KR101412038B1 - Genetically engineered protein and monoclonal antibody of foot-and-mouth disease virus type C and their application to the diagnostic method - Google Patents
Genetically engineered protein and monoclonal antibody of foot-and-mouth disease virus type C and their application to the diagnostic method Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법의 일예로서 하기 (1)단계 내지 (11)단계로부터 실시될 수 있다.
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 항체를 반응시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료를 반응시키는 단계;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계.The present invention relates to a method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using a C-type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody.
The method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease using the C-foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and monoclonal antibody of the present invention can be carried out from the following steps (1) to (11).
(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus antibody;
(2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) reacting the plate with a C-type FMDV recombinant protein as a diagnostic antigen;
(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein not attached to the plate by washing;
(5) reacting the plate with the test serum sample;
(6) washing and removing the test serum sample not attached to the plate;
(7) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody;
(8) removing the C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody not attached to the plate;
(9) reacting the plate with an anti-mouse antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(10) washing and removing the anti-mouse antibody conjugated with the homodisperse lipase enzyme not attached to the plate;
(11) measuring the absorbance of the chromogenic reaction by the enzyme reaction, and measuring the level of the C-type foot-and-mouth disease virus antibody in the test serum sample.
Description
본 발명은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using a C-type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody.
본 발명의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법의 일예로서 하기 (1)단계 내지 (11)단계로부터 실시될 수 있다.The method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease using the C-foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and monoclonal antibody of the present invention can be carried out from the following steps (1) to (11).
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 항체를 반응시키는 단계;(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus antibody;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계; (2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;(3) reacting the plate with a C-type FMDV recombinant protein as a diagnostic antigen;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein not attached to the plate by washing;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료를 반응시키는 단계;(5) reacting the plate with the test serum sample;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;(6) washing and removing the test serum sample not attached to the plate;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;(7) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;(8) removing the C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody not attached to the plate;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;(9) reacting the plate with an anti-mouse antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;(10) washing and removing the anti-mouse antibody conjugated with the homodisperse lipase enzyme not attached to the plate;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계.
(11) measuring the absorbance of the chromogenic reaction by the enzyme reaction, and measuring the level of the C-type foot-and-mouth disease virus antibody in the test serum sample.
구제역(foot-and-mouth disease)은 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus, FMDV)에 의해 소, 돼지, 양, 염소 등의 우제류 동물에 감염되는 매우 전염성이 높은 동물전염병이다. 일단 발생시에는 국제교역에 치명적인 영향을 미쳐서 상당한 경제적인 피해를 초래한다. 원인체는 구제역 바이러스로서 8,500 염기쌍으로 구성된 단일가닥의 RNA를 함유하고 있으며 VP1, VP2, VP3, VP4 네 개의 단백질이 60개씩 모여서 바이러스 외피를 구성한다. 현재 구제역은 O형, A형, 아시아 1형, C형, SAT(South African territories)1형, SAT 2형, SAT 3형의 7종의 혈청형으로 구분되고 있다.Foot-and-mouth disease is a highly contagious animal infectious disease caused by foot and mouth disease virus (FMDV), which infects animals such as cattle, pigs, sheep and goats. Once it happens, it will have a catastrophic effect on international trade and cause considerable economic damage. The causative agent is a foot-and-mouth disease virus that contains a single strand of RNA consisting of 8,500 basepairs and consists of 60 proteins, VP1, VP2, VP3, VP4, constituting the viral envelope. Currently, foot-and-mouth disease is divided into seven serotypes: O type, A type,
우제류 동물들이 구제역에 감염되었는지의 여부를 확인하는 구제역 검사에 있어서 확진검사로서는 항원검사가 필수적이나 항원검사시료가 없을 경우에는 혈청학적인 검사를 통해서 감염여부를 확인한다. 특히, 감염 후 숙주동물에서 형성되는 항체를 신속하게 검출하거나 백신접종후에 백신항체가를 정확하게 측정하려면 기존의 비구조단백질 항체검사법이 아닌 구조단백질 항체를 측정하는 검사법이 요구된다. In the foot-and-mouth disease test, which confirms whether or not homozygous animals are infected with foot-and-mouth disease, the antigen test is essential as a confirmation test, but if there is no antigen test sample, In particular, in order to rapidly detect an antibody formed in a host animal after infection or to accurately measure a vaccine antibody level after vaccination, a method for assaying a structural protein antibody, which is not a conventional non-avirulent protein antibody test, is required.
현재 구제역 검사에 사용되는 구조단백질 항체를 검출하는 진단법으로서 국제수역사무국에서는 중화시험법을 표준진단법으로 권장하고 있으나, 표준진단법으로 구조단백질 항체를 검출하는데에 3일 정도가 소요되고 고도의 생물안전차폐실험실에서 실시해야 하는 등 대량의 시료를 검사하기에는 어려움이 있어서 이를 극복하고자 효소결합면역측정법이 개발되었다. The International Agency for Biosafety and Engineering (IATA) recommends the use of the neutralization test method as a standard diagnostic method for the detection of structural protein antibodies used in foot-and-mouth disease. However, it takes about 3 days to detect the structural protein antibody by the standard diagnostic method, Enzyme binding immunoassay has been developed in order to overcome the difficulty of inspecting a large amount of samples which must be carried out in a laboratory.
Hamblin 등(1986)은 불활화 구제역 바이러스와 토끼 및 기니픽 다클론항체를 사용한 액상블로킹 방식(Liquid-phase blocking; LPB)의 효소결합면역측정법을 개발하였으나, 효소결합면역측정법에 사용되는 진단항원을 생산하려면 살아있는 구제역 바이러스를 취급해야하고 진단용 항체로서 다클론항체를 사용하기 때문에 생산시마다 항체역가의 차이가 발생하는 단점이 있다. 특히, 살아있는 구제역 바이러스를 취급하는 과정에서 구제역 바이러스의 유출로 인해서 구제역이 야외에 발생할 수 있는 위험성이 상존한다. Valarcher 등(2008)에 따르면 1987년과 1988년에 독일에서, 1993년에는 러시아에서 실험실내 구제역 바이러스 유출로 인한 구제역이 발생된 예가 있었고, 2007년도 영국에서의 구제역 발생도 실험실에서 취급하던 구제역 바이러스가 야외로 유출되어 발생한 예이다. Hamblin et al. (1986) developed an enzyme-linked immunosorbent assay for liquid-phase blocking (LPB) using inactivated foot-and-mouth disease virus and rabbit and guinea pig polyclonal antibody. However, , It has a disadvantage in that it has to deal with live foot-and-mouth disease virus and polyclonal antibody is used as diagnostic antibody. In particular, there is a risk that outbreaks of foot-and-mouth disease can occur outdoors due to outbreak of foot-and-mouth disease virus during handling of live foot-and-mouth disease virus. According to Valarcher et al. (2008), there were cases of foot-and-mouth disease caused by outbreak of foot-and-mouth disease virus in Russia in 1987 and 1988, in Germany in 1993, and outbreaks of foot- It is an outbreak in the outdoors.
