KR101429185B1 - Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain - Google Patents
Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain Download PDFInfo
- Publication number
- KR101429185B1 KR101429185B1 KR1020110141907A KR20110141907A KR101429185B1 KR 101429185 B1 KR101429185 B1 KR 101429185B1 KR 1020110141907 A KR1020110141907 A KR 1020110141907A KR 20110141907 A KR20110141907 A KR 20110141907A KR 101429185 B1 KR101429185 B1 KR 101429185B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- phoma
- lane
- primer
- strain
- glomerata
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 PCR을 이용한 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포마 속 균주 중에서도 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 유전자에 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 상기 포마 속 균주의 신속 정확한 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 수입 묘목류 및 종자에서의 검역병원균인 병자각균 포마 속 (Phoma sp.)을 고속으로 보다 간편한 방식으로 분류 및 동정할 수 있다. The present invention relates to a phoma More particularly, the present invention relates to a method for detecting a strain of Phoma The present invention relates to a primer specific to Actin and a β-tublin gene of glomerata , and a method for rapidly and precisely detecting the strain of the genus Forma using the primer.
According to the present invention, the quarantine pathogens in imported seedlings and seeds, Phoma sp.) can be classified and identified at a high speed in a more convenient manner.
Description
본 발명은 PCR을 이용한 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포마 속 균주 중에서도 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 유전자에 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 상기 포마 속 균주의 신속 정확한 검출방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a phoma More particularly, the present invention relates to a method for detecting a strain of Phoma (Actin) and? -tublin genes of glomerata , and a method for rapidly and precisely detecting the strain of the genus Forma using the primer.
식물의 진균병은 발병되면 전파가 매우 빠르기 때문에 피해가 클 뿐 아니라 방제가 어려워 식물검역에 있어서 매우 중요하게 다루어지고 있다. 특히, 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 발생은 기주범위가 넓고 특히, 월귤, 참다래 및 양벚나무에 점무늬병, 잎마름병 및 검은무늬병 등을 일으켜 생산량 감소를 초래하는 등 그 피해가 커 포마 속 (Phoma sp.) 중 9종이 검역병으로 지정되어 있다.The fungal disease of plants is very fast because of the spreading of the disease, so it is not only difficult to control but also it is very important for plant quarantine. In particular, phoma sp.) the generation of strain in that damage, such as to result in jeommunuibyeong, leaf blight and yield reduction caused by such as a large black blotch particular, blueberry, kiwi, and both the host range cherry greater poma (Phoma sp.) are designated as quarantine bottles.
그러나, 수입 종자류 검사는 주로 습지배양하여 형태적 동정에 의존하므로 병자각균의 동정이 매우 어렵고 배양시 포자형성까지 소요되는 시간이 너무 길어 효율적인검사가 어려운 실정이다. 2006년부터 2009년간 검출된 관리병해충 포마 속 (Phoma sp.)은 수박 종자와 해바라기종자에서 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 2건만이 동정되어 그 검출 실적이 매우 저조하다.However, it is very difficult to identify the mosquito bacterium because it depends on morphological identification by cultivation of wet seeds. From 2006 to 2009, phytopathogenic fungi ( Phoma sp.) was detected only in two watermelon seeds and two seeds of Phoma glomerata in sunflower seeds.
따라서, 병자각균에 효과적으로 대응하기 위해서는, 병자각균의 감염 여부 및 어떤 종의 병자각균에 감염되었는지 신속하게 확인하여야 한다. 특히, 최근에는 고소득 작물인 외국산 과수류에 대한 관심이 증가하면서 국내에서 재배가 가능한 올리브, 자두, 월귤(블루베리), 참다래, 양벚 등 재식용 묘목 수입이 급속히 증가되어, 수입 묘목류나 종자가 병자각균 포마 속 (Phoma sp.)에 감염되었는지 여부 및 상기 묘목이나 종자로부터 검출되는 균주가 포마 속 (Phoma sp.)인지를 신속하게 구분할 것이 요구되고 있다. Therefore, in order to effectively cope with mosquito bacillus, it is necessary to promptly confirm whether the mosquito bacillus has been infected and which species has been infected. In recent years, as the interest in foreign high-yielding crops has increased, imports of seedlings such as olives, plums, blueberries, kiwi, and cherry trees, which can be cultivated in Korea, have been rapidly increasing, and imported seedlings and seeds Phoma sp.) and whether the strain detected from the seedlings or seeds is infected with phoma sp.) is required to be identified quickly.
따라서, 다양한 병자각균에 감염된 종자나 묘목을 대상으로 어떠한 병자각균에 감염되었는지 그 종 구분을 신속하게 수행할 수 있는 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 키트나 검출방법이 요구된다.
Therefore, there is a need for a detection primer and a detection kit or a detection method using the detection primer capable of rapidly sorting any mosquito bacterium infected with seeds or seedlings infected with various pathogens.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포마 글로메라타 (Phoma 균주를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention poma glow other camera (Phoma A primer set that specifically detects a strain is provided.
또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계 및 상기 PCR 결과를 확인하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주의 존재 유무를 판단하는 단계를 포함하는, 포마 속 (Phoma sp.) 균주를 검출하는 방법을 제공한다.
The present invention also relates to a method for detecting the presence or absence of a strain of Phoma glomerata by performing PCR using the primer set for DNA extracted from a sample, Phoma sp.) strains.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 신속 정확하게 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 존재 유무를 검출할 수 있는 PCR 방법을 확립하고자 연구하던 중, 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 유전자를 토대로 특이적인 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 검출이 가능한 프라이머 세트를 설계 및 제작하였고, 이를 토대로 포마 속 (Phoma sp.) 균주 균주의 검출 방법을 확립하였다. The present invention has been made in order to establish a PCR method capable of detecting the presence or absence of a Phoma sp. Strain quickly and accurately. Actin and β-tubulin of Phoma sp. ( Phoma sp.) strain was designed and constructed on the basis of this gene, and a detection method of the strain of Phoma sp. was established based on this primer set.
본 발명은 포마 속 (Phoma sp.) 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여, 시료내 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 존재 유무를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 시료로부터 포마 속 (Phoma sp.) 균주에 특이적인 염기서열을 PCR로 증폭시켜서 포마 속 (Phoma sp.) 균주를 검출한다. The present invention using a specific primer set in the poma (Phoma sp.) Strain, in a sample within poma (Phoma sp.) Provides a method for detecting the presence or absence of strain. In this method, a base sequence specific to a strain of Phoma sp. Is amplified by PCR from a sample to detect a Phoma sp. Strain.
본 발명은 포마 속 (Phoma sp.) 균주 중에서도 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua) 또는 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 균주에 각각 특이적인 프라이머 세트를 제공한다. The present invention relates to the use of phoma Among the strains, phoma medicinalis ( Phoma medicaginis , Phoma loticola , Phoma glomerata , phoma exigua ( Phoma exigua or Phoma destructiva < / RTI > strains.
포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다. Phoma Medica medicaginis ) detecting primer set is a set comprising a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
포마 로티콜라 (Phoma loticola) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다. Phoma loticola ) detecting primer set is a set comprising a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다. Phoma glomerata ) detecting primer set is a set comprising a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
포마 엑시구아 (Phoma exigua) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다. Phoma exigua detection primer set is a set comprising a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다. Phoma destructiva ) detecting primer set is a set comprising a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
본 발명의 프라이머 디자인 방법은 국내?외의 포마 속 (Phoma sp .) 분양 균주 27점을 확보한 후, 그 중에서도 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 서브글로메라타 (Phoma subglomerata), 보에레미아 엑시구아 (Boeremia exigua)의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 서열에서 프라이머를 디자인하였다. The primer design method of the present invention is a method of designing a phoma sp . ). After securing 27 prevalent strains, among them Phoma destructiva , Phoma exigua , Phoma glomerata , Phoma loticola , < RTI ID = 0.0 > Phoma & medicaginis , Phoma subglomerata subglomerata , Boeremia < RTI ID = 0.0 > The primers were designed from Actin and β-tublin sequences of exigua.
