KR101423698B1

KR101423698B1 - 이산화티탄 나노튜브의 표면에 약물을 고정화하는 방법 및 이산화티탄 나노튜브의 표면에 고정화된 약물을 포함하는 복합체

Info

Publication number: KR101423698B1
Application number: KR1020120102371A
Authority: KR
Inventors: 강인규; 정용수; 문성모; 구태형
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2014-07-25
Also published as: KR20140035733A

Abstract

본 발명은 티타늄 소재의 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브에 약물을 고정화하는 방법 및 약물이 표면에 고정화된 이산화티탄 나노튜브을 포함하는 복합체로서, 그 용도는 의료용 임플란트 등으로 사용될 수 있다.

Description

이산화티탄 나노튜브의 표면에 약물을 고정화하는 방법 및 이산화티탄 나노튜브의 표면에 고정화된 약물을 포함하는 복합체 {METHOD OF IMMOBILIZATION OF TiO2-NANOTUBE AND COMPOSITE COMPRISING THE DRUG IMMOBILIZED ON SURFACE OF TiO2-NANOTUBE}

본 발명은 이산화티탄 나노튜브의 표면에 약물을 고정화하는 방법 및 티타늄층, 이산화티탄 나노튜브층 및 그 표면에 고정화된 약물층을 포함하는 복합체에 관한 것이다.

의료용 임플란트는 주로 골다공증으로 인한 대퇴골 경부 골절(osteoporotic femoral neck fracture) 및 무릎 및 고관절의 퇴행성 변화 등을 치료하기 위해 임플란트를 사용하고 있다. 결손치아를 복구치료하기 위해서 치과용 임플란트를 사용하고 있다.

임플란트와 같이 신체에 매식되는 것은 신체에 거부 반응이 없는 재료로서 유독성이 없어야 하고 항원성 및 발암성이 없어야 한다. 또한 임플란트의 수명기간 동안 골조직과의 결합력을 유지하여야 하고 높은 내부식성을 지녀야만 한다. 다양한 임플란트(implant) 재료가 널리 사용되고 있는데, 그 중 티타늄(또는 티타늄 합금)은 금속 임플란트 재료 중 가장 생체 적합성이 좋으며 비강도도 좋을 뿐만 아니라 다양한 장점으로 인해서 가장 널리 사용하고 있는 재료이다.

티타늄의 생체 적합성을 좀 더 증진시키기 위한 방법으로 티타늄의 표면처리가 많이 시도되었으며, 양극 산화도 그 중 한 방법으로 연구되었다. 마이크로 아크 산화법으로 만든 마이크로 기공의 산화막이 최근 생체 분야에 응용되어 시제품으로도 나오고 있으며, 100 나노미터의 지름을 갖는 다공성 산화막도 최근 연구가 되고 있다. 나노기공의 산화막은 나노구조의 티타늄 산화물이 가지는 성질을 이용하여 센서 분야나 광촉매 분야에서 응용하기 위해 연구된 방법들이나 최근들어 나노 기공 구조가 생체 적합성을 높인다는 보고가 되어지면서 생체 재료분야에서도 연구가 되고 있다.

한편, 임플란트 또는 인공 고관절을 인체에 시술한 후에, 손상된 부위의 회복시간과, 임플란트 또는 인공 고관절과 뼈가 안정적으로 결합하는 시간을 단축시키고, 수술이 끝난 후 초기에 발생할 수 있는 급성 염증을 방지하여 임플란트 또는 인공 고관절과 뼈와의 골유착 기간을 단축시켜 회복을 촉진시키기 위해 항생제와 같은 약물이나, 성장인자나 인슐린과 같은 단백질(이하 ‘생체활성물질’)을 표면에 코팅하는 방안이 연구되고 있다. 생체활성물질을 임플란트 재료 표면에 코팅시키는 방법은 약물이 혼합된 기능성 고분자를 코팅하는 방법, 임플란트 표면 위에 수산화 인회석 코팅층을 형성시킨 후 그 위에 생체활성인자를 물리적으로 흡착시키는 법 등이 연구되고 있는데, 이러한 방법들은 생체활성인자의 변화, 담지율 저하 및 방출속도의 제어가 어렵다는 문제점이 있다.