이러한 단점을 극복하고자 엄 등(2004)은 구제역 바이러스 O형의 구조단백질 P1 유전자와 단백분해효소인 3C 유전자를 이용한 유전자재조합 단백질 항원을 제작하여 구제역 O형 항체진단법으로 적용하였다. To overcome these drawbacks, Um et al. (2004) prepared recombinant protein antigens using the structural protein P1 gene of foot-and-mouth disease virus type O and the 3C gene, a proteolytic enzyme, and applied it as a diagnostic method for foot-and-mouth disease type O antibody.
또한 고 등(2009)은 구제역 아시아1형에 대해서 동일한 전략으로 접근하여 유전자재조합 단백질 진단항원을 개발하였고 아시아1형 특이 단클론항체를 결합하여 아시아1형 특이 항체를 검출하는 진단기법 개발을 보고하였다. In addition, Ko et al. (2009) developed a diagnostic recombinant protein antigen by approaching the same strategy for foot-and-mouth disease Asia
다만, 구제역 7종의 혈청형 중 C형 구제역에 대해서는 아직까지 유전자재조합 진단항원을 이용한 항체진단기법이 소개된 예가 없다.However, there are no examples of antibody diagnostic techniques using genetic recombinant diagnostic antigens for C-type foot-and-mouth disease among seven serotypes of foot-and-mouth disease.
이에 본 발명에서는 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법을 제공하고자 한다.
Accordingly, the present invention provides a method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease using a C-foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody.
본 발명의 목적은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법을 제공하고자 한다.
It is an object of the present invention to provide a method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using a C-type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody.
상기에서 언급한 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 C형 구제역 바이러스 구조단백질 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 함유한 배큘러바이러스(baculovirus)를 이용하여 곤충세포에서 생산된 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법을 제공하고자 한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for producing a C-foot-and-mouth disease virus gene (C-type) produced by insect cells using a baculovirus containing the P1 gene and the 3C protease gene of the C- A method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using recombinant protein antigens and monoclonal antibodies.
상기에서 단클론항체는 C형 구제역 바이러스 감염개체 혹은 백신개체의 혈청내 항체와의 경쟁반응을 하는 96-42를 사용할 수 있다.In the above, the monoclonal antibody can be used as a 96-42 antibody that competes with a C-type foot-and-mouth disease virus infected individual or a vaccine individual with a serum antibody.
상기에서 단클론항체는 융합세포주(기탁번호KCLRF-BP-00283)에 의해 생산된 단클론항체 96-42를 사용할 수 있다.The above monoclonal antibody may be monoclonal antibody 96-42 produced by a fusion cell line (Accession No. KCLRF-BP-00283).
본 발명의 C형 구제역 진단방법의 일예로서 하기 (1)단계 내지 (11)단계로 이루어진 C형 구제역 진단방법을 제공할 수 있다.As an example of the C type foot-and-mouth disease diagnosis method of the present invention, there can be provided a C type foot-and-mouth disease diagnostic method comprising the following steps (1) to (11).
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 항체를 반응시키는 단계;(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus antibody;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계; (2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;(3) reacting the plate with a C-type FMDV recombinant protein as a diagnostic antigen;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein not attached to the plate by washing;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료를 반응시키는 단계;(5) reacting the plate with the test serum sample;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;(6) washing and removing the test serum sample not attached to the plate;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;(7) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;(8) removing the C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody not attached to the plate;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;(9) reacting the plate with an anti-mouse antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;(10) washing and removing the anti-mouse antibody conjugated with the homodisperse lipase enzyme not attached to the plate;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계.(11) measuring the absorbance of the chromogenic reaction by the enzyme reaction, and measuring the level of the C-type foot-and-mouth disease virus antibody in the test serum sample.
본 발명은 상기의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법에 있어서, 단클론항체를 생산하는 융합세포주(기탁번호KCLRF-BP-00283)를 제공할 수 있다.
The present invention can provide a fusion cell line (Accession No. KCLRF-BP-00283) for producing a monoclonal antibody in the method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using the above-described C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and monoclonal antibody.
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 C형 구제역 바이러스의 구조단백질에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 부위의 유전자를 함유한 배큘러바이러스(baculovirus)를 이용하여 곤충세포에서 생산된 진단항원과 경쟁반응용 단클론항체를 이용하여 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였고 그 유효성을 평가한 결과 기존의 C형 구제역을 진단하는 방법의 하나인 액상블로킹 방식의 효소결합면역측정법 (LPB ELISA)과 대등한 결과를 나타내었다. 이와 같이 구제역 C형 항체진단분야에 있어서 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 사용하여 기존의 불활화바이러스 진단항원과 항혈청을 사용한 진단법과 대등한 결과를 보여주었다는 것은 세계최초의 사례이다. The method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease of the present invention uses a baculovirus containing the P1 gene corresponding to the structural protein of the C-foot-and-mouth disease virus and the gene of the 3C protease site to compete with the diagnostic antigen produced in the insect cell A novel type of enzyme-linked immunosorbent assay was developed using a monoclonal antibody for the reaction. The results of the enzyme-linked immunosorbent assay were compared with those of the liquid-blocking enzyme-linked immunosorbent assay (LPB ELISA) The results are shown. In this way, it is the first case in the world to show the result of using the recombinant protein antigen and the monoclonal antibody in the diagnosis of foot-and-mouth disease type C antibody in comparison with the diagnosis method using the conventional inactivated virus diagnostic antigen and antiserum.
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있어서 간편하게 C형 구제역 바이러스 감염여부를 판정하거나 백신 접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법이나 기존에 불활화바이러스를 사용하는 기존 진단법(LPB ELISA)을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다. The method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease in accordance with the present invention is a competition-type enzyme-linked immunosorbent assay which can be tested in the same manner regardless of species such as bovine, porcine or chlorine, Can be used as a new diagnostic method that can replace the conventional virus detection method (LPV ELISA) using the virus neutralization test method or the conventional inactivated virus.
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다. The C type foot-and-mouth disease diagnosis method of the present invention can prevent a disease from occurring due to unexpected accident due to unauthorized accident due to handling of virus because it does not treat live virus unlike the conventional diagnosis method.
또한 본 발명의 C형 구제역 진단방법은 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용함으로써 일반실험실에서도 손쉽게 C형 구제역 바이러스 진단항원을 생산할 수 있어서 긴급방역상황에서 신속한 진단액 공급이 가능하고 궁극적으로 구제역의 국내유입을 차단하여 국내 축산업의 보호에 기여할 수 있다.
