KR101410536B1 - 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드는 로드가 연결되어 형성된 매크로 크기의 기공 구조 및 로드 상에 마이크로 크기의 기공구조가 형성되어 있어서 우수한 세포 부착력을 나타내며, 이에 따라서 골 세포 공학 재료로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드{Dual-pore structured scaffolds comprising chitosan/nanobioactive glass for bone engineering}

본 발명은 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드에 관한 것이다.

골 및 치아를 포함하는, 단단한 조직의 재생은, 최근 들어 인공의, 3-차원(3D) 구조의 스캐폴드의 사용으로 가능해졌다(Hutmacher DW. Biomaterials 2000;21:2529-43). 공동(pore) 배치 및 물리적 성질을 포함하여, 적당한 성질을 갖는 스캐폴드의 개발은 조직 세포의 생체 외(ex-vivo) 배양 및 조직 공학을 위한 구조의 응용에 있어서 중요하다(Kim HW, Shin SY, Kim HE, Lee YM, Chung CP, Lee HH, et al. J Biomater Appl 2008;22:485-504; Hollister SJ. Nat Mater 2005; 4: 518-24).

골 재생을 증진시키기 위한 일반적인 전략으로서 사용되는 스캐폴드는 조직 및 스캐폴드의 구성체를 생성하는 골을 3-차원(3D)으로 성장시킬 수 있는 주형(template)이다. 스캐폴드의 사용을 수반하는 두 가지 중요한 골 재생 전략은 인시츄(in situ) 조직 재생 및 조직 공학이다. 일반적으로, 조직 공학은 인체 외부의 생물반응장치(bioreactor)에서 스캐폴드 상에 세포를 성장시키는 것을 수반하며, 상기 지지체를 이식시킨 후, 상기 스캐폴드는 성숙한 골로 골이 재형성됨에 따라 용해되어야만 한다. 인시츄(in situ) 조직 재생에서는 스캐폴드를 인체 내로 직접적으로 이식시킨다. 상기 두 경우에서, 이식된 스캐폴드 물질은 생리적인 환경에 적응해야만 한다. 골 수복을 위한 이상적인 스캐폴드는 1) 골을 3차원으로 성장시키기 위한 주형으로 적용해야 하며; 2) 생체 적합성이 있어야 하며; 3) 숙주 골(host bone)("생활성"으로 언급된 특성)과 결합을 형성하고, 골 성장을 자극하고; 4) 비-독성 분해 물질로 적절한 속도로 용해되어야 하고; 5) 이식시 숙주 골과 일치하는 기계적 특성을 가져야 하며; 및 6) 임상 적용을 위해 상업 생산 및 살균할 수 있어야 한다.

기준 1)을 달성하기 위해, 스캐폴드는 3D로 연결된 기공 네트워크를 가져야 하며, 이는 세포 이동, 유체 흐름(영양 공급) 및 스캐폴드 상에 성장시킬 골을 허락하기 위해 충분히 큰 연결을 갖는 것이 바람직하다. 또한 혈액 공급을 위한 골의 최소한의 연결크기는 성장을 위해 100 ㎛로 고려되고 있다.

빠른 프로토타이핑(prototyping) 기법의 하나인 로보캐스팅 방법은 스캐폴드를 구성하는 기공의 사이즈 및 양을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 스캐폴드의 모양을 갖는 잘-조절된(fine-tuned) 기하학적인 파라미터를 갖는 스캐폴드를 생산하는 것을 촉진할 수 있다.

최근에는 분해 가능한 고분자 및 생활성 무기물을 포함하는 다양한 조성물로부터 로보틱-디스펜스드(Robotic-dispensed) 스캐폴드를 개발하여 왔다. 디스펜딩(dispending) 조건 뿐만 아니라 재료의 용액 성질은 스캐폴드의 제조 가용성 및 결과적 성질을 지배하는 것으로 여겨진다(Dorj B, Kim MK, Won JE, Kim HW. Mater Lett 2011; 65: 3559-62; Oh CH, Hong SJ, Yu HS, Jegal SH, Kim HW. Tissue Eng C 2010; 16(4): 561-71; Miranda F, Pajares A, Saiz E, Tomsia AP, Guiberteau F. J Biomed Mater Res A 2008; 85A: 218-27; Ang TH, Sultana FSA, Hutmacher DW, Wong YS, Fuh JYH, Mo XM, et al. Mater Sci Eng C 2002; 20: 35-42).