본 발명의 일 구현예는 임플란트 또는 인공 고관절과 뼈와의 골유착 기간을 단축시켜 회복을 촉진시키기 위해, 이산화티탄 나노튜브의 표면에 약물을 고정화하는 방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명의 일 구현예는 티타늄층, 상기 티타늄층의 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층, 및 나노튜브층 표면에 고정화된 약물층을 포함하는 복합체를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 티타늄층, 상기 티타늄층의 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층, 및 나노튜브층 표면에 고정화된 약물층을 포함하는 복합체를 적용한 의료용 임플란트를 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일구현예는

(a) 티타늄층 소재 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층을 제공하고,

(b) 상기 이산화티탄 나노튜브층의 표면 산소와, 아민기와 알콕시기를 함유하는 실란 화합물의 알콕시기를 반응시켜 Si-O 결합을 형성하고, 아스파르트산 또는 글루탐산을 반응시켜, 상기 실란 화합물의 아민기와 아스파르트산 또는 글루탐산의 주쇄 카르복시기 사이에 펩타이드 결합을 형성하고,

(c) 상기 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복시기에 약물을 결합시키는 단계를 포함하는, 이산화티탄 나노튜브 표면에 약물을 고정화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 티타늄층; 양극산화방법에 의해, 상기 티타늄층의 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층; 상기 이산화티탄 나노튜브층에 링커를 통해 결합된 약물층을 포함하는 복합체에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 링커는 실란 화합물-아미노산이 연결된 잔기로서 하기 화학식 2의 구조를 갖는다.

[화학식 2]

상기 식에서, R¹은 탄소수1 내지 3의 알콕시기이고, R²는 탄소수 1-4의 알킬렌기이고, m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이며 m+n=4인 조건을 만족하며, p는 1 or 2의 정수이다. 상기 식에서 p=1인 경우는 아스파르트산이며, p=2인 경우는 글루탐산이다.

본 발명이 또 다른 일 예에 따른 이산화티탄 나노튜브의 표면에 약물을 고정화하는 방법은 (a) 티타늄층 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층을 제공하는 단계, (b) 상기 이산화티탄 나노튜브층에 링커를 연결하는 단계, (c) 상기 링커에 약물을 결합하는 단계를 포함한다.

상기 (a)단계에서, 티타늄 소재의 표면에 이산화티탄 나노튜브를 형성하는 공정은 양극산화처리에 의해서 이루어지는 것이 바람직하다. 양극산화 처리는 부동태 막을 쉽게 생성할 수 있는 금속(알루미늄, 티타늄 등)을 특정 전해질에서 양극 전압을 가하여 원하는 성질의 산화막의 형태로 이산화티탄 나노튜브를 얻는 방법이다.

도 4를 참조하면, 전해조 내에 전해액(Electrolyte)이 담겨져 있고, 또한 캐소드(Cathode)전극 및 애노드(Anode)전극이 침지되어 있다. 애노드전극으로는 티타늄모재를 사용하고, 캐소드전극에는 통상의 보조전극을 사용하는데, 예를 들면 백금, 은, 티타늄 또는 탄소 등을 이용할 수 있다. 상기 전극들에 전원을 인가함으로써 티타늄 소재의 표면에서 양극산화반응이 일어나며, 이로 인하여 표면에 이산화티탄 나노튜브가 생성되게 된다

한편, 상기 전해액은 인산 이온, 불소이온, 또는 에틸렌글리콜 포함된 전해질 용액을 사용할 수 있다. 전해질 용액에서 티타늄모재의 표면에는 부동태막의 생성 및 상기 이온에 의한 화학 반응이 종합적으로 일어나 나노튜브가 생기게 된다. 이때의 나노튜브의 크기는 전해질 및 전압등의 공정 변수에 의해 크게 좌우되며, 보통 20 내지 130 나노미터 범위(지름)의 크기를 가지나 본 발명의 범위는 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 티탄층의 두께는, 예를 들면 티탄층의 두께는 8,000 내지 12,000 마이크로미터일 수 있으며, 이산화티탄 나노튜브층의 두께는 1 내지 100 마이크로미터일 수 있다.

상기 (b)단계, 이산화티탄 나노튜브층에 링커를 연결하는 단계는 티탄층에 형성된 이산화티탄 나노튜브 상에 존재하는 히드록시기에 약물의 결합을 돕는 링커를 먼저 결합시키는 단계이다.

티타늄 디스크 표면에 존재하는 히드록시기에 약물을 결합하는 경우, 결합이 약하기 때문에 인체 내에 적용하면 약물의 표적에 전달되어 작용하기 전에 분리되는 문제점이 있다. 따라서, 약물의 표적에 전달되어 작용할 수 있도록 적절히 강한 결합력을 제공하기 위하여, 상기 링커를 사용하여 약물을 결합하는 것이 바람직하다.

상기 (a) 단계의 양극산화 처리에 의해, 티타늄 디스크 표면에 이산화티탄 나노튜브를 형성하면, 자연발생적으로 히드록시기가 이산화티탄 나노튜브층의 표면에 형성되게 된다.

본 발명에 적용가능한 링커 화합물은 상기 이산화티탄 나노튜브의 히드록시기와 결합가능한 관능기와, 약물과 결합가능한 관능기를 포함하는 화합물일 수 있다.