프라이머의 선발은, 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 균주 중 특정 균주에만 반응하고 근연종 포몹시스 속 (Phomopsis sp.), 파일로스틱타 속 (Phyllosticta sp.)이나 다른 포마 속 (Phoma sp.) 균주에는 반응하지 않는 종 특이적인 프라이머를 제작하였다. 또한 Phoma 속균과 유사한 균사상태로 존재하는 토양 및 종자서식균인 라이족토니아(Rhizoctonia sp). 푸사리움(Fusarium sp). 파이소프토라(Phytophthora sp.), 피시움 속(Pythium sp .) 등의 균주에도 반응하지 않는 종 특이적 프라이머를 제작하였다.Selection of the primers was carried out using Phoma medicaginis , Phoma loticola , Phoma glomerata), poma eksi guar (Phoma exigua), poma Death trucks Tyva (Phoma destructiva ) and only a few strains of the genus Phomopsis sp.), phyllosticta sp. or other phoma Species specific primers that did not react with the strain were prepared. In addition, Rhizoctonia sp . Is a soil and seed culture that exists in a mycelial state similar to that of Phoma . Fusarium sp ). Phytophthora sp. , Pythium sp. sp . ) Was prepared by using a strain-specific primer.
본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua) 또는 포마 데스트룩티바 (Phoma destructiva) 균주를 검출하기 위한 키트를 제공한다. The invention, poma Medica jiniseu (Phoma comprising a reagent for performing a primer set and amplification reaction according to the invention medicaginis , Phoma loticola , Phoma glomerata , phoma exigua ( Phoma exigua or Phoma destructiva ) strains.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. In the kit of the present invention, the reagent for carrying out the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffer, and the like. In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performing conditions.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 종자 또는 묘목에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 포마 속 (Phoma sp.) 병자각균을 검출하는 방법을 제공한다.In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a method of isolating genomic DNA from a plant seed or a seedling by amplifying the genomic DNA using the separated genomic DNA as a template and an oligonucleotide primer set according to the present invention carried out by amplifying the target sequence and poma comprising the step of detecting the amplified product in (Phoma sp.) mosquito bacterium.
본 발명의 식물 종자 또는 묘목 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계에 있어서, 상기 병원균에 기주식물이 될수 있는 종자를 선발하여 실험하였으며 이는 바람직하게는 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파(Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자를 포함하거나 그밖의 모든 식물에 적용됨을 포함하므로 포마 속 (Phoma sp .) 병자각균에 감염된 식물이면 이에 제한되지 않는다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizardprep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 실시예에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 모든 종류의 키트를 이용할 수 있다.
In the step of isolating the genomic DNA from the plant seed or seedling sample of the present invention, seeds that can be host plants for the pathogens have been selected and tested, which are preferably chicory, canola, alfalfa It is applied to all plants, including Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice, Palm seeds, It contains phoma sp . ) Is not limited to plants infected with the pathogen. A method known in the art may be used for separating the genomic DNA from the sample. For example, the CTAB method may be used, or a wizardprep kit (Promega) may be used. Using the separated genomic DNA as a template, an oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention may be used as a primer to amplify the target sequence. Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Strand displacement amplification or amplification with Q [beta] replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and all sorts of commercially available kits can be used.
수입 묘목이나 종자에서 검출될 수 있는 병자각균은 발병되면 전파가 매우 빠르고 피해가 크기 때문에, 식물 검역시의 신속한 검사가 필요하다. 본 발명은 병자각균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출용 프라이머, 검출방법 및 검출키트와 상기 검출용 프라이머 제작에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제안함으로써, 상기 병자각균의 감염여부의 조기 진단에 따른 신속한 조치와 특정 병자각균에 대한 맞춤형 방역활동을 가능하게 할 수 있으므로, 산업적으로 그 효과가 매우 크다고 할 것이다.
Since the pathogenic bacteria that can be detected in imported seedlings or seeds are very fast to propagate and cause a great deal of damage, rapid inspection at the time of plant quarantine is necessary. The present invention proposes a detection primer, a detection method and a detection kit capable of rapidly and accurately detecting sickle-shaped bacteria and a polynucleotide that can be used in the production of the detection primer, And it is possible to make customized anti-virus activities against specific mosquito bacterium. Therefore, the effect is very high in industry.
도 1은 PCR을 위한 적절한 변성 (Denaturation) 조건을 확립하기 위하여, 94℃에서 1분, 2분, 3분, 5분 동안 변성한 DNA로 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 3: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 레인 4: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 5: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), M: 100bp marker.
도 2는 PCR을 위한 적절한 PCR 사이클 조건을 확립하기 위하여, 20 30, 40 사이클 후 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 3: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 레인 4: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 5: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), M: 100bp marker.
도 3은 PCR을 위한 적절한 주형 (Template) DNA 농도 조건을 확립하기 위하여, 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 포마 로티콜라 (Phoma loticola) (CBS562.81, 180bp), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) (CBS108.62, 205bp)의 DNA를 배수별 (10배, 50배, 100배, 500배, 1000배)로 희석하여 PCR을 수행하여 낮은 농도에서의 검출능을 조사한 것이다. 레인 1: 1x 희석액, 레인 2: 10x 희석액, 레인 3: 50x 희석액, 레인 4: 100x 희석액, 레인 5: 500x 희석액, 레인 6: 1000x 희석액, M: 마커 (100bp 또는 25/100bp).
도 4는 본 발명의 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae-batatas)(KACC 43114).
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 6은 본 발명의 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 글로메라타 (P. glomerata)(KACC41361, 214bp); 2: Phoma sp.(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 7은 본 발명의 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 2: Phoma sp.(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 8은 본 발명의 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae -batatas)(KACC 43114).
도 9는 본 발명의 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 데스트럭티바 (P. destructiva) (CBS162.78), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 10은 본 발명의 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)을 이용하여 포마 엑시구아 (Phoma exigua)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 11은 본 발명의 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)을 이용하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 12는 본 발명의 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 포마 로티콜라 (Phoma loticola)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 로티콜라 (Phoma loticola) (CBS 562.81), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 13은 본 발명의 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) (CBS 108.62), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 14는 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 5를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 중 어느 하나와 비교 균주로서 3개의 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 균주에 대하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다. M: 25/100bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 각각 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 3: 필로스틱타 카피타렌시스 (Phyllosticta capitalensis)(KACC 45111), 레인 4: 필로스틱타 시트리아시아나 (Phyllosticta citriasiana)(KACC 45113), 레인 5: 필로스틱타 무사룸 (Phyllosticta musarum)(KACC 45114).
도 15는 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 5를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 중 어느 하나와 비교 균주로서 4종의 토양 병원균에 대하여 실시한PCR 결과를 나타낸다. M: 25/100bp, 레인 1: 각각 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 레인 2: 푸사리움 속 (Fusarium sp.), 레인 3: 리조크토니아 속 (Rhizoctonia sp.), 레인 4: 피티움 속 (Pythium sp.), 레인 5: 피톱쏘라 속 (Phytophthora sp.)