키토산은 자연계에 존재하는 다당류중의 하나이고 상처 드레싱(wound dressing), 약물 전달체 및 조직 공학을 위한 스캐폴드로서 다양한 응용을 위해서 의학재료로서 널리 사용되어 왔다(Dash M, Chiellini F, Ottenbrite RM, Chiellini E. Prog Polym Sci 2011; 36: 981-1014; Jayakumar R, Manzoor DMK, Nair SV, Tamura H. Carbohydr Polym 2010; 82: 227-32).

키토산은 높은 양-전하를 띠기 때문에, 주로 핵산의 전달체로서 사용되어 왔다. 단단한 조직에 있어서 이의 응용을 위해서, 그러나, 골 세포 활성, 골 재생 능력 및 기계적인 강도와 같은 몇몇의 성질은 여전히 향상될 필요가 있다.

몇몇의 현재까지의 연구에 있어서 키토산과 하이드록시 아파타이트(HA)와 같은 생활성 무기 물질을 포함하는 조성물에 대해서 보고된 바 있으며, 이는 기계적 및 생물학적인 특성을 증진시킨다고 보고된 바 있다.

예를 들어, 키토산 스캐폴드에 하이드록시 아파타이트(HA)를 도입하는 것은 기계적 강도의 증가 및 분화와 같은 골 형성의 반응을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다. 게다가 생활성 유리(BG)의 마이크로 입자 형태를 키토산에 추가하는 것은 생체 내 (in vitro) 무기물화(mineralization) 및 세포의 기능을 촉진한다고 증명된 바 있다(Thein-Han WW, Misra RDK. Acta Biomater 2009; 5: 1182-97; Le J, Sun H, Sun D, Yao Y, Yao F, Yao K. Carbohydr Polym 2011; 85: 885-94; Couto DS, Hong Z, Mano JF. Acta Biomater 2009; 5: 115-23).

나노-크기의 생활성 유리의 놀라운 성질 및 이의 생고분자와의 나노조성물이 보고된 바 있다(Boccaccini AR, Erol M, Stark WJ, Mohn D, Hong Z, Mano JF. Compos Sci Technol 2010; 70: 1764-76; Hong Z, Reis R, Mano JF. J Biomed Mater Res A 2009; 88: 304-13; Brunner TJ, Grass RN, Stark WJ. Chem Commun 2006; 13: 1384-6). 또한 나노생활성유리(nBG)는 우수한 세포 및 조직과의 상용성을 가진 골 생활성 재료이며, 조직 공학에 있어서 골 세포 분화를 촉진하기 위한 적당한 무기 나노조성물로서 제안된 바 있다(Kim HW, Kim HE, Knowles JC. Adv Funct Mater 2006;16:1529-36; Kim HW, Song JH, Kim HE. J Biomed Mater Res A 2006; 79A: 698-705; Lee HH, Yu HS, Jang JH, Kim HW. Acta Biomater 2008; 4: 622-9).

그러나, 현재까지 개발된 나노생활성 유리를 포함하는 생고분자로 제조된 스캐폴드의 경우에는 그 구조에 있어서 약 1000 ㎛의 평균 직경을 가지는 상호 연결된 기공 네트워크가 불균일하게 형성되어 있으면 규칙적인 채널의 구조를 형성하고 있지 않다. 이는 그 제조시에 졸-겔 합성법에 의해서 제조된 나노생활성 유리를 포함하는 생고분자 혼합물을 촉매 용액 및 계면활성제와 혼합하여 공기중에서 가열 교반하여 일정한 형태의 폼(foam)을 형성시키고 이를 몰드 내에 부어서 가열 냉각하는 방식을 따르기 때문이다(대한민국 공개특허 제10-2010-0091945호).

이에 본 발명자는, 일정한 반복 구조를 얻기 위해서 로보캐스팅 방법을 사용하여 냉각 조건에서 연구를 수행하였고, 이에 따라서 새로운 구조의 로드(rod)의 규칙적 배열을 갖는 동시에 일정한 계층(hierarchical)의 형태를 갖는 마이크로/마크로 공동 구조를 갖는 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 이중 기공 구조의 스캐폴드를 제조할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 로보캐스팅 기술을 통하여 동결-건조 방법에 의해서 제조한 신규한 구조의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드를 제공하기 위한 것이다. 상기 다공성 로드의 평균 직경은 50 ㎛내지 500 ㎛이고, 상기 다공성 로드는 서로 연결되어 평균 직경이 50 ㎛ 내지 900 ㎛의 매크로 기공을 형성한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드에 있어서, 상기 다공성 로드의 평균 직경은 50 ㎛ 내지 500 ㎛이고, 상기 다공성 로드는 서로 연결되어 평균 직경이 50 ㎛ 내지 900 ㎛의 매크로 기공을 형성하는 이중 기공 구조의 스캐폴드를 제공한다.

