KR101442751B1

KR101442751B1 - 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 지질생합성 촉진용 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR101442751B1
Application number: KR1020120145161A
Authority: KR
Inventors: 유영경; 이정노; 최정은; 이강태; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-09-24
Also published as: KR20140076758A

Abstract

본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 피부 외용제 조성물은 스테롤 조절인자 결합단백질(SREBP-1c), 페록시좀 증식 활성화 수용제(PPARs) 또는 지방산 합성효소(FAS)의 전사인자를 조절하여 트리글리세라이드, 콜레스테롤 또는 세라마이드의 생합성 촉진하여 피부 항상성 유지 및 피부 노화 방지 효과를 갖는다.

Description

우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 지질생합성 촉진용 피부 외용제 조성물{Topical Composition For Promoting Lipid Biosynthesis Comprising Arctium lappa seed extract As Active Ingredient}

본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부투과 장벽을 구성하는 지질(lipid)은 피지선 유래 지질(Sebaceous lipid)와 표피 지질(Epidermal lipid)로 구성되어 있는데 각각 피지세포(Sebocyte)와 각질세포(Keratinocyte)에서 생성된다. 피지세포(Sebocyte)에서 생성되는 피지(Sebum)는 모낭을 통해 분비되고, 각질세포(Keratonocyte)에서 생성되는 지질은 S.spinosum 상부와 S.granulosum의 lamellar body에 저장되고 S. corneum에 이동되면 세포 사이로 분비된다. 인체에는 약 백만 개정도의 피지선(Sebaceoul gland)이 존재하며 주로 얼굴, 머리, 앞가슴, 겨드랑이, 배꼽주의, 목등에 많이 있다. 피지선은 모발의 줄기로 피지(Sebum)를 분비하는 전분비선(holocrine gland)으로 하루에 약 2g 정도를 분비하는 것으로 알려져 있다. 피지의 성분으로는 트리글리세라이드(triglyceride), 유리지방산(free fatty acid), 왁스 에스테르(wax ester), 스쿠알렌(squalene), 콜레스테릴에스테르(cholesteryl ester), 콜레스테롤(cholesterol) 등으로 알려져 있다. 피지선은 피부 스테로이드합성(cutaneous steroidogenesis) 조절, 국소적 안드로겐합성(local androgen synthesis) 조절, 뉴로펩타이드(neuropeptides)의 상호작용, 항균활성이 있는 지질생성, 염증유발성질(pro-inflammatory properties) 및 항염증성질(anti-inflammatory properties)를 발현하는 기능을 담당한다. 각질세포간 지질은 콜레스테롤, 지방산, 세라마이드, 스핑고리피드로 이루어져 있으며 라멜라 구조로 존재한다. 또한 세라마이드는 스핑고신, 파이토스핑고신, 6-하이드록시스핑고신 등으로 이루어진 백본에 하이드록시기가 붙어 있는 구조로 각질세포간 지질의 50%를 차지한다고 알려져 있다.

이러한 조성물들의 분포 비율과 지질량은 피부 장벽 유지 및 항상성(homeostasis)에 기여하게 되며, 외부의 물리적, 화학적 손상에 대해 빠른 복원력을 제공하게 된다. 노화과정 중의 표피지질은, 그렇지 않은 표피 조직과 달리, 전반적으로 감소하며 이에 따라 피부 장벽의 기능이 저하된다.

또한 노년층의 총 표피 지질은 청년층의 30% 정도로 감소되어 있기는 하나, 각각의 지질 함량 비율은 유지된다.

피부 각질의 지질들이 지질 생합성경로와 세라마이드 생합성 경로를 통하여 형성되는 것을 확인해 주는 것이며, 실제로 피부 각질의 지질은 진피의 인지질과 유리 지방산에서 유래한 것임이 문헌에 보고되어 있다[Hamanaka et al., 2002, J. Invsti. Dermatol. 119:416-423]. 또한 유리 지방산의 비율이 변화함에 따라 노화성 피부로 진행될 수 있다는 것이 알려져 있다[Rogers et al., 1996, Arch. Dermatol. Res, 288:765-770].

