KR101374478B1 - Composition and kit for preparing a cell block, and method for preparing cell blocks using the same - Google Patents

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KR101374478B1 KR1020120005649A KR20120005649A KR101374478B1 KR 101374478 B1 KR101374478 B1 KR 101374478B1 KR 1020120005649 A KR1020120005649 A KR 1020120005649A KR 20120005649 A KR20120005649 A KR 20120005649A KR 101374478 B1 KR101374478 B1 KR 101374478B1
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Abstract

본 발명은 관찰 대상인 세포를 다수개 포함하는 세포 블록 제조용 조성물, 이를 포함하는 세포 블록 제조용 키트, 및 이를 이용하여 세포 블록을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 세포 블록 제조시 세포 변형을 최소화할 수 있으며 여러 층으로 적층된 세포를 원하는 방향으로 이식하고 절단하여 다양한 방향에서 세포를 관찰할 수 있게 제조된 세포 블록 제조용 조성물을 제공할 수 있다.The present invention provides a composition for producing a cell block comprising a plurality of cells to be observed, a kit for producing a cell block comprising the same, and a method for producing a cell block using the same. According to the present invention, it is possible to provide a composition for preparing a cell block, which can minimize cell deformation during cell block production, and is capable of observing cells in various directions by transplanting and cutting cells stacked in multiple layers in a desired direction. .

Description

세포 블록 제조용 조성물, 키트, 및 이들을 이용한 세포 블록 제조 방법 {Composition and kit for preparing a cell block, and method for preparing cell blocks using the same}Compositions, kits for preparing cell blocks, and methods for preparing cell blocks using them {Composition and kit for preparing a cell block, and method for preparing cell blocks using the same}

본 발명은 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 블록 제조에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포주 또는 세포 현탁액으로부터 세포 블록을 제조하기 위한 세포 블록 제조용 조성물과 이를 포함하는 키트, 및 이들을 이용한 세포 블록 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to cell block preparation comprising one or more cells. More specifically, the present invention relates to a composition for preparing a cell block for producing a cell block from a cell line or cell suspension, a kit comprising the same, and a method for producing a cell block using the same.

병리 업무 중 가장 기본적인 작업이 생검 또는 수술로 채취한 세포, 조직, 장기 등의 변화를 광학현미경 등에 의하여 판독함으로써 질병을 진단함과 동시에 질병의 병인, 역학, 경과 등을 규명하는 것이다. 세포 판독 시 일반적으로 조직 검사 등을 통하여 얻어진 세포들을 배양시켜 세포를 증식시킨 다음 증식된 세포들의 외형 변화 등을 관찰한다. The most basic task of the pathology task is to read the changes of cells, tissues, organs, etc. collected by biopsy or surgery by optical microscope to diagnose the disease and to identify the etiology, epidemiology and course of the disease. During cell readout, cells obtained through histological examination or the like are generally cultured to observe the change in appearance of the proliferated cells.

배양 접시에서 세포를 배양한 경우, 배양 접시 바닥에 붙어있는 세포를 탈착시키기 위하여 일반적으로 트립신/인산염 완충 용액(PBS)을 처리하며, 이와 같은 트립신 처리로 인하여 세포표면 물질이 분해되어 세포가 배양 접시에서 탈착된다. 그러나, 트립신과 같은 시약은 독성이 있어 세포 변성과 사멸을 일으킬 수 있다. 탈착된 세포들을 관찰하기 위한 세포 블록 제조 방법으로는, 원심분리를 통하여 탈착된 세포들을 모아 포르말린 용액으로 고정시킨 후, 고정시킨 세포들을 모아 1% 아가로오즈가 용해된 1xPBS를 이용하여 겔 상태의 세포 블록을 제조하는 방법이 널리 알려져 있다(http://www.ihcworld.com/_protocols/histology/cell_block.htm 참조). 이때 아가로오즈를 용해시키기 위하여 아가로오즈를 포함한 1xPBS를 끓인 후 세포의 변성을 막기 위해 충분히 식혀 굳기 전 세포와 혼합하여 세포 블록을 얻게 된다. 세포와 혼합되는 아가로오즈가 용해된 1xPBS 용액의 온도에 따라 고정시킨 세포들의 온도가 높아질 수 있고, 이후 냉각 시 온도가 낮아짐에 따라 세포의 이완 수축이 일어나면서 세포 외형의 변형이 일어날 수 있다. 즉, 기존의 세포 블록 제조용 1% 아가로오즈가 용해된 1xPBS 용액은 세포 내 수분 용출을 방지하기 위한 삼투압 조절은 가능하지만, 온도 변화에 따른 세포 변형을 일으킬 수 있어 세포 블록을 절단하여 관찰할 때 원하는 샘플 형태를 얻기 어려운 경우가 많았다. 또한, 이 경우 세포 블록에는 세포가 랜덤하게 분포되어 있어, 원하는 세포 형태로 절단하기가 어려운 점도 있었다. In the case of culturing cells in a culture dish, trypsin / phosphate buffer solution (PBS) is generally treated to desorb the cells attached to the bottom of the culture dish. This trypsin treatment causes the cell surface material to be degraded so that the cells are cultured. Desorption from However, reagents such as trypsin are toxic and can cause cell degeneration and death. As a cell block manufacturing method for observing detached cells, the desorbed cells are collected by centrifugation, fixed in formalin solution, and the fixed cells are collected and gelated using 1xPBS in which 1% agarose is dissolved. Methods of making cell blocks are well known (see http://www.ihcworld.com/_protocols/histology/cell_block.htm). At this time, in order to dissolve agarose, 1xPBS containing agarose is boiled and then cooled enough to prevent cell denaturation and mixed with cells before solidification to obtain a cell block. The temperature of the cells fixed according to the temperature of the 1xPBS solution in which the agarose is mixed with the cells may be increased, and then, as the temperature is lowered during cooling, relaxation of the cells may occur and deformation of the cell appearance may occur. That is, the 1xPBS solution in which 1% agarose is dissolved in the conventional cell block can control the osmotic pressure to prevent elution of water in the cell, but it may cause cell deformation due to temperature change, and thus, when cutting and observing the cell block. Often the desired sample form was difficult to obtain. In this case, cells were also randomly distributed in the cell block, which made it difficult to cut into desired cell forms.

이에, 본 발명자는 세포 변형을 최소화하면서 세포들을 원하는 형태로 적층하여, 세포 관찰이 용이한 세포 블록 제조 방법을 개발하고자 하였다.
Accordingly, the present inventors have attempted to develop a cell block manufacturing method for cell observation by stacking cells in a desired form while minimizing cell deformation.

본 발명은 조직 검사 등 병리학적 과정에서 활용될 수 있는 세포 블록 제조용 조성물 및 이를 이용한 세포 블록 제조 방법을 제공하고자 한다. The present invention is to provide a composition for producing a cell block that can be utilized in pathological processes such as histology and a method for producing a cell block using the same.

본 발명은 조직 검사 등으로 얻어진 세포를 관찰하고자 할 경우, 세포 생존율을 높이고 세포 변형을 최소화할 수 있는 세포 블록 제조용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하고자 한다. The present invention, if you want to observe the cells obtained by histological examination, etc., to provide a composition for producing a cell block and a kit comprising the same can increase the cell viability and minimize cell transformation.

