KR101451872B1 - 알파-스피나스테롤을 유효성분으로 포함하는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 α-스피나스테롤을 유효성분으로 포함하는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태(androgen-related disease, disorders or conditions) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 식물-유래된 본 발명의 α-스피나스테롤은 혈청 및 전립선 내 테스토스테론 및 DHT(dihydrotestosterone)의 레벨을 현저하게 감소시킨다. 이를 통해, 본 발명의 α-스피나스테롤을 포함하는 조성물의 투여는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태(예컨대, BPH)에 의해 비후화된 전립선의 무게 감소를 유도한다. 따라서, 본 발명의 α-스피나스테롤이 나타내는 우수한 활성 및 안정성은, 의약 및 의약외품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

Description

알파-스피나스테롤을 유효성분으로 포함하는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Androgen-Related Diseases, Disorders or Conditions Comprising alpha-Spinasterol As an Active Ingredient}

본 발명은 알파-스피나스테롤을 유효성분으로 포함하는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

전립선 비대증(Benign prostatic hyperplasia, BPH)은 널리 퍼져있는 질환으로, 전립선 확대(prostate enlargement) 및 하부 요로(lower urinary tract) 징후들에 의해 임상적으로 특징화될 수 있다. 공중 건강 상에 BPH의 과도한 부담에도 불구하고, BPH의 발생과정(pathogenesis)은 일부분만 이해되고 있다[1, 2]. 전립선 확대는 안드로겐의 존재 하에서 일어나고[3], 단백동화 스테로이드들(anabolic steroids)이 전립선의 용량을 증가시키며 요류 속도(urine flow)를 감소시켜 증가된 배뇨 빈도(urinary frequency)를 유발한다고 상세히 알려져 있다[4]. 전립선은 테스토스테론 및 이의 고환 외부 기원 전구체들(extratesticular origin)이 보다 강력한 DHT(dihydrotestosterone)로 생활성화되는 안드로겐-의존성 기관이다[5]. 통상적으로, 전립선은 DHT 형성의 중요한 기관으로 생각되고 있다[6]. 전립선의 내분비 활성의 전반적인 효과(systemic effect)는 주로 DHT 형성 및 순환(circulation)을 위한 이의 배출에 관여된다. DHT의 생산은 나이가 듬에 따라 증가하여 전립선 성장의 증대 및 비대증을 유발한다[7]. DHT의 중요성은 5-환원효소(5-reductase) 억제제가 BPH 남성 환자에 적용된 임상 연구들에 의해 확인된다. 많은 경우에, 5-환원효소 억제제를 이용한 치료법은 전립선의 DHT 레벨과 전립선 크기를 현저하게 감소시켰다[8]. 피나스테라이드(finasteride)는 안드로겐-의존성 질환들, 예를 들어 남성형 대머리, 전립선 비대증(BPH) 및 전립선암의 치료에 폭넓게 이용되고 있다[9]. 피나스테라이드는 5-환원효소의 경쟁적 및 특이적 억제제로, 전립선, 모낭세포(hair follicles) 및 다른 안드로겐-민감성 조직에서 테스토스테론의 DHT 전환을 차단하여 혈청 및 전립선 내 DHT 농도의 억제를 초래한다[10]. 피나스테라이드 및 두타스테라이드(dutasteride) 같은 종래에 이용된 약물들은 BPH의 효과적인 치료 방법이라는 것이 증명되었지만, 이들의 사용은 발기 부전(erectile dysfunction), 성욕감퇴(loss of libido), 현기증(dizziness) 및 상기도 감염(upper respiratory tract infection) 같은 부작용들로 인하여 엄격하게 제한되고 있다[11, 12].

