종적으로 중합과정을 마친 완전한 면역-하이드로젤 비드를 HEPES 완충용액이 담긴 바이알에서 오일과 분리시켜 모을 수 있었다(도 6C). FIG. 6B is an experimental photograph showing the preparation of an immuno-hydrogel bead using a PDMS microfluid system chip. Through the tube connected to the outlet of the microfluidic system chip, it can be seen that the unpolymerized hydrogel droplet still exits. At this time, the UV light source was exposed through the photomask for 30, 60, 120, and 180 seconds to find the exposure time for curing of the PEG-DA hydrogel droplet. Finally, the complete immune-hydrogel beads that had undergone the polymerization process could be collected and separated from the oil in a vial containing HEPES buffer (FIG. 6C).

도 7A는 위 과정을 통해 제작한 면역-하이드로젤 비드를 광학 현미경으로 찍은 사진이고 크기는 대략 700 ㎛ 이다. 앞서 설명한 바와 같이 비드의 크기는 조절 가능하다. 도 7B는 PAT 단백질이 하이드로젤 비드 내부로 침투하여 PDA 베지클 표면의 항체와 결합하여 PDA 베지클이 빨간색 형광을 띠는 것을 형광현미경으로 찍은 사진이다.
FIG. 7A is a photograph of an immuno-hydrogel bead prepared through the above process by an optical microscope, and its size is approximately 700 μm. As described above, the size of the bead is adjustable. FIG. 7B is a photograph showing that the PAT protein penetrates into the hydrogel bead and binds to the antibody on the surface of the PDA bezle so that the PDA bezle shows red fluorescence.

<실험예 1> 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디아세틸렌 베지클의 최적 혼합비 비교Experimental Example 1 Comparison of optimum mixing ratio of polyethylene glycol and polydiacetylene bezle

PDA 베지클을 하이드로젤 안에 포집하였을 때 PDA 베지클이 구조적 안정성을 가지면서 표적물질을 센싱할 수 있는 바이오센서로서의 고유성질을 유지하는 것이 중요하다. 따라서, PEG-DA 용액과 PDA 베지클을 섞었을 때 PEG-DA가 PDA 베지클에 미치는 영향을 알아보고 최적의 조성비를 찾고자 하였다. PEG-DA 용액과 파란색의 PDA(TCDA:DMPC=8:2) 베지클을 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4 비율로 섞어보았다. When the PDA bezel is captured in the hydrogel, it is important to maintain the inherent property of the PDA bezle as a biosensor capable of sensing the target substance with structural stability. Therefore, we investigated the effect of PEG-DA on PDA vesicles when PEG-DA solution was mixed with PDA bejecle and wanted to find the optimal composition ratio. PEG-DA solution and blue PDA (TCDA: DMPC = 8: 2) vesicles were mixed at a ratio of 4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2 and 1: 4.

결과적으로, 상기 혼합 비율에서 모두 PDA 베지클의 색이 변하였다(도 8). 이는 PEG-DA가 PDA 베지클의 ene-yne conjugated backbone에 영향을 주어 다른 외부자극이 없이도 전에 색 변화가 일어난 것이다. 그래서 PEG-DA를 줄이고 PDA 베지클 비율을 높였다. PEG-DA 용액과 PDA 베지클 비율을 1:1로 섞었을 경우 파란색이 희석되거나 색이 변하지 않았지만 최적의 조성비로 선택하기에는 여전히 충분하지 못했다. 1:4 비율로 섞었을 때 PDA 베지클만으로 이루어진 샘플 정도의 파란색을 유지하였고, UV 광원(λ=365nm) 조사에 의해 젤 상태로 경화되었다(도 8F).As a result, the PDA beige color changed in all of the above mixing ratios (Fig. 8). This is because the PEG-DA affects the ene-yne conjugated backbone of the PDA vesicles, so that the color change occurred before the external stimulus. Thus, PEG-DA was decreased and PDA ratio was increased. When the ratio of PEG-DA solution to PDA bezacel was 1: 1, blue was not diluted or color changed, but still not enough to choose optimal composition ratio. When blended in a ratio of 1: 4, the sample was blue as much as the PDA beige alone and cured in a gel state by irradiation with UV light (? = 365 nm) (Fig. 8F).