우엉은 높이가 50~150cm이고, 곧은 뿌리가 30~60cm까지 자라며 끝에서 줄기가 나온다. 겉면은 짙은 녹색이지만 뒷면에 흰 솜털이 빽빽이 나며, 가장자리에 이 모양의 톱니가 있다. 꽃은 7~8월에 피는데 검은 자줏빛이 돌며, 두화는 가지 끝에 산방꽃차례로 달린다. 총포는 둥글고 포는 바늘 모양이며 끝이 갈고리처럼 생긴다. 꽃은 관상화이고 종자는 검은색이며 관모는 갈색이다. 열매는 수과로서 9월에 익는다. 우엉의 뿌리에는 이눌린과 약간의 팔미트산이 들어 있는 것으로 알려져 있다. 유럽에서는 이뇨제와 발한제로 쓰고 종자는 부기가 있을 때 이뇨제로 사용하며, 인후통과 독충의 해독제로 쓴다. 우엉의 씨앗은 우방자라고도 하며 풍열을 소통시켜 ?어지게 하고 폐기를 통하게 하며 두진이 돋아나게 하고 부기를 가라앉히며 해독하는 효능이 있는 약재로도 쓰인다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물 중에서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 우엉의 씨앗인 우방자가 스테롤 조절인자 결합단백질(sterol regulatory element-binding proteins, 이하 ‘SREBP-1c’라 한다), 페록시좀 증식 활성화 수용제(peroxisome proliferator-activated receptors, 이하 ‘PPARs’라 한다) 및 지방산 합성효소(Fatty acid synthase, 이하 ‘FAS’라 한다)의 전사인자들을 촉진하여 세포간지질의 생합성을 촉진하여 노화 등에 기인한 피부표피층의 지질 항상성 붕괴를 치료 및 예방하여, 표피의 피부 장벽효과를 유지해서 피부 전체의 항상성 유지기능 및 노화방지기능을 지속시키는 것을 목적으로 한다.

따라서, 상기와 같은 본 발명의 목적은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 의해 달성된다. 상기 조성물은 피부 지질 생합성 증가에 의한 피부 항상성 유지 효과 및 노화방지 효과를 갖는다

바람직하게는, 상기 조성물은 스테롤 조절인자 결합단백질(SREBP-1c), 페록시좀 증식 활성화 수용제(PPARs) 및 지방산 합성효소(FAS)의 전사인자를 촉진하는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 조성물은 콜레스테롤, 세라마이드 또는 트리글리세라이드 발현양을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 우방자 추출물은 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 0.00001 ~ 40.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 우방자 추출물은 SREBP-1c, PPARs, FAS의 발현증가, Nile red staining & flow cytometry를 통한 지질 증가, 콜레스테롤 발현증가, 트리글리세라이드 발현증가, 세라마이드 발현증가를 갖는다.

도 1은 각질세포에 우방자 추출물 및 리놀렌산을 도포한 경우의 지질 생성량을 도시한 것이다.

본 발명은 피부 표피지질의 생합성 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물로서 지질 생합성 증가에 의하여 피부 항상성을 유지하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은, 스테롤 조절인자 결합단백질(SREBP-1c), 페록시좀 증식 활성화 수용제(PPARs) 또는 지방산 합성효소(FAS)의 전사인자를 조절하여 트리글리세라이드, 콜레스테롤 또는 세라마이드의 생합성 증가시켜서 노화 등의 원인에 기인한 세라마이드 등의 지질 감소에 따른 피부표피지질의 항상성의 붕괴를 치료 및 예방한다.

본 발명의 하기 특정 제조예를 참조하여 우방자 추출물의 제조방법을 설명하면 다음과 같다: 우방자를 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조 중량의 1-10배의 저급알코올을 가한다. 일정온도에서 일정기간 추출하고 여과한 후, 회전 감압증발기로 건조한다.

본 발명에 따르면, 상기 우방자 추출물은 조성물의 전체 중량에 대해서 0.00001 ~ 40.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 우방자 추출물은 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.00001 중량% 미만인 경우에는 유효 효과가 나타나지 않으며, 40.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

따라서, 이러한 우방자 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 SREBP-1c, PPARs, FAS의 발현증가, 지질 증가, 콜레스테롤 발현증가, 세라마이드 발현증가, 트리글리세라이드 발현증가 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 성분은 상기 유효 성분 이외에 피부 외용제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

의약품에 적용할 경우에는 본 발명에 따른 우방자 추출물을 유효성분으로 하여 사용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구투여제 혹은 비경구 투여제롤 제제화 할 수 있다.