본 발명에서는 스캐폴드의 잘-조절된(fine-tuned) 기하학적인 파라미터를 보존하기 위해서 로보캐스팅 방법을 사용하여 스캐폴드를 형성하며 구성성분으로서 나노생활성유리(nBG)를 첨가하여 키토산 스캐폴드를 제조한다.

본 발명의 키토산은 유기 폴리머로서 D-글루코사민(2-아미노-2-데옥시-D-글루코스)의 β-(1→ 4)중합체이다. 천연에는 접합균류의 세포벽 중에 존재하고 있는 것이 확인되어 있지만, 보통은 키틴을 진한 알칼리로 처리하여, N-디아세틸 (N-deacetyl)화하여 생산하고 있다.

본 발명의 생활성 유리는 Hench에 의해 발견되었으며, Bioglass^® 로 명명되었으며, 이는 1980년 중반부터 Perioglas^® 및 Novabone^®　상품명으로 분말 구조의 재생 골로서 임상적을 사용되었다. 생활성 유리는 체액과 접촉시 표면에서 HCA(hydroxycarbonated apatite)층이 형성되기 때문에 골에 결합된다. HCA는 조성이 골 미넬랄과 유사하며, 골과 강한 결합을 형성한다. 생활성 유리는 인체 내에서 안전하게 용해되고, 유전자 수준에서 골 세포를 자극하는 역할을 하는 임계적 농도의 실리콘 및 칼슘 이온을 방출하며, 심지어 매우 적은 활성 세포가 존재할 때 새로운 골 재생을 일으킨다.

생활성 유리가 재생 물질로써의 이용에 적합한 반면, Bioglass^®　합성물은 다공성의 지지체의 생산에 적합하지 않다. 이는 소결 공정(sintering process)을 사용해야만 하기 때문이며, 이는 국소적인 흐름을 일으키기 위해 유리를 유리 전이 온도 이상으로 가열하는 것을 요구한다. Bioglass^®　합성물은 유리 전이 온도 이상에서 즉시 결정화되며, 한번 결정화된 Bioglass^® 는 생활성을 잃는다. 생활성 유리는 용해로 유래된 것 및 졸-겔로 유래된 것의 두 가지 종류가 있다. 실리카를 기초로한 졸-겔로 유래된 생활성 유리는 스캐폴드의 제작에 첨가물질로서 사용되어 일차 골아세포가 부가적인 신호종(signalling species) 없이 광물화된 미완성의 골 조직을 성장시킨다. 특히, 졸-겔로 유래된 생활성 유리 스캐폴드는 이들의 기계적인 특성과 별개로 이상적인 스캐폴드를 위한 기준을 대부분 충족할 수 있다.

본 발명에서는 나노 크기의 생활성유리를 사용(nanobioactive glass, nBG) 하였으며, 바람직하게는 100 nm 내지 500 nm 크기의 평균 최대 직경을 가지는 입자로 구성된 생활성 유리를 사용하였다. 본 발명에서의 나노생활성유리는 졸-겔 용액의 형태로 준비한다. 또한 본 발명에서의 키토산의 분자량은 5,000 내지 50,000 분자량을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 키토산을 증류수에 용해시켜서 사용하는바, 키토산의 함량은 5 w/v% 내지 10 w/v%인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 6 w/v%를 포함한다. 본 발명의 바람직한 키토산의 비율조절은 로보캐스팅 공정으로 형태학적인 붕괴 없이 섬유 형태로 로보틱 디스펜싱(robotic dispensing)이 가능한 적당한 용액의 성질을 갖는 농도를 맞추기 위해서이다.

키토산 용액과 나노생활성유리를 혼합하여 키토산 대비 나노생활성유리의 농도는 0.1 중량이 되도록 조절한다. 더욱 바람직하게는 상기 키토산 용액과 나노생활성유리의 혼합 비율은 나노생활성유리가 복합물 내에 1 내지 50 wt% 로 포함될 수 있고, 10 내지 30 wt%로 되는 것이 바람직하다. 상기 범위를 만족하는 경우 기계적 강도 및 생활성 능력에 있어서 향상되는 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 키토산 용액과 나노생활성유리를 혼합하여 제조된 혼합물을 로보캐스팅 장치를 사용하여 평균 직경은 50 ㎛ 내지 500 ㎛인 로드(rod)를 형성하도록 디스펜싱하여 로드가 서로 연결되어 평균 직경이 50 ㎛ 내지 900 ㎛의 매크로 기공을 형성하도록 제조하였다. 상기 로드의 평균 직경은 바람직하게는 100 ㎛ 내지 300 ㎛이고, 상기 매크로 기공의 평균 직경은 100 ㎛ 내지 500 ㎛인 것이 바람직하다.

키토산 용액과 나노생활성유리의 혼합물을 로보캐스팅 장치를 사용하여 디스펜싱할 경우 흘러나온 용액은 고체화시키기 어렵고 오히려 섬유 형태를 유지하지 않고 분해가 되는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자는 흘러나온 용액의 고체화를 위해서 여러 가지 방안을 고려하던 중 로보캐스팅 장치의 바늘에서 용액이 흘러나오자마자, 어떠한 용매도 사용하지 않고 곧바로 -80 ℃ 내지 -30 ℃의 온도로 냉각 시키는 방법에 의해서 처음의 섬유 형태를 유지하면서 설계한 몰드의 구조대로 평균 직경이 50 ㎛ 내지 900 ㎛의 매크로 기공을 형성하는 로드를 형성할 수 있다는 것을 확인하였다. 더욱 바람직하게는 -50 ℃의 온도로 냉각하는 것이 바람직하다.

본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드는 키토산과 나노생활성유리의 반응에 의해서 그 구조 자체에서 다공성의 기공을 형성하게 되는바, 본 발명의 키토산 및 나노생활성 유리로 형성된 로드는 다공성의 구조를 갖게 된다.

특히 키토산 용액과 나노생활성유리의 혼합물 내에 형성되는 마이크로 기공의 형태 및 공동 크기는 냉각 온도 등의 조건에 매우 의존적이며, -50 ℃의 온도 범위를 갖는 드라이-아이스 조건은 얼음 결정의 크기를 결정하고, 따라서 5 ㎛ 내지 30 ㎛ 마이크로공동 크기가 얻어진다. 만약 냉각 온도가 더 낮아질 수 있다면, 상기 크기는 얼음 결정의 핵생성 속도를 촉진하여 더 감소될 것이다.

따라서 결과적으로, 로보캐스팅 장치를 사용하여 키토산 용액과 나노생활성유리의 혼합물을 디스펜싱하여 형성된 로드는 로드 내 마이크로 크기의 다공성 구조를 갖는 1차 기공 구조를 가지면서 로드가 서로 연결되어 매크로 크기의 기공을 형성하는 2차 기공 구조를 갖는 이중 기공 구조의 스캐폴드가 형성된다.

또한, 본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드는 로보캐스팅 장치를 사용하여 디스펜싱시 적층구조를 형성할 수 있는바, 다층 구조의 형태를 형성할 수 있고 이에 따라서 매크로 기공이 일정한 방향으로 수직으로 이어진 채널의 형태를 유지할 수 있다. 상기 적층구조는 10 층 내지 50 층의 적층구조를 가질 수 있으며, 바람직하게는 적층구조가 형성된 최종적인 구조는 약 10 mm × 10 mm × 3 mm 의 3차원(3D)구조 일 수 있다.

본 발명의 키토산은 효소에 의해서 생분해가 가능한 폴리머인바, 시간이 경과함에 따라서 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 로드 내 1차 기공의 크기가 성장하면서 생분해가 일어나게 된다.

본 발명의 신규한 구조의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드는 로보캐스팅 방법에 의해서 성공적으로 생산되었다. 드라이-아이스 동결 조건은 증착된 스캐폴드가 미리-정해져 있는 (pre-defined) 매크로 기공 배열을 보전하도록 하였다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 신규한 구조의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드는 SBF에 있어서 생체 내 무기질 형성능력이 증명되었을 뿐만 아니라, 세포 확산(spreading) 및 분화(proliferation)를 포함하는 조직 세포에 대한 반응이 매우 우수한바 바람직한 세포 기질 조건을 제공한다. 따라서 본 발명의 키토산/나노생활성유리 스캐폴드는 새로운 골 공학 재료로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드는 로드가 연결되어 형성된 매크로 크기의 기공 구조 및 로드 상에 마이크로 크기의 기공구조가 형성되어 있어서 우수한 세포 부착력을 나타내었으며, 키토산에 의한 생체 내 무기질 형성능력이 우수하며 나노생활성유리가 스캐폴드에 균일하게 넓게 분포되어 기계적 강도가 우수하고 이에 따라서 골 세포 공학 재료로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은, 키토산 및 나노생활성유리 조성 스캔폴드를 생산하기 위한 로보캐스팅 기술의 대략적인 개략도 및 생성된 스캐폴드의 광학 영상을 나타낸 것이다. 조성물 용액(10 wt % 나노생활성 유리)의 로보틱 디스펜싱 및 다층 구조는 드라이 아이스 냉각 조건을 유지하여 얻을 수 있다.
도 2는, 본 발명의 스캐폴드의 SEM 영상을 나타낸 것이다. 다양한 배율에서의 키토산/나노생활성유리의 형태(a-c) 및 키토산의 형태(d,e)를 나타낸 것이다.
도 3은, (a,b) 1일(a) 및 7일(b) 동안의 SBF-침지 후의 나노조성물 스캐폴드의 SEM 영상을 나타낸 것이고, (c) 각각의 침지 시간에 따라 측정된 샘플의 EDS 원소 분석을 나타낸 것이다.
도 4는, (a-c) 다양한 배율에서의 3일 동안의 본 발명의 스캐폴드에 대한 세포 성장의 SEM 형태를 나타낸 것이고, (d) MTS 분석에 의해서 측정된, 키토산 및 키토산/나노생활성유리 스캐폴드의 세포 분화 능력을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것을 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드의 제조.

키토산 파우더(Sigma LTD, 5,000 내지 50,000 분자량)를 증류수 (2% w/v 아세트산을 포함)에 녹여 6% w/v로 조절하였다. 이러한 농도는 형태학적인 붕괴없이 섬유 형태로 로보틱 디스펜싱(robotic dispensing)이 가능한 적당한 용액 성질을 갖는 농도이다. 무기상으로서, 나노생활성 유리(nBG)는 종래 알려진 방법에 의해서 제조하였다(Kim HW, Kim HE, Knowles JC. Adv Funct Mater 2006; 16: 1529-36).

나노생활성유리(70SiO₂·25CaO·5P₂O₅) 졸-겔 용액을 전자스핀하였고 700 ℃에서 열-처리하여, 100 nm 내지 500 nm의 지름을 갖는 나노생활성유리를 제조하였다. 상기 나노생활성유리를 증류수에 분산하였고 그 후 키토산 용액과 혼합하였다. 키토산 대비 나노생활성유리의 농도는 0.1 중량이고, 키토산 용액과 나노생활성유리의 혼합 비율은 키토산/나노생활성유리 복합물 내에 나노생활성유리가 15 wt% 로 포함되었다.

키토산/나노생활성유리 용액을 로보캐스팅 장치(Ez-ROBO3, Iwashita)를 사용하여 미리-정해져 있는(pre-defined) 3-차원(3D) 섬유 네트워크 구조에 흘러나오게(dispensed) 하였다. 상기 용액을 37 ℃에서 열 자켓 세트에 캡슐화된 주사기에 적재하고, 힘-제어 플런저(plunger)를 사용하여 바늘(330 ㎛ 지름)을 통해서 섬유 네트워크 구조에 주사하였다.

섬유 디스페싱 로드(dispensing rod)는 개인 컴퓨터와 연결되어 있는 위치 조절 유닛에 의하여 조절 되었고, 상기 속도는 5 mm/s로 고정되었다. 특히, 스캐폴드 침전은 드라이 아이스를 포함하는 -70 ℃ 내지 -80 ℃의 냉각 수조에서 수행되었고, 냉각 환경은 어떠한 용매도 사용하지 않고 만들어졌다. 용액이 바늘의 끝에서 나오자 마자, 섬유 라인의 형태로 동결되었고 미리-정해져 있는(pre-defined) 매크로채널의 구조로 층-층 구조를 형성하였다. 로보캐스팅 스캐폴드의 부피는 대략 10 mm X 10 mm X 3 mm 였다. 제조된 스캐폴드는 하룻밤 동안 50 ℃에서 동결-건조되었다. 키토산/나노생활성유리 용액의 로보틱 디스펜싱(robotic dispensing) 과정을 도 1에 개략적으로 나타내었다 (도 1).

그 결과, 드라이-아이스 냉각 수조에서 로보캐스팅 기술에 의해서 제조된 스캐폴드의 SEM 형태를 도 2에 나타내었다. 키토산/나노생활성유리 스캐폴드는 이중 기공 구조로 형성되어 있으며, 특히 형성된 다공성 로드의 평균 직경은 50 ㎛ 내지 500 ㎛이고, 상기 다공성 로드는 서로 연결되어 평균 직경은 50 ㎛ 내지 900 ㎛의 기공을 형성하는 기공 구조로 배열되었다(도 2(a)). 또한 키토산/나노생활성유리 자체에서 5 ㎛ 내지 30 ㎛ 마이크로 크기의 기공이 형성되어 마이크로/매크로 (micro/macro) 이중-공동 구조가 형성되었다(도 2(b)). 또한 표면 가까이에서의 검측을 통해서 키토산 밀집 매트릭스를 포함하는 스캐폴드 내부에 둘러싸인 나노생활성유리의 성분의 존재를 확인 하였다 (Fig. 2(c)에 활살표로 표시).

동일한 조건에서 순수한 키토산으로 로보틱-디스펜스하여 스캐폴드를 제조하였다. 순수한 키토산을 사용한 경우에도 마이크로/매크로(micro/macro) 이중-공동 구조가 형성되었다(도 2(d)(e)).

실험예 1: 본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드의 생분해 활성 평가

키토산의 스캐폴드의 형태 및 상기 실시예 1에서 제조한 이의 나노생활성유리를 포함하는 스캐폴드의 형태를 주사 전자 현미경(SEM, Hitachi, Japan)에 의해서 조사하였다. 스캐폴드의 분해를 인산 완충 식염수(PBS) 용액에서 배양하는 동안 측정하였다. 인산 완충 식염수(PBS)는 매일 새로 갈아주었고 샘플의 무게 변화를 기록하였다.

배지를 매일 새롭게 하는 동안, PBS에서의 배양에 의한 스캐폴드의 분해가 관찰되었다. 2주 후에, 스캐폴드의 두 종류에 대한 최초 무게로 부터 시험에 의해서 기록되는 무게의 변화는 약 40-50%였다.

이것은 생성된 스캐폴드가 실질적으로 생분해성이고, 재복구 과정 동안의 손상된 조직에 있어서 일시적인 스캐폴드로서 활용할 수 있다는 가능성을 제안한다.

실험예 2: 본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드의 무세포 ( acellular ) 골- 생활성의 측정

상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에서 생체 내(in vitro) 아파타이트 미네랄의 형성은 2주 동안, 배지의 교환 없이 SBF(simulated body fluid)에 샘플을 침지하여 측정하였다. 미네랄 유도는 SEM 및 분산형 현미경(EDS; Bruker)에 의해서 분석하였다.

1일에, 배양된 샘플의 SEM 영상은 스캐폴드의 표면에서 형성되는 결정섬(crystallite islands)을 나타냈다(Fig. 3(a)). 7일 동안 연장된 배양은 무기질 상이 스캐폴드의 표면을 거의 완벽하게 덮는 것을 보여주었다(Fig. 3(b)).

무기질의 EDS 분석은 침지시간에 따라서 함께 증가된 Ca 및 P 증착을 보여주었다. 그리고 Ca/P의 비율은 1.62 에서 1.67 내지 1.69 범위로 나타났고 이것은 골 무기질 하이드록시아파타이트(HA)와 유사하였다.

키토산/나노생활성유리 스캐폴드는 무세포(acellular) 조건에서 우수한 세포내 아파타이트 형성 능력을 갖고 있는 것으로 여겨진다. 나노생활성유리로부터의 이온성 방출은 양전하의 (아민기)키토산 분자에 대한 인산 이온의 유도를 도울 수 있고, 키토산 분자에 대한 감소된 무기질화 메커니즘으로서 칼슘 포스페이트 무기질 상을 형성하기 위한 칼슘 이온의 증착을 도울 수 있다 (Manjubala I, Scheler S, Bossert Jorg, Jandt KD. Acta Biomater 2006; 2: 75-84).

비록 스캐폴드의 기계적인 성질이 여기에서는 측정되지는 않았으나, 키토산 지지체에 있어서 나노-크기의 무기 조성물의 균질한 분배는 스캐폴드의 강도를 증가시키는데 상당히 기여할 것이다. 또한 기계적인 성질은 무기질화 진행시에 추가적으로 강화될 것이다(Thein-Han WW, Misra RDK. Acta Biomater 2009;5:1182?97; Kretlow JD, Mikos AG. Tissue Eng 2007; 13: 927-38). 골 조직 공학에 있어서 기계적 성질은 스캐폴드의 사용시 고려되는 중요한 파라미터이기 때문에 기계적인 성질이 향상되는 것이 매우 중요하다.

실험예 3: 본 발명의 키토산 및 나노생활성유리로 형성된 다공성 로드를 포함하는 이중 기공 구조의 스캐폴드의 세포생존 능력 평가

상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에 대한 세포 반응은 MC3T3-E1(전골모세포)를 사용하여 측정하였다. 세포는 각각의 로보캐스트 스캐폴드에 2×10⁴의 수로 배양하였고, 다른 문헌에서 기술한 방법에 의해서 골원성(osteogenic) 배지에서 배양하였다(Oh SA, Kim SH, Won JE, Kim JJ, Shin US, Kim HW. J Tissue Eng 2010; 2010: 4752-60).

세포의 고정 및 탈수 후에, 스캐폴드에 부착되고 성장한 세포의 형태를 SEM을 사용하여 측정하였다. 세포의 생존능력은 이전에 기술된 방법에 의해서 Cell Titer 96 Aqueous One Solution assay kit (Promega)를 사용하여 MTS[3-(4,5-다이메틸싸이아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움]에 의해서 측정하였다 (Boccaccini AR, Erol M, Stark WJ, Mohn D, Hong Z, Mano JF. Compos Sci Technol 2010; 70: 1764-76).

7일 간의 배양 후에, 각각의 샘플을 세척하였고 그리고 나서 MTS 시약 엘리컷 (aliquot; 100 ㎕)을 추가하였다. 3시간 동안의 배양 후에, 흡광도는 ELISA 플레이트 리더기 (Versamax)를 사용하여 490 nm에서 기록하였다.

세포를 키토산/나노생활성유리 스캐폴드에 배양하였고 3일 동안 배양된 세포의 영상을 SEM에 의해서 관찰하였다(도 4(a-c)). 본 발명의 스캐폴드에, 세포는 부착되고 넓게 퍼지는 것으로 보였다. 그리고 세포는 마이크로포러스 스캐폴드 표면에 가깝게 접착하는 것 같아 보였다. 몇몇의 세포는 공동 갭 및 편평한 뚫린 공동 채널과 가교되었다. 7일 동안 배양한 스캐폴드에 대한 세포의 증식 레벨은 두 가지 경우에 대하여 MTS 분석에 의해서 측정함으로서 비교 가능하였다(도 4(d)). 이러한 생체 내(in vitro) 세포적 반응은 본 발명의 키토산/나노생활성유리 스캐폴드는 세포에 3D 매트릭스 조건을 제공하여 세포의 고정(anchorage), 확산(spreading), 이동 (migration) 및 성장(growth)을 위해서 적합하다는 것을 증명하였다.

Claims (7)

1. 미리-정해져 있는(pre-defined) 네트워크 구조를 따라서 키토산과 나노생활성유리 혼합물이 로드(rod)를 형성하여 제조된 스캐폴드에 있어서,
   상기 네트워크 구조는 규칙적인 채널 구조의 배열을 갖는 동시에 일정한 계층의 형태를 갖는 적층 구조이며;
   상기 로드의 평균 직경은 50 ㎛ 내지 500 ㎛이며,
   상기 로드가 연결되어 형성된 50 ㎛ 내지 900 ㎛의 매크로 기공 및 로드에 형성된 5 ㎛ 내지 30 ㎛ 크기의 마이크로 기공을 포함하는 이중 기공 구조를 갖고;
   상기 키토산과 나노생활성유리의 혼합물은 -80℃ 내지 -30℃의 온도로 냉각되는 배스(bath)에서 디스펜싱되어, 섬유 형태를 유지하면서 로드의 형태로 고체화된, 스캐폴드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 스캐폴드 내에 나노생활성유리가 1 내지 50 wt%로 포함된 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 나노생활성유리는 졸-겔형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 스캐폴드는 10 층 내지 50 층의 적층구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
   

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