따라서, 이 실험결과를 바탕으로 면역-하이드로젤 비드 제작을 위한 최적의 PEG-DA: PDA 베지클 조성비를 1:4로 정하였다.
Therefore, based on the results of this experiment, the optimum ratio of PEG-DA: PDA vesicle composition for immuno-hydrogel bead preparation was 1: 4.

다음으로 PEG-DA 전구체 용액이 광중합되는데 필요한 UV 광원 (λ=365nm) 노출시간을 측정하였다. UV 광원을 30, 60, 120, 180초 노출시킨 결과, 최소 60초 이상 조사를 하여야 하이드로젤을 형성하였다. 면역-하이드로젤 비드 제작 시 튜브 두께와 오일상에 의한 영향을 고려하여 UV 광원 노출시간을 120초로 결정하였다.
Next, the exposure time of the UV light source (? = 365 nm) required for photopolymerization of the PEG-DA precursor solution was measured. The UV light source was exposed for 30, 60, 120, and 180 seconds. As a result, irradiation was performed for at least 60 seconds to form a hydrogel. The UV light source exposure time was determined to be 120 seconds in consideration of the tube thickness and oily phase effects in the preparation of immune-hydrogel beads.

<실시예 2> PAT 단백질의 비색 정량 검출<Example 2> Colorimetric detection of PAT protein

상기 제조예 2에서 제조된 PDA 베지클을 이용하여 GMO 마커 단백질 중 하나인 PAT 단백질을 검출하였다. PAT protein, which is one of the GMO marker proteins, was detected using the PDA bezle prepared in Preparation Example 2 above.

먼저, 항체-PDA 베지클 용액과 항체-PDA 베지클이 고정된 하이드로젤을 96-웰 마이크로플레이트에서 각각 다양한 농도의 PAT 단백질과 반응시켰다. 반응은 1 mM 항체가 결합된 PDA 베지클과 0 ~ 2μM PAT 단백질이 있는 5 mM HEPES 완충용액을 포함한 최종 300㎕ 용액으로 맞춘 후 37℃에서 1시간 동안 진행하였다. 항체-PDA 베지클이 고정된 하이드로젤의 경우 100㎕의 PEG-DA 전구용액을 96-웰에 넣고 UV 광원(λ=365nm)을 2분간 조사하여 젤 상태로 경화시킨 후 PAT 단백질과 반응시켰다. 면역-하이드로젤 비드의 경우 1.5mL-튜브에 PDA 베지클 용액과 동일한 부피의 비드와 0 ~ 2μM PAT 단백질이 있는 5mM HEPES 완충용액을 최종 300 ㎕의 용액으로 맞춘 후 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 반응시켰다. 반응 후, PAT 단백질 농도에 따른 색 변화 차이를 맨눈으로 관찰하였고 그 정도를 수치화하기 위해 ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA)의 RGB 모듈을 이용하여 빨간색 강도를 계산하였다. 또한 정량적 계산을 위해 플레이트 리더(safire, Tecan, Grodig, Austria)를 이용하여 흡광도 및 형광세기를 측정하였다. 형광세기 측정 시 여기파장과 방출파장은 각각 540 nm와 620 nm로 지정하였다. First, the hydrogel in which the antibody-PDA bezule solution and the antibody-PDA beadlet were immobilized was reacted with various concentrations of PAT protein in a 96-well microplate, respectively. The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour after being combined with the final 300 μl solution containing 1 mM antibody-conjugated PDA bead and 5 mM HEPES buffer containing 0 to 2 μM PAT protein. In the case of the hydrogel in which the antibody-PDA bezel was immobilized, 100 μl of the PEG-DA precursor solution was placed in a 96-well, irradiated with UV light (λ = 365 nm) for 2 minutes to cure the gel state and then reacted with the PAT protein. For immune-hydrogel beads, add 5 mL of 5 mM HEPES buffer containing 0 to 2 μM PAT protein and the same volume of beads as the PDA bezel solution to the final 300 μL solution in a 1.5 mL tube and shake for 1 hour at 37 ° C Lt; / RTI > After the reaction, the difference in color change according to the PAT protein concentration was observed with the naked eye. To quantify the degree, the red intensity was calculated using the RGB module of ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA). Absorbance and fluorescence intensity were also measured using a plate reader (safire, Tecan, Grodig, Austria) for quantitative calculation. The excitation and emission wavelengths of the fluorescence intensity were determined to be 540 nm and 620 nm, respectively.