구체적으로 상기 (b)단계는 상기 이산화티탄 나노튜브층의 표면 산소와, 아민기와 알콕시기를 함유하는 실란 화합물의 알콕시기를 반응시켜 Si-O 결합을 형성하고, 아스파르트산 또는 글루탐산을 반응시켜, 상기 실란 화합물의 아민기와 아스파르트산 또는 글루탐산의 주쇄 카르복시기사이에 펩타이드 결합을 형성할 수 있다. 상기 링커는 이산화티탄 나노튜브의 히드록시기에 결합하는 실란 화합물과 이에 연결된 아미노산, 예를 들면 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

상기 실란 화합물은 이산화티탄 나노튜브의 히드록시기와 반응하여 Si-O 결합을 형성할 수 있는 알콕시기와, 아미노산의 주쇄 카르복시기와 결합가능한 아민기를 갖는 실란 화합물이 바람직하다. 바람직한 실란 화합물은 하기 화학식 1의 구조식을 가지는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

(R¹)m-Si-(R²)n-NH₂

상기 식에서, R¹은 탄소수1 내지 4의 알콕시기이고, R²는 탄소수 1 내지 4의 알킬렌기이고, m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이며 m+n=4인 조건을 만족한다.

상기 실란 화합물의 구체적인 예로는, 3-aminopropyltriethoxysilane(3-APTES)이다.

상기 실란 화합물의 알콕시기가 상기 이산화티탄 나노튜브의 히드록시기와 반응하여 Si-O 결합을 형성한 후에, 실란 화합물의 아미노기에 아미노산의 주쇄 카르복시기가 결합하여 펩타이드 결합을 형성하여 링커를 완성한다. 상기 이산화티탄 나노튜브층에 실란 화합물을 반응시키는 공정은 실란 화합물와 물의 혼합 용액에 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 형성된 티타늄을 담지하고 반응시켜 수행할 수 있다. 더욱 구체적으로는 실란 화합물을 물과 1:9의 부피비로 혼합하여 용액을 제고하고, 상기 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 형성된 티타늄을 상기 용액에 담지시키고 90℃에서 2시간동안 반응시켜 수행할 수 있다.

상기 실란 화합물에 아미노산을 결합하는 단계는 바람직하게는 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복시기를 보호기로 보호하고, 상기 실란의 아민기와 주쇄 카르복시기의 펩타이드 결합을 형성하고, 상기 보호기를 제거하여 수행할 수 있다. 상기 보호기는 아미노산의 측쇄 카르복시기가 실란 화합물과의 반응에 관여하지 않도록 보호하는 기능을 수행하는 관능기일 수 있으며, 예를 들면, 벤질에스터일 수 있다.

상기 (c)단계, 상기 링커에 약물을 결합하는 단계는 상기 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복시기에 약물을 결합시켜 도입하는 단계이다.

본 발명에 적용 가능한 약물은 이산화티탄 나노튜브-링커 결합체의 링커의 카르복시기와 결합가능한 관능기를 갖는 약물을 포함하며, 예를 들면 약물에 아미노기를 가지고 있어 상기 링커의 카르복시기와 펩타이드 결합을 형성하는 약물일 수 있다. 상기 약물의 구체적인 예로는 파미드론산, 알렌드론산(Alendronic acid) 및 이들의 약릭적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다.

상기 약물이 파미드론산인 경우, 상기 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복시기와 파미드론산의 아민기가 펩타이드 결합으로 연결될 수 있다.

상기 티탄층에 형성된 이산화티탄 나노튜브 상에 링커를 통해 파미드론산이 연결된 경우, 파미드론산에 의해 의료용 임플란트로 사용될 경우 조골세포의 생장을 촉진하고 파골세포의 생장을 억제하여 임플란트와 뼈와의 골유착 기간을 단축시켜 회복을 촉진시킬 수 있는 장점이 있다.

파미드론산(pamidronic acid)은 골칼슘 함량의 불균형에 기인한 골대사 이상질환, 예를 들면 파제트 골염, 악성 종양에 의한 과칼슘혈증, 유방암 환자의 용해성 골전이, 및 다발성 골수종에 의한 골연화등의 치료에 사용되며, 골 재흡수 저해제(bone resorption inhibitor)의 기능을 갖는 제2세대 비스포스포네이트계 약물에 속한다. 구체적인 약리효과로는 파골세포(osteoclast)의 골흡수에 대한 강력한 억제는 부분적으로 골 무기질과 파미드로네이트(pamidronate)의 결합으로 나타난 결과로 추정되며, 파골세포의 전구체가 골에 접근하여 재흡수성이 있는 성숙 파골세포로의 전환을 억제하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일예에서, 상기 아미노산이 글루탐산이고 실란 화합물은 에톡시기를 포함하는 실란 화합물을 반응물로 사용하여 이산화티탄 나노튜브상에 링커를 통해 파미드론산이 결합된 복합체를 제조하는 공정을 구체적 모식도를 들어 설명하고자 한다.