도 16은 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 17은 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)를 이용하여 포마 엑시구아 (Phoma exigua)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 18은 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)를 이용하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 19는 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 포마 로티콜라 (Phoma loticola)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 20은 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 21은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)의 접종 농도 (1x105, 1x104, 1x103, 1x102, 1x101 cfu/ml)에 따른 검출능을 조사한 결과를 나타낸다. M: 15/7000bp, 레인 1, 6, 11, 16, 21: 1x105 cfu/ml, 레인 2, 7, 12, 17, 22: 1x104 cfu/ml, 레인 3, 8, 13, 18, 23: 1x103 cfu/ml. 레인 4, 9, 14, 19, 24: 1x102 cfu/ml, 레인 5, 9, 14, 19, 25: 1x101 cfu/ml.
도 22는 본 발명에 따른 PCR 수행 과정을 사진으로 나타낸 것이다.
도 23은 개발프리믹스 키트에서의 5종의 프라이머별 검출능을 검정한 결과를 나타낸 것이다. M, 마커; 1, 양성대조구; 2, 사과묘목에서 추출한 DNA; 3, 음성대조구; 4, DW(증류수)FIG. 1 shows the result of performing PCR with denatured DNA at 94 ° C for 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, and 5 minutes in order to establish appropriate denaturation conditions for PCR. Lane 1: Fomade Des Trucke Tiba (Phoma destructiva) (CBS 162.78, 193 bp), lane 2: pomacexgua (Phoma exigua) (CBS 761.70, 222 bp), lane 3: formalin exsigua (Phoma exigua) (CBS761.70, 206bp), lane 4: phomaroticola (Phoma loticola) (CBS 562.81, 180 bp), Lane 5: Forma Medicinalis (Phoma medicaginis) (CBS 108.62, 205 bp), M: 100 bp marker.
Figure 2 shows the results of performing PCR after 20-30, 40 cycles to establish appropriate PCR cycle conditions for PCR. Lane 1: Fomade Des Trucke Tiba (Phoma destructiva) (CBS 162.78, 193 bp), lane 2: pomacexgua (Phoma exigua) (CBS 761.70, 222 bp), lane 3: formalin exsigua (Phoma exigua) (CBS761.70, 206bp), lane 4: phomaroticola (Phoma loticola) (CBS 562.81, 180 bp), Lane 5: Forma Medicinalis (Phoma medicaginis) (CBS 108.62, 205 bp), M: 100 bp marker.
Figure 3 is a graphical representation of the results obtained in the presence of a formaldehyde-Phoma exigua) (CBS 761.70, 222 bp), formalin exiguaPhoma exigua) (CBS761.70, 206bp), phomaroticola (Phoma loticola) (CBS 562.81, 180 bp), Pomade medicinalis (Phoma medicaginis(CBS108.62, 205bp) was diluted by the drainage (10 times, 50 times, 100 times, 500 times, 1000 times) and PCR was carried out to investigate the detection ability at low concentration. Lane 1: 1x diluent, lane 2: 10x diluent, lane 3: 50x dilution, lane 4: 100x dilution, lane 5: 500x dilution, lane 6: 1000x dilution, M: marker (100bp or 25 / 100bp).
FIG. 4 shows the results of performing PCR on 12 strains using the primer set 5 (PD-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: Formadest truck teba (Phoma destructiva) (CBS 162.78, 193bp), lane 2:Phomasp.) (KACC 40355), lane 3:Phomasp.) (KACC41362), lane 4:Phomasp.) (KACC41841), lane 5:Phomasp.) (KACC42405), lane 6:Phomasp.) (KACC42444), lane 7:Phomasp.) (KACC42445), lane 8:Phomasp.) (KACC42479), lane 9:Phomopsis sp.) (KACC 40333), lane 10: poopsic diosporaPhomopsis diospyri) (KACC41009), lane 11:Phomopsis sp.) (KACC42446), lane 12: poomoths iphomoea-batatas (Phomopsis ipomoeae-batatas) (KACC 43114).
FIG. 5 shows the results of performing PCR on 12 strains using the primer set 4 (PE-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: pomace exigua (Phoma exigua) (CBS 761.70, 222 bp), lane 2:Phomasp.) (KACC 40355), lane 3:Phomasp.) (KACC41362), lane 4:Phomasp.) (KACC41841), lane 5:Phoma sp.) (KACC42405), lane 6:Phoma sp.) (KACC42444), lane 7:Phomasp.) (KACC42445), lane 8:Phoma sp.) (KACC42479), lane 9:Phomopsis sp.) (KACC 40333), lane 10: poopsic diosporaPhomopsis diospyri) (KACC41009), lane 11:Phomopsis sp.) (KACC42446), lane 12: poomoths iphomoea-batatas (Phomopsis ipomoeae - batatas) (KACC 43114).
FIG. 6 shows the results of performing PCR on 12 strains using the primer set 3 (PG-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: pomagglomerata (P. glomerata) (KACC41361, 214 bp); 2: Phoma sp. (KACC 40355), lane 3:Phoma sp.) (KACC41362), lane 4:Phoma sp.) (KACC41841), lane 5:Phoma sp.) (KACC42405), lane 6:Phoma sp.) (KACC42444), lane 7:Phomasp.) (KACC42445), lane 8:Phoma sp.) (KACC42479), lane 9:Phomopsis sp.) (KACC 40333), lane 10: poopsic diosporaPhomopsis diospyri) (KACC41009), lane 11:Phomopsis sp.) (KACC42446), lane 12: poomoths iphomoea-batatas (Phomopsis ipomoeae - batatas) (KACC 43114).
FIG. 7 shows the results of PCR performed on 12 strains using the primer set 2 (PL-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: pomaloticola (Phoma loticola) (CBS 562.81, 180 bp), lane 2: Phoma sp. (KACC 40355), lane 3:Phoma sp.) (KACC41362), lane 4:Phoma sp.) (KACC41841), lane 5:Phoma sp.) (KACC42405), lane 6:Phoma sp.) (KACC42444), lane 7:Phomasp.) (KACC42445), lane 8:Phoma sp.) (KACC42479), lane 9:Phomopsis sp.) (KACC 40333), lane 10: poopsic diosporaPhomopsis diospyri) (KACC41009), lane 11:Phomopsis sp.) (KACC42446), lane 12: poomoths iphomoea-batatas (Phomopsis ipomoeae - batatas) (KACC 43114).
FIG. 8 shows the results of PCR performed on 12 strains using the primer set 1 (PM-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: pomade medicinalis (Phoma medicaginis) (CBS 108.62, 205 bp), lane 2:Phoma sp.) (KACC 40355), lane 3:Phoma sp.) (KACC41362), lane 4:Phoma sp.) (KACC41841), lane 5:Phoma sp.) (KACC42405), lane 6:Phoma sp.) (KACC42444), lane 7:Phoma sp.) (KACC42445), lane 8:Phoma sp.) (KACC42479), lane 9:Phomopsis sp.) (KACC 40333), lane 10: poopsic diosporaPhomopsis diospyri) (KACC41009), lane 11:Phomopsis sp.) (KACC42446), lane 12: poomoths iphomoea-batatas (Phomopsis ipomoeae -batatas) (KACC 43114).
