KR101362211B1 - Photorhabdus temperata subsp. temperata and antimicrobial and insecticidal composition having extracts derived from the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 포토랍두스 템페라타 템프라타 및 이의 추출물을 포함하는 항균·살충 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 우수한 항균활성 및 살충활성을 동시에 갖는 포토랍두스 템페라타 템프라타 및 이의 추출물을 포함하는 항균·살충 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to an antimicrobial and insecticidal composition comprising photolapdus temperata temperata and extracts thereof, and more specifically, to a photolabdus temperata temperata and extracts thereof having both excellent antimicrobial and insecticidal activity. It relates to the antimicrobial and insecticidal composition included.
곤충병원성 선충에서 유래되는 곤충병원세균은 면역억제, 세포치사효과, 항생물질 분비능 및 살충활성 등을 가진다고 알려졌다. 이러한 능력이 한 생물종으로부터 파생되는 지를 이해하기 위해서는 곤충병원세균이 나타내는 생활환을 이해할 필요가 있다.Insect pathogens derived from entomopathogenic nematodes are known to have immunosuppressive effects, cytotoxic effects, antibiotic secretion and insecticidal activity. To understand whether this ability is derived from a species, it is necessary to understand the life cycle represented by insect pathogens.
곤충병원세균은 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하며, 곤충병원성 선충과 공생관계를 가지고 있다. 즉, 감염태 선충의 장내에 이들 곤충병원세균이 존재하게 된다. 대상 곤충이 출현하게 되면 감염태 선충이 기주 농작물 병해충의 혈강내로 침입하게 되고, 여기서 장내 공생세균을 곤충의 혈강으로 토해내게 된다.Insect pathogens belong to Enterobacteriaceae and have a symbiotic relationship with insect pathogenic nematodes. In other words, these insect pathogens are present in the intestinal worm's bowel. When the target insects appear, infectious nematodes invade into the bloodstream of host crop pests, and intestinal symbiotic bacteria are spewed out into the bloodstream of insects.
곤충의 혈강에는 척추동물의 혈액과 림프액이 혼재해 있는 혈림프(hemolymph)가 자리하고 있다. 혈림프는 구성상 혈장과 혈구로 나뉘며, 척추동물의 혈액이 갖는 산소운반 능력 이외에 거의 유사한 기능을 가지고 있다. 특히 혈구세포는 선충 또는 세균과 같은 외래 침입자에 대한 세포성 면역반응을 보유하고 있으며, 혈장에는 다양한 항생 단백질을 지니고 있어 체액성 면역반응이 가능한 것으로 알려져 있다.Hemolymph, which contains a mixture of vertebrate blood and lymph fluid, is located in the bloodstream of insects. Hemolymph is divided into plasma and blood cells, and has almost similar functions in addition to oxygen carrying ability of vertebrate blood. In particular, hematopoietic cells have cellular immune responses against foreign invaders such as nematodes or bacteria, and are known to be capable of humoral immune responses because plasma has various antibiotic proteins.
이러한 곤충 면역반응은 외래침입 물질의 인식(recognition), 면역 중개(mediation) 그리고 면역 반응(reaction)으로 이루어져 있다.This insect immune response consists of the recognition of foreign invasive substances, mediation and immune reaction.
침입한 선충과 이들로부터 방출된 공생세균이 갖는 당면한 문제는 곤충의 혈림프로부터의 면역방어기작이다. 일반적으로 병원체들은 면역인식 회피, 억제 및 내성의 기작들을 발휘하게 된다. 그러나 이들의 정확한 구분은 매우 힘들어, 실제로 이러한 기작들이 상호 어우러져서 나타나는 면역체계 현상으로 보여지게 된다. The immediate problem with invading nematodes and symbiotic bacteria released from them is the immune defense mechanisms of insect blood lymphocytes. In general, pathogens exert mechanisms of immune recognition avoidance, inhibition and resistance. However, the precise distinction between them is very difficult, and in fact, these mechanisms appear to be a phenomenon of the immune system that is a combination of each other.
제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila, Xn)의 경우, 포스포리파제A2(PLA2)를 대상으로 면역억제를 유도한다. 제노랍두스 네마토필라에 의한 PLA2 억제는 비록 외래 병원균의 침입을 혈구세포가 인식하여도 아이코사노이드류가 생성되지 않아 면역반응으로 이어지지 않게 된다.In the case of Xenorhabdus nematophila (Xn), immunosuppression is induced against phospholipase A2 (PLA2). PLA2 inhibition by Xenorabdus nematophila does not lead to an immune response, even though blood cells recognize the invasion of foreign pathogens and do not produce icosanoids.
면역작용을 억제시킨 후, 제노랍두스 네마토필라는 직접적으로 세포치사반응을 유도하게 된다. 특히, 혈구세포의 치사는 결국 혈구에 기인한 면역반응을 비가역적으로 억제하게 되는 결과를 초래하게 된다. After suppressing the immune action, genoblastus nematophila directly induces cell death. In particular, lethality of blood cells eventually results in irreversible inhibition of immune responses due to blood cells.
한편, 제노랍두스 네마토필라에 기인한 곤충의 면역억제는 자연계에서 다른 병원체의 침입을 허용할 수 있게 된다. 공생선충의 발육은 공생세균 단독의 한정성(monoxenic) 조건을 요구하기 때문에, 유사 세균종 또는 분류학적으로 매우 이종 형태의 세균 및 진균까지도 억제시킬 수 있는 항생물질의 분비가 필요하게 된다. On the other hand, the immunosuppression of insects caused by Xenorabdus nematophila can allow invasion of other pathogens in nature. Since the development of symbiotic nematodes requires the monoxenic condition of symbiotic bacteria alone, it is necessary to secrete antibiotics capable of inhibiting similar bacterial species or even taxonomically very heterogeneous types of bacteria and fungi.
곤충병원세균의 이차 대사산물에 함유되어 있는 성분중에는 면역억제 물질인 벤젤리덴아세톤(benzelidenaceton), 항균성을 가지는 안트라퀴논(antraquinon) 외에 여러 독소 단백질들이 포함되어 있다고 알려져 있다. Among the components contained in the secondary metabolites of insect pathogens, it is known that benzelidenaceton, an immunosuppressive substance, and anthraquinon, which have antimicrobial properties, include various toxin proteins.
곤충에 대한 병원성을 가진 세균들이라 할지라도 곤충에 대한 반수치사량(LD50)이 10,000개의 세포 이하일 경우에만 곤충병원성 세균으로 간주하는데, 곤충병원성 세균의 한 종류인 제노랍두스(Xenorhabdus ) 속 세균은 숙주인 Steinernema 속 선충과 같이 삽입될 때 꿀벌부채명나방 유충에 대하여 LD50 < 100개의 세포 농도로 높은 병원성을 나타내지만, 숙주 선충이 없는 공생세균만으로는 LD50 > 5,000개의 세포로 공생세균에 의한 병원성이 매우 낮아진다고 알려졌다. Although wandering bacteria with pathogenic to insects half of the insect lethal dose (LD50) is a gen drawer Douce (Xenorhabdus) in bacteria of the host one type of insect pathogenic bacteria only to be considered as insect pathogenic bacteria if 10,000 cells or less When inserted with a nematode of the Steinernema genus, it exhibits high pathogenicity to the bee-larged moth larva with a concentration of LD50 <100 cells. However, only symbiotic bacteria without host nematodes, LD50> 5,000 cells, show very low pathogenicity by symbiotic bacteria. Became known.
그러나, 선충의 공생세균 중에서도 포토랍두스(Photorhabdus ) 속 세균은 공생하는 숙주 선충을 함께 처리하지 않아도 꿀벌부채명나방의 유충에 대한 LD50이 100 세포 이하인 것으로 보고되고 있다. 하지만, 살충활성이 높은 공생세균이라도 공생세균 단독으로는 경구독성이나, 주사독성에 한계를 보이는 문제점이 있다. However, among the symbiotic bacteria of nematodes picture Rob Douce (Photorhabdus) in bacteria do not have to deal with a host symbiotic nematodes are reported to be less than the LD50 for the honeybee larvae of moths, 100 people Debt cells. However, even symbiotic bacteria with high insecticidal activity have a problem in that they are limited to oral toxicity and injection toxicity.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 항균활성 및 살충활성을 동시에 가지는 포토랍두스 템페라타 템프라타 균주를 선발하였고, 이의 추출물이 더욱 우수한 항균활성 및 살충활성을 갖는다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Thus, the present inventors have made a thorough effort to solve the above problems, as a result of selecting a photolabdus temperata temprata strain having both antimicrobial activity and insecticidal activity, that the extract has more excellent antimicrobial activity and pesticidal activity. It confirmed and completed this invention.
본 발명의 목적은 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 갖는 미생물을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a microorganism having both antimicrobial activity against phytopathogens and pesticidal activity against crop pests.
본 발명의 다른 목적은 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 갖는 미생물, 이의 배양액 및 미생물 배양액의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 살충 조성물을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide an antimicrobial composition and an insecticidal composition comprising an extract of a microorganism having a antimicrobial activity against phytopathogens and pesticidal activity against crop pests, a culture medium thereof and a microbial culture solution.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균활성 및 살충활성을 동시에 갖는 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P)를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 (Accession Number: KACC 91741P) having both antimicrobial activity and insecticidal activity.
본 발명은 또한, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition comprising Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P) or a culture thereof as an active ingredient.
본 발명은 또한, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 살충 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pesticidal composition comprising Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P) or a culture thereof as an active ingredient.
본 발명은 또한, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P) 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition comprising an extract of the Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P) as an active ingredient.
본 발명은 또한, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P) 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 살충 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pesticidal composition comprising an extract of the Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P) as an active ingredient.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 균주 배양액에 헥산, 에틸아세테이트, 에탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 첨가시켜 추출한 것 특징으로 한다. In the present invention, the extract is characterized in that extracted by adding a solvent selected from the group consisting of hexane, ethyl acetate, ethanol and water to the strain culture.
본 발명에 있어서, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 및 항균 조성물은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 애쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the photolabduus temperata temprata ECOWIN_104 and the antimicrobial composition is Botrytis cinerea, Phytophthora capsici , Colletotrichum acutatum , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani and It is characterized by having antimicrobial activity against one or more plant pathogens selected from the group consisting of Ryezotonia serealis ( Rhizoctonia cerealis ).
본 발명에 있어서, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 및 살충 조성물은 꿀배추좀나방(Plutella xylostella), 담배거세미나방(Spodoptera litura), 털뿔가지나방(Alcis angulifera), 애모무늬잎말이나방(Adoxophyes orana), 감나무잎말이나방(Ptycholoma lecheana), 밤애기잎말이나방(Cydia Kurokoi), 복숭아순나방(Grapholita molesta), 은무늬굴나방(Lyonetia prunifoliella), 복숭아심식나방(Carposina sasakii), 파밤나방(Spodoptera exigua), 목화바둑나방(Diaphania indica), 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis), 이화명나방(Chilo suppressalis) 및 왕담배나방(Helicoverpa armigera)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 농작물 병해충에 대하여 살충활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
In the present invention, the photolapdus temperata temprata ECOWIN_104 and the insecticidal composition is honey cabbage moth ( Plutella xylostella ), tobacco giant moth ( Spodoptera litura ), moth horned moth ( Alcis angulifera ), moth pattern leaf moth ( Adoxophyes orana), persimmon ipmalyi moth (Ptycholoma lecheana), the night the baby ipmalyi moth (Cydia Kurokoi), peach net moth (Grapholita molesta), is patterned oysters moth (Lyonetia prunifoliella), peach simsik moth (Carposina sasakii), beet armyworm (Spodoptera exigua ), diaphania indica , Cacthalocrocis medinalis , Clamphalocrocis medinalis , Chilo suppressalis and Helicoverpa armigera It is done.