도 9A는 항체-PDA 베지클 용액에 PAT 단백질을 넣기 전과 2μM의 PAT 단백질을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 흡광도를 측정한 결과를 비교한 것으로, PAT 단백질을 넣기 전(파란색 그래프)에는 650nm 파장(파란색) 근처에서 가장 뾰족하고 높은 피크가 나타나지만 PAT 단백질을 넣고 반응(빨간색 그래프)시키면 650nm 영역의 피크는 줄어들고 540nm 파장(빨간색) 영역에서 높은 피크가 나타났다. FIG. 9A is a graph comparing the results obtained by measuring the absorbance of PAT protein before and after adding 2 μM of PAT protein to the antibody-PDA beadlet solution at 37 ° C. for 1 hour. The most sharp and high peak appears near the 650 nm wavelength (blue), but when the PAT protein is added and reacted (red graph), the peak in the 650 nm region decreases and the peak in the 540 nm wavelength (red) region appears.

PAT 단백질 농도에 따른 파란색 대 빨간색 변화 정도는 아래에 정의된 colorimetric response (CR)에 의해 정량적 계산이 가능하다. The degree of blue to red variation according to the PAT protein concentration can be quantitatively calculated by the colorimetric response (CR) defined below.

[식 1][Formula 1]

여기서, PB=A_blue/(A_blue+A_red)이고, Here, PB = A _blue / (A _blue + A _red )

A는 UV-vis 스펙트럼에서 파란색 부분(~650nm) 또는 빨간색 부분(~540nm) 중 어느 하나에서의 흡광도를 나타내고,A represents the absorbance in either the blue portion (~ 650 nm) or the red portion (~ 540 nm) in the UV-vis spectrum,

PB₀는 PAT 단백질의 첨가 전 항체-PDA 베지클 용액의 초기 파란색 퍼센트를 나타내며, PB ₀ represents the initial blue percentage of the antibody-PDA bezlet solution before addition of the PAT protein,

PB_f는 PAT 단백질의 첨가 및 인큐베이션 후 항체-PDA 베지클 용액의 최종 파란색 퍼센트를 나타낸다. PB _f represents the final blue percentage of the antibody-PDA vesicle solution after addition of the PAT protein and incubation.

도 9B 그래프는 항체-PDA 베지클 용액에 여러 농도(0~2μM)의 PAT 단백질과 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 색 변화 정도를 CR(%)로 나타낸 것이다. 400 nM 까지는 반응이 거의 없다가 2μM의 PAT 단백질과 반응 시 CR(%)가 급격히 증가하는 것을 알 수 있다. FIG. 9B is a graph showing the degree of color change in CR (%) after reacting with various concentrations (0 to 2 μM) of PAT protein at 37 ° C. for 1 hour in an antibody-PDA bezel solution. Although there is almost no reaction up to 400 nM, it can be seen that CR (%) increases rapidly when reacted with 2 μM of PAT protein.

이러한 변화는 육안으로 확인할 수 있는데, 도 10b에 보면, PDA 베지클이 고정된 하이드로젤이 여러 농도(0~2μM)의 PAT 단백질과 반응하여 뚜렷하게 색이 변한 것을 맨눈으로 확인할 수 있다. This change can be confirmed visually. Referring to FIG. 10B, it can be confirmed by the naked eye that the hydrogel in which the PDA bezel is immobilized reacts with various concentrations of PAT protein (0 to 2 μM) to change the color clearly.

또한, 도 10a의 용액 타입과 비교해서도 신호비가 커진 것을 알 수 있다. 도 10c는 PDA 베지클이 고정된 하이드로젤이 표적물질에 대한 선택성이 있는지를 확인하기 위해 BSA 단백질과 반응시킨 대조실험 결과이다.Also, it can be seen that the signal ratio is larger than that of the solution type of Fig. 10A. FIG. 10C is a result of a control experiment in which the PDA bezel-fixed hydrogel was reacted with the BSA protein to confirm the selectivity for the target substance.