FIG. 9 is a graph showing the results obtained by using the primer set 5 (PD-BTP1) of the present invention and the number of phamaceuticals (Phoma destructiva)Phoma) Strain of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: DW, negative control, lane 2: pomade dogtiva (P. destructiva) (CBS 162.78), lane 3: Fomatra capillata (Phoma tracheiphila) (KACC 45210), Lane 4: Formacacular Vitacea Room (P. cucurbitacearum) ≪ / RTI > (KACC45215), lane 5:P. flaccida(KACC 45216), lane 6: P. fungicola (KACC 45217), lane 7:P. lingam) ≪ / RTI > (KACC45218), lane 8:Phoma loticola) (KACC45220), lane 9: forma macdonaldi (P. macdonaldii) (KACC45221), lane 10: Foma macros toma (P. macrostoma there . macrostoma) (KACC 45222).
FIG. 10 shows the result of performing PCR on Phoma exigua and 8 Phoma strains using the primer set 4 (PE-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: DW, negative control, lane 2:Phoma exigua) (CBS 761.70), lane 3:Phoma tracheiphila) (KACC 45210), Lane 4: Formacacular Vitacea Room (P. cucurbitacearum) ≪ / RTI > (KACC45215), lane 5:P. flaccida(KACC 45216), lane 6: P. fungicola (KACC 45217), lane 7:P. lingam) ≪ / RTI > (KACC45218), lane 8:Phoma loticola) (KACC45220), lane 9: forma macdonaldi (P. MacDonaldi) (KACC45221), lane 10: Foma macros toma (P. macrostoma there . macrostoma) (KACC 45222).
FIG. 11 shows the results of performing PCR on Phoma glomerata and 8 Phoma strains using the primer set 3 (PG-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: DW, negative control, lane 2: phomaglomerata (Phoma glomerata), Lane 3: Formatra capillary (Phoma tracheiphila) (KACC 45210), Lane 4: Formacacular Vitacea Room (P. cucurbitacearum) ≪ / RTI > (KACC45215), lane 5:P. flaccida(KACC 45216), lane 6: P. fungicola (KACC 45217), lane 7:P. lingam) ≪ / RTI > (KACC45218), lane 8:Phoma loticola) (KACC45220), lane 9: forma macdonaldi (P. MacDonaldi) (KACC45221), lane 10: Foma macros toma (P. macrostoma there . macrostoma) (KACC 45222).
Fig. 12 is a graph showing the results obtained by using the primer set 2 (PL-BTP1) of the present invention and the phoma loticola and eightPhoma) Strain of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: DW, negative control, lane 2: pomaloticola (Phoma loticola) (CBS 562.81), lane 3:Phoma tracheiphila) (KACC 45210), Lane 4: Formacacular Vitacea Room (P. cucurbitacearum) ≪ / RTI > (KACC45215), lane 5:P. flaccida(KACC 45216), lane 6: P. fungicola (KACC 45217), lane 7:P. lingam) ≪ / RTI > (KACC45218), lane 8:Phoma loticola) (KACC45220), lane 9: forma macdonaldi (P. macdonaldii) (KACC45221), lane 10: Foma macros toma (P. macrostoma there . macrostoma) (KACC 45222).
FIG. 13 shows the results of performing PCR on Phoma medicaginis and 8 Phoma strains using the primer set 1 (PM-BTP1) of the present invention. M: 25/100 bp, lane 1: DW, negative control, lane 2: Phoma medicaginis (CBS 108.62), lane 3:Phoma tracheiphila) (KACC 45210), Lane 4: Formacacular Vitacea Room (P. cucurbitacearum) ≪ / RTI > (KACC45215), lane 5:P. flaccida(KACC 45216), lane 6: P. fungicola (KACC 45217), lane 7:P. lingam) ≪ / RTI > (KACC45218), lane 8:Phoma loticola) (KACC45220), lane 9: forma macdonaldi (P. macdonaldii) (KACC45221), lane 10: Foma macros toma (P. macrostoma there . macrostoma) (KACC 45222).
FIG. 14 is a graph showing the results obtained by using primer sets 1 to 5 according to the present invention,Phoma medicaginis), Fomarotikola (Phoma loticola), ≪ / RTI >Phoma glomerata), ≪ / RTI >Phoma exigua), Formadest truck (Phoma destructiva) And 3 strains of Phyllosticta sp. As a comparative strain. M: 25/100 bp, lane 1: DW, negative control, lane 2:Phoma medicaginis), Fomarotikola (Phoma loticola), ≪ / RTI >Phoma glomerata), ≪ / RTI >Phoma exigua), Formadest truck (Phoma destructiva), Lane 3: phyllosic tacapitalans (Phyllosticta capitalensis) (KACC 45111), Lane 4: Philostronica Citi Asiana (Phyllosticta citriasiana) (KACC 45113), Lane 5: Philosophical Tamusa Room (Phyllosticta musarum) (KACC 45114).
FIG. 15 is a graph showing the results obtained by using primer sets 1 to 5 according to the present invention,Phoma medicaginis), Fomarotikola (Phoma loticola), ≪ / RTI >Phoma glomerata), ≪ / RTI >Phoma exigua), Formadest truck (Phoma destructiva) And the comparative strain, and the results are shown in the PCR result for four kinds of soil pathogens. M: 25 / 100bp, lane 1:Phoma destructiva),Formosa exigua (Phoma exigua), ≪ / RTI >Phoma glomerata), Pomalotikola (Phoma loticola), ≪ / RTI >Phoma medicaginis), Lane 2: fusarium speciesFusarium sp.), Lane 3: rijacktonia sp. (Rhizoctonia sp.), lane 4:Pythium sp.), lane 5: sawdustPhytophthora sp.)
Fig. 16 is a graph showing the results obtained by using primer set 5 (PD-BTP1)Phoma destructiva10 chickory, Canola, Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice (Rice) ), And palm (Seed Palm) seeds. M: 15 / 7000bp, (-): Water, (+): Formadess Truck Tiba (Phoma destructiva), Lane 1: Chicory, Lane 2: Canola, Lane 3: Alfalfa, Lane 4: Carrot, Lane 5: Sorghum, Lane 6: Pepper, Lane 7: Tomato, Lane 8: Wild rye, Lane 9: Rice, Lane 10: Palm seed.
17 is a graph showing the results obtained by using primer set 4 (PE-BTP1)Phoma exigua10 chickory, Canola, Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice (Rice) ), And palm (Seed Palm) seeds. M: 15 / 7000bp, (-): Water, (+): Formadess Truck Tiba (Phoma destructiva), Lane 1: Chicory, Lane 2: Canola, Lane 3: Alfalfa, Lane 4: Carrot, Lane 5: Sorghum, Lane 6: Pepper, Lane 7: Tomato, Lane 8: Wild rye, Lane 9: Rice, Lane 10: Palm seed.
Fig. 18 is a graph showing the results obtained by using primer set 3 (PG-BTP1)Phoma glomerata10 chickory, Canola, Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice (Rice) ), And palm (Seed Palm) seeds. M: 15 / 7000bp, (-): Water, (+): Formadess Truck Tiba (Phoma destructiva), Lane 1: Chicory, Lane 2: Canola, Lane 3: Alfalfa, Lane 4: Carrot, Lane 5: Sorghum, Lane 6: Pepper, Lane 7: Tomato, Lane 8: Wild rye, Lane 9: Rice, Lane 10: Palm seed.
FIG. 19 is a graph showing the results obtained by using primer set 2 (PL-BTP1)Phoma loticola10 chickory, Canola, Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice (Rice) ), And palm (Seed Palm) seeds. M: 15 / 7000bp, (-): Water, (+): Formadess Truck Tiba (Phoma destructiva), Lane 1: Chicory, Lane 2: Canola, Lane 3: Alfalfa, Lane 4: Carrot, Lane 5: Sorghum, Lane 6: Pepper, Lane 7: Tomato, Lane 8: Wild rye, Lane 9: Rice, Lane 10: Palm seed.