In addition, the C-type foot-and-mouth disease diagnosis method of the present invention can easily produce C-type foot-and-mouth disease virus antigen in a general laboratory using a gene recombinant protein diagnostic antigen, so that it is possible to supply a rapid diagnosis solution in an emergency emergency situation and ultimately, To contribute to the protection of domestic livestock industry.
도 1은 본 발명의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법을 나타낸 것이다.
도 2(가)는 C형 구제역 바이러스 P1을 클로닝 벡터에 삽입하여 제한효소로 절단한 그림이며, 도 2(나)는 전이벡터에 삽입하여 동일한 제한효소로 처리한 후의 그림이다. 도 2(다)는 최종적으로 유전자재조합 베큘로바이러스 유전자를 제작하여 PCR로 확인한 도면이다.
도 3은 형광항체법으로 비감염세포(가)와 유전자재조합 베큘로바이러스를 접종한 곤충세포(나)에서 구제역 바이러스 C형 혈청으로 반응성 차이를 관찰한 도면이다.
도 4는 초고속원심분리후 형성된 침전물에 대해서 전자현미경으로 관찰한 바이러스 유사입자 그림이다(빨간색 표시는 10nm 크기 펜타머 바이러스 유사입자임).
도 5는 유전자재조합 단백질의 항원성을 평가하기위하여 항원 반응성을 비감염세포와 비교하여 관찰한 도면이다.
도 6은 기존 진단법(LPB ELISA)를 적용하여 본 발명의 유전자재조합 단백질 진단항원과 불활화바이러스간의 양성혈청과 음성혈청간의 반응성을 비교한 도면이다.
도 7은 형광항체법으로 정상 IBRS-2 세포(가)와 C형 구제역 바이러스를 접종한 IBRS-2 세포(나)에서 C형 단클론항체 96-42로 반응성 차이를 나타낸 것이다.
도 8은 C형 구제역 바이러스를 불활화하여 염소에 접종한 후에 일자별로 채취한 혈청을 대상으로 초기항체 검출율을 나타낸 것으로서, (가)는 본 발명의 효소결합면역측정법에 의한 초기항체 검출율을 나타낸 것이고, (나)는 기존진단법(LPB ELISA)에 의한 초기항체 검출율을 나타낸 것이다. 1 shows a method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease using the C-foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and the monoclonal antibody of the present invention.
Fig. 2 (A) is a picture obtained by inserting the C-foot-and-mouth disease virus P1 into a cloning vector and digesting it with a restriction enzyme, and Fig. 2 (B) is a picture after being inserted into a transition vector and treated with the same restriction enzyme. FIG. 2 (c) is a diagram showing the final recombinant baculovirus gene produced and confirmed by PCR.
FIG. 3 is a graph showing the difference in reactivity between the non-infected cells (a) and the insect cells (b) inoculated with the recombinant beculovirus by the fluorescent antibody method and the reactivity with the group B serotype C sera.
FIG. 4 is a graph showing a virus-like particle observed with an electron microscope for a precipitate formed after ultra-high speed centrifugation (the red mark is a 10 nm-sized pentameric virus-like particle).
FIG. 5 is a diagram showing the antigen reactivity observed in comparison with non-infected cells in order to evaluate the antigenicity of a recombinant protein.
FIG. 6 is a graph comparing the reactivity between the positive serum and the negative serum between the diagnostic recombinant protein of the present invention and the inactivated virus according to the conventional diagnostic method (LPB ELISA).
Figure 7 shows the difference in reactivity with C-type monoclonal antibody 96-42 in IBRS-2 cells (b) inoculated with normal IBRS-2 cells (a) and C type foot-and-mouth disease virus by fluorescent antibody method.
FIG. 8 shows the detection rate of the initial antibody in the sera collected after inoculation of the C type foot-mouth disease virus and inoculated with chlorine on
본 발명은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법을 나타낸다.The present invention relates to a method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using a C-type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody.
또한 본 발명은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 진단항원과 단클론항체 96-42를 이용한 효소결합면역측정법으로, 검사혈청과 단클론항체 96-42간의 경합반응에 의하여 C형 구제역 바이러스 특이 항체를 검출하는 방법에 의해 C형 구제역을 진단할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.The present invention also provides an enzyme-linked immunosorbent assay using a C-type FMDV recombinant protein diagnostic antigen and a monoclonal antibody 96-42 to detect a C-type FMD specific antibody by a competition reaction between a test serum and monoclonal antibodies 96-42 A method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease can be provided.
상기에서 유전자재조합 단백질 항원은 C형 구제역 바이러스 구조단백질 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 함유한 배큘러바이러스를 이용하여 곤충세포에서 생산된 것을 사용할 수 있다. In the above, the recombinant protein antigen can be produced in insect cells using a circulatory virus containing the C-type foot-and-mouth disease virus structural protein P1 gene and the 3C protease gene.
상기에서 단클론항체는 C형 구제역 바이러스 감염개체 혹은 백신개체의 혈청내 항체와의 경쟁반응을 하는 96-42를 사용할 수 있다.In the above, the monoclonal antibody can be used as a 96-42 antibody that competes with a C-type foot-and-mouth disease virus infected individual or a vaccine individual with a serum antibody.
상기에서 단클론항체는 C형 구제역바이러스에 특이적으로 결합하고 바이러스 중화역가를 보유한 단클론항체 96-42를 사용할 수 있다. The above monoclonal antibody can be used with monoclonal antibody 96-42, which specifically binds to C-type foot-and-mouth disease virus and has a virus neutralization value.
상기에서 단클론항체는 융합세포주(기탁번호KCLRF-BP-00283)에 의해 생산된 단클론항체 96-42를 사용할 수 있다.The above monoclonal antibody may be monoclonal antibody 96-42 produced by a fusion cell line (Accession No. KCLRF-BP-00283).
상기의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법의 일예로서 하기 (1)단계 내지 (11)단계에 의해 실시할 수 있다(도 1 참조).As an example of the method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using the above-described C-foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and monoclonal antibody, the method can be carried out by the following steps (1) to (11).
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 항체를 반응시키는 단계;(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus antibody;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계; (2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;(3) reacting the plate with a C-type FMDV recombinant protein as a diagnostic antigen;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein not attached to the plate by washing;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료를 반응시키는 단계;(5) reacting the plate with the test serum sample;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;(6) washing and removing the test serum sample not attached to the plate;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;(7) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;(8) removing the C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody not attached to the plate;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;(9) reacting the plate with an anti-mouse antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;(10) washing and removing the anti-mouse antibody conjugated with the homodisperse lipase enzyme not attached to the plate;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계.(11) measuring the absorbance of the chromogenic reaction by the enzyme reaction, and measuring the level of the C-type foot-and-mouth disease virus antibody in the test serum sample.
상기에서 플레이트는 96웰 마이크로플레이트(96 well microplates)를 사용할 수 있다.The plate may be a 96-well microplate.
상기에서 (1)단계의 항체는 C형 구제역 바이러스 토끼혈청 항체를 사용할 수 있다.