PDA 베지클의 PAT 단백질과의 반응에 따른 빨간색 값의 변화를 정량적 계산한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, PDA 베지클이 고정된 하이드로젤은 PDA 베지클 용액에 비해 모든 농도에서 신호비가 크고 PAT 단백질에 대한 선택성이 있다. 이는 고밀도의 PDA 베지클이 3차원 구조의 하이드로젤에 고정되어 있는 상태에서 항원-항체 반응에 따른 응집시 기계적 자극이 더해져서 신호비가 증폭되었을 것이다. As shown in FIG. 11, the hydrogel in which the PDA bezel was immobilized had a larger signal ratio at all concentrations than the PDA bezlet solution, and PAT There is a selectivity for proteins. This would be due to the addition of mechanical stimuli during flocculation due to the antigen-antibody reaction in the state where the high-density PDA beads are immobilized on the three-dimensional hydrogel.

PDA 베지클의 형광방출 특성은 면역반응에 따른 반응 신호를 정량화하는 또 다른 방법으로 활용된다. PDA 베지클은 외부자극이 가해지면 540nm 파장의 빛에서 여기되어 620nm 파장에서 빨간색 형광을 방출한다. 본 실험에서 면역반응에 따른 PDA 베지클의 빨간색 형광세기는 fluorescence microplate reader를 이용하여 측정하였다. The fluorescence emission characteristic of PDA bezel is utilized as another method for quantifying the response signal according to the immune response. PDA bezel is excited by light of 540nm wavelength and emits red fluorescence at 620nm wavelength when external stimulus is applied. In this experiment, the red fluorescence intensity of the PDA bezle according to the immune response was measured using a fluorescence microplate reader.

도 12에 나타난 바와 같이, BSA 단백질에 대해서는 반응이 없지만 PAT 단백질 농도에 따라 빨간색 형광세기가 선형적으로 증가하는 것을 알 수 있다. As shown in FIG. 12, although there is no reaction for the BSA protein, it can be seen that the intensity of red fluorescence increases linearly with the concentration of PAT protein.

면역-하이드로젤 비드의 최대 장점은 PDA 베지클을 고밀도로 하이드로젤 내부에 포집하였기 때문에 동일 부피의 PDA 베지클 용액과 비교하여 표적물질에 대한 반응성이 뛰어나다는 것이다. 따라서 면역-하이드로젤 비드 몇 개만으로도 표적물질을 쉽게 검출할 수 있고 농도별 분석 또한 가능하다. 도 13은 10㎕의 PDA 베지클 용액(a)과 동일 부피에 해당하는 면역-하이드로젤 비드 6개(b)를 여러 농도(0~2μM)의 PAT 단백질과 반응시킨 결과이다. The greatest advantage of immune-hydrogel beads is that PDA vesicles are collected at high density inside the hydrogel, so they are more reactive to target substances than PDA bezel solutions of the same volume. Thus, only a few immune-hydrogel beads can easily detect the target material, and concentration-based analysis is also possible. FIG. 13 shows the result of reacting 6 (b) immuno-hydrogel beads corresponding to the same volume as 10 .mu.l of PDA vesicle solution (a) with PAT protein at various concentrations (0 to 2 .mu.M).

도 13에 나타난 바와 같이, PDA 베지클 용액 타입은 희석되어 표적물질에 대한 반응성을 판별하기 어렵지만 면역-하이드로젤 비드는 반응에 의한 뚜렷한 색 변화를 띠기 때문에 맨눈으로 쉽게 확인할 수 있다. As shown in FIG. 13, although the PDA bezel solution type is diluted and it is difficult to discriminate the reactivity to the target substance, the immune-hydrogel bead can be easily identified by the naked eye because it exhibits a distinct color change due to the reaction.