본 발명은 원하는 각도에서 세포를 관찰할 수 있도록 절단이 가능하도록, 원하는 방향으로 적층된 세포를 포함하는 세포 블록을 제조하는 방법을 제공하고자 한다. The present invention is to provide a method for producing a cell block comprising cells stacked in a desired direction, such that the cutting is possible to observe the cells at a desired angle.

본 발명의 한 면은 다양한 목적으로 세포를 관찰하기 위한 세포 블록 제조용 조성물에 관한 것으로, 0.5 내지 2중량% 아가로오즈(agarose), 5 내지 20중량%의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물, 및 잔량의 물 및/또는 인산염 완충액(Phosphate Buffer Solution: PBS)을 포함하는 세포 블록 제조용 조성물을 제공한다. One aspect of the present invention relates to a composition for preparing a cell block for observing cells for various purposes, 0.5 to 2% by weight agarose, 5 to 20% by weight sugars, sodium chloride (NaCl) or a mixture thereof, And a residual amount of water and / or phosphate buffer solution (PBS).

본 발명의 다른 한 면은 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물, 세포 채취 수단, 세포 블록 제조용 틀, 및 임의로 사용 지침서를 포함하는 세포 블록 제조용 키트에 관한 것이다. Another aspect of the invention relates to a cell block preparation kit comprising a composition for cell block preparation according to the invention, a cell harvesting means, a cell block preparation frame, and optionally instructions for use.

본 발명의 또 다른 한 면은 상기한 세포 블록 제조용 조성물 또는 세포 블록 제조용 키트를 사용하여 세포주 또는 세포 현탁액으로부터 세포를 포함하는 세포 블록을 제조하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the invention relates to a method for producing a cell block comprising cells from a cell line or cell suspension using the cell block preparation composition or cell block preparation kit described above.

본 발명의 구현예에 따르면, 세포 블록 내에 세포를 원하는 방향으로 적층시킬 수 있고, 세포 변형을 최소화하여 세포 형태가 유지된 세포를 포함하는 세포 블록을 제조할 수 있으므로, 원하는 방향으로 세포 블록을 절단하여 세포 절편을 관찰할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, cells can be stacked in a cell block in a desired direction, and a cell block including cells in which cell morphology is maintained can be prepared by minimizing cell deformation, thereby cutting the cell block in a desired direction. Cell sections can be observed.

도 1은 본 발명의 구현 원리의 이해를 돕기 위한 도면으로서, 낮은 온도일 때(

Figure 112012004673467-pat00001
)와 상대적으로 높은 온도일 때(
Figure 112012004673467-pat00002
)의 수분 활성도 및 수분 함유량의 관계를 나타낸 그래프이다. 도 1에서 가로축은 수분 활성도를, 세로축은 물체 중의 수분 함유량(수분 수용량)을 나타내며, (b)는 (a)에서 상대적으로 낮은 수분 활성도 부분을 확대하여 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 블록에서 온도의 변화 및 시간의 경과에 따른 수분 활성도 변화로 인하여 당류 또는 염화나트륨이 세포 주변에 얇은 막을 형성함으로써 결정화 구조가 얻어진 상태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 세포 블록의 모형도로서, 세포 블록이 냉각됨에 따라 도 2에 도시된 바와 같이 세포 주변에 당류나 염화나트륨의 결정성 막이 형성되면서 세포 블록 조성물 내의 아가로오즈에 의하여 경화되어, 세포 내 수분 등의 손실 없이 세포가 원형 그대로 유지되어 포함되어 있는 세포 블록의 형성 과정을 개략적으로 도시한 도면 및 세포 블록 완성 후의 세포 부분 확대도이다.
도 4는 기존의 세포 블록 제조용 용액(1% 아가로오즈가 용해된 1xPBS 용액)을 사용하여 제조된 세포 블록의 모형도로서, 온도 변화에 따라 세포의 변형이 일어난 상태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 포함하는 용기의 일 예를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명에 따라 세포 채취 수단을 사용하는 방법의 일 예를 도시한 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 틀의 일 예를 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 세포 블록 제조용 틀에서 성형된 세포 블록을 분리해내는 과정을 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 배양 접시에서 배양된 세포를 채취하여 세포 블록을 제조하는 방법의 일 예를 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명에 따라 얻어진 세포 블록을 절단하여 세포를 관찰하는 방법을 예시적으로 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 한 구현예에 따라 세포 현탁액(계대 배양 세포)으로부터 세포를 분리하여 세포 블록을 제조하는 방법의 일 예의 도시한 도면이다. 1 is a view to help understand the implementation principle of the present invention, when the low temperature (
Figure 112012004673467-pat00001
) And relatively high temperatures (
Figure 112012004673467-pat00002
) Is a graph showing the relationship between water activity and water content. In Figure 1, the horizontal axis represents water activity, the vertical axis represents water content (water content) in the object, and (b) is a graph showing an enlarged portion of relatively low water activity in (a).
FIG. 2 is a view schematically showing a state in which a crystallized structure is obtained by forming a thin film around a cell due to a change in temperature and a change in water activity over time in a cell block according to the present invention.
FIG. 3 is a schematic diagram of a cell block according to the present invention. As the cell block is cooled, it is cured by agarose in the cell block composition while forming a crystalline membrane of saccharide or sodium chloride around the cell as shown in FIG. It is a schematic diagram illustrating the process of forming a cell block in which cells are kept intact without loss of intracellular moisture and the like, and an enlarged view of a cell part after completion of the cell block.
FIG. 4 is a schematic diagram of a cell block prepared using a conventional cell block preparation solution (1 × PBS solution in which 1% agarose is dissolved), and schematically illustrates a state in which cell deformation occurs according to temperature change.
5 is a view schematically showing an example of a container including a composition for producing a cell block according to the present invention.
6 is a view showing an example of a method using a cell harvesting means according to the present invention.
7 is a view showing an example of a cell block manufacturing frame according to the present invention.
8 is a view showing a process of separating the molded cell block in the cell block manufacturing frame according to an embodiment of the present invention.
9 is a view showing an example of a method for producing a cell block by collecting the cultured cells in a culture dish according to an embodiment of the present invention.
10 is a diagram illustrating a method of observing cells by cutting a cell block obtained according to the present invention.
11 is a diagram illustrating an example of a method of preparing a cell block by isolating cells from a cell suspension (passage cultured cells) in accordance with one embodiment of the present invention.