FIG. 20 is a graph showing the results of measurement of the fluorescence intensity of the primer set 1 (PM-BTP1)Phoma medicaginis10 chickory, Canola, Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice (Rice) ), And palm (Seed Palm) seeds. M: 15 / 7000bp, (-): Water, (+): Formadess Truck Tiba (Phoma destructiva), Lane 1: Chicory, Lane 2: Canola, Lane 3: Alfalfa, Lane 4: Carrot, Lane 5: Sorghum, Lane 6: Pepper, Lane 7: Tomato, Lane 8: Wild rye, Lane 9: Rice, Lane 10: Palm seed.
Fig. 21 is a cross-Phoma medicaginis), Fomarotikola (Phoma loticola), ≪ / RTI >Phoma glomerata), ≪ / RTI >Phoma exigua), Formadest truck (Phoma destructiva) Inoculation concentration (1x105, 1x104, 1x103, 1x102, 1x10One cfu / ml). M: 15/7000 bp,
22 is a photograph showing a PCR process according to the present invention.
FIG. 23 shows the results of testing the detection performance of the five types of primers in the development premix kit. M, marker; 1, positive control; 2, DNA extracted from apple seedlings; 3, negative control; 4, DW (distilled water)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하기 이해시키기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the structure and effects of the present invention will be described in more detail with reference to specific examples and comparative examples in order to facilitate understanding of the present invention. However, it should be understood that the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
<재료 및 방법>≪ Materials and methods >
실험 전 준비물Preparation before experiment
- DNA 추출키트 : Qiagen DNeasy plant mini kit (cat. No. 69104) - DNA Extraction Kit: Qiagen DNeasy plant mini kit (cat. No. 69104)
- 항온블럭 또는 항온수조를 65℃로 미리 맞춰둔다- Pre-set temperature block or hot water bath to 65 ° C
- AP1(Lysis buffer)을 미리 65℃에서 10분간 가열한다. - Heat AP1 (Lysis buffer) at 65 ° C for 10 minutes in advance.
게놈 (Genome ( genomicgenomic ) ) DNADNA 추출 extraction
① 종자를 블렌더에 곱게 갈거나 파우치를 이용하여 마쇄한다.① Grind the seed to the blender finely or use a pouch.
② 시료 1g을 1.5㎖ 튜브에 담는다.② Put 1 g of sample in 1.5 ml tube.
③ 미리 65℃에 가열된 AP1(lysis buffer)를 400㎕ 첨가한다.(3) Add 400 μl of AP1 (lysis buffer) heated to 65 ° C in advance.
④ RNase A stock solution(100 mg/ml) 4㎕ 첨가하고 30초-1분간 혼합 후④ Add 4 μl of RNase A stock solution (100 mg / ml) and mix for 30 seconds to 1 minute
65℃에서 10분간 가열한다(이때 2-3분마다 가볍게 섞어준다) Heat at 65 ° C for 10 minutes (lightly shake every 2-3 minutes)
⑤ AP2 130㎕을 첨가하고 잘 혼합한 후 5분간 얼음 또는 냉장고에 둔다. ⑤ Add 130 ㎕ of AP2, mix well and place on ice or refrigerator for 5 minutes.
⇒ 14,000rpm으로 5분간 원심분리 한다. ⇒ Centrifuge at 14,000 rpm for 5 minutes.
⑥ 상층액을 collection tube가 부착된 스핀-컬럼(보라색)에 옮긴다. ⑥ Transfer the supernatant to a spin-column (purple) with collection tube.
⇒ 14,000rpm으로 2분간 원심분리 한다. ⇒ Centrifuge at 14,000 rpm for 2 minutes.
⑦ 원심분리 후 collection tube로 빠져나온 용액을 새로운 튜브로 옮긴다. ⑦ After centrifugation, transfer the solution that has escaped to the collection tube to a new tube.
⑧ 용액의 1.5배가 되도록 AP3/E를 첨가하여 강하게 혼합하여 준다. ⑧ AP3 / E is added so that it is 1.5 times as much as the solution, and mixed strongly.
⑨ 혼합액의 650㎕ 정도를 스핀-컬럼(투명색)으로 옮긴다. ⑨ Transfer about 650μl of the mixed solution to the spin-column (transparent color).
⇒ 14,000rpm으로 10분간 원심분리 한다(2회 반복 수분 완전히 제거). ⇒ Centrifuge at 14,000 rpm for 10 minutes (completely remove water twice).
⑩ column membrane을 새로운 tube에 장착하고 AE(Elution buffer)를 100㎕ ⑩ Insert column membrane into new tube and add 100 ㎕ of AE (Elution buffer)
첨가한 후 5분간 실온에 둔다. After addition, the mixture is allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
⑪ 8,000rpm으로 1분간 원심분리 하여 DNA를 추출한다.⑪ Centrifuge at 8,000 rpm for 1 minute to extract DNA.
⑫ 추천: 최대한 많은 DNA를 획득하기 위해 ⑪번 과정을 반복한다.
⑫ Recommendation:
PCRPCR 반응 reaction
PCR 혼합물로서 시료, 양성대조군, 음성대조군, 물의 4가지를 제조하였다. PCR 혼합물은 Hot start PCR premix(Bioneer) 20㎕, 정방향 프라이머 1㎕ (25 pmole), 역방향 프라이머 1㎕ (25 pmole), 게놈 DNA 1㎕, 증류수 17㎕로 첨가하여 최종 부피를 20㎕로 조정하였다. As a PCR mixture, four samples were prepared: a sample, a positive control, a negative control, and water. PCR mixture was prepared by adding 20 Hot of Hot start PCR premix (Bioneer), 1 정 (25 pmoles) of forward primer, 25 ole of reverse primer, 1 게 of genomic DNA and 17 증 of distilled water to adjust the final volume to 20 하였다 .
PCRPCR 조건 Condition
PCR 조건은 92℃에서 2분간 예비변성 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분의 30 사이클을 수행한 후, 72℃에서 7분간 최종 연장을 수행하였다. 이 중 10㎕를 전기영동으로 확인하였다 (도 22). 프라이머의 서열 정보는 하기의 표 1에 나타내었다. The PCR conditions were preliminary denaturation at 92 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes, followed by a final extension at 72 ° C for 7 minutes. 10 [mu] l of these was confirmed by electrophoresis (Fig. 22). Sequence information of the primers is shown in Table 1 below.
서열번호SEQ ID NO:
서열 (5'→3')The sequence (5 '- > 3')
(μ(μ
molmol
))
222222
프라이머 세트 1은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)에 특이적인 프라이머 세트로서, PM-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 1은 정방향의 프라이머 (PM-BTP1(F1)), 서열번호 2는 역방향의 프라이머(PM-BTP1(R1))이다. The primer set 1 is Phoma medicaginis ) as PM-BTP1. SEQ ID NO: 1 is a forward primer (PM-BTP1 (F1)) and SEQ ID NO: 2 is a reverse primer (PM-BTP1 (R1)).
프라이머 세트 2는 포마 로티콜라 (Phoma loticola)에 특이적인 프라이머 세트로서, PL-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 3은 정방향의 프라이머 (PL-BTP1(F1)), 서열번호 4는 역방향의 프라이머(PL-BTP1(R1))이다. The primer set 2 is Phoma loticola ) as a primer set, designated PL-BTP1. SEQ ID NO: 3 is a forward primer (PL-BTP1 (F1)) and SEQ ID NO: 4 is a reverse primer (PL-BTP1 (R1)).