또한, 빨간색 강도를 정량적으로 계산한 도 14에서도 면역-하이드로젤 비드의 표적물질에 대한 신호비가 훨씬 크다는 것을 알 수 있다. 면역-하이드로젤 비드의 검출한계(the limits of detection, LOD)는 20nM 로서 매우 낮은 농도의 표적물질을 검출할 수 있다. 이는 기존에 보고된 S-ELISA와 CI-ELISA 방법의 검출한계가 각각 0.01㎍/mL과 1.0㎍/mL 임을 감안할 때 면역-하이드로젤 비드는 표적물질에 대한 민감도가 뛰어나다고 할 수 있다. 식물조직 안에 유전 형질전환체(transgenic materials)의 일반적인 농도는 10㎍/g 이상이고 GM 피망(pepper)의 PAT 단백질 농도는 3-5㎍/g tissue이라고 보고된바 있어 본 시스템의 검출한계(0.14㎍/300㎕ reaction)는 GMO의 표적 단백질을 검출하기에 충분히 낮다고 할 수 있다. Also in FIG. 14, which quantitatively calculated the red intensity, it can be seen that the signal ratio of the immune-hydrogel beads to the target substance is much larger. The limits of detection (LOD) of immune-hydrogel beads is 20 nM, which allows detection of very low concentrations of target material. Considering that the detection limits of the previously reported S-ELISA and CI-ELISA methods are 0.01 μg / mL and 1.0 μg / mL, respectively, the immune-hydrogel beads are superior to the target substance. Since the general concentration of transgenic materials in plant tissues is over 10 μg / g and the concentration of PAT protein in GM pepper is 3-5 μg / g tissue, the detection limit of this system (0.14 Mu] g / 300 [mu] l reaction) is low enough to detect the target protein of GMO.

면역-하이드로젤 비드의 또 다른 장점으로는 휴대성이 좋고 쉽게 수거할 수 있다는 점이다. 휴대성이 좋기 때문에 현장 진단용으로 사용이 가능하고 비드 형태의 고체 타입이기 때문에 쉽게 가라앉아서 원심분리와 같은 부가적인 장비 없이도 표적물질을 검출 후 쉽게 수거할 수 있다.
Another advantage of immune-hydrogel beads is their portability and ease of collection. Because it is portable, it can be used for on-site diagnosis. Since it is a solid type of bead type, it can be easily searched and collected easily after detection of target material without additional equipment such as centrifugation.

Claims

A polydiacetylene bezle to which a reactor or a functional ligand is bound is collected at high density in a polyethylene glycol hydrogel matrix,
Polyethylene glycol, and polydiacetylene bezle in which the reactor or functional ligand is combined are mixed in a weight ratio of 1: 1 to 4: hydrogel beads.

The method according to claim 1,
The reactor or functional ligand is at least one hydrogel bead selected from the group consisting of an antibody, an aptamer, a DNA probe, an RNA probe, a PNA probe, a biotin and a protein receptor.

The method according to claim 1,
Polydiacetylene bezle is a polymer of a compound represented by the following formula (1), or a hydrogel bead derived from a complex of a compound of the formula (1) and a phospholipid:
[Chemical Formula 1]

In this formula,
R ₁ is an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms,
R ₂ is an alkylene group having 1 to 30 carbon atoms,
R ₃ represents an epoxy group, an aziridine group, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON ₃ , CH ₂ C (NH ²⁺ ) OCH ₃ , -OP (O ² ^- ) OH, .

The method of claim 3,
R ₁ is an alkyl group having 3 to 18 carbon atoms,
R ₂ is an alkylene group having 3 to 18 carbon atoms,
R < ₃ > is -COOH or -COH.

The method of claim 3,
Wherein the phospholipid is contained in an amount of 1 to 80 mol% based on the polydiacetylene bezle.

delete

Polyethylene glycol and polydiacetylene bezle to which a reactor or a functional ligand is bound are mixed in a weight ratio of 1: 1 to 4, and channels providing oily phase and aqueous phase flow, respectively, are mixed with T - preparing a precursor solution droplet in a microfluidic system arranged in a shape of a cylinder; And
Polymerizing the precursor solution droplet to prepare a bead in which the reactor or the functional ligand-bound polydiacetylene bezle is collected in a high density in a polyethylene glycol hydrogel matrix.

delete

A biosensor comprising the hydrogel bead of claim 1.

Reacting the hydrogel bead of claim 1 with a sample; And
And measuring a color change or fluorescence change of the reaction product.

A method for identifying a transgenic crop, comprising the step of reacting the hydrogel bead of claim 1 with a sample.

13. The method of claim 12,
Wherein the hydrogel bead comprises an antibody to a genetically modified crop marker protein.