The antibody of step (1) above may be a C-type FMV rabbit serum antibody.
본 발명은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법에 있어서 사용되는 단클론항체를 생산하는 융합세포주(기탁번호KCLRF-BP-00283)를 포함한다.The present invention includes a fusion cell line (Accession No. KCLRF-BP-00283) for producing a monoclonal antibody used in a method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using a C-foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody.
본 발명은 C형 구제역 바이러스 VP1 특이 펩타이드 부위를 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포융합에 의해서 생산되어 C형 구제역 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체 96-42를 생산하는 융합세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00283)를 제공할 수 있다.
The present invention relates to a monoclonal antibody 96-C which is produced by cell fusion between immune B cells and mouse myeloma cells derived from a C-foot-and-mouth disease virus VP1-specific peptide region immunized with a mouse and specifically binding to C- 42 (Accession No. KCLRF-BP-00283) can be provided.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하고자 한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서는 C형 구제역 바이러스 구조단백질 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 이용하여 베큘로바이러스 감염 곤충세포에서 진단항원의 인공발현을 시도하였다. 또한, C형 구제역 바이러스에 특이적인 단클론항체를 경쟁반응용 항체로 제작하여 상기의 진단항원과 더불어 C형 구제역 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법에 의해 C형 구제역 진단방법을 제공하고자 한다.In the present invention, artificial expression of a diagnostic antigen was attempted in a baculovirus-infected insect cell using the P1 protein of the foot-and-mouth disease virus type C and the 3C protease gene. In addition, a method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease by providing a monoclonal antibody specific for C-type foot-and-mouth disease virus as a competitive antibody and rapidly detecting C-type foot-and-mouth disease antibody together with the above-
본 발명의 발명자들은 C형 구제역 바이러스 구조단백질에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 부위의 유전자를 하나의 발현벡터에 클로닝한 후에 유전자재조합 배큘로바이러스 DNA를 제작하고 이를 곤충세포에서 발현하여 진단항원으로 사용하고, 경쟁반응용 단클론항체는 바이러스의 중화 에피톱에 해당하는 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종후 면역세포와 골수종유래 세포를 세포융합하여 융합세포주 96-42를 제작하고 이를 한국세포주은행(KCLB, Korean Cell Line Bank)에 기탁하여 2012년 04월 17일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00283을 부여받았다. The inventors of the present invention prepared a gene recombinant baculovirus DNA after cloning the P1 gene corresponding to the C-foot-and-mouth disease virus structural protein and the gene of the 3C protease site into a single expression vector, , And a competitive reaction monoclonal antibody was prepared by synthesizing a peptide corresponding to a neutralizing epitope of a virus and then fusing the immune cells and the myeloma cells derived from the mouse to prepare a fusion cell line 96-42, , Korean Cell Line Bank), and received the deposit number KCLRF-BP-00283 on Apr. 17,
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며, C형 구제역의 감염여부를 판정하거나 백신 접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법과 기존의 LPB ELISA를 대체할 수 있는 신규 진단법으로서의 활용이 가능하다.The method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease of the present invention is a competition-type enzyme-linked immunosorbent assay which can be tested in the same manner regardless of the species such as cattle, pigs and chlorine. Can be used as a new diagnostic method that can replace the virus neutralization test method and the existing LPB ELISA.
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 기존 C형 구제역 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다. 결과적으로 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용함으로써 일반실험실에서도 손쉽게 C형 구제역 바이러스 진단항원을 생산할 수 있어서 긴급방역상황에서 신속한 진단액 공급이 가능하고 궁극적으로 구제역의 국내유입을 차단하여 국내 축산업의 보호에 기여할 수 있다.The C-type foot-and-mouth disease diagnosis method of the present invention does not treat live viruses unlike conventional C-foot-and-mouth disease diagnosis methods, so that it is possible to prevent a disease from occurring due to unintentional accidents caused by virus handling. As a result, it is possible to easily produce C type FMDV antigen in general laboratory by using diagnostic recombinant protein gene, so that it is possible to supply quick diagnosis solution in case of emergency and ultimately to prevent domestic influx of foot-and-mouth disease and contribute to protection of domestic livestock industry. .
본 발명은 C형 구제역 바이러스 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 제작할 수 있는 형태의 진단항원을 개발하고 C형 구제역 바이러스에 대해서 특이적으로 결합하는 단클론항체를 선발하여 C형 구제역 바이러스 항체를 신속하게 검출할 수 있는 새로운 C형 구제역 진단방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for preparing a diagnostic antigen that can be safely produced in a general laboratory by replacing an existing inactivated virus with a recombinant protein as a C-type foot-and-mouth disease virus diagnostic antigen and a monoclonal antibody specifically binding to a C- A method for diagnosing C type foot-and-mouth disease, which can rapidly detect C type foot-and-mouth disease virus antibody.
본 발명의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 C형 구제역 진단방법을 제공하는 것이 바람직하다.
The method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and the monoclonal antibody of the present invention was carried out under various conditions. In order to achieve the object of the present invention, It is desirable to provide a method for diagnosing C type foot-and-mouth disease using a protein antigen and a monoclonal antibody.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Test Examples. However, these are for the purpose of illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.
<실시예 1> C형 구제역 바이러스 유전자재조합 P1 단백질 발현Example 1 Expression of P1 Protein in Recombinant C-Foot-and Mouth Virus
C형 구제역 바이러스(C3/Resende/Brazil, 유전자은행 AY593807)를 감염시킨 IBRS-2 세포에서 RNeasy extraction 키트(Qiagen사)를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하였다. 상보적인 DNA는 Random hexamer와 AccuPower RT Premix(바이오니아사 제품)를 사용하여 제작하였고, cDNA를 주형으로 nPfu DNA polymerase(Enzynomics사 제품)를 적용하여 유전자를 증폭하였다. Viral RNA was extracted from the IBRS-2 cells infected with the C type foot-and-mouth disease virus (C3 / Resende / Brazil, gene bank AY593807) using the RNeasy extraction kit (Qiagen). The complementary DNA was prepared using Random hexamer and AccuPower RT Premix (Bioneer), and the gene was amplified using nPfu DNA polymerase (Enzynomics) as a template.