상기 (a) 티타늄층 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층을 제공하는 단계를 수행한 이후, 상기 이산화티탄 나노튜브층에 형성된 히드록시기에, 트리에톡시기와 아민기를 포함하는 실란 화합물을 반응시켜 Si-O 결합을 형성하며, 이의 모식도를 하기 반응식 1에 개략적으로 표시한다.

[반응식 1]

하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 상기 이산화티탄 나노튜브층에 Si-O 결합을 통해 연결된 실란 화합물의 아민기에 보호화된 L-글루탐산을 반응시켜, 실란 화합물의 아민기와 글루탐산의 주쇄 카르복시기의 펩타이드 결합을 형성하여 링커를 제조한다. 상기 이산화티탄 나노튜브층에 연결된 실란 화합물-글루탐산 링커의 보호기를 알칼리 가수분해로 제거한다.

[반응식 2]

상기 이산화티탄 나노튜브층에 연결된 실란 화합물-글루탐산의 측쇄 카르복시기에 파미드론산의 아민기를 반응시켜 펩타이드 결합으로 연결된, 티탄층-이산화티탄 나노튜브층-링커-약물 복합체를 제조한다.

[반응식 3]

본 발명이 일예는 티타늄층; 양극산화방법에 의해, 상기 티타늄층의 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층; 상기 이산화티탄 나노튜브층에 링커를 통해 결합된 약물층을 포함하는 복합체를 제공하며, 이들 복합체의 이는 일예에 따른 티타층-이산화티탄 나노튜브층-링커-약물 복합체는 다양한 의료용 임플란트로 사용될 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 복합체는 상기 이산화티탄 나노튜브층에 링커를 통해 결합된 약물층을 포함하는 복합체의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 의료용 임플란트는 골다공증으로 인한 대퇴골 경부 골절(osteoporotic femoral neck fracture) 및 무릎 및 고관절의 퇴행성 변화 등을 치료하기 위해 임플란트, 또는 결손치아를 복구치료하기 위해서 치과용 임플란트 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 티타늄층의 두께 및 이산화티탄 나노튜브층은 두께는 사용목적에 적합하도록 적절히 조절하여 제작할 수 있으며, 예를 들면 티타늄층의 두께가 1,000 내지 12,000 마이크로미터이고, 상기 이산화티탄 나노튜브층은 두께가 1 내지 100 마이크로미터일 수 있다.

상기 복합체에 포함되는 약물의 함량은 약물의 유효한 효과를 발휘가능한 농도를 고려하여 0.1 ppm 내지 100 ppm농도일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 ppm일 수 있다. 상기 함량범위를 초과하는 경우에는 파골세포뿐만 아니라 조골세포의 성장에도 바람직하지 못한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명에 따른 이산화티탄 나노튜브에 약물을 고정화하는 방법 및 이에 따라 제조되는 티타늄층, 이산화티탄 나노튜브층 및 그 표면에 고정화된 약물층을 포함하는 복합체는, 임플란트 또는 인공 고관절과 뼈와의 골유착 기간을 단축시켜 회복을 촉진시킬 수 있어, 의료용 임플란트로 유용하게 이용될 수 있다.

도1a은 본 발명의 일실시예에 따라 무처리 티타늄 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)의 표면 SEM사진을 나타낸다.
도1b는 본 발명의 일실시예에 따라 표면에 무처리 티타늄 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P) 복합체의 표면을 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy)로 분석한 그래프와 분석결과이다.
도 2a은 본 발명의 일실시예에 따라 무처리 티타늄 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브-실란 화합물이 결합된 티타늄 디스크(nt-TiO₂-A), 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)의 표면 SEM사진을 나타낸다.
도 2b 본 발명의 일실시예에 따라 무처리 티타늄 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)에서 배양한 조골세포를live & dead 분석법으로 분석한 세포의 형광 현미경(배율 X100) 사진이다.
도 2c는 무처리 티타늄 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)에서 배양한 조골세포를 MTT 분석법으로 분석한 결과 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일실시예에 따라, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)에서 배양한 파골세포를live & dead 분석법으로 분석한 세포의 형광 현미경(배율 X100 또는 X200) 사진이다.
도 3b 및 도 3c는 본 발명의 일실시예에 따라, 배양된 파골세포를4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 propidium iodide(PI) 염색법으로 염색한 후에 형광현미경으로 관찰한 사진이며, DAPI 염색결과는 파랑형광으로서 파골세포의 생존을 나타내고, PI 염색결과는 적색형광으로서 사멸세포를 나타내며, 약물층없이 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 결합된 티타늄 디스크(nt-TiO₂)에서 배양한 파골세포 염색결과가 도 3b이고, 약물층이 결합된 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 결합된 티타늄 디스크(nt-TiO₂ _-P)에서 배양한 파골세포 염색결과가 도 3c이다.
도 4는 본 발명의 일예에 따라 티타늄 소재 표면에 이산화티탄 나노튜브를 형성하기 위해 사용된 장치의 모식도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 약물 함유 복합체 제조