스피나스테롤은 항-종양성(antitumor), 항-궤양성(antiulcerogenic), 항-암성(anticarcinogenic) 약리학적 활성들을 나타내는 참취[Aster scaber Thunb. (Asteraceae)]의 지상부(aerial parts)로부터 동정된 생물학적 활성 화합물이다[13-15]. 공개된 여러 연구들에서, 스피나스테롤은 항-염증 효과들도 가지는 것으로 알려져 있다[16]. 하지만, 래트 모델에서 테스토스테론-유도된 BPH을 치료하기 위한 α-스피나스테롤의 효능에 대한 연구는 아직까지 보고되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 안드로겐 의존성 질환(androgen-dependent diseases)을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다양한 약리활성을 가지는 α-스피나스테롤(α-spinasterol)을 식물(구체적으로는, 왕불유행)로부터 동정하고 상기 화합물이 혈액과 조직에서 안드로겐(구체적으로는, 테스토스테론 및 DHT)의 레벨을 효과적으로 감소시킨다는 사실을 래트 모델로 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태(androgen-related disease, disorders or conditions) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알파-스피나스테롤(α-spinasterol)을 유효성분으로 포함하는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태(androgen-related disease, disorders or conditions) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 안드로겐 의존성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다양한 약리활성을 가지는 α-스피나스테롤을 식물(구체적으로는, 왕불유행)로부터 동정하고 상기 화합물이 혈액과 조직에서 안드로겐(구체적으로는, 테스토스테론 및 DHT)의 레벨을 효과적으로 감소시킨다는 사실을 래트 모델로 확인하였다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 α-스피나스테롤은 식물로부터 유래된 하기의 화학식 I로 표현되는 화합물이다:

화학식 I

본 발명의 α-스피나스테롤은 다양한 식물(특히, 다양한 약리활성을 가지는 생약재)로부터 추출될 수 있으며, 예를 들어 왕불유행, 천마(Gastrodiae Rhizoma), 시호(Bapleuri Radix), 당귀(Angelicae gigantis Radix), 길경(Platycodi Radix), 도인(Persicae Semen), 계지(Cinnamomi Ramulus), 대황(Rhei Rhizoma), 감초(Glycyrrhizae Radix), 천궁(Cnidii Rhizoma), 진피(Aurantii nobilis Pericarpium), 택사(Alismatis Rhizoma), 황련(Coptidis Rhizoma), 황금(Scutellariae Radix), 시호(Bupleuri Radix), 은시호(Gypsophilae Radix), 인삼(Gingseng), 옥룡편(stachytarpheta jamaicensis), 자리공(Phytolacca esculenta) 및 참취(Aster scaber THUNB) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 α-스피나스테롤은 왕불유행(Melandrium firmum Rohrbach)으로부터 동정된 화합물이다.