P1 유전자의 순방향 프라이머(forward primer)는 5' AAT GGA TCC ATG GGA GCC GGG CAA TCC AGC 3'이고(서열번호 1 참조), 역방향 프라이머(reverse primer)는 5' GCC ACT AGT TTA CTG TTT CGC CGG CGC GAT 3'이고(서열번호 2 참조), 단백분해효소인 3C 유전자의 순방향 프라이머는 5' GAT TCT CGA GAT GAG CGG TGC CCC CCC GAC CGA C 3'이고(서열번호 3 참조), 역방향 프라이머는 5' AAC AGC ATG CTA CTC ATG GTG TGG TTC AGG GTC 3'이다(서열번호 4 참조). The forward primer of the P1 gene is 5 'AAT GGA TCC ATG GGA GCC GGG CAA TCC AGC 3' (see SEQ ID NO: 1) and the reverse primer is 5 'GCC ACT AGT TTA CTG TTT CGC CGG CGC GAT 3 '(see SEQ ID NO: 2), the forward primer of the proteolytic enzyme 3C gene is 5' GAT TCT CGA GAT GAG CGG TGC CCC CCC GAC CGA C 3 '(SEQ ID NO: 3) AAC AGC ATG CTA CTC ATG GTG TGG TTC AGG GTC 3 '(see SEQ ID NO: 4).
유전자 증폭기(PCR, Eppendorf)를 사용하여 상기의 P1 및 3C 유전자에 대한 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머에 대한 유전자를 증폭하였고 조건은 다음과 같다. 즉, 95℃에서 2분간 변성을 시키고 나서 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분을 기본 사이클로 해서 35회 반복하였다. 마지막에는 72℃에서 10분간 연장증폭하였다. The gene for the forward primer and the reverse primer for the P1 and 3C genes was amplified using a gene amplifier (PCR, Eppendorf), and the conditions were as follows. That is, denaturation at 95 ° C for 2 minutes was repeated 35 times at 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes. And finally extended at 72 ° C for 10 minutes.
그 결과는 도 2(가)에서와 같이 확인되었고, 증폭한 유전자는 전이벡터인 pFastBacDual 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다. 이렇게 제작된 전이벡터는 도 2(나)와 같이 확인되었고 이 벡터를 배큘로바이러스 유전자 bacmid DNA를 함유하고 있는 대장균에 형질전환하여 유전자재조합 베큘로바이러스 핵산을 도 2(다)와 같이 확인하였다. 핵산 추출후 곤충세포(Sf9)에 주입하여 재조합배큘로바이러스를 제작하였다. The result was confirmed as shown in Fig. 2 (a), and the amplified gene was inserted into a pFastBacDual vector (Invitrogen), which is a transition vector. The transfection vector thus constructed was confirmed as shown in FIG. 2 (B), and this vector was transformed into Escherichia coli containing the baculovirus gene bacmid DNA, and the recombinant beculovirus nucleic acid was identified as shown in FIG. 2 (C). After the nucleic acid extraction, the cells were injected into insect cells (Sf9) to prepare recombinant baculoviruses.
상기에서 도 2(가)는 C형 구제역 바이러스 P1 유전자를 클로닝 벡터에 삽입하여 제한효소로 절단한 것이며, 도 2(나)는 전이벡터에 삽입하여 동일한 제한효소(BamHI & Spel)로 처리한 후를 나타낸 것이다. 도 2(다)는 최종적으로 유전자재조합 베큘로바이러스 유전자를 제작하여 PCR로 확인한 것이다. 2 (A) is a fragment of a C-foot-and-mouth disease virus P1 gene inserted into a cloning vector and cleaved with a restriction enzyme. FIG. 2 (B) is inserted into a transfer vector and treated with the same restriction enzyme (BamHI & Spel) . Fig. 2 (c) shows the result of PCR using the final recombinant baculovirus gene.
세포배양 플라스크에서 배양한 곤충세포에 재조합배큘로바이러스를 접종한 후에 세포변형이 관찰되면 냉동(-70℃) 및 융해(37℃)를 3회 반복하여 세포를 파쇄하고 원심분리(10,000×g, 30분)하여 상층액을 취하여 진단항원으로 사용하였다. When cells were transformed after inoculation of recombinant baculovirus into insect cells cultured in a cell culture flask, the cells were disrupted by three cycles of freezing (-70 ° C) and thawing (37 ° C), followed by centrifugation (10,000 × g, 30 min), and the supernatant was used as a diagnostic antigen.
단백질 발현여부를 확인하기 위하여 형광항체법을 실시하였다. 정상 Sf9 세포슬라이드에 유전자재조합 배큘로바이러스 상층액을 접종한 후에 세포변성이 관찰되면 인산완충용액으로 3회 세척 후 건조하고 나서 아세톤과 메탄올을 1:1의 부피비로 혼합한 액으로 세포를 10분간 고정하였다. 이후에 인산완충용액으로 세척한 후에 C형 VP1 펩타이드 혈청으로 37℃에서 1시간 반응시켰다. 다시 인산완충용액으로 세척한 후에 FITC 결합된 항마우스 항체를 이차항체로 1시간 동안 반응시켜서 형광여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 3(나)에서 보는 바와 같이 C형 VP1 펩타이드 항혈청을 이용한 형광항체법에서 양성반응성이 확인되었다. 한편 도 3(가)는 정상 Sf9 세포 슬라이드에 유전자재조합 배큘로바이러스를 접종하지 않고 형광항체법을 실시한 것을 나타내었다.Fluorescent antibody method was used to confirm protein expression. After the inoculation of the genetically recombinant baculovirus supernatant on the normal Sf9 cell slides, if the cell degeneration was observed, the cells were washed three times with phosphate buffer solution and dried. Then, cells were mixed with acetone and methanol at a volume ratio of 1: 1 for 10 minutes Respectively. After washing with phosphate buffer solution, the cells were reacted with C type VP1 peptide serum at 37 ° C for 1 hour. After washing with phosphate buffer, FITC-conjugated anti-mouse antibody was reacted with secondary antibody for 1 hour to observe fluorescence. As a result, as shown in Fig. 3 (B), the positive reactivity was confirmed in the fluorescent antibody method using the C type VP1 peptide antiserum. On the other hand, Fig. 3 (a) shows that the fluorescent antibody method was performed without inoculating genetically recombinant baculovirus into normal Sf9 cell slides.
발현단백질을 초고속원심분리(100,000×g, 4시간)한 후에 침전물을 취하여 전자현미경으로 관찰한 결과, 도 4와 같이 10nm 크기의 펜타머 형태의 바이러스 유사입자가 관찰되었다.
After the expression protein was subjected to ultra-high-speed centrifugation (100,000 x g, 4 hours), the precipitate was taken and observed under an electron microscope. As a result, a virus-like particle of pentamer shape having a size of 10 nm was observed as shown in Fig.
<실시예 2> 유전자재조합 단백질의 항원성 평가≪ Example 2 > Evaluation of antigenicity of a recombinant protein
상기 실시예 1에서 얻은 본 발명의 유전자재조합 단백질에 대해 C형 구제역 진단시 진단항원으로서의 적합성을 측정하였다. The suitability of the recombinant protein of the present invention obtained in Example 1 as a diagnostic antigen in the diagnosis of C type foot-and-mouth disease was measured.