1-1:티타늄-이산화티탄 나노튜브층의 제조( nt - TiO ₂ )

양극 산화 장치의 모식도는 도 4에 나타난 바와 같으며, 양극 산화용 전원으로는 직류 전원(FinePower. Korea, 전류:0-1.05A, 전압:0-95V, 2 채널)을 사용하였으며, 전해조는 용적 500mL의 PTFE 재질로 된 비커를 이용하였다. 양극 전원에 사용되는 티타늄 디스크는 CP Grade 2의 티타늄(가히금속, 한국)을 지름 15mm, 두께 10mm의 디스크로 준비하여 1000번 사포까지 연마하여 표면을 평평하게 한 후 아세톤, 에탄올, 증류수 순으로 초음파 세척하였다. 위에서 준비한 시편들을 0.25 wt%의 불화 암모늄(NH4F)과 2 vol%의 증류수를 포함하는 에틸렌 글리콜(Ethylene glycol) 기반의 전해액에 침지하여 60V 에서 30분 이상 산화처리 하였다. 그리고, 산화된 막을 초음파 세척기를 이용하여 제거하였으며 다시 동일한 전해액에서 동일한 전압으로 30분 동안 산화처리하였다.

상기 양극산화 되지 않은 티타늄 디스크 및 양극산화처리로 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 디스크의 SEM 사진을 도 1a에 나타내고, XPS로 표면을 측정한 그래프를 도 1b에 나타냈다. 양극산화를 한 후 티타늄의 표면 위에 약 100 내지 120 나노미터의 직경을 갖는 나노튜브가 균일하게 생성되었음을 알 수 있었다.

1-2: 티타늄-이산화티탄 나노튜브-링커 결합체 ( nt - TiO ₂ -G) 제조

상기 1-1에서 제조한, 티타늄층위에 형성된 이산화티탄 나노튜브에 링커가 결합한 결합체 (nt-TiO₂-G)를 제조하기 위하여, 3-aminopropyltriethoxysilane(3-APTES)을 물과 1:9의 부피비로 혼합하여 용액을 제고하고, 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 형성된 티타늄을 상기 용액에 담지시키고 90℃에서 2시간동안 반응시켜 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 티타늄-이산화티탄 나노튜브-실란 화합물 결합체(nt-TiO₂-A)를 XPS로 표면을 측정한 그래프를 도 1b에 나타냈다. nt-TiO₂ 디스크 표면에 있는 수산기(-OH)가 3-aminopropyltriethoxysilane(3-APTES)과 반응하여 nt-TiO₂ 디스크 표면은 아미노기(-NH₂)를 가지게 된다. 이것을 ESCA를 통하여 nt-TiO₂ 디스크 표면에는 수치가 낮았던 N원소와 Si원소가 증가함을 확인할 수 있었다.

상기 제조된 nt-TiO₂-A의 실란 화합물의 말단 아미노기에 글루탐산을 결합시키기 위해, L-glutaminc acid gamma-benzylester 1X10^-5 mol과 3차수 20ml를 첨가한 용액을 만들고 삼차수에 대하여 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodimide(EDC) 0.25wt%, N-Hydroxy-Succinimide(NHS) 0.25wt%인 용액과 1:1의 비율로 투입한 반응조를 24시간 동안 ice bath에 두어 카르복실기를 활성화한다 아미노기가 도입된 nt-TiO₂-A 디스크를 활성화한 용액에 5시간 침지시켜 L-glutaminc acid gamma-benzylester를 고정화 하였다. nt-TiO2-G에는 벤질기(-benzyl)가 결합되어 있는데, 이를 Alkaline hydrolyses방법을 통하여 벤질기(-benzyl)를 수산기(-OH)로 치환시켜준다. 이의 방법으로는 1N NaOH를 1시간동안 반응시킨 뒤 0.1N HCl을 5분간 반응 시킨다. 벤질기(-benzyl)가 떨어진 것을 자외-가시선 흡수 분관 광도기 (UV-visible spectroscopy)를 통하여 확인할 수 있었다.

1-3: 티타늄-이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 ( nt - TiO ₂ -P) 제조

순차적으로 티타늄층, 이산화티탄 나노튜브에 결합된 링커 및 상기 링크에 결합된 약물 복합체(nt-TiO₂-P)를 제조하기 위하여, 3차수 20ml를 첨가한 용액을 만들고 삼차수에 대하여 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodimide(EDC) 0.25wt%, N-Hydroxy-Succinimide(NHS) 0.25wt%인 용액을 nt-TiO₂-G 표면의 카르복실기를 12시간동안 활성화를 시킨 후 PDA 1 X 10^-5 mol과 3차수 5ml를 첨가한 용액을 5시간 침지시켜 PDA를 고정화하여, 티타늄-이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)를 제조하였다. 이를 ESCA를 통하여 확인하였으며, 상대적으로 Si원소가 감소한 것을 통하여 파미드로 산이 고정화된 것을 알 수 있었다.