본 발명의 제1면은 0.5 내지 2중량% 아가로오즈(agarose), 5 내지 20중량%의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물, 및 잔량의 물 및/또는 인산염 완충액(Phosphate Buffer Solution: PBS)을 포함하는 세포 블록 제조용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물로부터 세포 블록 제조용 겔을 제조하는 방법은 당업계에 공지된 기술을 기초로 통상의 기술자에 의하여 용이하게 실시될 수 있다. 예를 들면, 물, 1xPBS, 또는 이들의 혼합 용매에 소정 함량의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물과 아가로오즈를 넣고, 당류 등과 아가로오즈가 충분히 용해될 수 있을 정도의 온도 하에서 이들이 충분히 용해될 수 있는 시간 동안 가열한 다음 적절한 온도, 예를 들면 30 내지 38℃의 온도로 식혀서 사용하는 것이다. The first aspect of the present invention is a 0.5 to 2% by weight agarose, 5 to 20% by weight sugar, sodium chloride (NaCl) or a mixture thereof, and the balance of water and / or phosphate buffer solution (PBS) It provides a composition for producing a cell block comprising a). The method for preparing a cell block preparation gel from the cell block preparation composition according to the present invention can be easily carried out by a person skilled in the art based on techniques known in the art. For example, a predetermined amount of sugar, sodium chloride (NaCl) or a mixture thereof and agarose may be added to water, 1 × PBS, or a mixed solvent thereof, and they may be sufficiently dissolved at a temperature such that sugars and agarose can be sufficiently dissolved. It is heated for a time that can be dissolved and then cooled to an appropriate temperature, for example, 30 to 38 ° C.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기한 바와 같이 얻어진 아가로오즈와 당류가 완전히 용해되어 있는 세포 블록 제조용 조성물을 배양 접시 상에서 배양된 세포주 상에 적가하여 세포주 표면에 도포한 다음 하나 이상의 세포주를 분리하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 상기와 같이 배양된 세포주 상에 도포하면 트립신과 같은 시약의 처리 없이도 세포를 배양 접시로부터 쉽게 분리할 수 있어 시약에 의한 세포 변성과 사멸을 최소화할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition for preparing a cell block in which agarose and saccharides are completely dissolved is added dropwise onto a cell line cultured on a culture dish, and then applied to the cell line surface, and then one or more cell lines are separated. Can be used to When the composition for cell block preparation according to the present invention is applied onto the cultured cell line as described above, cells can be easily separated from the culture dish without treatment of reagents such as trypsin, thereby minimizing cell denaturation and death by the reagents.

본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물은 또한 상기한 바와 같이 분리된 세포주를 이식하기 위한 세포 블록 제조용 겔 성형체를 제조하는 데 사용될 수 있다.The composition for cell block preparation according to the present invention can also be used to prepare a gel block for cell block preparation for transplanting isolated cell lines as described above.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기한 바와 같이 얻어진 아가로오즈와 당류가 완전히 용해되어 있는 세포 블록 제조용 조성물을 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 현탁액과 혼합한 다음 겔 상태의 세포 블록을 제조하는데 사용할 수 있다. According to another embodiment of the present invention, a cell block preparation composition in which agarose and saccharides are completely dissolved is mixed with a cell suspension containing one or more cells, and then used to prepare a cell block in a gel state. Can be.

본 발명에서 “세포”란 원핵 세포, 진핵 세포 구분없이 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포를 모두 포함하는 것으로 해석된다. In the present invention, the "cell" is interpreted to include all animal cells, plant cells, and microbial cells without distinguishing between prokaryotic and eukaryotic cells.

본 명세서에서 “당류”라는 용어는 세포주 또는 세포 현탁액에 처리 시 세포 주변에 얇은 막을 형성하여 세포의 변형을 방지할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 포도당, 과당과 같은 단당류, 자당(설탕), 맥아당, 유당과 같은 이당류, 셀룰로오스, 전분, 글리코겐과 같은 다당류를 들 수 있다. 보다 구체적인 당류의 예로는 포도당, 과당, 자당, 맥아당, 유당과 같은 단당류와 이당류이며, 시판되는 정제 설탕 등을 사용할 수 있다.As used herein, the term "saccharides" is not particularly limited as long as it can form a thin film around the cells when treated in a cell line or cell suspension to prevent cell deformation, for example, monosaccharides such as glucose, fructose, sucrose (sugar) ), Maltose, disaccharides such as lactose, polysaccharides such as cellulose, starch and glycogen. More specific examples of the sugars include monosaccharides such as glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose and disaccharides, and commercially available refined sugar.

본 발명에서 염화나트륨은 시약용 또는 제약용 염화나트륨이나 시판되는 식용 소금을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하기는 정제 소금을 사용하는 것이다.In the present invention, sodium chloride may be used for both reagent or pharmaceutical sodium chloride or commercial edible salt, preferably using purified salt.

본 발명에서 아가로오즈 등의 성분을 용해시키기 위하여 사용되는 용매는 물, 1xPBS, 또는 이들이 임의의 비율로 혼합된 혼합 용매이다. 이들 용매 중 바람직하기는 물, 보다 바람직하기는 증류수, 가장 바람직하기는 3차 증류수인 것이다. In the present invention, the solvent used to dissolve the components such as agarose is water, 1xPBS, or a mixed solvent in which they are mixed in any ratio. Among these solvents, water, more preferably distilled water, and most preferably tertiary distilled water.

본 발명의 제2면은 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 이용하여 세포 블록을 제조하는 방법에 관한 것이다. The second aspect of the present invention relates to a method for producing a cell block using the composition for producing a cell block according to the present invention.

일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 세포 블록 제조 방법은 (a) 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 배양된 세포 상에 도포하는 단계, (b) 상기 조성물이 도포된 하나 이상의 세포를 세포 채취 수단을 이용하여 1회 이상 채취하는 단계, 및 (c) 상기 세포 블록 제조용 조성물을 성형하여 얻어진 세포 블록용 겔 내부에 채취된 세포들을 주입하는 단계를 포함한다. According to one embodiment, the method for producing a cell block according to the present invention comprises the steps of: (a) applying a composition for producing a cell block according to the present invention on cultured cells, (b) collecting a cell with one or more cells to which the composition is applied. Collecting at least one time by means, and (c) injecting the collected cells into the cell block gel obtained by molding the cell block manufacturing composition.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 세포 블록 제조 방법은, 물 및/또는 1xPBS 용매 중에 실질적으로 완전히 용해되어 있는 0.5 내지 2중량% 아가로오즈(agarose)와 5 내지 20중량%의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물을 포함하는 세포 블록 제조용 조성물을 제공하는 단계, 30 내지 38℃의 상기 조성물을 배양된 세포 상에 도포하는 단계, 세포 채취 수단(예: 피스톤 등)을 이용하여 하나 이상의 세포를 1회 이상 채취하는 단계, 물 및/또는 1xPBS 용매 중에 실질적으로 완전히 용해되어 있는 0.5 내지 2중량% 아가로오즈(agarose)와 5 내지 20중량%의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물을 포함하는 세포 블록 제조용 조성물로부터 성형된 세포 블록용 겔 내부에 채취된 세포들을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 과정에 따른 세포 블록 제조 방법은 아래의 제조예 1을 기초로 쉽게 이해될 수 있다(도 7 참조). More specifically, the cell block preparation method according to the present invention comprises 0.5 to 2% by weight of agarose and 5 to 20% by weight of saccharides, sodium chloride (NaCl) substantially completely dissolved in water and / or 1xPBS solvent. ) Or providing a composition for producing a cell block comprising a mixture thereof, applying the composition at 30 to 38 ℃ on the cultured cells, one or more cells using a cell harvesting means (e.g., a piston, etc.) Harvesting more than once, cells comprising from 0.5 to 2% by weight agarose and 5 to 20% by weight of saccharides, sodium chloride (NaCl) or mixtures thereof substantially completely dissolved in water and / or 1xPBS solvent It may include the step of injecting the cells collected in the cell block gel molded from the composition for block production. The cell block manufacturing method according to this process can be easily understood based on Preparation Example 1 below (see FIG. 7).