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 토끼유래 항체를 반응시키는 단계;(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus rabbit-derived antibody;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계; (2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;(3) reacting the plate with a C-type FMDV recombinant protein as a diagnostic antigen;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein not attached to the plate by washing;
(5) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 기니픽 혈청을 넣어 반응시키는 단계;(5) adding C-type FMD guinea pig serum to the plate to react;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 기니픽 혈청을 제거하는 단계;(6) removing C-type FM virus guinea pig serum not attached to the plate;
(7) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항기니픽 항체를 반응시키는 단계;(7) reacting the plate with an anti-guinea pig antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항기니픽 항체를 세척하여 제거하는 단계;(8) washing and removing the anti-guinea pig antibody bound to the hostess peroxidase enzyme not attached to the plate;
(9) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 수준을 측정하는 단계.(9) measuring the absorbance of the chromogenic reaction due to the enzyme reaction, and measuring the level of recombinant protein of C type FMDV in the serum sample to be tested.
상기 방법으로 본 발명의 유전자재조합 단백질의 진단항원으로서의 적합성을 기존 진단법(LPB ELISA) 구성물인 기니픽 C형 혈청을 적용하여 비감염세포(Sf9)와 반응성을 비교한 결과 도 5에서와 같이 유전자재조합 단백질에서만 뚜렷한 반응성을 확인하였다.As a result of comparing the reactivity of the recombinant protein of the present invention with the non-infected cells (Sf9) by applying the guinea pig type C serum as a constituent of the LPB ELISA, Significant reactivity was confirmed.
한편 상기 실시예 1에서 얻은 본 발명의 유전자재조합 단백질 및 기존 C형 구제역 진단법에서 사용하고 있는 불활화 구제역 바이러스와 항원성을 비교하기 위하여 기존 진단법(LPB ELISA)에 포함되어있는 3가지 혈청(영국 퍼브라이트연구소에서 생산하는 혈청으로서 LPB ELISA 키트에 포함되어 있는 대조혈청임)을 사용하여 불활화바이러스 항원과 본 발명의 유전자재조합 단백질간의 항원성을 평가하였다. Meanwhile, in order to compare antigenicity with the inactivated foot-and-mouth disease virus used in the genetic recombinant protein of the present invention obtained in Example 1 and the existing C-type foot-and-mouth disease diagnosis method, three sera Which is a control serum contained in an LPB ELISA kit as a serum produced by Wright Laboratories) was used to evaluate the antigenicity between the inactivated virus antigen and the recombinant protein of the present invention.
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 토끼유래 항체를 반응시키는 단계;(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus rabbit-derived antibody;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계; (2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질(혹은 불활화 C형 구제역 바이러스 항원)을 반응시키는 단계;(3) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus recombinant protein (or inactivated C-type foot-and-mouth disease virus antigen) as a diagnostic antigen;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질(혹은 불활화 C형 구제역 바이러스 항원)을 세척하여 제거하는 단계;(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein (or inactivated C type foot-and-mouth disease virus antigen) not attached to the plate to remove it;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료(대조혈청으로서 강양성, 약양성, 음성혈청)를 반응시키는 단계;(5) reacting the plate with a test serum sample (strong positive, weak positive, negative serum as a control serum);
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;(6) washing and removing the test serum sample not attached to the plate;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;(7) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;(8) removing the C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody not attached to the plate;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;(9) reacting the plate with an anti-mouse antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;(10) washing and removing the anti-mouse antibody conjugated with the homodisperse lipase enzyme not attached to the plate;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계.(11) measuring the absorbance of the chromogenic reaction by the enzyme reaction, and measuring the level of the C-type foot-and-mouth disease virus antibody in the test serum sample.
상기와 같이 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
The measurement was carried out as described above and the results are shown in Fig.
도 6에서와 같이 3가지 대조혈청에 대해서 유전자재조합 단백질은 C형 불활화 구제역 바이러스 항원과 마찬가지로 양성혈청과 음성혈청을 공히 감별할 수 있었다.
As shown in FIG. 6, for the three control sera, the recombinant protein was able to discriminate positive and negative sera from C-type inactivated FMDV antigen.
<실시예 3> C형 구제역 바이러스 단클론항체를 생산하는 융합세포주 제작Example 3 Production of a fusion cell line producing a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody
C형 구제역 바이러스(C3/Resende/Brazil, 유전자은행 AY593807) 아미노산 서열을 토대로 하여 VP1 129번부터 169번 아미노산에 해당하는 부위의 펩타이드 (TTYTGTTTYTTSARRGDSAHLAAAAHARHLPTSFN FGAVKAE)(서열번호 5 참조)를 펩트론(대전, 대한민국)에서 제작하였다. 펩타이드 합성후에는 KLH(keyhole limpet hemocyanin)에 결합하였고 이를 마우스에 4회 복강접종하였고 5회째 정맥주사한 후에 비장을 채취하여 세포융합에 사용하였다.(TTYTGTTTYTTSARRGDSAHLAAAAHARHLPTSFN FGAVKAE) (see SEQ ID NO: 5) corresponding to the amino acid sequence of VP1 129 to 169 was amplified by peptide tyrosine (Taejon, Korea) on the basis of the amino acid sequence of C type foot-and-mouth disease virus (C3 / Resende / Brazil, gene bank AY593807) Respectively. After peptide synthesis, the cells were bound to KLH (keyhole limpet hemocyanin), which was intraperitoneally injected 4 times, and the spleen was collected and used for cell fusion.
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 비장에서 채취한 림프구를 무혈청 배지(DMEM, Invitrogen)로 세척한 후, 마우스 골수종 유래 세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 부피비율로 혼합한 후 폴리에틸렌글리콜 150(Roche)을 1ml 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 증식배지[D-MEM, HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), 10％ 우태아혈청]에 희석한 후 미리 마우스 복강세포가 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, 5％ 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다.Cell fusion was performed as follows using a general method using polyethylene glycol. The lymphocytes collected from the spleen were washed with serum-free medium (DMEM, Invitrogen) and mixed with a mouse myeloma cell line (SP2 / 0-Ag14 mouse myeloma cell line) at a volume ratio of 5: 1. Then, polyethylene glycol 150 ) Was added and fused. After completion of the fusion, the cells were diluted in the proliferation medium (D-MEM, HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), 10% fetal bovine serum), and 100 쨉 l were dispensed into 96-well microplates, And cultured in a 5% carbon dioxide incubator.