무처리 티타늄 디스크, 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)의 표면 SEM사진을 도 1a에 나타내고, XPS로 표면을 분석한 그래프와 분석결과를 도 1b에 나타냈다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, nt-TiO₂와 티타늄-이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)의 표면 형태는 비슷한 것을 확인하였다

도 1b에 나타낸 바와 같이, 티타늄 디스크 표면에 PDA를 고정화 사실을 ESCA를 통하여 확인할 수 있었다. ESCA는 H와 He을 제외한 모든 원소의 분석이 가능하고, 원소의 조성뿐만 아니라 화학 결합 상태에 관해서도 알 수 있다. 티타늄 디스크에는 없었던 Si 원소를 확인할 수 있었으며, Si 원소가 감소하면서, P 원소를 확인 할 수 있었다.

< 실시예 2> 조골세포의 생장촉진능 평가

2-1: 조골세포 배양

조골세포 계열(mouse osteoblast cell line) MC3T3-E1(Cell line name)세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 분양 받아 1% Penicillin Streptomycin(Pen Strep,GiBCO)과 10% fetal bovine serum(FBS,GIBCO)이 함유된 alpha-MEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3 ~ 4일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

상기 배양된 조골세포를 무처리 티타늄 디스크, (nt-TiO2) 디스크, 및 티타늄-이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)에서 접종하여 배양하였다.

상기 세 가지 디스크에서 배양된 조골세포 채취하여 SEM을 관찰하였으며 SEM 사진을 도 2a에 나타냈다. 도 2a의 왼쪽 칼럼의 사진은 배양후 4시간 경과한 것이고, 오른쪽 칼럼은 배양후 3일이 경과한 사진이다. 상기 결과에 따르면, 무처리 티타늄 디스크에 비해서, (nt-TiO₂) 디스크 및 (nt-TiO₂-P) 디스크는 조골세포와의 상용성(cell compatibility)이 우수함을 확인할 수 있었으며, (nt-TiO₂-P) 디스크는 (nt-TiO₂) 디스크에 비해서 조골세포의 성장이 우수함을 확인할 수 있었다.

2-2: 세포생존 확인( Calcein and Propidium Iodide Assay )

상기 2-1의 방법에 따라, 2일간 배양한 조골세포를 live & dead assay키트를 이용하여 세포의 생존성 시험을 수행하였다.

4well plate dish에 각각의 티타늄 디스크를 넣고 well당 cell solution 농도 3.0 X 10⁴ cell/ml 를 1ml투입하였고 96시간동안 배양하였다. 세포의 형광염색을 하기에 앞서 1ml의 staing buffer에 0.001ml의 Calcein-AM(calcein acetoxymethyl ester)와 0.001ml의 PI(propidium iodide)를 넣은 용액을 준비한다. 이 시약들 중에서 Calcien-AM은 비형광물질이었던 것이 세포에서 estrase에 의해 분해되면서 green의 형광을 띄며 세포내에 남게 되며, PI는 살아있는 세포막을 통과할 수 없어 membrane이 손상된 죽은 세포에만 들어가 핵을 염색시켜 적색 형광을 부여한다. 각각의 well의 상층액을 제거하고 PBS로 세척을 한 다음 미리 준비해둔 staining buffer/Calcein-AM 용액을 각각 well 당 0.2ml씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 15분간 염색을 한 다음 용액을 제거한 후 PBS로 2~3회 세척을 한 다음 형광현미경으로 관찰하였다.

live & dead assay키트는 Calcein-AM과 Propidium Iodide용액을 함유하여 생존세포와 사멸세포를 동시에 염색을 통해 확인할 수 있는 방법이다. 생존한 세포에서는 esterase에 의해서 Calcein-AM으로 부터 Calcein이 분리되어 강한 초록색 형광을 나타내며, Propidium Iodide 용액은 세포핵을 염색하는 염료로서 생존 세포의 경우 세포막을 통과할 수 없으나 사멸세포의 세포막을 통과하여 핵내 DNA 이중사슬과 결합하여 붉은 형광색을 나타내게 되어 490nm파장에서 형광빛을 탐지함으로써 세포의 생존여부를 확인할 수 있다.

상기 2-1의 방법에 따라, 무처리 티타늄 디스크와 비교시에, ntTiO₂와 ntTiO₂-링커-약물 복합체의 표면에서 조골세포를 3일간 배양한 후에 live & dead assay키트로 세포의 생존성 시험을 수행하였으며 그 결과로 얻어진 형광현미경 사진을 도 2b에 나타냈다.