경구투여율을 위한 제제로서는 정제, 환제, 과랍제, 연, 경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 필렛제 등을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스르페이, 현탁액, 유제, 좌제 등을 들 수가 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존제, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용화하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1: 우방자 추출물의 제조

본 발명에서 사용한 우방자 추출물의 제조방법은 다음과 같다.

우방자 100g을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조 중량의 1-10배의 70% 저급알코올을 가한다. 15-35℃에서 5일간 추출한 후 300메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압증발기로 건조하여, 건조 중량 28.7 g인 우방자 추출물을 얻었다.

실험예 1: 세포 배양

실험예에 사용한 세포는 2종류로 다음과 같은 방법으로 배양하였다.

① 각질세포: Keratinocyte

인간 정상 피부 세포인 각질세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1× 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1 의 우방자 추출물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 우방자 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.

② 피지세포 : SZ95

사람의 피지세포주인 SZ95 세포는 독일 베를린자유대학의 대학의학센터 벤자민 프랭크린(The Free University of Berlin University Medical center Benjamin Franklin)의 Dr. Zouboulis 로부터 분양받은 Human immortalized sebocyte(SZ95) 세포를 10% FBS가 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)/F12(1:1)을 사용하여 CO2 배양기(37℃,5%CO2)에서 배양하였다. 그리고 48시간 주기로 배양액을 교체하였다.

실험예 2: PPARs 발현량 측정

실험예 1에서 배양된 세포 중 피지세포에 대하여 다음과 같은 방법으로 PPARs( PPAR-α, PPAR-β, PPAR-γ) 단백질 발현량을 측정하였다. 발현량 측정은 웨스턴 블라팅(Western Blotting)을 통한 단백질 발현양 측정방법을 이용하였다.

먼저 배양한 피지세포에 우방자 추출물(20 μg/ml 및 50 μg/ml)와 리놀렌산 200 μg/ml를 각각 처리하고 48시간 배양한다. 이후 배지 제거와 세척을 진행하고 여기에 라이시스 완충액 80㎕로 용해시킨 후 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심 분리 후 상층액을 모았다. 세포 용해액(lysate)에 함유된 단백질의 양은 브래드퍼드(Bradford) 법으로 측정하였다. 30㎕의 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 일렉트로블라팅(electro blotting) 120V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF 막을 5% 탈지유(skim milk)에서 1시간 방치한 뒤 1차 항체(primary antibody)에서 4℃에서 하룻밤 동안 두었다. 다시 TBST로 세 번 세척한뒤 2차 항체(secondary antibody)를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척라고 ECL kit (Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 BioRad GelDoc을 이용하여 정량화 하였다.

각각의 시험값의 밴드 강도를 읽어서 대조군 대비 함량증가를 백분율로 변환하여 표 1에 나타내었다.

	농도 (μg/ml)	PPAR-α(%)	PPAR-β(%)	PPAR-γ(%)
우방자 추출물	20	101.4	192.7	151.8
우방자 추출물	50	112.7	228.6	201.5
리놀렌산	200	161.1	168.3	157.1

우방자 추출물을 농도별(20 및 50 μg/ml)로 처리하고 48시간 배양한 후, PPAR-α, PPAR-β, PPAR-γ 단백질 발현을 조사한 결과, PPAR-β와 PPAR-γ의 발현이 확인되었으며 농도의존적인 단백질 발현 증가를 보여주었다. 양성 대조군인 리놀렌산도 PPAR-β와 PPAR-γ의 발현을 증가시켰다.

실험예 3: SREBP -1c, FAS 의 발현량 측정

실험예 1에서 배양된 세포 중 피지세포에 대하여 다음과 같은 방법으로 SREBP-1c, FAS(fatty acid synthase), 발현량을 측정하였다. 발현량 측정은 웨스턴 블라팅(Western Blotting)을 통한 단백질 발현양 측정방법을 이용하였다.

먼저 배양한 피지세포에 우방자 추출물(20 μg/ml 및 50 μg/ml)과 리놀렌산 200 μg/ml를 각각 처리하고 48시간 배양한다. 이후 배지 제거와 세척을 진행하고 여기에 라이시스 완충액 80㎕로 용해시킨 후 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심 분리 후 상층액을 모았다. 세포 용해액(lysate)에 함유된 단백질의 양은 브래드퍼드(Bradford) 법으로 측정하였다. 30㎕의 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 일렉트로블라팅(electro blotting) 120V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF 막을 5% 탈지유(skim milk)에서 1시간 방치한 뒤 1차 항체(primary antibody)에서 4℃에서 하룻밤 동안 두었다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 2차 항체(secondary antibody)를 상온에서 1시간 반응시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit (Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 BioRad GelDoc을 이용하여 정량화 하였다.