C형 구제역 바이러스에 대한 단클론항체를 생산하는 융합세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 융합세포가 증식한 웰의 배양 상층액을 수거하여 펩타이드 항원을 이용한 간접 효소결합면역측정법을 실시하여 양성반응을 보이는 웰의 융합세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.8개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. C형 구제역 바이러스에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰을 선발하였다. 이렇게 선발된 융합세포주를 발브씨 마우스의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 IgG 항체만을 ImmunoPure IgG 정제 키트(Pierce, 미국)로 정제하여 실험에 사용하였다. 최종선발한 단클론항체인 96-42는 IgG1이고, 상기 실시예 1에서 언급한 형광항체법을 이용한 바이러스 항원과의 반응성을 측정하고 이를 도 7을 통해 확인하였다.Selection of fusion cell lines producing monoclonal antibodies against C-foot-and-mouth disease virus was carried out as follows. As a result of the cell fusion, the culture supernatant of the wells in which the fusion cells were proliferated was harvested and subjected to an indirect enzyme-linked immunosorbent assay using a peptide antigen. The fusion cells of the wells showing positive reactions were immersed in a 96 well plate in which mouse peritoneal cells were cultured 0.8 cells per well were added and cultured until a single clone was formed. The wells in which only one clone proliferates were selected while producing antibodies against the C-foot-and-mouth disease virus. The resulting recombinant cell line was inoculated into the peritoneal cavity of Balb / c mice and the resulting antigen was collected and purified with ImmunoPure IgG purification kit (Pierce, USA). The final selected monoclonal antibody, 96-42, was IgG1, and its reactivity with the viral antigen using the fluorescent antibody method described in Example 1 was measured and confirmed by FIG.
상기 단클론항체인 96-42를 한국세포주은행에 기탁하여 2012년 04월 17일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00283을 부여받았다. The above monoclonal antibody, 96-42, was deposited with the Korean Cell Line Bank and received deposit number KCLRF-BP-00283 on Apr. 17, 2012.
도 7은 형광항체법으로 정상 IBRS-2 세포(가)와 C형 구제역 바이러스를 접종한 IBRS-2 세포(나)에서 C형 구제역 바이러스에 대한 단클론항체 96-42로 반응성 차이를 나타낸 것이다.
Figure 7 shows the reactivity difference with monoclonal antibody 96-42 against C type FMV in IBRS-2 cells (b) inoculated with normal IBRS-2 cells (a) and C type foot-and-mouth disease virus by fluorescent antibody method.
<실시예 4> 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법 확립 및 유효성 평가Example 4 Establishment and Evaluation of Enzyme Linked Immunoassay Using Gene Recombinant Protein Antibody and Monoclonal Antibody
유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체 96-42를 이용하여 C형 구제역 바이러스 항체를 검출하기 위한 효소결합면역측정법은 다음과 같다.An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of C-type FMDV antibody using recombinant protein antigen and monoclonal antibody 96-42 is as follows.
96웰 마이크로플레이트에 C형 항원을 포집할 수 있는 항체로서 토끼 유래 C형 구제역 바이러스 VP1 항혈청을 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)에 200배 희석하여 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 웰당 50㎕씩 분주하여 4℃에서 16시간 정치하였다. 이튿날, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05％ 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10mM 인산완충용액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하고 나서 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질 항원을 블로킹용액(10mM 인산완충용액에 0.05％ 트윈 20 및 5％ 탈지유 첨가한 용액)으로 1:16으로 희석하여 웰당 50㎕씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 단백질 항원을 세척하여 제거하고 나서 검사혈청을 블로킹용액으로 1:5로 희석하여 웰당 50㎕씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 다시 3회 세척하여 항원에 결합하지 않은 혈청내 항체를 제거한 후, 단클론항체인 96-42를 블로킹용액으로 0.2㎍/ml 농도로 희석하여 웰당 50㎕씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척하고 나서, 발색제로서 오피디(O-Phenylenediamine) 용액과 0.015％ 과산화수소수를 첨가하여 15분 내외로 반응시켰다. 혈청이 배제된 대조군의 흡광도가 1.2 내외의 값을 보일 것으로 추정되는 시점에서 1.25N 황산용액을 50㎕/well 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 최종결과는 혈청 없이 단클론항체만을 첨가한 웰의 흡광도 대비 검사웰의 흡광도 억제도를 환산하여 분석하였다. 상기 반응의 결과판정에서 단클론항체 대조웰의 흡광도보다 50％ 이상 반응이 저해된 웰, 즉 반응저해도(Percentage Inhibition, PI)가 50％ 이상인 경우 C형 구제역 바이러스 항체 양성반응으로 판정하였다. The rabbit-derived FMV VP1 antiserum was diluted 200 times with carbonate buffer (pH 9.6) as an antibody capable of capturing the C-type antigen in a 96-well microplate and added to a 96-well microplate (Maxisorp) And allowed to stand at 4 캜 for 16 hours. On the next day, the coated microplate was washed three times with a washing solution (phosphate buffered buffer containing 0.05% Tween 20) to remove the unattached antibody, and the C type foot-and-mouth disease virus gene The recombinant protein antigen was diluted 1:16 with a blocking solution (0.05% Tween 20 and 5% skim milk added to 10 mM phosphate buffer), and 50 ㎕ / well was added thereto. The mixture was reacted at 37 캜 for 1 hour. After washing of the unbound protein antigen by washing three times with washing solution, the test serum was diluted 1: 5 with blocking solution, and 50 ㎕ per well was dispensed and reacted at 37 캜 for 1 hour. After the antibody was removed from the serum not bound to the antigen, the monoclonal antibody 96-42 was diluted with blocking solution to a concentration of 0.2 μg / ml, and 50 μl of the diluted antibody was dispensed into the wells at 37 ° C. for 1 hour Lt; / RTI > O-Phenylenediamine solution and 0.015% hydrogen peroxide solution were added as a coloring agent, and the mixture was reacted for about 15 minutes. At the time when the absorbance of the control group in which the serum was excluded was supposed to show a value of about 1.2 or less, 1.25 N sulfuric acid solution was added at 50 / / well to stop the color development reaction and then the absorbance was measured at 492 nm. The final results were analyzed by converting the absorbance of the test well to the absorbance of the well without monoclonal antibody alone. The result of the above reaction was judged to be positive for the C-type FMD antibody when the well was inhibited by 50% or more of the absorbance of the monoclonal antibody control well, that is, the percentage inhibition (PI) was 50% or more.
반응저해도(％)=100×[(대조웰 흡광도-검사혈청 흡광도)/대조웰 흡광도] Reaction inhibition (%) = 100 x [(control well absorbance - test serum absorbance) / control well absorbance]
이때, 대조웰 흡광도는 혈청없이 단크론항체 96-42만 첨가된 웰의 흡광도이다.
At this time, the absorbance of the control well was the absorbance of the well containing only the monoclonal antibodies 96-42 without serum.