상기 도 2b의 형광 현미경 사진으로부터, ntTiO₂디스크와 ntTiO₂-링커-약물 복합체(nt-TiO₂-P) 디스크는, 사멸 세포를 나타낸 붉은 색 형광과 녹색 형광이미지의 면적을 고려하여 사멸세포가 거의 없어, 모두 조골세포 배양에 좋은 표면활성을 갖는 것으로 나타났으며, ntTiO₂-링커-약물 복합체의 경우 조골세포의 생존이 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.

2-3: MTT 분석

조골세포에 대한 증식률 측정은 MTT 분석법(Carmichael 등, 1987)을 이용하여 확인하였다. 2-1의 방법에 따라 조골세포를 2일과 3일을 배양한 후에 MTT 분석을 수행하였다.

구체적으로, 4well plate dish에 각각의 티타늄 디스크를 넣고 well당 cell solution 농도 3.0 ⅹ 10⁴cell/ml의 세포 배양약 1ml투입하였고 각각48시간과72시간동안 배양하였다. 그런 후에, 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 100μg을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. Plate를 1,000rpm에서 10분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide(DMSO; Sigma, St. Louis, MO, USA) 150μL를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Bio-TEK instrumenis. Inc., Winooski Vermont, WI, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식률을 측정하였으며 그 결과를 도 2c에 나타냈다.

MTT formazan의 흡광도는 570nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, 상기 그래프는 평균치 ± 평균의 표준오차로 표시하였으며, 10 ppm이 0 ppm에 비하여 세포수가 적은 것을 확인할 수 있었다. 즉, 세가지 disc에서 조골세포의 활성을 보여주며, 앞에서 살펴본 점착 거동에서 nt-TiO₂ 와 nt-TiO₂-P 디스크에서 세포의 증식도포(spreading)가 빠르게 진행된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 파골세포의 배양 억제능 평가

3-1: 파골세포의 배양

macrophage세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)로부터 분양 받아 1% Penicillin Streptomycin(Pen Strep,GiBCO)과 10% fetal bovine serum(FBS,GIBCO)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, Culture disc에 macrophage 세포를 하루정도 배양하여 안정화 시킨 후, 파골세포로의 분화에는 Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)과Macrophage colony stimulating factor (M-CSF)를 각각 50ng/ml 첨가한 DMEM 배지로 대체하여 배양하였다. 5일간 배양한 후, 파골세포 분화를 확인할 수 있는 Maker인 For the staining of tartrate- resistant acid phosphatase in osteoclasts (TRAP staining)을 통하여 확인하였다. 4Well chamber에 Well 당 cell solution 농도 3.0 ⅹ 10⁴ cell/ml를 1ml 투입하였고, 120시간 후 배양액을 제거하여 PBS로 세척한 다음 10% formalin으로 5분간 가교처리 하였다. 정제수로 세척한 후 tartate-containing buffer/chromogenic substrate 용액을 각각 well 당 0.5ml씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 60분간 염색을 한 다음 용액을 제거한 후 PBS로 세척 한 다음 광학현미경으로 관찰하였다.

3-2: 파골세포생존 확인시험( Calcein and Propidium Iodide Assay )

상기 3-1에서 배양된 파골세포에 대해서, 실시예 2-2의 세포생존확인법((Calcein and Propidium Iodide Assay)과 실질적으로 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 파미드로 산을 고정화한 티타늄 디스크와 고정화하지 않은 디스크와 비교하였을 때 세포의 초기접착에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해서 세포에 형광 염색을 한 후 공초점 현미경으로 고나찰하였다. 4 well plate dish에 각각의 디스크를 넣고 well당 cell solution 농도 3.0 ⅹ 10⁴cell/ml를 1ml 투입하였고 72시간동안 배양하였다. 세포의 형광염색을 하기에 앞서 1ml의 staining buffer에 0.001ml의 Calcein-AM(calcein acetoxymethyl ester)와 0.001ml의 PI(propidium iodide)를 넣은 용액을 준비한다. 이 시약들 중에서 Calcien-AM은 비형광물질이었던 것이 세포에서 estrase에 의해 분해되면서 green의 형광을 띄며 세포내에 남게 되며, PI는 살아있는 세포막을 통과할 수 없어 membrane이 손상된 죽은 세포에만 들어가 핵을 염색시켜 red의 형광을 띄게한다. 각각의 well의 상층액을 제거하고 PBS로 세퍽을 한 다음 미리 준비해둔 staining buffer/Calcein-AM 용액을 각각 well 당 0.2ml씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 15분간 염색을 한 다음 용액을 제거한 후 PBS로 2~3회 세척을 한 다음 형광현미경으로 관찰하였다. , 얻어진 형광 현미경 사진을 도 3a에 나타냈다.

도 3a는 표면에 이산화티탄 나노튜브가 형성된 티타늄 (nt-TiO₂) 디스크, 및 이산화티탄 나노튜브-링커-약물 복합체 (nt-TiO₂-P)에서 배양한 파골세포를live & dead 분석법으로 분석한 세포의 형광 현미경(배율 X100 또는 X200) 사진이다.