왕불유행(Melandrium firmum Rohrbach)은 패랭이꽃과(Caryophyllaceae)에 속하는 이년생 초본인 장구채(Melandriumfirmum) 및 애기장구채(Melandrium apricum)의 종자로 불유행(不留行), 금궁화(禁宮花), 금잔은대자(金盞銀臺子)로도 불리는 데, 30-80의 크기로 잎은 마주난다. 꽃은 7월에 피며, 잎겨드랑이와 원줄기 끝에 취산화서로 층층으로 달리며, 열매는 삭과로 달걀 모양이다. 약재는 줄기가 가늘고 볼록한 마디가 있으며 마디에서 가지와 잎이 마주났고, 길이는 약 20-40 cm이다. 전통적으로, 왕불유행은 간에 주로 작용하여 위로는 유즙의 분비를 촉진시키고 혈분에는 혈액순환을 돕고 어혈을 풀어주며, 경락에 작용하여 기의 순환을 원활히 한다고 알려져 있다. 또한, 월경이 고르지 못한 증상이나 가슴부위에 생긴 종기에 탁월한 효과가 있으며 철제류에 생긴 상처를 낫게 한다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 α-스피나스테롤을 식물(구체적으로는, 왕불유행)에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 구체적으로는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(구체적으로는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 추출물은 물 또는 메탄올을 왕불유행에 처리하여 수득한 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 α-스피나스테롤은 다음의 단계를 통해 추출한다: (a) 용매(구체적으로는, 메탄올)을 이용한 환류 추출을 통해 식물(구체적으로는, 왕불유행)로부터 추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 추출물을 여과시켜 물에 현탁한 후 다양한 용매 분획(예컨대, 헥세인 분획, EtOAc 분획, BuOH 분획)을 수득하는 단계; (c) 상기 분획을 컬럼 및 박층 크로마토그래피(column and thin layer chromatography)를 실시하여 화합물을 분리/동정하는 단계; 및 (d) 상기 화합물의 구조를 분석하는 단계.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 식물(구체적으로는, 왕불유행) 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 식물(구체적으로는, 왕불유행) 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 왕불유행 추출물은 감압 증류 및 동결 건조, 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로서, (a) 상술한 본 발명의 α-스피나스테롤 또는 이를 포함하는 식물 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 α-스피나스테롤을 포함하는 식물 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈액 또는 조직에서 안드로겐의 레벨을 감소시킨다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈청, 전립선, 모낭세포(hair follicles) 또는 다른 안드로겐-민감성 조직(adrogen-sensitive tissues; 예컨대, 고환, 신장, 뼈, 등)에서 안드로겐의 레벨을 감소시킨다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 조성물은 혈청 및 전립선에서 안드로겐의 레벨을 감소시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 전립선의 무게를 감소시킨다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 작용하는 α-스피나스테롤의 처리는 TP(testosterone propionate)-유도된 BPH 그룹과 비교하여 전립선의 무게를 현저하게 감소시켰다(참고: 도 1B, 약 20% 감소).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 레벨이 감소되는 안드로겐은 테스토스테론(testosterone) 및 DHT(dihydrotestosterone)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 α-스피나스테롤은 테스토스테론 및 DHT의 레벨을 혈청 및 전립선 모두에서 대조군과 비교하여 현격하게 감소시켰다. 테스토스테론의 레벨의 경우, 본 발명의 α-스피나스테롤은 혈청 및 전립선에서 대조군(예컨대, TP-유도된 BPH 그룹)과 비교하여 모두 약 50% 수준으로 감소시켰다(참고: 도 2). DHT의 경우도, 본 발명의 α-스피나스테롤은 혈청 및 전립선에서 대조군(예컨대, TP-유도된 BPH 그룹)과 비교하여 각각 약 40% 및 70% 레벨로 감소시켰다(참고: 도 3).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태에 의해 유도된 조직병리학적 변화들을 감소시킨다(참고: 도 4, 예를 들어, 상피세포층의 두께 감소).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태는 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH), 전립선염, 전립선암(prostatic cancer), 고환암(testicular cancer), 안드로겐-의존성 여드름(androgen dependent acne), 안드로겐성 탈모증(androgenic alopecia), 지루증(seborrhea), 조숙증(precocious puberty), 안드로겐과다혈증(hyperandrogenism), 여성 다모증(female hirsutism), 남성화(virilization), 다낭난소증후군(polycystic ovary syndrome, POCS), HIAR-AN(Hyperandrogenism, Insulin Resistance and Acanthosis Nigricans) 증후군, 난소 난포막과형성증(ovarian hyperthecosis), 기능장애성 자궁출혈(dysfunctional uterine bleeding), 불임(infertility) 및 안드로겐-생산성 종양(androgen-producing tumors)을 포함하며, 보다 구체적으로는 전립선 비대증, 전립선염, 전립선암, 고환암, 안드로겐성 탈모증, 안드로겐과다혈증, 다낭난소증후군 및 안드로겐-생산성 종양을 포함하고, 보다 더 구체적으로는, 전립선 비대증, 전립선염, 전립선암, 고환암, 안드로겐과다혈증 및 안드로겐-생산성 종양을 포함하며, 보다 더욱 더 구체적으로는 전립선 비대증, 전립선염, 전립선암 및 고환암을 포함하고, 가장 구체적으로는 전립선 비대증 및 전립선암을 포함한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 하루에 0.0002-50 mg/kg(체중) 범위 내이며, 보다 구체적으로는 0.001-20 mg/kg(체중) 범위 내이고, 보다 더 구체적으로는 0.01-10 mg/kg(체중) 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 α-스피나스테롤 또는 이를 포함하는 식물 추출물 뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 오미자 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 α-스피나스테롤을 유효성분으로 포함하는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태(androgen-related disease, disorders or conditions) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

(b) 식물 유래된 본 발명의 α-스피나스테롤은 혈청 및 전립선 내 테스토스테론 및 DHT(dihydrotestosterone)의 레벨을 감소시킨다.

(c) 이를 통해, 본 발명의 α-스피나스테롤을 포함하는 조성물의 투여는 안드로겐-관련 질환, 질병 또는 상태(예컨대, BPH)에 의해 비후화된 전립선의 무게 감소를 유도한다.