프라이머 세트 3은 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)에 특이적인 프라이머 세트로서, PG-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 5는 정방향의 프라이머 (PG-BTP1(F1)), 서열번호 6은 역방향의 프라이머(PG-BTP1(R1))이다.The primer set 3 is Phoma glomerata ) as a primer set, designated PG-BTP1. SEQ ID NO: 5 is a forward primer (PG-BTP1 (F1)) and SEQ ID NO: 6 is a reverse primer (PG-BTP1 (R1)).
프라이머 세트 4는 포마 엑시구아 (Phoma exigua)에 특이적인 프라이머 세트로서, PE-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 7 (PE-BTP1(F1))과 서열번호 8 (PE-BTP1(F2))은 정방향의 프라이머, 서열번호 9는 역방향의 프라이머(PE-BTP1(R1))이다.The primer set 4 was a Phoma exigua ) as a primer set, PE-BTP1. SEQ ID NO: 7 (PE-BTP1 (F1)) and SEQ ID NO: 8 (PE-BTP1 (F2)) are forward primers and SEQ ID NO: 9 is reverse primer (PE-BTP1 (R1)).
프라이머 세트 5는 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에 특이적인 프라이머 세트로서, PD-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 10는 정방향의 프라이머 (PD-BTP1(F1)), 서열번호 11은 역방향의 프라이머(PD-BTP1(R1))이다.
The primer set 5 is the Phoma destructiva ) as a primer set, designated PD-BTP1. SEQ ID NO: 10 is a forward primer (PD-BTP1 (F1)) and SEQ ID NO: 11 is a reverse primer (PD-BTP1 (R1)).
실시예Example 1: 본 발명의 1: 프라이머primer 세트의 디자인 Design of sets
프라이머는 포마 속 (Phoma)에서 분리한 균주, 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 서브글로메라타 (Phoma subglomerata)와 보에레미아 엑시구아 (Boeremia exigua) 균주의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 서열에서 프라이머를 디자인하였다. Primer is a strain isolated from poma poma des truck Tyva in (Phoma) (Phoma destructiva), poma eksi guar (Phoma exigua , Phoma glomerata , < RTI ID = 0.0 > Phoma loticola , < RTI ID = 0.0 > Phoma & medicaginis , Phoma subglomerata Primin was designed from Actin and β-tublin sequences of the subglomerata and Boeremia exigua strains.
프라이머 선발 방법은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua) 또는 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에만 특이적으로 반응하고, 근연종인 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 또는 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)에는 반응하지 않는 프라이머를 선발하였다. The primer selection method is Phoma medicaginis , Phoma loticola , Phoma glomerata , phoma exigua ( Phoma exigua or Phoma destructiva ), and the most closely related species, Phyllosticta ( Phyllosticta) sp.) or phomopsis sp. ( Phomopsis sp.) were selected.
선발된 프라이머 세트 1 내지 5를 포마 속 (Phoma sp.) 균주에 감염된 10개의 종자와 반응시켜서 종자에서의 프라이머 검출능을 확인하였다. 인공접종을 위해, 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자인 종자(10품종)을 사용하였다. 각 병원균의 포자 농도 및 종자수는 1x104 cfu/ml/15 seeds로 하였으며, 25℃에서 4일간 배양한 후 종자에서의 프라이머 검출능을 확인하였다. The selected primer sets 1 to 5 were transformed into Phoma sp.) were reacted with 10 seeds infected to determine the primer detection ability in the seeds. For the artificial inoculation, it is possible to use Chicory, Canola, Alfalfa, Carrot, Sorghum, Pepper, Tomato, Wild rye, Rice, , Palm seed (10 varieties) were used. The spore concentration and the number of seeds of each pathogen were 1 × 10 4 cfu / ml / 15 seeds. After culturing at 25 ° C. for 4 days, the primer detection ability was confirmed in the seeds.
도 16 내지 도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 개발된 프라이머 세트 1 내지 5는 모든 종자에서의 검출능이 우수함을 알 수 있었다.
As can be seen from FIG. 16 to FIG. 20, the primer sets 1 to 5 developed according to the present invention were found to have excellent detection performance in all seeds.
실시예Example 2: 본 발명의 2: 프라이머primer 세트를 이용한 Using a set 포마Forma 속 ( Genus PhomaPhoma spsp .)의 특정 균주에서의 특이적 검출Specific detection in a particular strain
(1) (One) 포마Forma 속 ( Genus PhomaPhoma spsp .)과 .)and 근연종Relative species 포몹시스Poomics 속 ( Genus PhomopsisPhomopsis spsp .) 균주에서의 종 특이적 Lt; RTI ID = 0.0 > 검출능Detectability 검정 black
도 4 내지 도 8은 본 발명의 프라이머 세트 1 내지 5가 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 7종의 포마 속 (Phoma sp.)과 4종의 포몹시스 속 (Phomopsis sp.) 균주에서는 검출되지 않았음을 보여준다. Figs. 4 to 8 show that the primer sets 1 to 5 of the present invention were detected only in a specific strain that specifically responded to the species, and the seven strains of Phoma sp.) and four species of Phomopsis ( Phomopsis sp.) strains.
사용된 비교균주는 다음과 같다:The comparative strains used were:
- 포마 속 (Phoma sp.) (7종) : Phoma sp.(7종) - Phoma sp.) (7 species): Phoma sp . (7 species)
- 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(4종) : Phomopsis sp.(2종) - Phomopsis sp.) (4 species): Phomopsis sp . (2 species)
P. diospyri (1종) P. diospyri (1 kind)
P. ipomoeae - batatas(1종)
P. ipomoeae - batatas (1 species)
도 9는 본 발명의 프라이머 세트 5가 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)와 다른 포마 속 (Phoma)인 포마 플라시다 (P. flaccida), 포마 커커비타세아룸 (P. cucurbitacearum), 포마 펀지콜라 (P. fungicola)에서 검출되지 않았음을 나타낸다. Let the poma Plastic (P. flaccida), poma connector is Vita Seah room (P. cucurbitacearum) Figure 9 is a primer set 5 is poma des truck Tyva (Phoma destructiva) and the other in poma (Phoma) of the present invention, It was not detected in P. fungicola .
사용된 비교균주는 다음과 같다:The comparative strains used were:
- 포마 속 (Phoma sp.) : P. tracheiphila(포마 트라키필리아), P. flaccida(포마 플라시다), P. cucurbitacearum(포마 커커비타세아룸), P. fungicola(포마 펀지콜라), P. lingam(포마 링감), P. loticola(포마 로티콜라), P. macdonaldii(포마 맥도날디), P. macrostoma (포마 마크로스토마)- Phoma spp .): P. tracheiphila ( P. trachiphilia ) , P. flaccida ( P. spp .) , P. cucurbitacearum ( P. spp. ) , P. fungicola ( P. fungicola ) , P. lingam , P. loticola ( Pomarotikola ) , P. macdonaldii ( P. macardoni ) , P. macrostoma (Foma Macross Tomoma)
도 10 내지 도 13은 상기 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 검출용 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)을 제외한 4종의 프라이머 세트 1 내지 4 (PM-BTP1, PL-BTP1, PG-BTP1, PE-BTP1)가 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 8종의 포마 속 (Phoma sp .) 균주에서는 검출되지 않았음을 나타낸다. 10 to 13 are the poma des truck Tyva (Phoma destructiva) for detecting primer set 5 (PD-BTP1) than four kinds of primer sets 1 to 4 (PM-BTP1, PL- BTP1, PG-BTP1 a, PE-BTP1) is detected only in certain strains that react with species-specific , And 8 varieties ( Phoma sp . ) Strain. ≪ / RTI >
사용된 비교균주는 다음과 같다:The comparative strains used were:
- 포마 속 (Phoma sp.) : P. tracheiphila , P. flaccida , P. cucurbitacearum, P. fungicola , P. lingam , P. loticola , P. macdonaldii , P. macrostoma
- Phoma sp.): P. tracheiphila , P. flaccida , P. cucurbitacearum, P. fungicola , P. lingam , P. loticola , P. macdonaldii , P. macrostoma
(2) 근연종 필로스틱타 속 ( Phyllosticta sp.) 균주와의 종 특이적 비교 검정 (2) Relative species Philo stick in the other (Phyllosticta sp. ) Species specific comparison with strains
도 14는 본 발명의 프라이머 세트 1 내지 5는 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 3종의 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 균주에서는 검출되지 않았음을 나타낸다. 14 shows that the primer sets 1 to 5 of the present invention were detected only in a species-specific reacting strain, and three strains of Phyllosticta sp.) strain.