[시험예 1] 불활화바이러스 실험접종 염소혈청에 대한 진단법의 유효성 평가[Test Example 1] Evaluation of the effectiveness of the in vitro test for inoculated chicken serum
본 발명의 진단법의 초기 항체 검출율을 평가하기 위하여 염소 4두(염소1 내지 염소4)에 C형 구제역 불활화바이러스를 4.60× 107 조직세포감염량(TCID50) 접종한 후에 일자별(0일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일)로 채취한 혈청을 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법과 기존진단법(LPB ELISA)간의 초기항체 검출율을 비교하고 이를 도 8에 나타내었다.In order to evaluate the detection rate of the initial antibody in the diagnostic method of the present invention, 4.60 × 10 7 tissue-cell-infected amount (TCID 50 ) of C-type foot-mouth disease inactivated virus was inoculated into 4 chlorine (
도 8의 결과에서처럼 접종후 7일째에는 4두중 3두에서 양성전위가 시작되어 10일째에는 4두 모두 양성으로 판정되었다. 이는 본 발명의 효소결합면역측정법과 기존진단법(LPB ELISA)과 동일한 결과이다. 즉, 초기 항체검출율에 있어서 동등한 효과를 확인하였다. As shown in Fig. 8, positive results were obtained in 3 out of 4 mice at 7 days after inoculation, and 4 mice at 10 days were positive. This is the same result as the enzyme-linked immunosorbent assay of the present invention and the conventional diagnostic method (LPB ELISA). That is, the same effect was confirmed in the initial antibody detection rate.
한편 도 8의 (가)는 본 발명의 효소결합면역측정법에 의한 초기항체 검출율을 나타낸 것이고, (나)는 기존진단법(LPB ELISA)에 의한 초기항체 검출율을 나타낸 것이다.8 (a) shows the initial antibody detection rate by the enzyme-linked immunosorbent assay of the present invention, and (b) shows the initial antibody detection rate by the LPB ELISA.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is evident that many alternatives, modifications and variations will be apparent to those skilled in the art without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the following claims. It will be understood that the invention may be modified and varied without departing from the scope of the invention.
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있어서 간편하게 C형 구제역 바이러스 감염여부를 판정하거나 백신 접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법이나 기존에 불활화바이러스를 사용하는 기존 진단법(LPB ELISA)을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다. The method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease in accordance with the present invention is a competition-type enzyme-linked immunosorbent assay which can be tested in the same manner regardless of species such as bovine, porcine or chlorine, Can be used as a new diagnostic method that can replace the conventional virus detection method (LPV ELISA) using the virus neutralization test method or the conventional inactivated virus.
본 발명의 C형 구제역 진단방법은 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다. The C type foot-and-mouth disease diagnosis method of the present invention can prevent a disease from occurring due to unexpected accident due to unauthorized accident due to handling of virus because it does not treat live virus unlike the conventional diagnosis method.
또한 본 발명의 C형 구제역 진단방법은 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용함으로써 일반실험실에서도 손쉽게 C형 구제역 바이러스 진단항원을 생산할 수 있어서 긴급방역상황에서 신속한 진단액 공급이 가능하고 궁극적으로 구제역의 국내유입을 차단하여 국내 축산업의 보호에 기여할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.
In addition, the C-type foot-and-mouth disease diagnosis method of the present invention can easily produce C-type foot-and-mouth disease virus antigen in a general laboratory using a gene recombinant protein diagnostic antigen, so that it is possible to supply a rapid diagnosis solution in an emergency emergency situation and ultimately, It can contribute to the protection of the domestic livestock industry and it is possible to be used in industry.
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Claims (8)
상기의 단클론항체는 융합세포주(기탁번호KCLRF-BP-00283)에 의해 생산된 단클론항체 96-42인 것을 특징으로 하는 C형 구제역 진단방법.A method for diagnosing C type foot-and-mouth disease in a mammal other than a human using a C-type foot-and-mouth disease virus recombinant protein antigen and a monoclonal antibody,
Wherein said monoclonal antibody is monoclonal antibody 96-42 produced by a fusion cell line (Accession No. KCLRF-BP-00283).
유전자재조합 단백질 항원은 C형 구제역 바이러스 구조단백질 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 함유한 배큘러바이러스를 이용하여 곤충세포에서 생산된 것 임을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 C형 구제역 진단방법.The method according to claim 1,
Wherein the recombinant protein antigen is produced in an insect cell using a circulatory virus containing a C-type foot-and-mouth disease virus structural protein P1 gene and a 3C protease gene.
단클론항체는 C형 구제역 바이러스 감염개체 혹은 백신개체의 혈청내 항체와의 경쟁반응을 하는 96-42인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 C형 구제역 진단방법.
The method according to claim 1,
Wherein the monoclonal antibody is 96-42 which competes with a C-type foot-and-mouth disease virus infected individual or a vaccine individual with a serum antibody.
(1) 플레이트에 C형 구제역 바이러스 항체를 반응시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 플레이트에 진단항원으로 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 유전자재조합 단백질을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 상기 플레이트에 검사혈청시료를 반응시키는 단계;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;
(7) 상기 플레이트에 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 C형 구제역 바이러스 단클론항체를 제거하는 단계;
(9) 상기 플레이트에 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 반응시키는 단계;
(10) 상기 플레이트에 부착되지 않은 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 항마우스 항체를 세척하여 제거하는 단계;
(11) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청시료 중의 C형 구제역 바이러스 항체 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 C형 구제역 진단방법.The method according to claim 1,
(1) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus antibody;
(2) washing and removing the antibody not attached to the plate;
(3) reacting the plate with a C-type FMDV recombinant protein as a diagnostic antigen;
(4) washing the C type foot-and-mouth disease virus recombinant protein not attached to the plate by washing;
(5) reacting the plate with the test serum sample;
(6) washing and removing the test serum sample not attached to the plate;
(7) reacting the plate with a C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody;
(8) removing the C-type foot-and-mouth disease virus monoclonal antibody not attached to the plate;
(9) reacting the plate with an anti-mouse antibody conjugated with a horseradish peroxidase enzyme;
(10) washing and removing the anti-mouse antibody conjugated with the homodisperse lipase enzyme not attached to the plate;
(11) A method for diagnosing C-type foot-and-mouth disease in a mammal other than a human, comprising measuring the absorbance of the chromogenic reaction caused by the enzyme reaction and measuring the level of the C-type foot- and mouth disease virus antibody in the test serum sample.
플레이트는 96웰 마이크로플레이트인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 C형 구제역 진단방법.6. The method of claim 5,
Wherein the plate is a 96-well microplate.
(1)단계의 항체는 C형 구제역 바이러스 토끼혈청 항체인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 C형 구제역 진단방법.6. The method of claim 5,
Wherein the antibody of step (1) is a C-type foot-and-mouth disease rabbit serum antibody.
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| KR20110031012A (en) * | 2009-09-18 | 2011-03-24 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) | Diagnostic method for the detection of antibodies to foot-and-mouth disease virus type asia 1 |
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|---|---|---|---|---|
| KR20070046390A (en) * | 2005-10-31 | 2007-05-03 | 주식회사 제노바이오텍 | Novel specific detection method for antibody against non-structural protein in fmdv infected animal using 3ab protein and monoclonal antibody combination |
| KR20110031012A (en) * | 2009-09-18 | 2011-03-24 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) | Diagnostic method for the detection of antibodies to foot-and-mouth disease virus type asia 1 |
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