각각의 시험값의 밴드 강도를 읽어서 대조군 대비 함량증가를 백분율로 변환하여 표 2에 나타내었다.

	농도 (μg/ml)	SREBP-1(%)	FAS(%)
우방자 추출물	20	119.6	198.3
우방자 추출물	50	164.9	205.6
리놀렌산	200	121.4	139.9

우방자 추출물을 농도별(20 및 50 μg/ml)로 처리하고 48시간 배양한 후 단백질 발현을 조사한 결과, SREBP-1과 FAS(fatty acid synthase) 단백질 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 양성 대조군으로 사용한 리놀렌산 (200 μg/ml) 또한 단백질 발현이 증가되었다.

실험예 4: 지질 측정

Nile red staining & flow cytometry를 통하여 지질 생성량을 측정하였다.

실험예 1에서 배양된 각질 세포에 우방자 추출물(12.5 μg/ml 및 25.0 μg/ml)과 리놀렌산 200 μg/ml를 각각 처리하고 48시간 배양하였다. 상기 각 월에서 각질세포를 수거한 후, 1 μM Nile red 용액으로 10분간 염색하여 552/636(Ex/Em)nm에서 형광강도(fluorescence intensity)를 측정하였다. 측정결과를 도 1에 도시하였다. 도 1을 보면, Nile red 염색 후 FACS로 형광강도를 측정하여 현미경으로 관찰한 결과, 우방자를 처리한 군에서 지질 생성이 증가하였고, 양성 대조군으로 사용한 리놀렌산 200 μg/ml 처리한 세포(94.64)보다 피크의 넓이가 큰 것(우방자 추출물 25 μg/ml, 99.74)을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 콜레스테롤 측정

실험예 1에서 배양한 SZ95 세포를 10 cm 배양용기에 1 X 10⁵ 개씩 분주하고 우방자 추출물을 각각 25, 50, 100, 200 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 5일간 배양하고 콜레스테롤을 정량하였다. 콜레스테롤 정량 방법은 상기 5일간 배양된 세포에 라이시스 완충액(EDTA 10 μL, 100mM SPB 용액, PMSF 1 μL, Triton X-100 10 μL)를 처리하고 초음파로 분해하였다. 세포용해액에 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액을 첨가하고 혼합하여 원심분리기(2000 rpm, 15분)하여 하층액을 취하여 질소가스(N₂)로 농축시켰다.

상기 농축된 시료에 에탄올 300 μL를 넣어 녹인 후 총 콜레스테롤 키트(total cholesterol kit, AM 202-K)를 이용하여 측정하였다. 1 mL의 효소 시액에 100 μL의 시료를 첨가하고 혼합하여 37℃에서 5분 동안 배양 후 500 nm의 파장에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 표준액의 콜레스테롤은 3 mL의 효소시액에 20 μL의 표준액을 넣어 3 mg/mL 값으로 하였다.

측정된 콜레스테롤의 양을 표 3에 나타내었다. 표 3을 보면, 대조군이 0.81 mg/ml 이었으나, 우방자를 처리한 군보다 콜레스테롤이 증가한 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 트리글리세라이드 측정

실험예 1에서 배양한 SZ95 세포를 10 cm 배양용기에 1 X 10⁵ 개씩 분주하고 우방자를 각각 25, 50, 100, 200 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 5일간 배양하고 콜레스테롤를 정량하였다. 트리글리세라이드 정량 방법은 상기 5일간 배양된 세포에 라이시스 완충액(EDTA 10uL, 100mM SPB 용액, PMSF 1uL, Triton X-100 10uL)를 처리하고 초음파로 분해하였다. 세포용해액에 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액을 첨가하고 혼합하여 원심분리기(2000 rpm, 15분)하여 하층액을 취하여 질소가스(N₂)로 농축시켰다.