상기 도 3b의 형광 현미경 사진으로부터, 사멸 세포를 나타낸 붉은 색 형광과 녹색 형광이미지의 면적을 고려하면, ntTiO₂디스크에서 사멸 파골세포가 적색 형광을 나타내는 면적에 비해, ntTiO₂-링커-약물 복합체(nt-TiO₂-P) 디스크에서 적색 형광을 나타내는 면적이 더 넓은 결과를 나타내며, 이는 파골세포 배양에 좋은 표면활성을 갖는 것으로 나타났으며, (nt-TiO₂-P) 디스크가 파골세포을 저해함을 확인할 수 있었다.

3-3: 4,6- diamidino -2- phenylindole ( DAPI )와 propidium iodide ( PI ) 염색법에 의한 파골세포 관찰

상기 3-1에서 배양한 파골세포에 대해서, D-PBS로 2번 씻고 2% 4% 파라포름알데히드로 5분간 고정하였다. 고정 후D-PBS로 5분씩 3회 씻은 후 0.5 ug/mL DAPI 20분간 처리하였다. 염색된 세포를 형광현미경으로 관찰하였다. 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 propidium iodide(PI)는 sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다.

세포를 PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데히드로 5분간 고정하였다. 이후, 핵 염색제인 4'6'-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 대응염색(counterstain)한 다음 마운팅액(Molecular Probes사)을 처리하고 형광 현미경(Zeiss사)으로 촬영하였다.

도 3b 및 도 3c는 본 발명의 일실시예에 따라, 배양된 파골세포를4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 propidium iodide(PI) 염색법으로 염색한 후에 형광현미경으로 관찰한 사진이며, DAPI 염색결과는 파랑형광으로서 파골세포의 생존을 나타내고, PI 염색결과는 적색형광으로서 사멸세포를 나타내며, 약물층없이 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 결합된 티타늄 디스크(nt-TiO₂)에서 배양한 파골세포 염색결과가 도 3b이고, 약물층이 결합된 표면에 이산화티탄 나노튜브층이 결합된 티타늄 디스크(nt-TiO₂ _-P)에서 배양한 파골세포 염색결과가 도 3c이다.

도 3b 및 3c의 이미지는 Calcein-AM대신 DAPI를 이용하여, DAPI/dead staining를 진행하여 세포 상태를 확인하였고, Live-dead staining와 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

Claims

(a) 티타늄 소재의 표면에 형성된 이산화티탄 나노튜브층을 제공하고,
(b) 상기 이산화티탄 나노튜브층의 표면 산소와, 아민기와 알콕시기를 함유하는 실란 화합물의 알콕시기를 반응시켜 Si-O 결합을 형성하고, 아스파르트산 또는 글루탐산을 반응시켜, 상기 실란 화합물의 아민기와 아스파르트산 또는 글루탐산의 주쇄 카르복시기 사이에 펩타이드 결합을 형성하고,
(c) 상기 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복시기에 약물을 결합시키는 단계를 포함하고,
상기 약물은 파미드론산(pamidronic acid), 알렌드론산(Alendronic acid) 및 이들의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
이산화티탄 나노튜브 표면에 약물을 고정화하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 이산화티탄 나노튜브층은 티타늄의 양극산화처리에 의해 제조되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것인 방법:
[화학식 1]
(R¹)m-Si-(R²)n-NH₂
상기 식에서, R¹은 탄소수1 내지 4의 알콕시기이고, R²는 탄소수 1-4의 알킬렌기이고, m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이며 m+n=4인 조건을 만족한다.
제 1 항에 있어서, 상기 (b) 반응단계는, 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복시기를 보호기로 보호하고, 상기 실란의 아민기와 주쇄 카르복시기의 펩타이드 결합을 형성하고, 상기 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
삭제
티타늄층; 양극산화처리에 의해 형성된 이산화티탄 나노튜브층; 상기 이산화티탄 나노튜브층에 링커를 통해 결합된 약물층을 포함하며,
상기 약물은 파미드론산(pamidronic acid), 알렌드론산(Alendronic acid) 및 이들의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군에서 선택되는 것이고,
상기 링커는 하기 화학식 2을 갖는 것인 복합체:
[화학식 2]

상기 식에서, R¹은 탄소수1 내지 3의 알콕시기이고, R²는 탄소수 1-4의 알킬렌기이고, m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이며 m+n=4인 조건을 만족하며, p는 1 or 2의 정수인, 복합체.
제 6 항에 있어서, 상기 티타늄층의 두께가 1,000 내지 12,000 마이크로미터이고, 이산화티탄 나노튜브층은 두께가 1 내지 100 마이크로미터인 복합체.
제 6 항에 있어서, 상기 약물은 0.1 ppm 내지 100 ppm농도로 고정화된 것인 복합체.
삭제
제 6 항에 있어서, 상기 복합체는 의료용 임플란트인 복합체.