사용된 비교균주는 다음과 같다:The comparative strains used were:
- 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) : P. capitalensis - Phyllosticta sp.): P. capitalensis
P. P. citriasianacitriasiana
P. P.
musarummusarum
(3) 토양 병원균과의 (3) Soil pathogens 종특이적Species-specific 비교 검정 Comparison test
도 15는 본 발명의 프라이머 세트 1 내지 5는 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 4종의 토양 병원균에서는 검출되지 않았음을 나타낸다. FIG. 15 shows that primer sets 1 to 5 of the present invention were detected only in a species-specifically reacting strain, but not in four soil pathogens of a comparative strain.
사용된 비교균주는 다음과 같다:The comparative strains used were:
- 선발된 토양 병원균: Fusarium sp ., Rhizoctonia sp ., - Selected soil pathogens: Fusarium sp ., Rhizoctonia sp .,
PythiumPythium
spsp
., .,
PhytophthoraPhytophthora
spsp
. .
실시예 3: 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 포마 속 ( Phoma sp.) 균주의 PCR 조건 확립 및 검출 감도 시험 Example 3: poma using a primer set of the present invention in (Phoma sp. ) PCR conditions and detection sensitivity test
상기 실시예 1에서 디자인한 프라이머 세트 1 내지 5 (PM-BTP1, PL-BTP1, PG-BTP1, PE-BTP1, PD-BTP1)를 이용하여 포마 속 (Phoma sp.)의 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 균주에 대한 PCR 조건을 확립하기 위하여 1분, 2분, 3분, 4분 동안 94℃에서 변성 (denaturation)시켜서, 1분 동안 변성 (denaturation)시키는 경우에 가장 적합한 농도의 단일한 밴드가 나타난다는 것을 확인하였다 (도 1).The embodiment in which a primer set designed in the first 1 to 5 (PM-BTP1, PL- BTP1, PG-BTP1, PE-BTP1, PD-BTP1) poma in (Phoma using sp.) poma Medica jiniseu (Phoma of medicaginis , Phoma loticola , Phoma glomerata , phoma exigua ( Phoma denaturation at 94 ° C for 1 minute, 2 minutes, 3 minutes and 4 minutes and denaturation for 1 minute in order to establish the PCR conditions for the exigua and
또한, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 결합 (annealing), 72℃에서 2분간 신장 반응 (extension)하는 PCR 조건을 20, 30, 40 사이클로 각각 나누어 증폭한 뒤, 30 사이클의 경우에 약 200 bp의 원하는 크기에서 단일밴드로 나타난다는 것을 확인하였다 (도 2). The amplification was carried out at 94 ° C for 1 min, annealing at 55 ° C for 1 min and extension at 72 ° C for 2 min. The PCR conditions were 20, 30 and 40 cycles, respectively. And a single band at a desired size of about 200 bp (Fig. 2).
그리고, 적합한 주형 DNA 농도를 설정하기 위하여, DNA를 배수별 (10배, 50배, 500배, 1000배)로 희석하여 낮은 농도에서의 검출능을 조사하였는데, 100배 희석 농도에서도 여전히 검출능이 높다는 것을 확인하였다 (도 3).
In order to determine the proper template DNA concentration, the DNA was diluted to several times (10-fold, 50-fold, 500-fold, and 1000-fold) so that the detection ability at low concentrations was examined. (Fig. 3).
실시예Example 4: 시험개발 4: Test development 프리믹스Premix 키트에서의In kit 프라이머의Primer 검출능Detectability 조사 Research
선정된 업체에서 제작한 각 프라이머 별 프리믹스 키트를 이용하여 사과묘목에서 추출한 DNA를 사용하여 본 발명의 프라이머 세트의 검출능을 조사하고 그 결과를 도 23에 나타내었다.
The detection ability of the primer set of the present invention was examined using DNA extracted from apple seedlings using the premix kit for each primer manufactured by the selected company. The results are shown in FIG.
합성 업체 선정 PCR 조건은 다음과 같았다.The PCR conditions selected by the manufacturer were as follows.
- 반응 부피 20 ㎕ - reaction volume 20 [mu] l
- PCR 조건: 92℃ 2분, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분 (30 사이클), 72℃ 7분 PCR conditions: 92 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes (30 cycles), 72 ° C for 7 minutes
- PCR machine hybaid no. 4, c04, block - PCR machine hybaid no. 4, c04, block
- E.P PCR product 4 ㎕, w/2.5% TBE gel
- 4 μl of EP PCR product, w / 2.5% TBE
상기와 같이 개발 프리믹스 키트에서 5종의 프라이머별 검출능을 조사한 결과, 프라이머 별로 해당 병원체에 대해서만 종 특이적으로 검출됨을 확인할 수 있었다 (도 23). As a result of detecting the detection ability of each of the five types of primers in the developed pre-mix kit as described above, it was confirmed that only the specific pathogen was detected specifically for each primer (FIG. 23).
참고문헌references
1. R. C Larsen., 2002. Rapid method using PCR-based SCAR markers for the detection and identificatiom of Phoma sclerotioides. The cause of Brown root rot disease of alfalfa. Plant disease. 86(9):928-932. 1. R. C Larsen., 2002. Rapid method using PCR-based SCAR markers for the detection and identification of Phoma sclerotioides. The cause of Brown root rot disease of alfalfa. Plant disease. 86 (9): 928-932.
2. Johannes D. E Gruyter, Maikel M. Aveskamp, 2009. Molecular phylogeny of Phoma and allied anamorph genera : Towards a reclassification of the Phoma complex. Mycologial research. 113: 508-519.2. Johannes D. E Gruyter, Maikel M. Aveskamp, 2009. Molecular phylogeny of Phoma and allied anamorph genera: Towards a reclassification of the Phoma complex. Mycologial research. 113: 508-519.
3. Simon R. Ellwood, lars G. Kamphuis, Richard P. Oliver. 2006. Identification of sources of resistance to Phoma medicaginis isolates in Melicago truncatula SARDI core collection accessions, and multigene differentiation of isolates. Phytopathology. 1331-1336.3. Simon R. Ellwood, lars G. Kamphuis, Richard P. Oliver. 2006. Identification of sources of resistance to Pharma medicaginis isolates in Melicago truncatula SARDI core collection accessions, and multigene differentiation of isolates. Phytopathology. 1331-1336.
4. Carbone, I., and Kohn, L. M. 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia 91: 553-556. 4. Carbone, I., and Kohn, L. M. 1999. A method for designing primer sets for filamentous ascomycetes. Mycologia 91: 553-556.