상기 농축된 시료에 에탄올 300 μl를 넣어 녹인 후 Triglycerides kit(GPO-PAP)를 이용하여 트리글리세라이드를 측정하였다. 1mL의 효소시액에 100 μL의 시료를 첨가하고 혼합하여 37℃에서 5분 동안 배양 후 546nm의 파장에서 ElISA Reader로 흡광도를 측정하였다. 표준액의 트리글리세라이드는 3mL의 효소시액에 20 μl의 표준액을 넣어 3mg/ml 값으로 하였다.

제형예 1: 우방자 추출물을 함유하는 조성물의 제조

우방자 추출물을 포함하는 제형예 1 (제조예 1)을 제조하였으며, 효능의 비교를 위해 우방자 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 조성물(비교제형예 1), 보습제로서 글리세린 및 솔비톨을 포함하는 조성물(비교제형예 2), 추출물이나 보습제를 모두 포함하지 않는 조성물(비교제형예 3)을 하기 표 5에 나타내었다.

구분	성분 (단위: 중량%)	제형예 1	비교 제형예 1	비교 제형예2	비교 제형예3
A	우방자 추출물 (제조예 1)	0.1	-	-	-
	글리세린	-	5.0	5.0	-
	1,3-부틸렌글리콜	-	5.0	-	-
	솔비톨	-	-	5.0	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7	0.7
	스쿠알렌	5.0	5.0	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2
	사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0	3.0
	BHT	0.05	0.05	0.05	0.05
C	향,방부제	적량	적량	적량	적량

실험예 7: 우방자 추출물의 보습 효과

세포간 지질이 생성되어 증가되면, 피부의 항상성, 면역력 및 보습력도 증가한다. 우방자 추출물의 보습효과를 확인하기 위하여, 상기 제형예 1의 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 80 명을 무작위로 20 명씩 4개 그룹 (A, B, C, 및 D)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 조성물을, B 그룹에는 각각 우방자 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 조성물(비교제형예 1), C그룹에는 보습제로서 글리세린 및 솔비톨을 포함하는 조성물(비교제형예 2)의 조성물을 그리고 D그룹에는 보습제가 들어가지 않은 베이스 제형을 각각 1일 2회씩 4주간 얼굴에 사용하도록 하였다. 보습 효과는 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

구분	사용전	사용 2주 후	사용 4주 후
제형예 1	48.6	61.3	68.7
비교제형예 1	49.3	60.9	66.4
비교제형예 2	47.8	58.6	64.9
비교제형예 3	48.6	49.7	51.3

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 일반 다른 보습제를 함유한 (비교제형예 1,2,3)와 비교하여도 본 발명의 우방자 추출물을 함유한 (제형예 1)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 8: 세라마이드 측정

실험예 7에서 실시한 피험자들에게 피부 각질 시료를 테잎 방법(tape method)를 이용하여 시료를 채취하여 다음과 같은 조건으로 세라마이드 함량을 측정하였다. 테잎 방법으로 적출된 시료의 단위 단백질당 세라마이드의 함량을 구하였으며 단백질의 함량은 BSA 단백질 분석 키드로 구하였다.

세라마이드 분석을 위해 UPLC-MS는 Waters사 Aquity UPLC 시스템과 연결된 Quattro Premier XE MS 모델을 사용하였다.

<분석조건>

컬럼 Acquity BEH C*(2.1 mm X 50 mm, 1.7um)

이동상 5mM 암모늄 포메이트/메탄올(4:6, 0.1% 포름산)

유속: 0.3 ml/min

컬럼 온도: 40℃

이온화조건-ESI 양이온 모드

공급원 온도-130 ℃

탈용매화온도-350℃

콘 가스 유소 800 L/h

모세관 전압-3.2 Kv

이온 모니터 MRM

세라마이드	제형예1(ng/mg)	비교제형예 3(ng/mg)
C16 세라마이드	128.3	88.2
C18 세라마이드	121.7	79.1
C24 세라마이드	183.3	126.1

실험결과 단위 단백질당 세라마이드 3종에 대한 제형예 1과 비교제형예 3를 비교하였을때 함량이 증가한 것을 확인 하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 지질 생합성 촉진용 화장료 조성물로서,
상기 지질은 콜레스테롤, 세라마이드 및 트리글리세라이드로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것인 피부 지질 생합성 촉진용 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 우방자 추출물은 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 0.00001 ~ 40.0 중량% 함유되는 것인, 피부 지질 생합성 촉진용 화장료 조성물.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것인, 피부 지질 생합성 촉진용 화장료 조성물.