본 발명에 따르면, 하나 이상의 세포들이 하나 이상의 층으로 적층되어 세포 채취 수단 내에 수집되며, 겔 상태로 성형된 세포 블록 내부에 주입된 다음 냉각되어 적층된 세포와 겔 상태의 블록이 일체화된 세포 블록을 얻을 수 있다. 세포 주입 시 겔 상태의 블록은 세포 주입이 용이하도록 완전히 경화되기 전의 겔 상태인 것이 바람직하며, 보다 바람직하기는 세포 블록 조성물의 온도가 50℃ 이하, 가장 바람직하기는 30 내지 38℃의 온도일 때 세포를 주입하는 것이다. 세포 블록 제조 후 경화 및 보관은 30℃ 미만의 온도에서 이루어진다. 세포 블록의 장기간 보관을 위해서는 4℃ 이하의 낮은 온도에서 밀폐하여 보관하는 것이 바람직하다.According to the present invention, a cell block in which one or more cells are stacked in one or more layers and collected in a cell harvesting means, injected into a cell block molded in a gel state, and then cooled and laminated with the cell block in which the gel block is integrated You can get it. The gel block at the time of cell injection is preferably in the gel state before being completely cured to facilitate cell injection, and more preferably, when the temperature of the cell block composition is at most 50 ° C, most preferably at 30 to 38 ° C. Inject the cells. Curing and storage after cell block production takes place at temperatures below 30 ° C. For long term storage of cell blocks, it is desirable to store them at a low temperature of 4 ° C. or lower.

본 발명의 또 다른 면은, 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 집단(cell population)에 0.5 내지 2중량% 아가로오즈와 5 내지 20중량%의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물이 실질적으로 완전히 용해되어 있는 물 및/또는 PBS 용액을 포함하는 세포 블록 제조용 조성물을 혼합한 다음 경화시키는 단계를 포함하는 세포 블록 제조 방법을 제공한다. 세포 집단에 혼합될 때 상기 세포 블록 제조용 조성물의 온도는 30 내지 38℃인 것이 바람직하다. 이러한 과정에 따른 세포 블록 제조 방법은 아래의 제조예 2를 기초로 쉽게 이해될 수 있다(도 8 참조). Another aspect of the invention is a substantially complete dissolution of 0.5-2% by weight agarose and 5-20% by weight of saccharides, sodium chloride (NaCl) or mixtures thereof in a cell population comprising one or more cells. It provides a method for producing a cell block comprising the step of mixing and then curing the composition for producing a cell block comprising a water and / or PBS solution. When mixed with the cell population, the temperature of the cell block preparation composition is preferably 30 to 38 ℃. The cell block manufacturing method according to this process can be easily understood based on Preparation Example 2 below (see FIG. 8).

본 명세서에서 세포 집단이란 하나 이상의 세포가 포함된 세포군을 지칭하는 것으로 해석된다. 세포 집단의 예를 들면, 접시 등에서 배양되기 어려운 세포를 세포 현탁액(계대 배양 세포)으로부터 원심분리 등에 의하여 수집한 세포 집단을 지칭한다. As used herein, a cell population is interpreted to refer to a cell population containing one or more cells. For example, a cell population obtained by centrifugation or the like of cells which are difficult to be cultured in a dish or the like from a cell suspension (passage cultured cells) is referred to.

본 발명에 따르면, 배양 접시 등에서 배양된 후 접시의 바닥에 붙어있는 세포를 별도의 탈착 과정 없이 고정화하여 세포 블록을 제작할 수 있으며, 접시 등에서 배양되기 어려운 세포의 경우 세포 현탁액(계대 배양 세포)으로부터 원심분리 등에 의하여 세포만을 수집한 다음 고정화하여 세포 블록을 제작할 수 있다. 이때 세포 탈착 처리에 쓰이는 트립신과 같은 시약의 사용 또는 원심분리 등의 세포분리 과정을 최소화할 수 있어, 세포의 변성과 손상을 줄일 수 있다. According to the present invention, after culturing in a culture dish, the cells attached to the bottom of the dish can be immobilized without a separate desorption process to produce a cell block, and in the case of cells difficult to be cultured in a dish, centrifugation from a cell suspension (passage cultured cells) Only cells may be collected by immobilization and then immobilized to produce cell blocks. At this time, it is possible to minimize the cell separation process such as the use of reagents such as trypsin used for cell desorption or centrifugation, thereby reducing cell denaturation and damage.

또한, 본 발명에 따르면, 일정한 방향으로 세포층을 적층하여, 세포 블록을 제작할 수 있어 세포 블록 내에 세포를 원하는 방향으로 고정시킬 수 있으므로 원하는 방향으로 세포 블록을 절단하여 세포 절편을 관찰할 수 있다.In addition, according to the present invention, by stacking the cell layer in a predetermined direction, it is possible to produce a cell block to fix the cells in the desired direction in the cell block, so that the cell fragments can be observed by cutting the cell block in the desired direction.

본 발명의 일 구현예에서는, 이식되는 세포가 보다 명확하게 확인될 수 있도록 필요에 따라 세포 주입용 겔 상태의 블록은 착색될 수 있다. 세포 주입용 겔 블록의 착색은 블록이 경화되기 전 당류나 염화나트륨 또는 아가로오즈와 화학 반응하지 않는 임의의 색상 잉크를 적가하는 등의 방법으로 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the block in the gel state for cell injection may be colored as necessary so that the cells to be transplanted can be more clearly identified. The coloring of the gel block for cell injection can be easily carried out by those skilled in the art by dropping any color ink that does not chemically react with sugars, sodium chloride or agarose before the block is cured.

본 발명에 따른 세포 블록 제조시 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 미리 고정화하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 배양 접시 상의 세포 또는 세포 현탁액에서 수집된 세포를 4% 포르말린 또는 알코올로 고정하고, 1xPBS(인산염 완충액)으로 포르말린 또는 알코올을 제거한 다음, 세포가 마르지 않도록 주의하면서 1xPBS를 제거해낸 세포를 사용한다. In preparing the cell block according to the present invention, the cells may be used by immobilization in advance according to methods known in the art. For example, cells collected from a cell or cell suspension on a culture dish are fixed with 4% formalin or alcohol, deformed formalin or alcohol with 1 × PBS (phosphate buffer), and cells removed with 1 × PBS removed, taking care not to dry the cells. use.

본 발명에서는 당류와 염화나트륨을 포함하는 용액을 세포 블록 제조용 겔 성형체로 사용함으로써, 세포 블록 성형이 용이할 뿐 아니라 수분활성도 조절에 의한 세포 변형을 최소화할 수 있다. 본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 온도 및 용질에 따른 수분 활성도 변화를 고려한 열역학적 원리에 기초한 것이다. In the present invention, by using a solution containing a saccharide and sodium chloride as a gel molded body for cell block production, not only the cell block molding is easy but also cell modification by controlling water activity can be minimized. The present invention is not limited to a particular theory, but is based on thermodynamic principles that take into account changes in water activity with temperature and solute.

도 1 및 도 2를 참조로 본 발명의 구현 원리를 개략적으로 설명하고자 한다. 설탕과 같은 당류 또는 염화나트륨 함유 수용액이 낮은 온도에 있을 경우, 액체에서 기체로 상태변화가 일어날 때 그래프의 기울기가 완만하게 증가하는 구간이 나타나다가 기체 상태가 되면서 기울기가 급격하게 변하면서 수분 활성도가 높아짐에 따라 수분 함유량도 증가하게 된다(도 1의

Figure 112012004673467-pat00003
그래프 참조). 그러나, 이러한 수용액이 높은 온도에 있을 경우, 낮은 온도일 때보다 수분 함유량이 낮게 증가하다가 어느 시점(Inversion point)에서는 더 이상 수분 활성도가 증가하지 않게 된다(도 1의
Figure 112012004673467-pat00004
그래프 참조). 수분 활성도가 낮으면 수분 함유도가 낮으므로 결정 상태의 설탕 등은 매우 적은 양의 용매(예: 물)와도 잘 흡착되어 세포의 형태를 유지하면서 세포와 밀착된다.1 and 2 will be described schematically in the implementation principle of the present invention. If the sugar or sodium chloride-containing aqueous solution such as sugar is at a low temperature, the slope of the graph gradually increases when the state changes from liquid to gas. The moisture content also increases (see FIG. 1).
Figure 112012004673467-pat00003
See graph). However, when the aqueous solution is at a high temperature, the water content increases lower than at a low temperature, and at some point (inversion point), the water activity no longer increases (see FIG. 1).
Figure 112012004673467-pat00004
See graph). When the water activity is low, the water content is low, so the sugar in the crystalline state is adsorbed well with a very small amount of solvent (eg, water) and adheres to the cell while maintaining the shape of the cell.

본 발명에서 당류와 염화나트륨은 온도 변화에 따라 비결정 상태에서 결정상태로 상당히 빨리 변하기 때문에 세포 블록을 만들 때 단시간 내에 결정화에 의하여 세포 표면에 결정성 막을 형성하여 수분 활성도를 낮추어 주며, 온도 변화 후 세포 변형을 억제하는 역할을 한다(도 2 참조). In the present invention, since the sugar and sodium chloride change considerably quickly from the amorphous state to the crystalline state according to the temperature change, it forms a crystalline membrane on the cell surface by crystallization within a short time when making the cell block, thereby lowering the water activity, and cell transformation after temperature change It serves to suppress (see Figure 2).

따라서, 본 발명에 따르면, 상기한 바와 같이 당류와 염화나트륨이 온도 변화에 따라 결정상태로 빠르게 변하여 세포 표면에 결정성 막을 형성하여 세포와 아가로오즈 겔이 단단히 밀착됨에 따라, 온도 변화 후 세포 변형을 억제하고, 세포와 세포 고정용 아가로오즈 겔이 잘 밀착되어 세포 블록을 절편으로 절단하는 경우 고정용 아가로오즈 겔과 세포가 분리되지 않게 된다(도 3 참조). Therefore, according to the present invention, as described above, the sugar and sodium chloride rapidly change to a crystalline state according to the temperature change to form a crystalline membrane on the surface of the cell, so that the cells and agarose gel tightly adhered, the cell deformation after the temperature change Inhibition of the agarose gel and the cell-fixing agarose gel is in close contact with the cell block to cut the fragments of the fixing agarose gel and the cell is not separated (see Figure 3).

도 3에 도시된 바와 같이, 당류나 염화나트륨과 아가로오즈를 포함하는 겔이 50℃ 이하의 온도에서 상온으로 냉각되면서 온도 차이로 인하여 용매에 용해되어 있는 당류나 염화나트륨이 세포 주변에 얇은 결정성 막을 형성하여 삼투압 조절뿐 아니라 온도 변화에 따른 세포 변형을 최소화하는 역할을 한다(Sugar Affecting Hysteresis). 즉, 당류나 염화나트륨과 아가로오즈를 포함하는 수용액이 겔 상태로 굳기 전의 온도에서 물 분자는 분자 운동이 비교적 활발해지고, 용질의 포화점에 도달하여 세포 주변에 용질이 흡착하게 되면, 이로 인하여 용질의 과포화에 의한 빠른 탈습이 세포의 외형을 보호하게 되고 이는 세포 변형을 방지하고 보다 안정된 결정화 구조를 제공할 수 있다(도 3 참조). 반면, 기존의 세포 블록 제조용 1% 아가로오즈가 용해된 1xPBS 용액은 겔의 경화시 일어나는 온도 변화에 따라 세포 변형이 일어나는 경우가 많다(도 4 참조).As shown in Figure 3, the gel containing sugars or sodium chloride and agarose is cooled to room temperature at a temperature of 50 ℃ or less while the sugar or sodium chloride dissolved in the solvent due to the temperature difference to form a thin crystalline membrane around the cells It forms and plays a role in minimizing cellular transformation due to temperature changes as well as osmotic pressure control (Sugar Affecting Hysteresis). That is, water molecules become relatively active at the temperature before the aqueous solution containing saccharides, sodium chloride and agarose in a gel state becomes relatively active, and when the solute reaches the saturation point of the solute, the solute is adsorbed around the cell. Rapid desorption by supersaturation of protects the appearance of the cells, which can prevent cell transformation and provide a more stable crystallization structure (see FIG. 3). On the other hand, the 1xPBS solution in which 1% agarose is dissolved in the conventional cell block is often transformed according to the temperature change that occurs during curing of the gel (see FIG. 4).

본 발명의 제3면은 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물, 세포 채취 수단, 세포 블록 제조용 틀, 및 필요에 따라 사용 지침서를 포함하는 세포 블록 제조용 키트를 제공한다. The third aspect of the present invention provides a cell block manufacturing kit comprising a composition for producing a cell block according to the present invention, a cell harvesting means, a cell block manufacturing frame, and instructions for use as necessary.

본 발명의 한 구현예에서, 세포 블록 제조용 조성물은 일정량의 아가로오즈; 당류, 염화나트륨, 또는 이의 혼합물; 및 물 및/또는 인산염 완충액(Phosphate Buffer Solution: PBS)을 각각 별도로 포함하도록 포장된 것이거나, 일정량의 아가로오즈; 및 당류, 염화나트륨, 또는 이의 혼합물 만을 포함하도록 포장되고, 소정 함량의 물, 1xPBS, 또는 이들의 혼합 용매는 사용 시 별도로 첨가될 수 있다. In one embodiment of the invention, the cell block preparation composition is a certain amount of agarose; Sugars, sodium chloride, or mixtures thereof; And packaged separately to include water and / or phosphate buffer solution (PBS), or in an amount of agarose; And sugars, sodium chloride, or mixtures thereof only, and a predetermined amount of water, 1 × PBS, or a mixed solvent thereof may be added separately in use.

본 발명에 따른 세포 블록 제조용 키트는 필요에 따라 사용방법이 기재된 사용 지침서가 함께 제공될 수 있다. 사용 지침서에는 세포 블록 제조용 조성물을 이용하여 세포 블록을 제조하는 방법이 상세하게 기재된다. 예를 들면, 사용 지침서에는 물, 인산염 완충액(PBS), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 용매에 당류, 염화나트륨(NaCl), 또는 이의 혼합물과 아가로오즈를 넣고, 당류와 아가로오즈가 용해되는 온도 하에서 이들이 용해되는 시간 동안 가열한 다음, 세포 블록 제조용 틀에 넣고, 세포 채취 수단에 의하여 채취된 세포를 세포 블록 제조용 틀 내에서 성형된 겔 상태의 세포 블록에 주입하여 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 블록을 제조하는 방법이 기재될 수 있다. Cell block manufacturing kit according to the present invention may be provided with instructions for use described as needed. Instructions for use describe in detail how to make cell blocks using the composition for making cell blocks. For example, the instructions for use include sugars, sodium chloride (NaCl), or mixtures and agarose in a solvent selected from water, phosphate buffer (PBS), and mixtures thereof, and the temperature at which sugars and agarose are dissolved. The cells block containing one or more cells is heated under the time that they are lysed, and then placed in a cell block manufacturing frame, and the cells collected by the cell harvesting means are injected into a cell block in a gel state molded in the cell block manufacturing frame. Processes for preparing the same may be described.

세포 블록 제조용 조성물을 포함하는 용기의 일 예를 도 5에 도시하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 세포 블록 제조용 조성물 포함 용기(30)는 아가로오즈를 포함하는 제1구획(10), 당류 및/또는 염화나트륨을 포함하는 제2구획(20)을 포함하는 것으로, 사용 시 제2구획(20)의 당류 및/또는 염화나트륨과 제1구획(10)의 아가로오즈를 혼합한 다음, 일정량의 물, 1xPBS, 또는 이들의 혼합 용매를 첨가하여 바로 가열할 수 있는 재질의 용기(30)인 것이 바람직하다. 선택적으로 제2구획은 임의로 당류 및/또는 염화나트륨이 소정 함량의 물에 용해된 수용액 또는 이들이 용해된 1xPBS을 포함하는 것일 수 있다. 제1구획과 제2구획을 구성하는 용기의 재질은 같거나 다를 수 있다.An example of a container including a composition for preparing a cell block is shown in FIG. 5. As shown in FIG. 5, the container 30 including the composition for preparing a cell block includes a first compartment 10 containing agarose, a second compartment 20 containing sugar and / or sodium chloride, Material that can be directly heated by mixing sugars and / or sodium chloride in the second compartment 20 and agarose in the first compartment 10 after use, and then adding a certain amount of water, 1 × PBS, or a mixed solvent thereof. It is preferable that it is the container 30 of. Optionally, the second compartment may optionally comprise an aqueous solution in which sugars and / or sodium chloride are dissolved in a predetermined amount of water or 1 × PBS in which they are dissolved. The material of the container constituting the first compartment and the second compartment may be the same or different.

세포 채취 수단은 내부에 세포를 수집할 수 있는 공동(hollow)의 관형 몸체와 채취된 내용물을 배출시킬 수 있는 배출 수단을 포함하는 것이면, 그 형태는 특별히 제한되지 않는다. 세포 채취 수단 및 사용 방법의 일 예는 도 6에 도시되어 있다. 세포 채취 수단은 속이 빈 관형 몸체 및 채취된 내용물을 배출시키기 위한 배출기로 이루어진다.The cell collecting means is not particularly limited as long as the cell collecting means includes a hollow tubular body capable of collecting cells therein and a discharge means capable of discharging the collected contents. An example of a cell harvesting means and method of use is shown in FIG. 6. The cell harvesting means consists of a hollow tubular body and an ejector for discharging the collected contents.

본 발명에서는 일정한 모양으로 세포 블록을 성형하기 위하여 세포 블록 제조용 틀을 사용할 수 있다. 세포 블록 제조용은 세포 블록 외형을 형성하기 위한 몰드를 하나 이상 가지는 것이면 형태, 재료 등은 특별히 제한되지 않는다. 세포 블록 제조용 틀은 세포 블록의 보관 및 분리가 용이하도록, 필요에 따라 구획 상부의 덮개부와 하부의 분리가능한 슬라이드 판, 및 슬라이드 판을 몰드에 고정할 수 있는 고정수단을 가질 수 있다.In the present invention, a cell block manufacturing frame may be used to mold the cell block into a predetermined shape. The form, material and the like are not particularly limited as long as they have at least one mold for forming the cell block shape for the cell block production. The cell block manufacturing frame may have a cover portion at the top of the compartment and a detachable slide plate at the bottom, and fixing means for fixing the slide plate to the mold, as necessary, so as to facilitate storage and separation of the cell block.

세포 블록 제조용 틀의 일 예를 도 7에 도시하였다. 도 7에 도시된 바와 같이 세포 블록 제조용 틀은 세포 블록 성형을 위한 하나 이상의 분리된 구획(40)을 포함하고, 상부 및 하부가 개방된 몰드(50), 구획의 하단부에 배치되는 슬라이드 판(60), 슬라이트 판 고정수단(70), 몰드의 덮개부(80)로 구성될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 하나 이상의 분리된 구획(40) 각각에 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물 용액을 붓고, 완전히 경화되기 전 세포 채취 수단으로 채취된 세포를 주입한 다음 경화시켜 보관한다. 세포 블록 사용시, 고정수단(70)을 해제하여 하부의 슬라이드 판(60)을 제거하고, 몰드(50)내 각 구획으로부터 세포 블록(90)을 분리해낸다(도 8 참조). 분리된 세포 블록은 나이프 등의 절단 수단에 의하여 원하는 방향으로 절단되어 절편을 얻어 절편에 포함된 세포를 현미경 등의 관찰 수단으로 관찰할 수 있다. An example of a cell block manufacturing frame is shown in FIG. 7. As shown in FIG. 7, the cell block manufacturing frame includes one or more separate compartments 40 for cell block molding, a mold 50 having upper and lower openings, and a slide plate 60 disposed at the lower end of the compartments. ), The slit plate fixing means 70, the cover portion 80 of the mold. In an embodiment of the invention, the composition solution for cell block preparation according to the invention is poured into each of the one or more separate compartments 40, the cells collected by cell harvesting means before being fully cured and then cured and stored. When using the cell block, the fixing means 70 is released to remove the lower slide plate 60 and separate the cell block 90 from each compartment in the mold 50 (see FIG. 8). The separated cell block is cut in a desired direction by a cutting means such as a knife to obtain a section, and the cells contained in the section can be observed with a observation means such as a microscope.

도 7 및 도 8에서 구획(40) 및 몰드(50)는 육면체로 도시되어 있으나, 이들의 형상은 육면체를 포함하는 다면체나 원통형 등 다양한 형상으로 제조될 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. In FIG. 7 and FIG. 8, the compartment 40 and the mold 50 are illustrated as hexahedrons, but their shapes may be manufactured in various shapes such as a polyhedron or a cylindrical shape including a hexahedron, and are not particularly limited.

본 발명에 따라 세포 블록을 제조할 경우의 장점을 정리하면 다음과 같다. The advantages of the case of preparing the cell block according to the present invention are as follows.

첫째, 배양 접시에서 배양된 세포 상(도 9의 (1))에 본 발명에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 도포하면, 세포의 존재에 의하여 도포면이 불균일하게 된다(도 9의 (2)). 이 불균일한 도포면을 갖는 세포를 피스톤 등의 세포 채취 수단에 의하여 1회 이상 분리하면 세포 채취 수단 내에 여러 층으로 적층된 세포가 얻어지고(도 9의 (3) 및 (4)), 이를 완전히 경화되지 않은 세포 블록 제조용 조성물 겔 내부에 주입하면(도 9의 (5)), 아직 경화되지 않은 조성물 성분이 적층된 불균일한 세포층 사이에 충진되어 세포와 세포 블록 겔 사이에 틈을 메워주고 세포 칩이 세포 블록에 고정될 수 있게 한다.First, when the composition for producing a cell block according to the present invention is applied onto cells cultured in a culture dish (Fig. 9 (1)), the coated surface becomes nonuniform due to the presence of cells (Fig. 9 (2)). When the cells having this non-uniform coating surface are separated at least once by a cell collecting means such as a piston, cells stacked in multiple layers in the cell collecting means are obtained (Figs. 3 and 4 in Fig. 9), and they are completely cured. When injected into the composition gel for the preparation of untreated cell blocks (FIG. 9 (5)), the composition components, which have not yet been cured, are filled between the uneven cell layers stacked to fill the gap between the cells and the cell block gel and the cell chip Allow to be fixed to the cell block.

둘째, 본 발명에 따르면 원하는 세포 밀도를 갖는 세포 블록을 얻을 수 있다. 세포 배양 접시 상에 세포 밀도를 조절함으로써 세포 채취 수단에 의하여 채취되는 세포의 밀도를 크거나 작게 할 수 있고, 따라서 이로부터 제조된 세포 블록의 세포 밀도 또한 자유롭게 조절할 수 있다.Secondly, according to the present invention, a cell block having a desired cell density can be obtained. By adjusting the cell density on the cell culture dish, the density of the cells collected by the cell harvesting means can be made large or small, and thus the cell density of the cell blocks prepared therefrom can also be freely controlled.

셋째, 일정한 방향으로 세포를 적층하여 세포 블록에 주입할 수 있으므로, 주입된 세포를 관찰하고자 하는 부위별, 각도별로 절단하여 관찰할 수 있다(도 10 참조). 따라서, FISH(Fluorescence in situ hybridization)과 같이 세포 내 성분의 확인 실험이 용이할 뿐 아니라, 세포 절편 제조 후 세포 블록 겔을 용해시켜 제거한 다음 세포만을 분리하고 세포 절편들을 모아 세포 부위별 DNA, RNA, 단백질 등을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 기존의 아가로오즈/1xPBS 용액을 사용한 경우에 비하여 세포 변형이 현저하게 적고 세포와 세포 블록 겔 사이의 공간이 거의 없어 세포의 절단이 용이하다. Third, since the cells can be stacked and injected into the cell block in a predetermined direction, the injected cells can be observed by cutting each region and angle (see FIG. 10). Therefore, the identification of intracellular components such as FISH (Fluorescence in situ hybridization) is not only easy, but after cell fragment preparation, the cell block gel is dissolved and removed, and then only the cells are separated and the cell fragments are collected to collect DNA, RNA, Proteins and the like. In addition, according to the present invention, the cell agglomerate is significantly less than that of the conventional agarose / 1xPBS solution, and there is little space between the cell and the cell block gel, thereby facilitating cell cleavage.

이하, 실시예에서 본 발명이 추가로 설명된다. 다만 본 실시예는 후술되는 청구범위에 정의된 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.In the following, the invention is further described. However, this embodiment should not be construed as limiting the scope of the invention as defined in the following claims.

실시예Example

세포 블록 제조예 1Cell Block Preparation Example 1

도 9를 참조로 세포 블록 제조 방법을 예시적으로 설명한다. An example of a cell block manufacturing method will be described with reference to FIG. 9.

배양 접시에서 배양된 세포를 4% 포르말린으로 고정하였다(상온, 20분). 1x PBS로 포르말린을 제거하고, 세포가 마르지 않도록 주의하면서 1x PBS를 제거하였다(1). 이와는 별도로 1g 아가로오즈, 10g 설탕을 증류수 89g에 넣고 100℃에서 10분간 끓여 세포 블록 제조용 용액을 얻었다(도시되지 않음). 얻어진 용액을 37℃로 식힌 후 파이펫으로 세포가 고정된 배양 접시 상에 얇게 덮었다(2). 용액이 겔 상태로 어느 정도 굳으면, 빨대형 피스톤(3)을 이용하여 세포를 개별적으로 찍어서 떼어내었다(4). (4) 단계를 여러 회 반복하여 여러 개의 세포를 일정하게 적층시킬 수 있다. 이와는 별도로 앞서 제조된 세포 블록 제조용 용액 중 남은 용액에 검정 잉크를 몇 방울 떨어 트려 착색시킨 후 블록 제조용 틀에 부었다. 블록 제조용 틀 내의 용액이 굳기 전 빨대형 피스톤에 적층된 세포들을 주입하였다(5). Cells cultured in the culture dish were fixed with 4% formalin (room temperature, 20 minutes). Formalin was removed with lx PBS and lx PBS was removed (1), taking care not to dry the cells (1). Separately, 1 g agarose and 10 g sugar were added to 89 g of distilled water and boiled at 100 ° C. for 10 minutes to obtain a solution for preparing a cell block (not shown). The resulting solution was cooled to 37 ° C. and then thinly covered on a culture dish in which cells were fixed with a pipette (2). When the solution solidified to some extent in a gel state, cells were individually taken off using a straw piston (4) and removed (4). Step (4) can be repeated several times to uniformly stack several cells. Separately, a few drops of black ink was added to the remaining solution in the cell block preparation solution prepared above, and then colored in a block preparation frame. The stacked cells were injected into the straw piston before the solution in the block preparation mold solidified (5).

도 10에 도시된 바와 같이, 세포 블록에 주입된 세포들을 관찰하기 위하여, 나이프 등의 절단 수단에 의하여 얻어진 세포 블록을 원하는 방향으로 절단하여 절편을 얻고 절편에 포함된 세포를 현미경 등의 관찰 수단으로 관찰한다. As shown in Fig. 10, in order to observe the cells injected into the cell block, the cell block obtained by cutting means such as a knife is cut in a desired direction to obtain a section, and the cells contained in the section are observed by a microscope or the like. Observe.

세포 블록 제조예 2Cell Block Preparation Example 2

도 11을 참조로 세포 블록 제조 방법을 예시적으로 설명한다. An exemplary cell block manufacturing method will be described with reference to FIG. 11.

배양 접시에 붙어서 자라지 않는 세포의 경우 원심분리기로 세포 만을 수집하여 세포 블록을 제조할 수 있다. 4% 포르말린을 넣고 관찰하고자 하는 세포를 풀어서 세포를 고정하였다(상온, 20분). 고정화된 세포 함유 용액을 원심분리하여 상층액은 버리고 하부의 고정된 세포를 얻었다. 고정된 세포에 1x PBS 버퍼를 넣고 잘 풀어서 세척하였다(1). 세척된 세포를 원심분리하여 상층액을 버리고 다시 세포를 수집하였다(화살표로 표시됨). 이와는 별도로 1g 아가로오즈, 10g 염화나트륨(정제 소금)을 증류수 89g에 넣고 100℃에서 10분간 끓여 세포 블록 제조용 용액을 얻었다(도시되지 않음). 얻어진 용액을 37℃로 식힌 후 앞서 얻은 세포를 넣은 후 세포 블록 틀에 주입하였다(2). 세포를 관찰하고자 하는 방향으로 절단하여 관찰하였다(3).In the case of cells that do not grow by attaching to the culture dish, a cell block may be prepared by collecting only cells with a centrifuge. 4% formalin was added to the cells to be observed to fix the cells (room temperature, 20 minutes). The immobilized cell-containing solution was centrifuged to discard the supernatant and to obtain the lower fixed cells. 1x PBS buffer was added to the fixed cells, washed well, and washed (1). The washed cells were centrifuged to discard the supernatant and to collect the cells again (indicated by arrows). Separately, 1 g agarose and 10 g sodium chloride (purified salt) were added to 89 g of distilled water and boiled at 100 ° C. for 10 minutes to obtain a solution for preparing a cell block (not shown). The obtained solution was cooled to 37 ° C., and then the cells obtained above were added and then injected into the cell block frame (2). The cells were cut and observed in the direction to be observed (3).

Claims (18)

0.5 내지 2중량% 아가로오즈(agarose); 5 내지 20중량%의 당류, 염화나트륨(NaCl) 또는 이의 혼합물; 및 잔량의 물, 인산염 완충액(PBS), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 용매를 포함하는 세포 블록 제조용 조성물.0.5 to 2 weight percent agarose; 5-20% by weight of sugars, sodium chloride (NaCl) or mixtures thereof; And a solvent selected from the balance of water, phosphate buffer (PBS), and mixtures thereof. 제1항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 세포 블록 제조용 조성물.The composition of claim 1, wherein the cells are prokaryotic or eukaryotic cells. 제1항에 있어서, 상기 당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류로부터 선택되는 것인 세포 블록 제조용 조성물.The composition of claim 1, wherein the saccharide is selected from monosaccharides, disaccharides, or polysaccharides. 제1항에 있어서, 상기 당류는 포도당, 과당, 자당, 맥아당, 유당, 셀룰로오스, 전분, 및 글리코겐으로부터 선택되는 하나 이상의 당류인 세포 블록 제조용 조성물. The composition of claim 1, wherein the sugar is at least one sugar selected from glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, cellulose, starch, and glycogen. 제1항에 있어서, 상기 용매는 물인 세포 블록 제조용 조성물. The composition of claim 1, wherein the solvent is water. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 사용하여 세포주 또는 세포 현탁액으로부터 세포 블록을 제조하는 방법.A method for producing a cell block from a cell line or cell suspension using the cell block preparation composition according to any one of claims 1 to 5. (a) 제1항에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 배양된 세포 상에 도포하는 단계,
(b) 상기 조성물이 도포된 하나 이상의 세포를 세포 채취 수단을 이용하여 1회 이상 채취하는 단계, 및
(c) 상기 세포 블록 제조용 조성물을 성형하여 얻어진 세포 블록용 겔 내부에 채취된 세포들을 주입하는 단계를 포함하는, 세포 블록 제조 방법.
(a) applying the composition for producing a cell block according to claim 1 on cultured cells,
(b) collecting at least one or more cells to which the composition has been applied by using a cell collecting means, and
(c) injecting the collected cells into the cell block gel obtained by molding the cell block composition, cell block manufacturing method.
제1항에 따른 세포 블록 제조용 조성물을 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 집단에 혼합한 다음 경화시키는 단계를 포함하는 세포 블록 제조 방법.A method of producing a cell block comprising the step of mixing the composition for producing a cell block according to claim 1 to a cell population comprising one or more cells and then curing. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세포 블록 제조용 조성물의 온도는 30 내지 38℃인 세포 블록 제조 방법.The method of claim 7 or 8, wherein the temperature of the composition for producing a cell block is 30 to 38 ℃ cell block manufacturing method. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세포 블록 제조용 조성물이 착색된 것인 세포 블록 제조 방법.The method for producing a cell block according to claim 7 or 8, wherein the composition for producing a cell block is colored. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세포는 채취되기 전 미리 포르말린 또는 알코올로 고정화된 것인 세포 블록 제조 방법.The method of claim 7 or 8, wherein the cells are immobilized with formalin or alcohol in advance before being harvested. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 세포 블록 제조용 조성물; 세포 채취 수단; 세포 블록 제조용 틀; 및 사용 지침서를 포함하는 세포 블록 제조용 키트.Composition for producing a cell block according to any one of claims 1 to 5; Cell harvesting means; Frameworks for making cell blocks; And kits for making cell blocks comprising instructions for use. 제12항에 있어서, 상기 세포 블록 제조용 조성물은 소정 함량의 아가로오즈를 포함하는 제1구획, 및 소정 함량의 당류, 염화나트륨, 또는 이의 혼합물을 포함하는 제2구획을 포함하는 가열가능한 용기 내에 포함되며, 사용 시 제1구획의 아가로오즈와 제2구획의 당류, 염화나트륨, 또는 이의 혼합물을 혼합한 다음 소정 함량의 물, 인산염 완충액(PBS), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 용매를 첨가하여 사용되는 것인 세포 블록 제조용 키트.The composition of claim 12, wherein the composition for making a cell block is contained in a heatable container comprising a first compartment comprising a predetermined amount of agarose and a second compartment comprising a predetermined amount of sugar, sodium chloride, or mixtures thereof. In use, agarose of the first compartment and sugars of the second compartment, sodium chloride, or a mixture thereof are mixed, followed by addition of a predetermined amount of water, a phosphate buffer (PBS), and a solvent selected from the mixture thereof. Will be a cell block manufacturing kit. 제12항에 있어서, 상기 세포 블록 제조용 조성물은 소정 함량의 아가로오즈를 포함하는 제1구획, 및 소정 함량의 당류, 염화나트륨, 또는 이의 혼합물이 용해된 물, 인산염 완충액(PBS), 및 이들의 혼합물을 포함하는 제2구획을 포함하는 가열가능한 용기 내에 포함되어 있는 것인 세포 블록 제조용 키트.The method of claim 12, wherein the cell block manufacturing composition comprises a first compartment containing a predetermined amount of agarose, and water in which a predetermined amount of sugar, sodium chloride, or a mixture thereof is dissolved, phosphate buffer (PBS), and their The cell block manufacturing kit which is contained in the heatable container containing a 2nd compartment containing a mixture. 제12항에 있어서, 상기 세포 채취 수단은 내부에 세포를 수집할 수 있도록 공동을 갖는 관형 몸체와 채취된 내용물을 배출시킬 수 있는 배출 수단을 포함하는 것인 세포 블록 제조용 키트.13. The cell block manufacturing kit according to claim 12, wherein the cell collecting means includes a tubular body having a cavity to collect cells therein and an ejecting means for discharging the collected contents. 제12항에 있어서, 상기 세포 블록 제조용 틀은 하나 이상의 구획으로 이루어진 세포 블록 성형용 몰드를 포함하는 것인 세포 블록 제조용 키트.The cell block manufacturing kit of claim 12, wherein the cell block manufacturing frame includes a cell block molding mold including one or more compartments. 제16항에 있어서, 상기 세포 블록 제조용 틀은 세포 블록 성형용 몰드 상부에 분리가능한 덮개부, 하부에 분리가능한 슬라이드 판, 및 슬라이드 판을 몰드에 고정할 수 있는 고정수단을 추가로 포함하는 것인 세포 블록 제조용 키트. The method of claim 16, wherein the cell block manufacturing frame further comprises a removable cover portion on the upper part of the cell block molding mold, a removable slide plate on the bottom, and fixing means for fixing the slide plate to the mold. Kit for making cell blocks. 제12항에 있어서, 상기 사용 지침서는 물, 인산염 완충액(PBS), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 용매에 당류, 염화나트륨(NaCl), 또는 이의 혼합물과 아가로오즈를 넣고, 당류와 아가로오즈가 용해되는 온도 하에서 이들이 용해되는 시간 동안 가열한 다음, 세포 블록 제조용 틀에 넣고, 세포 채취 수단에 의하여 채취된 세포를 세포 블록 제조용 틀 내에서 성형된 겔 상태의 세포 블록에 주입하여 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 블록을 제조하는 방법이 기재되어 있는 것인 세포 블록 제조용 키트.The method of claim 12, wherein the instructions for use are added to a solvent selected from water, phosphate buffer (PBS), and mixtures thereof, sugars, sodium chloride (NaCl), or a mixture thereof and agarose, the sugars and agarose Under the temperature of lysis, they are heated for the time they are dissolved, and then placed in a cell block preparation frame, and the cells collected by the cell harvesting means are injected into a cell block in a gel state molded in the cell block preparation frame to include one or more cells. A cell block manufacturing kit, wherein the method for producing a cell block is described.
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