(d) 따라서, 본 발명의 α-스피나스테롤이 나타내는 우수한 활성 및 안정성은, 의약 및 의약외품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

도 1은 TP ( testosterone propionate )-처리된 래트에서 체중(A) 및 전립선 무게(B)에 대한 α- 스피나스테롤의 효과를 보여주는 결과이다. 처리 그룹: 거세 그룹(castration), 옥수수 오일(피하 주입)+PBS(경구 투여); BPH 그룹, 테스토스테론(피하 주입)+PBS(경구 투여); 피나스테라이드(finasteride) 그룹, 피나스테라이드(10 mg/kg, 경구 투여)+테스토스테론(피하 주입); 및 α-스피나스테롤 그룹, α-스피나스테롤(5 mg/kg, 경구 투여)+테스토스테론(피하 주입). α-스피나스테롤 또는 피나스테라이드 처리는 테스토스테론 주입 1시간 전에 실시하였다. 표시: #, 거세 그룹과 비교하여 감소된 전립선 무게 결과에 대해 유의한 P 값 < 0.05; 및 *, BPH 그룹과 비교하여 감소된 전립선 무게 결과에 대해 유의한 P 값 < 0.05.
도 2는 혈청 내 테스토스테론(A) 및 DHT (B) 레벨에 대한 α- 스피나스테롤의 효과를 보여주는 결과이다. BPH 그룹과 비교하여 α-스피나스테롤-처리된 그룹에서 혈청 내 테스토스테론 및 DHT 레벨이 현저하게 더 낮았다. 처리 그룹: 거세 그룹, 옥수수 오일(피하 주입)+PBS(경구 투여); BPH 그룹, 테스토스테론(피하 주입)+PBS(경구 투여); 피나스테라이드(finasteride) 그룹, 피나스테라이드(10 mg/kg, 경구 투여)+테스토스테론(피하 주입); 및 α-스피나스테롤 그룹, α-스피나스테롤(5 mg/kg, 경구 투여)+테스토스테론(피하 주입). α-스피나스테롤 또는 피나스테라이드 처리는 테스토스테론 주입 1시간 전에 실시하였다. 표시: #, 거세 그룹과 비교하여 혈청 내 감소된 안드로겐 레벨 결과에 대해 유의한 P 값 < 0.05; 및 *, BPH 그룹과 비교하여 혈청 내 감소된 안드로겐 레벨 결과에 대해 유의한 P 값 < 0.05.
도 3은 전립선 내 테스토스테론(A) 및 DHT (B) 레벨에 대한 α- 스피나스테롤 의 효과를 보여주는 결과이다. BPH 그룹과 비교하여 α-스피나스테롤-처리된 그룹에서 전립선 내 테스토스테론 및 DHT 레벨이 현저하게 더 낮았다. 처리 그룹: 거세 그룹, 옥수수 오일(피하 주입)+PBS(경구 투여); BPH 그룹, 테스토스테론(피하 주입)+PBS(경구 투여); 피나스테라이드(finasteride) 그룹, 피나스테라이드(10 mg/kg, 경구 투여)+테스토스테론(피하 주입); 및 α-스피나스테롤 그룹, α-스피나스테롤(5 mg/kg, 경구 투여)+테스토스테론(피하 주입). α-스피나스테롤 또는 피나스테라이드 처리는 테스토스테론 주입 1시간 전에 실시하였다. 표시: #, 거세 그룹과 비교하여 전립선 내 감소된 안드로겐 레벨 결과에 대해 유의한 P 값 < 0.05; 및 *, BPH 그룹과 비교하여 전립선 내 감소된 안드로겐 레벨 결과에 대해 유의한 P 값 < 0.05.
도 4는 전립선 비대증에 대한 α- 스피나스테롤의 효과를 보여주는 결과이다. 전립선 조직에 대한 조직학적 검사는 최종 테스토스테론 주입 후 24시간 째에 실시하였다. 전립선 조직이 고정된 후, 4 μm의 두께로 절단하여 H&E 용액으로 염색하였다(배율 ×200).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

α- 스피나스테롤(α-spinasterol)을 포함하는 식물 재료

왕불유행(Melandrium firmum Rohrbach)은 2005년 3월에 대구의 민속 한약시장(folk medicine market)인 "약령시(Yak-ryong-si)"에서 구매하였으며, 충남대학교(대전, 한국)의 배기환 교수에 의해 분류학적으로 확인받았다. 증거 표본(voucher specimen; YNS-99-01)은 영남대학교에 보관되어 있다.

도구 및 시약

녹는점(Melting points, mp)은 Fisher-Johns 녹는점 측정기(melting point apparatus; Fisher Scientific Company, USA)를 이용하여 측정되었으며, 보정되지 않았다. FT-IR 스펙트럼은 JASCO FT-IR 300E 분광 광도계(Easton, MD, USA)를 이용하여 기록되었다. NMR 스펙트럼은 표준 Bruker 펄스 프로그램을 이용한 Bruker 250 MHz(DMX 250, Karlsruhe, Germany)로 기록되었다. 시료들은 피리딘-d ₅에 녹였으며, 화학적 쉬프트(chemical shifts)는 TMS(tetramethylsilane)의 ppm 다운필드(downfield)에 보고되었다. ESI(electrospray ionization)-MS 스펙트럼은 ESI 소스가 장착된 LCQ advantage-trap 질량 분광광도계(ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정되었다. 컬럼 크로마토그래피(silicagel 60, 70-230 and 270-400 mesh; Merck) 및 박층 크로마토그래피 플레이트(silica gel 60 F254 and RP-18F254; Merck)의 고정상(Stationary phases)은 Merck KGaA(Darmstadt, Germany)로부터 구매하였다. 점들은 UV 조사 및 10% H₂SO₄의 스프레이한 후 열 처리를 통해 검출하였다. 다른 모든 화합물들 및 용매들은 추가적인 정제과정이 필요없는 분석 등급을 사용하였다.

추출 및 동정

왕유불행 전체 식물체(10.0 kg)는 환류 하에서 12시간 동안 80% MeOH(20 L)을 세 번에 걸쳐서 추출한 후, 여과를 통해 농축된 MeOH 추출물(550.0 g)을 얻었다. 상기 MeOH 추출물을 H₂O에 현탁시키고 각각 헥세인(hexane), EtOAc 및 BuOH로 추출하여 헥세인-용해성(soluble) 분획(75.9 g), EtOAc-용해성 분획(47.4 g) 및 BuOH-용해성 분획(97.0 g)을 수득하였다. 이후, 상술한 헥세인-용해성 분획(50.0g)은 실리카 겔을 포함하는 컬럼 크로마토그래피(60×12 cm, silica gel 70-230 mesh)에 로딩되었으며, 헥세인과 EtOAc의 단계별 농도구배(100:1 → 1:1)를 이용하여 용출시켜 32개의 서브분획들(subfractions)을 수득하였다. 이중, 분획 14(2.5 g)가 실리카 겔 컬럼(4×50 cm, silica gel 70-230 mesh)에 로딩되고 헥세인:EtOAc(50:1-1:1)로 용출되어 화합물 1(300 mg)을 획득하였다. 상기 동정된 화합물 1의 화학 구조는 값이 알려진 물리화학적 및 스펙트럼 데이터와의 비교를 통해 결정되었으며, 그 결과는 다음과 같다:

α-스피나스테롤(1): 무색 결정, mp: 171-173℃; IR _max(KBr) cm¹:3251(OH), 1676(C=C stretch), 1471(CH₂), 1371(CH₃); ¹H-NMR(250 MHz, pyridine-d ₅) : 5.18(1H, dd, J = 15.0, 8.7 Hz, H-22), 5.14(1H, t, J = 4.0 Hz, H-7), 5.08(1H, dd, J = 15.0, 8.7 Hz, H-23), 3.84(1H, m, H-3), 1.06(3H, d, J = 6.5 Hz, CH₃-21), 0.87(3H, d, J = 6.8 Hz, CH₃-26), 0.85(3H, d, J = 6.5 Hz, CH₃-27), 0.82(3H, s, CH₃-19), 0.59(3H, s, CH₃-18); ¹³C-NMR(62.5 MHz, pyridine-d ₅) δ: 139.6(C-8), 138.6(C-22), 129.6(C-23), 117.9(C-7), 71.0(C-3), 55.9(C-17), 55.3(C-14), 51.3(C-24), 49.7(C-9), 43.4(C-13), 41.1(C-20), 40.5(C-5), 39.6(C-12), 38.9(C-4), 37.6(C-25), 37.5(C-1), 34.4(C-10), 32.1(C-2), 29.5(C-6), 28.2(C-16), 25.6(C-28), 23.3(C-15), 21.8(C-11), 21.5(C-26), 21.2(C-21), 19.1(C-27), 13.2(C-18), 12.4(C-29), 12.1(C-19). FAB-MS m/z 412 [M]⁺.

동물

12주령된 250-350 g의 수컷 래트(Wistar-Unilever rats; Central Lab. Animal Int. Seoul, Korea)는 40-60%의 상대 습도 하에서 18-23℃의 온도로 12시간의 빛/암 사이클이 유지되는 성장실에서 사육되었다. 상기 래트는 임의의 물을 포함하는 표준 실험실용 식이요법으로 관리되었다. 모든 실험 과정들은 실험동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드라인에 따라 실시하였고 동물 핸들링은 한국 동물복지법의 규약(National Animal Welfare Law of Korea)에 따라 이루어졌다.

거세(Castration) 과정

내인성 테스토스테론의 영향을 배제하기 위한 일주일 간의 순화 후, 모든 그룹 내 래트들은 실험 시작 3일 전에 거세되었다. 모든 동물들은 펜토바비탈(pentobarbital)의 복강내(intraperitoneal) 주입으로 마취시켰다. 이전에 보고된 방법에 따라, 거세는 고환 및 음낭(scrotal sac) 전반에 걸친 부고환 지방(epididymal fat)의 제거를 포함하였다(Coppenolle et al ., 2000). 정사(spermatic cord) 및 혈관벽은 3-0 봉합사로 연결되고 절제되었다.

BPH 의 유도 및 치료

래트들은 일주일의 순화(n = 8) 및 거세 후 5개의 그룹으로 임의적으로 분류하였다. 실험 그룹(2 내지 5 그룹)은 옥수수 오일에 녹여진 TP(testosterone propionate; 3 mg/kg)가 4주 동안 매일 피하 주입시킴으로써 BPH를 유도하였다. 실험 그룹 내 동물들은 TP 주입 4주 동안 위관 영양(gavage)을 통해 PBS, 피나스테라이드(finasteride; 양성 대조군; 10 mg/kg) 및 α-스피나스테롤(5 mg/kg)을 제공받았다. 음성 대조군 그룹들은 PBS를 구강 투여받았으며, 옥수수 오일을 4주 동안 매일 피하 주입받았다. 피나스테라이드는 잘-알려진 5α-환원효소 억제제로 BPH의 치료를 위해 이용되었다. 피나스테라이드의 유효한 투여량은 이전 보고들에 기반하였다. 몸무게는 실험 기간 동안 매주 측정하였다. 적용 용량(Application volume)은 개개의 동물들의 가장 최근 몸무게에 기반하여 미리 계산되었다.

최종 처리 후, 하룻밤 동안 단식시킨 모든 동물들이 펜토바비탈로 마취되었다. 혈액 시료들은 후대정맥(caudal vena cava)으로부터 얻었다. 혈청은 원심분리를 통해 수득하여 80℃에 저장하였다. 전체 전립선이 즉시 제거되어 측량되었으며, 이들의 상대적인 기관 무게가 몸무게 대 전립선 무게의 비로서 계산되었다. 알파-스피나스테롤 처리에 의한 상대적인 기관 무게에 따른 전립선 무게의 억제율이 이전에 기재된 바와 같이 계산되었다(Veeresh Babu, et al ., 2010). 조직학적 분석을 위해, 전립선 복부엽(ventral prostate lobe) 부분들이 10% 포르말린으로 고정되어 파라핀에 임베드(embed)되었다. 전립선의 나머지 부분들은 호르몬 레벨의 측정을 위해 80℃에 저장되었다.

균질화액(Homogenate)의 제조

전립선 조직이 균질기를 이용하여 프로테아제 억제제들(Sigma, MI, USA)을 포함하는 조직 용해/추출 시약(1/10 w/v)에서 균질화되었다. 균질화액은 12,000 g에서 25분 동안 4℃로 원심분리되었으며, 상층액(supernatant) 분획 내 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 측정하였다.

혈청 및 전립선에서 테스토스테론 및 DHT 의 측정

혈청 및 전립선 내 테스토스테론 및 DHT의 레벨은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정하였다. DHT 키트는 ALPCO Diagnostics(Salem, NH)으로부터 구매하였고 테스토스테론 키트는 Cayman(MI, USA)으로부터 구매하였다. 측정값(Values)은 전립선의 경우 mg 단백질 당으로, 혈청의 경우 mL 당으로 표현된다.

조직병리학적 검사( Histopathological examination )

전립선 내 형태학적 변화를 조사하기 위해, 파라핀에 임베드된 조직이 4 μm 두께의 절편들로 절단된 후 H&E 용액(hematoxylin, Sigma MHS-16; 및 eosin, Sigma HT110-1-32)로 염색되었다. 조직들은 Dako 마운팅 배지(Dakocytomation, Denmark, CA)로 커버슬라이드 위에 마운팅되어 현미경을 이용하여 관찰하였다.

통계 분석

데이터는 평균값±표준편차(SD)로 표현된다. 통계적 유의성은 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 독립적인 평균값들을 비교한 Student 양측(two-tailed) t-검정을 통해 결정되었다. 통계적 유의성을 위한 유효 레벨(critical level)은 P < 0.01 또는 P < 0.05로 셋팅된다.

실험결과

전립선 무게에 대한 α- 스피나스테롤의 효과

TP-유도된 BPH 동물들의 상대적인 전립선 무게는 음성 대조군 그룹과 비교하여 현저하게 더 높았다. 알파-스피나스테롤 처리된 동물들의 몸무게는 BPH 동물의 몸무게와 유의하게 다르지 않았다(도 1A). 하지만, TP-유도된 BPH 그룹과 비교하여 α-스피나스테롤 처리된 동물에서 상대적인 전립선 무게가 현저하게 감소하였다(도 1B).

혈청 내 테스토스테론 및 DHT 레벨에 대한 α- 스피나스테롤의 효과

TP-유도된 BPH 동물들은 음성 대조군(0.14±0.18 ng/mL)과 비교하여 현저하게 높은 혈청 테스토스테론 레벨(20.80±2.63 ng/mL)을 나타냈다. 하지만, α-스피나스테롤 처리된 동물들(10.53±2.39 ng/mL, P < 0.05)은 TP-유도된 BPH 동물들과 비교하여 뚜렷하게 낮은 혈청 테스토스테론 레벨을 나타냈다(도 2A). 또한, α-스피나스테롤 처리된 동물에서의 DHT 레벨(14.74±2.38 ng/mL, P < 0.05)도 TP-유도된 BPH 동물에서의 레벨(23.95±3.74 ng/mL, P < 0.01)과 비교하여 뚜렷하게 더 낮았다(도 2B).

전립선 내 테스토스테론 및 DHT 레벨 상에 α- 스피나스텔롤의 효과

TP-유도된 BPH 동물들은 거세된 그룹과 비교하여 더 높은 전립선 테스토스테론 레벨(3.25±0.23 ng/mL, P < 0.01) 및 DHT(426.01±144.05 pg/mL, P < 0.01)을 나타냈다. 피나스테라이드-처리된 동물 그룹은 BPH 동물 그룹과 비교하여 훨씬 더 낮은 테스토스테론 레벨(1.87±0.27 ng/mL, P < 0.01) 및 DHT 레벨(126.22±34.66 pg/mL, P < 0.01)을 나타냈다. 피나스테라이드-처리된 그룹과 같이, α-스피나스테롤-처리된 동물들도 BPH 동물들과 비교하여 현저하게 낮은 테스토스테론 레벨(1.47±0.27 ng/mL, P < 0.01) 및 DHT 레벨(133.31±35.27 pg/mL, P < 0.01)을 나타냈다(도 3A 및 도 3B).

전립선 조직의 조직학적 분석을 통해 α- 스피나스테롤의 효과

전립선의 상피세포층은 음성 대조군과 비교하여 TP-유도된 BPH 동물에서 더 두꺼웠다. 흥미롭게도, 상술한 조직학적 분석은 α-스피나스테롤의 투여가 BPH 래트의 조직 구성(histoarchitecture)을 약하게 변화시킨다는 것을 보여주었다(도 4).

추가논의사항

본 연구에서, 본 발명자들은 유도된 전립선 상피세포 비대증(prostatic epithelial hyperplasia)의 진행에 왕불유행(Melandrium firmum Rohrbach)으로부터 동정된 α-스피나스테롤의 효과를 조사하기 위해 래트 모델을 이용하였다. 본 발명자들의 결과들은 α-스피나스테롤의 투여에 의해 전립선 무게, 전립선 및 혈청 내 안드로겐(예컨대, DHT 및 테스토스테론) 레벨 및 전립선 비대증과 관계된 조직병리학적 변화들이 현저하게 감소된다는 것을 보여주었다.

본 발명자들의 연구에서, α-스피나스테롤의 투여 후 전립선 무게의 감소는 DHT 및 테스토스테론의 감소된 레벨에서 기인할 수 있다. 이전 연구들에 따르면, 테스토스테론 및 DHT는 남성 생식 기관들의 발달에 핵심적인 역할을 수행하고 일반적으로 BPH와 연관되어 있다[19, 20]. 노화(Aging)는 DHT의 과도한 생산을 유발하여 BPH의 발생 및 악화를 야기한다[20]. BPH 동물의 상대적인 전립선 무게는 대조군(vehicle)과 비교하여 현저하게 증가되는 반면에, 피나스테라이드 또는 라우린산(lauric acid)/미리스틴 산(myristic acid)으로 처리된 동물에서 감소한다[21].

본 연구의 결과들은 전립선 조직의 조직병리학적 검사와 일치하였다. BPH 동물들은 전립선 내 선 비대증(glandular hyperplasia)을 나타낸 반면에, α-스피나스테롤 처리된 동물들은 훨씬 약한 선 비대증을 보였다. 따라서, 상술한 발견과 호르몬 검사 결과들은 α-스피나스테롤이 BPH 치료에 효과적이라는 것을 의미한다.

또한, α-스피나스테롤은 혈청 및 전립선 모두에서 테스토스테론 및 DHT 레벨을 감소시켰다. 상술한 발견들과 전립선의 상대적 무게 및 조직병리학적 검사 결과들은 α-스피나스테롤이 래트에서 BPH의 발달을 억제하며, 상술한 효과들이 DHT 레벨 상에 감소와 밀접하게 연관되어 있다는 의미한다. 따라서, 더 높은 혈청 및 전립선 DHT 레벨은 더 큰 전립선 크기(volume) 및 더 높은 BPH 빈도(prevalence)와 연관될 수 있다. 결론적으로, BPH 래트 모델에서 α-스피나스테롤의 구강 투여는 전립선 크기, 전립선 비대증, 그리고 혈청 및 전립선 내 DHT 레벨을 현저하게 감소시켰다. 상기 정보는 아마도 BPH 같은 노화-의존성(age-dependent) 질환의 병인학에 대한 보다 더 나은 이해를 제공할 수 있을 것이며 전립선 질환들(prostate conditions)의 치료를 위한 보다 나은 타겟의 동정 및 보다 특이적인 치료제의 개발로 이어질 것이다. 본 발명자들의 결과들은 α-스피나스테롤이 BPH 치료에 매우 유용한 약물이라는 것을 강력하게 제시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 어떤 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (11)

1. 알파-스피나스테롤(α-spinasterol)을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 알파-스피나스테롤은 식물로부터 유래된 화합물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 식물은 왕불유행(Melandrium firmum Rohrbach)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈액 또는 조직에서 안드로겐의 레벨을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 안드로겐은 테스토스테론(testosterone) 또는 DHT(dihydrotestosterone)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 혈액은 혈청인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
7. 제 4 항에 있어서, 상기 조직은 전립선, 모낭세포(hair follicles) 또는 다른 안드로겐-민감성 조직(adrogen-sensitive tissues)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH)에 의해 비후화된 전립선의 무게를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 조직 내 상피세포층(epithelial cell layer)의 비후화를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
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