5. Glass, n. L., and Donaldson, G. C. 1995. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved gene from filamentous ascomycetes. Appl. Environ. Microbiol. 61:1323-1330.5. Glass, n. L., and Donaldson, G. C. 1995. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1323-1330.
6. Barbetti, M. J. 1995. Resistance in annual Medicago species to Phoma medicaginis on herbage under field conditions. Aust. J. Exp. Agric. 35: 209-214. 6. Barbetti, M. J. 1995. Resistance in annual Medicago species to Phoma medicaginis on herbage under field conditions. Aust. J. Exp. Agric. 35: 209-214.
7. Graham, J. H., Frosheiser, F. I., Stuteville, D. L., and Erwin, D. C. 1979. A compendium of alfalfa disease. The american phytopathological society, M. N. 7. Graham, J. H., Frosheiser, F. I., Stuteville, D. L., and Erwin, D. C. 1979. A compendium of alfalfa disease. The american phytopathological society, M.N.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) ) <120> Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain <130> ID111020003 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Phoma medicaginis <400> 1 caccacgaca atcaccatgc accagcag 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Phoma medicaginis <400> 2 cacagttcgt tgtaatagag cgtgtcagtt 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Phoma loticola <400> 3 tgtttaccaa caacaactaa caacggcca 29 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Phoma loticola <400> 4 cttcgaagag cgtgtcaatt a 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Phoma glomerata <400> 5 taaccttctc atgtcggcgg ca 22 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Phoma glomerata <400> 6 tagaagcggt cagcactcgc agtccgtctg a 31 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Phoma exigua <400> 7 gtaagtacac atytamtgta ttctctcgty gycatccg 38 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Phoma exigua <400> 8 tgtattctct cgtcgccatc cg 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Phoma exigua <400> 9 ggtcagcact cgcagtccgt c 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Phoma destructiva <400> 10 aacagccagc tcacaattga caggg 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Phoma destructiva <400> 11 ggtcagcact cgcagtccgt c 21 <110> REPUBLIC OF KOREA (Management: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA)) <120> Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain <130> ID111020003 <160> 11 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Phoma medicaginis <400> 1 caccacgaca atcaccatgc accagcag 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Phoma medicaginis <400> 2 cacagttcgt tgtaatagag cgtgtcagtt 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Phoma loticola <400> 3 tgtttaccaa caacaactaa caacggcca 29 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Phoma loticola <400> 4 cttcgaagag cgtgtcaatt a 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Phoma glomerata <400> 5 taaccttctc atgtcggcgg ca 22 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Phoma glomerata <400> 6 tagaagcggt cagcactcgc agtccgtctg a 31 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Phoma exigua <400> 7 gtaagtacac atytamtgta ttctctcgty gycatccg 38 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Phoma exigua <400> 8 tgtattctct cgtcgccatc cg 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Phoma exigua <400> 9 ggtcagcact cgcagtccgt c 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Phoma destructiva <400> 10 aacagccagc tcacaattga caggg 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Phoma destructiva <400> 11 ggtcagcact cgcagtccgt c 21
Claims (4)
Made of a reverse primer having the nucleotide sequence of the forward primer and SEQ ID NO: 6 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, poma glow other camera (Phoma glomerata ) detection primer set.
Of claim 1 wherein the by using the primer set, performing a polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR) poma glow camera other of poma glow camera other (Phoma glomerata) strain comprising the step of detecting a (Phoma glomerata) strain in accordance with Detection method.
a) 검색 시료를 수득하는 단계; b) 상기 수득한 검색 시료 및 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주를 탐지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주의 검출방법.
3. The method of claim 2,
a) obtaining a search sample; b) performing a polymerase chain reaction using the obtained search sample and the primer set according to claim 1; And c) analyzing the amplification products of the polymerase chain reaction to obtain a Phoma glomerata ) of a strain of Phoma glomerata .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110141907A KR101429185B1 (en) | 2011-12-26 | 2011-12-26 | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110141907A KR101429185B1 (en) | 2011-12-26 | 2011-12-26 | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130074838A KR20130074838A (en) | 2013-07-05 |
| KR101429185B1 true KR101429185B1 (en) | 2014-08-14 |
Family
ID=48988820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110141907A KR101429185B1 (en) | 2011-12-26 | 2011-12-26 | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101429185B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667468B (en) * | 2013-11-29 | 2015-09-23 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | The real-time PCR detection reagent of grape Phoma asparagi Sacc and detection method |
-
2011
- 2011-12-26 KR KR1020110141907A patent/KR101429185B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NCBI, GenBank Accession No. FJ427131.1 (2009.07.02.) * |
| Plant Disease, Vol. 90, No. 12, pp. 1523-1530 (2006.12.31.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130074838A (en) | 2013-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106987653B (en) | LAMP (loop-mediated isothermal amplification) detection primer for potato late blight bacteria and visual detection method thereof | |
| Li et al. | Specific and sensitive detection of Phytophthora nicotianae by nested PCR and loop‐mediated isothermal amplification assays | |
| CN110982922B (en) | Primer composition and method for rapidly detecting rice bakanae disease pathogenic bacteria fusarium granatum based on LAMP | |
| Katoh et al. | Rapid detection of Colletotrichum gloeosporioides in infected strawberry plants using loop-mediated isothermal amplification | |
| Delić | Polymerase chain reaction for phytoplasmas detection | |
| Guan et al. | A TaqMan-based real time PCR assay for specific detection and quantification of Xylella fastidiosa strains causing bacterial leaf scorch in oleander | |
| Dardouri et al. | Molecular characterization of Tunisian strains of Erwinia amylovora | |
| CN106480227A (en) | A kind of Citrullus vulgariss Acidovorax avenae subsp nested PCR detection method | |
| CN103667468B (en) | The real-time PCR detection reagent of grape Phoma asparagi Sacc and detection method | |
| Singh et al. | First report of mixed infection of phytoplasmas and begomoviruses in eggplant in India | |
| Qiao et al. | Development of nested PCR, multiplex PCR, and loop-mediated isothermal amplification assays for rapid detection of Cylindrocladium scoparium on Eucalyptus | |
| KR101429185B1 (en) | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma glomerata strain | |
| KR101429188B1 (en) | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma exigua strain | |
| KR101429190B1 (en) | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma destructiva strains | |
| CN107058609B (en) | Peronophythora litchi PCR primer and molecular detection method thereof | |
| KR101429182B1 (en) | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma loticola strain | |
| Zhang et al. | Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection of Alternaria alternata | |
| KR101429175B1 (en) | Development of rapid PCR detection method for Plant quarantine disease causing by Phoma medicaginis strain | |
| KR102267274B1 (en) | Primer set compostion for detecting strain of Acidovorax citrulli and method for detecting Acidovorax citrulli using thereof | |
| Hamada et al. | Rapid detection of Fusarium graminearum complex in wheat seeds using species-specific PCR primer designed based on a microsatellite region | |
| KR102003917B1 (en) | Specific primer set for detecting Phyllosticta draconis and uses thereof | |
| CN113789401B (en) | Primer for detecting phytophthora nicotianae by loop-mediated isothermal amplification method and detection method thereof | |
| KR101498110B1 (en) | Specific primer set for diagnosing Monosporascus cannonballus resistance, and uses thereof | |
| Hashoosh et al. | Genetic diversity using random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for Aspergillus niger isolates | |
| Bandakkanavara et al. | Molecular Detection and Characterization of China Aster (Callistephus chinensis L. Nees.) Phyllody Phytoplasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |