KR101379959B1 - 광 반사방식을 이용한 감염 씨감자의 선별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광반사방식을 이용하여 씨감자의 감염 여부를 판별하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각의 반사스펙트럼을 측정하고, 측정된 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각의 반사스펙트럼을 수학적인 전처리 기법을 적용한 후, 부분최소자승판별분석법(PLS-DA)을 이용하여 회귀분석하여 감염 여부 판별 예측모델을 확립하고, 상기 확립된 예측모델을 이용하여 씨감자의 감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 광반사방식을 이용한 씨감자의 감염 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

Description

광 반사방식을 이용한 감염 씨감자의 선별 방법{Method for discriminating disease-infected seed potato using light reflectance technique}

본 발명은 광반사방식을 이용하여 씨감자의 감염 여부를 판별하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각의 반사스펙트럼을 측정하고, 측정된 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각의 반사스펙트럼을 수학적인 전처리 기법을 적용한 후, 부분최소자승판별분석법(PLS-DA)을 이용하여 회귀분석하여 감염 여부 판별 예측모델을 확립하고, 상기 확립된 예측모델을 이용하여 씨감자의 감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 광반사방식을 이용한 씨감자의 감염 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

감자(Solanum tuberosum L.)는 벼, 밀, 옥수수와 함께 세계 4대 식량작물에 속하며, 단위면적당 생산량이 높고 환경의 영향을 적게 받아 재배하기가 용이하다. 감자재배 시 각종 병원균 감염에 의한 생산 수량 저하와 상품의 질적 저하를 막기 위해 무병 종서 씨감자를 이용한다. 최근 기술의 발전으로 수경재배를 통해 우수한 무병 씨감자를 생산하고 있으나 전체 공급량의 약 40% 정도이며 대부분이 토양에서 재배된 씨감자를 이용한다. 따라서 씨감자는 재배, 수확, 저장, 파종 과정 중 토양에서 서식하는 병원균의 침입에 쉽게 노출될 수 있다. 특히 지하부에서 뿌리나 줄기를 통해 침입하는 감염은 조기에 발견이 어렵고 재배지 토양과 전체 작물을 감염시키는 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 씨감자에 침입한 각종 곰팡이, 세균 등은 저온저장 환경에서 잠복 상태를 유지하게 되며 온도와 습도가 높아진 씨감자 파종 환경에서 번식하게 된다. 병원균에 감염된 씨감자는 상품성이 없고 식용될 수 없는 감자를 생산하므로 농가의 경제적 손실을 초래하게 된다. 현재 감염된 씨감자를 선별하는 기술은 인력에 의존하여 표면을 육안으로 선별하는 방법뿐이므로 생산성에 영향을 주지 않고 비파괴적인 방법을 이용한 내부 및 외부 감염 씨감자를 선별할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

분광분석 기술은 비파괴적인 방법으로 신속, 정확하게 농산물의 내외부 품질을 측정할 수 있는 기술 중 하나이다. 분광분석 방법에는 조사하는 광의 이용 형태에 따라 투과 및 반사 방식으로 구분하고 있으며 측정된 분광속성과 대상물의 성분, 조직 등의 변화를 분석하므로 대상물의 내외부 정보를 분석하는데 많이 이용되고 있다. 분광분석 기술로 획득한 투과 및 반사스펙트럼으로 농산물의 품질을 분석하는 방법에는 PCA(principal component analysis)와 PLS-DA(partial least square discriminant analysis) 등의 다변량 판별 분석 기법을 가장 많이 사용한다.

한국등록특허 제0934410호에는 근적외 분광분석법을 이용한 곡물 종실의 무게 측정방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 광 반사방식을 이용한 감염 씨감자의 선별 방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 광 반사방식을 이용하여 비파괴적으로 신속 용이하게 씨감자에 펙토박테리움 아트로셉티컴(Pectobacterium atrosepticum), 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacteri michiganensis subsp. sepedonicus), 버티실리움 알보아트룸(Verticillium albo - atrum) 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 감염 염부를 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 분광광도계로부터 스캐닝한 씨감자의 반사 스펙트럼을 이용하여 식물병원체의 감염 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

씨감자는 각종 병원체로부터 감염 가능성이 높아 씨감자 재배 및 파종은 정부에서 관리하고 있으며 농가에 보급 당시 감염 씨감자를 걸러내기 위해서는 노동력에 의존한 육안 선별을 실시하였으나, 내부 감염까지 선별할 수 없어 정확도가 떨어지며 시간과 노력이 크게 소요되는 문제점이 있었다. 따라서, 본 발명은 펙토박테리움 아트로셉티컴, 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스, 버티실리움 알보아트룸 및 라이족토니아 솔라니의 감염 여부를 반사 방식의 분광분석 기법을 이용하여 감염 여부를 판별함으로써, 비파괴 검사가 가능하여 빠르고 용이하게 판별할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 반사스펙트럼 측정에 사용된 분광광도계를 보여준다.
도 2는 정상 씨감자와 감염 씨감자의 저장기간에 따른 스펙트럼 변화를 나타낸 그래프이다((a): 저장 첫째날, (b): 저장 마지막날).
도 3은 감염 씨감자를 판별하기 위해 확립된 모델을 나타낸 것이다(Class Ⅰ: 정상 씨감자, Class Ⅱ: 감염 씨감자).
도 4는 도 3의 확립된 모델을 통해 예측된 검증 결과값과 오차막대를 나타낸 그래프이다((a) 펙토박테리움 아트로셉티컴 감염 씨감자, (b) 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스 감염 씨감자, (c) 버티실리움 알보아트룸 감염 씨감자, (d) 라이족토니아 솔라니 감염 씨감자).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 감염 씨감자와 비감염 씨감자를 각각 반사스펙트럼을 측정하는 단계;

(b) 상기 측정된 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각의 반사스펙트럼을 수학적인 전처리 기법을 적용한 후, 부분최소자승판별분석법(PLS-DA)을 이용하여 회귀분석하여 감염 여부 판별 예측모델을 확립하는 단계; 및

(c) 상기 확립된 예측모델을 이용하여 씨감자의 감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 광반사방식을 이용한 씨감자의 감염 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 판별 방법에서, 상기 감염은 식물병원균에 감염되는 것을 의미하며, 상기 식물병원균은 펙토박테리움 아트로셉티컴(Pectobacterium atrosepticum), 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacteri michiganensis subsp. sepedonicus), 버티실리움 알보아트룸(Verticillium albo -atrum) 및 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 펙토박테리움 아트로셉티컴 및 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스는 각각 감자무름병 및 감자둘레썩음병을 유발시키는 병원성 세균이고, 버티실리움 알보아트룸 및 라이족토니아 솔라니는 각각 반쪽시들음병 및 검은무늬썩음병을 유발하는 곰팡이 균이다.

또한, 본 발명의 판별 방법에서, 상기 (a)단계의 반사스펙트럼 측정은 분광광도계를 이용하여 측정할 수 있는데, 보다 상세하게는 상기 분광광도계는 400~1100 nm 파장대역인 반사스펙트럼을 스캐닝하여 측정하는 것으로, 다른 파장대역보다 시료의 전처리 없이 있는 그대로 측정하여 신속하고, 측정시료의 손상없이 회수하여 이용 및 기타분석에 사용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 판별 방법에서, 상기 (b)단계의 수학적인 전처리 기법은 씨감자의 펙토박테리움 아트로셉티컴(Pectobacterium atrosepticum) 또는 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacteri michiganensis subsp. sepedonicus) 감염 여부를 판별하는 경우 평균(mean)을 이용한 정규화 전처리, 씨감자의 버티실리움 알보아트룸(Verticillium albo - atrum) 감염 여부를 판별하는 경우 최대값(maximum)을 이용한 정규화 전처리 또는 씨감자의 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 감염 여부를 판별하는 경우 2차 미분 전처리를 적용하는 것을 특징으로 하며, 상기 방법으로 전처리 기법을 적용할 경우 결정계수 값은 높고 SEP 및 SEC가 낮은 좋은 예측 모델을 선정할 수 있었다.

또한, 본 발명의 판별 방법에서, 상기 (b)단계의 부분최소자승판별분석법(PLS-DA)은 부분최소자승법(PLS)과 유사한 방법이지만, PLS의 경우 스펙트럼과 종속변수(independent variables)인 실제 측정된 값과의 관계를 회귀 모델로 확립하고 예측하는 방법이고, PLS-DA의 경우 종속변수를 임의로 변수(dummy variables)로 지정하여 회귀 모델을 확립하고 예측하는 방법이다.

또한, 상기와 같은 본원 발명의 부분최소자승판별분석법(PLS-DA)으로 판별하는 통계적 처리로 인해, 스펙트럼에서 발생하는 파장의 중첩(overlapping)을 배제하여 보다 정밀한 예측이 가능하여, 최적의 예측모델을 선발할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것이 아니다.

1. 공시재료 및 균주

본 연구에서 사용된 씨감자는 강원도 감자종자진흥원으로부터 포장 재배되어 바이러스나 다른 병원체 감염이 없는 씨감자를 구입하였다. 실험실에 이송된 후 표면의 상처가 없고 씨눈이 자라지 않은 신선한 상태의 씨감자를 선별하였다. 씨감자 접종에 사용된 병원균은 토양에서 서식하는 세균 및 곰팡이로 씨감자 재배 및 저장 동안 종서에 발생하기 쉬운 병원체이다. 자연적으로 씨감자에 발생되는 세균 및 곰팡이 균은 병징의 진행 정도를 확인하기 어려우며 대부분이 여러 종의 세균 및 곰팡이가 씨감자에 서식하게 되어 병원체의 종류를 확인하기 어렵다. 따라서 단일 균을 배양하여 직접 씨감자에 접종하는 방법을 선택하였다. 접종에 이용한 세균으로는 무름병을 유발하는 펙토박테리움 아트로셉티컴(Pectobacterium atrosepticum)과 둘레썩음병을 유발하는 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacteri michiganensis subsp. sepedonicus)이며, 곰팡이로는 반쪽시들음병을 괴경에 발생시키는 버티실리움 알보아트룸(Verticillium albo-atrum)과 검은무늬썩은병을 괴경에 발생시키는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 배양한 후 정상 씨감자에 접종하였다. 표 1은 KACC(Korea Agricultural Culture Collection)에서 분양받은 균주를 나타낸 것이다. 세균 및 곰팡이 종류별로 제작된 시료 개수는 총 220개이며 펙토박테리움 아트로셉티컴에 감염시킨 씨감자 50개, 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스에 감염시킨 씨감자 50개, 라이족토니아 솔라니에 감염시킨 씨감자 50개, 버티실리움 알보아트룸에 감염시킨 씨감자 40개를 제작하였다. 비교를 위해 정상 씨감자 30개를 준비하였다.

정상 씨감자에 감염시킨 세균 및 곰팡이의 KACC 번호 및 식물병원균

	KACC No.	식물병원균
세균	10532	Pectobacterium atrosepticum
	20123	Clavibacteri michiganensis subsp. sepedonicus
곰팡이	40137	Rhizoctonia solani
	44940	Verticillium albo - atrum

2. 세균 및 곰팡이 병원균 접종 방법

선별된 씨감자는 씨눈 주변에 흙이 묻어 있어 곰팡이, 세균 등의 서식지가 되기 쉬워 세척 및 살균 과정을 수행하여 교차 오염을 방지하고자 하였다. 접종 전 살균 과정은 NaClO 200배 희석액에 20분간 침지시킨 후 멸균수로 2회 세척하였다. 그 후 무균실에서 건조시켜 시료의 표면에 존재하는 수분을 제거하고 UV 램프 하에서 2시간 동안 표면 살균하였다.

감염 씨감자의 시료제작은 소독된 칼을 이용하여 씨감자를 절반으로 절단한 다음 각각의 균을 100 ㎕씩 내부에 접종한 후 원래의 씨감자 형태로 접합하였다. 전체의 시료는 멸균된 용기에 거름종이를 깔고 수분을 유지하기 위하여 증류수를 넣어 각각의 균주별로 최적의 온도를 설정한 후 인큐베이터에 보관하였다. 각각의 시료는 저장 동안 반사스펙트럼을 3~4회 측정하였다. 세균은 빠르게 감염이 진행되어 10일 동안 3회를 측정하였고, 곰팡이의 경우 15일 동안 4회를 측정하였다.

3. 반사 스펙트럼 측정 장치

반사스펙트럼의 측정에는 도 1과 같이 스펙트로미터(S-3100, sinco, Korea)와 적분구를 이용하여 400~1100 nm 영역의 반사스펙트럼을 획득하였다. 반사스펙트럼은 1 nm의 해상도이며 실시간 8회 스캔된 평균값을 이용하였다. 반사스펙트럼의 반사율은 화이트 레퍼런스(white reference)와 다크 레퍼런스(dark reference)를 측정하였고 하기식을 이용하여 반사율로 계산하여 구하였다. 화이트 레퍼런스는 테프론 보드(teflon board)를 이용하였으며 다크 레퍼런스는 광을 완전히 차단하고 측정하였다.

R=(Ri-D)/(W-D)×100(%)

R: 계산된 상대적인 반사값

Ri: 씨감자의 반사강도 값

D: 다크 레퍼런스의 반사강도 값

W: 화이트 레퍼런스의 반사강도 값

4. 감염 씨감자 판별을 위한 예측모델 개발

획득한 스펙트럼은 시료의 불규칙한 형상과 시료 자체의 구성 성분에 따라 광 산란, 광 경로의 변화가 발생하므로 수학적인 전처리 기법을 적용하여 스펙트럼을 보정하고 안정적인 예측모델을 개발하는데 이용한다. 본 실험에서는 평균(mean), 최대값(maximum), 일정 범위값(range)의 정규화(normalization) 전처리 방법과 스펙트럼의 측정 당시 환경 변화에 기인한 스펙트럼 기준선의 이동을 보정하기 위하여 1차 미분과 2차 미분 전처리 기법을 적용하였다.

전처리 기법을 적용한 후 정상 씨감자와 감염된 씨감자를 판별하기 위하여 PLS-DA로 분석하였다. 본 연구에서는 정상 씨감자로부터 감염 씨감자를 판별하기 위하여 정상 씨감자의 종속변수를 임의의 값 “0”으로 지정하였고 감염된 씨감자의 종속변수는 “1”의 값으로 지정하였다. 개발된 예측 모델로 정상과 감염 씨감자의 판별 정확도를 나타낼 수 있게 된다. 데이터는 60%:40% 비율로 training set과 testing set으로 나눈 후 training set에 의해 모델을 개발한 후 testing set에 적용하여 정확도를 판정하였다. PLS-DA는 다변량 분석 소프트웨어(unscrambler v9.7, Camo Co., Norway)를 이용하였다.

PLS-DA는 일반적으로 상관계수(coefficient of correlation; r), 결정계수(coefficient of determination; R²), SEC(standard error of calibration), SEP(standard error of prediction), bias 등을 고려하여 예측모델의 성능을 평가하게 된다. 본 연구에서는 우수한 예측모델을 결정하기 위하여 결정계수가 높고 SEC, SEP가 낮은 모델을 선정하였다.

실시예 1: 정상 씨감자와 감염 씨감자의 반사스펙트럼 비교

획득한 반사스펙트럼은 처음과 끝부분의 노이즈와 관련된 부분을 제외하고 500~1000 nm를 분석에 이용하였다. 정상 및 감염 씨감자의 반사스펙트럼은 주성분 분석(principal component analysis; PCA)을 이용하여 이상점(outlier)을 제거한 후 나머지를 분석하였다. 도 2는 정상 및 감염 씨감자의 저장기간에 따른 스펙트럼의 변화를 분석하기 위하여 측정 1일차와 세균의 경우 10일차 반사스펙트럼의 평균값이며, 곰팡이 균의 경우 15일차의 반사스펙트럼을 평균하여 나타내었다. 측정된 반사스펙트럼에는 클로로필의 영역으로 알려진 680 nm 영역의 흡수가 확인되었으며 960 nm 수분 흡수 영역이 관찰되었다. 특히 버티실리움 알보아트룸(Verticillium albo-atrum)을 접종한 감염 씨감자를 제외한 저장 기간의 경과에 따라 스펙트럼의 변화가 관찰되는데 클로로필의 영역이 약해지면서 기울기가 가파른 형태의 반사스펙트럼이 확인되었다. 이러한 변화는 감염 부위를 중심으로 갈변 현상과 함몰 현상의 영향으로 스펙트럼의 흡수율이 변했기 때문이라 판단되었다.

실시예 2: 부분최소 자승 판별법을 이용한 예측모델 개발

도 3은 감염 씨감자를 판별하기 위해 개발된 모델의 결과 중 하나이다. Class I은 정상 씨감자의 모델 개발의 결과이며 Class II는 펙토박테리움 아트로셉티컴에 감염시킨 씨감자의 결과이다. Class I과 Class II의 판별 기준은 0과 1 사이의 0.5를 기준으로 0.5보다 낮으면 정상 씨감자 그룹인 Class I에 속하는 것으로 판단하였고 0.5보다 높으면 감염 씨감자인 Class II의 그룹으로 판단하였다. 본 실험에서 개발된 모델의 분석결과에서는 예측 값이 0.5로 어느 그룹에도 속하지 않는 결과를 나타내는 uncertain value는 없었으며 정상 씨감자를 감염 씨감자 그룹으로 판별하는 false positive와 감염 씨감자를 정상 씨감자로 판별하는 false negative는 나타나지 않았다.

표 2~5는 정상 씨감자와 감염 씨감자의 반사스펙트럼을 이용하여 PLS-DA를 적용한 결과이다. 각각의 표에는 전처리 별로 개발된 모델의 결정계수와 SEC를 나타내었으며, 모델의 검증 결과의 결정계수와 SEP를 나타내었다. 또한 각각의 정상과 감염 씨감자의 판별 정확도를 나타내었다. 표 2는 정상 씨감자와 펙토박테리움 아트로셉티컴에 감염된 씨감자를 분석한 결과이며, 표 3은 정상 씨감자와 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스에 감염된 씨감자를 분석한 결과이다. 표 4는 정상 씨감자와 라이족토니아 솔라니에 감염된 씨감자를 분석한 결과이며, 표 5는 정상 씨감자와 버티실리움 알보아트룸에 감염된 씨감자를 분석한 결과이다.

표 2의 펙토박테리움 아트로셉티컴에 감염된 씨감자를 판별하는 결과에서는 평균을 이용한 정규화 전처리에서 가장 좋은 예측 결과를 확인할 수 있었으며 이때의 결정계수는 0.919이고 SEP는 0.141이었다, 표 3의 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스에 감염된 씨감자를 판별하는 PLS-DA의 결과에서도 가장 우수한 예측 결과는 평균을 이용한 정규화 전처리에서 확인되었으며, 0.922의 결정계수와 0.138의 SEP가 확인되었다. 표 4의 라이족토니아 솔라니에 감염된 씨감자를 판별하는 PLS-DA의 결과는 2차 미분의 전처리에서 검증 결과가 가장 우수하였으며 이때의 결정계수는 0.867이고, 0.173의 SEP가 확인되었다. 표 5의 버티실리움 알보아트룸에 감염된 씨감자를 판별하는 결과에서는 최대값을 이용한 정규화에서 가장 좋은 검증 결과가 확인되었고 결정계수는 0.888이고, SEP는 0.167이었다. 예측 결과의 결정계수로 볼 때 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스에 감염된 씨감자의 판별 성능이 가장 우수하였다.

이는 정규화를 이용한 전처리는 형상의 차이에 의해 발생되는 스펙트럼의 변이를 최소화하고 각각의 그룹들 간의 스펙트럼의 특징을 구분하는데 효과적으로 작용하였기 때문으로 판단되었다. 또한 실험에서 병징의 현상이 빠르게 진행되고 정상 씨감자와 감염 씨감자의 구별이 뚜렷한 세균을 접종한 감염 씨감자의 판별 성능이 우수한 것으로 판단할 수 있었다.

각각의 검증 결과에서 우수한 검증 결과를 도 4의 그래프에 나타내었다. 그래프에는 예측된 결과값과 함께 오차막대를 표시하였다. 표시된 오차 막대에서 정상 씨감자를 감염 씨감자로 판단하는 false positive가 나타나서 원형으로 표시하였다. 따라서 표 2 내지 5에 나타낸 검증된 결과의 판별 정확도에는 버티실리움 알보아트룸을 접종한 씨감자의 97.6%를 제외하고 100%이었으며, 이는 오차를 제외한 결과 값이었다. 오차를 포함한 판별 정확도의 경우 1~3개 정도의 false positive와 false negative가 나타났으므로 감염 씨감자의 판별 정확도는 모두 90% 이상이었다.

Claims (5)

1. (a) 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각을 분광광도계로 400~1100 nm 파장대역인 반사스펙트럼을 스캐닝하여 측정하는 단계;
   (b) 상기 측정된 감염 씨감자와 비감염 씨감자 각각의 반사스펙트럼을 수학적인 전처리 기법을 적용한 후, 부분최소자승판별분석법(PLS-DA)을 이용하여 회귀분석하여 감염 여부 판별 예측모델을 확립하는 단계로서, 상기 수학적인 전처리 기법은 씨감자의 펙토박테리움 아트로셉티컴(Pectobacterium atrosepticum) 또는 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacteri michiganensis subsp. sepedonicus) 감염 여부를 판별하는 경우 평균(mean)을 이용한 정규화 전처리, 버티실리움 알보아트룸(Verticillium albo-atrum) 감염 여부를 판별하는 경우 최대값(maximum)을 이용한 정규화 전처리 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 감염 여부를 판별하는 경우 2차 미분 전처리를 적용하며; 및
   (c) 상기 확립된 예측모델을 이용하여 씨감자의 감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 광반사방식을 이용한 씨감자의 감염 여부를 판별하는 방법.
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