본 발명에 따른 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104는 농작물 병해충에 대한 살충력과 식물병원균에 대한 항균력이 모두 우수하므로, 이의 배양액 또는 추출물을 이용할 경우, 다양한 작물에서 농작물 병해충에 의한 피해를 효과적이면서 친환경적으로 방제 및 예방할 수 있다.
Photolapdus temperata temprata ECOWIN_104 according to the present invention is excellent in both insecticides and pesticides against phytopathogens of crop pests, when using the culture medium or extract thereof, effective and environmentally friendly to damage caused by crop pests in various crops Can be controlled and prevented.
도 1은 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104와 NCBI에 등록된 포토랍두스 속의 공지 균주의 16S rDNA 염기서열을 비교한 계통발생학적 모식도이다.
도 2는 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104와 NCBI에 등록된 포토랍두스 속의 공지 균주의 16S rDNA 염기서열을 비교분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104와 공지 균주인 P. temperata subsp. temperata BE09 NCBI EU930337의 염기서열을 비교분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ECOWIN_104를 NBTA 배지에서 배양시킨 콜로니 사진이다.
도 5는 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104의 액체 배양액 사진이다.1 is a phylogenetic schematic diagram comparing the 16S rDNA nucleotide sequences of a known strain of Photolabdus genus registered in Photolabdus temperata temprata ECOWIN_104 and NCBI of the present invention.
Figure 2 is a result of comparing the 16S rDNA nucleotide sequence of the known strain of the photolabdus temperata temprata ECOWIN_104 and the genus Photorapdus registered in the NCBI of the present invention.
Figure 3 is a photolabduus temperata tempprata ECOWIN_104 of the present invention and the known strain P. temperata subsp. This is the result of comparing and comparing the base sequences of temperata BE09 NCBI EU930337.
Figure 4 is a photograph of colonies incubated in the NBTA medium of the photolapdus temperata temperata ECOWIN_104 of the present invention.
Figure 5 is a photograph of the liquid culture solution of the Photorabdus temperata tempprata ECOWIN_104 of the present invention.
본 발명에서는 토양시료로부터 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 갖는 곤충병원성 선충을 분리한 다음, 이로부터 공생세균을 분리할 경우 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 갖는 균주를 선별할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.In the present invention, after separating the insect pathogenic nematode having both antimicrobial activity against phytopathogens and pesticidal activity against crop pests from soil samples, and separating symbiotic bacteria therefrom, antimicrobial activity against phytopathogens and pests against crop pests It was intended to confirm that the strain having all the activities can be selected.
본 발명의 일 실시예에서는 토양시료로부터 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 갖는 곤충병원성 선충을 분리하고, 다시 이로부터 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 갖는 균주를 선별하였다. In one embodiment of the present invention, the insecticidal pathogenic nematode having both antimicrobial activity against plant pathogens and pesticidal activity against crop pests is separated from soil samples, and from this, antimicrobial activity against plant pathogens and pesticidal activity against crop pests All strains were selected.
다음으로, 선별된 균주의 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 관찰하고, 탄소 이용원 조사 및 16S rDNA의 서열분석을 통하여 동정한 결과, 선별된 균주가 포토랍두스 템페라타 템프라타 (Photorhabdus temperata subsp. temperata)라는 것을 확인하고, 이를 2012년 9월 13일자로 농업유전자원센터에 기탁(KACC 91741P)하였다.Next, the morphological and biochemical characteristics of the selected strains were observed, and as a result of the identification through the carbon utilization survey and 16S rDNA sequencing, the selected strains were photorhabdus temperata subsp. temperata , which was deposited on September 13, 2012 to the Center for Agricultural Genetic Resources (KACC 91741P).
따라서, 본 발명은 일 관점에서 항균활성 및 살충활성을 동시에 갖는 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P)에 관한 것이다. Accordingly, the present invention relates to Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 (accession number: KACC 91741P) having both antimicrobial activity and insecticidal activity in one aspect.
상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P)는 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 애쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 등의 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 한다. Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession Number: KACC 91741P) is Botrytis cinerea, Phytophthora capsici , Collet tree It has antimicrobial activity against plant pathogens such as Colletotrichum acutatum , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani , and Rhizoctonia cerealis . do.
상기 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)는 잿빛곰팡이병, 상기 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)는 고추역병, 상기 콜레토트리쿰 애쿠타툼(Colletotrichum acutatum)은 참외탄저병, 상기 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)은 시들음병, 상기 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)는 벼 잎집무늬마름병 및 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)는 벼 잎집눈무늬병을 유발하는 것으로 알려졌다.The Botrytis cinerea is gray mold, the Phytophthora capsici is pepper blight, and the Colletotrichum acutatum is melon anthrax, the Fusarium oxis Fusarium oxysporum is known to cause wilting disease, and Rhizoctonia solani is known to cause rice leaf blight and Rhizoctonia cerealis to cause rice leaf blight.
또한, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P)는 꿀배추좀나방(Plutella xylostella), 담배거세미나방(Spodoptera litura), 파밤나방(Spodoptera exigua), 털뿔가지나방(Alcis angulifera), 애모무늬잎말이나방(Adoxophyes orana), 감나무잎말이나방(Ptycholoma lecheana), 밤애기잎말이나방(Cydia Kurokoi), 복숭아순나방(Grapholita molesta), 은무늬굴나방(Lyonetia prunifoliella), 복숭아심식나방(Carposina sasakii), 목화바둑나방(Diaphania indica), 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis), 이화명나방(Chilo suppressalis), 왕담배나방(Helicoverpa armigera) 등의 나방류 농작물 병해충에 대하여 살충활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
Also, the picture Rob Douce tempera other system Prata ECOWIN_104 (Photorhabdus temperata subsp temperata ECOWIN_104. ) ( Accession number: KACC 91741P) is the honey cabbage moth (Plutella xylostella), tobacco giant seminar room (Spodoptera litura), beet armyworm (Spodoptera exigua ), Alcis angulifera , Adoxophyes orana , Persimmon leaf moth ( Ptycholoma lecheana ), Chestnut leaf moth ( Cydia Kurokoi ), Peach net moth ( Grapholita molesta ) Pesticide activity against insect pests such as Lyonetia prunifoliella ), Peach- Carrot Moth ( Carposina sasakii ), Cotton Monarch ( Diaphania indica ), Persimmon Moth ( Cnaphalocrocis medinalis ), Chilo suppressalis and Helicoverpa armigera Characterized in having a.
실험을 통해 확인된 바와 같이, 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P)는 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 모두 가지므로, 항균 조성물 또는 살충 조성물로 이용될 수 있다.As confirmed through the experiments, Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P) of the present invention has antimicrobial activity against plant pathogens and pesticidal activity against crop pests. Since both have, it can be used as an antimicrobial composition or a pesticidal composition.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 살충 조성물에 관한 것이다.
Therefore, in another aspect, the present invention relates to an antimicrobial composition and insecticidal composition comprising Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P) or a culture thereof as an active ingredient. .
한편, 본 발명에서는 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P)의 배양액으로부터 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 갖는 추출물을 분리할 경우, 식물병원균에 대한 항균활성 및 농작물 병해충에 대한 살충활성을 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.Meanwhile, in the present invention, an extract having antimicrobial activity against plant pathogens and pesticidal activity against crop pests is isolated from a culture medium of Photorhabdu temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession Number: KACC 91741P). In this case, the antimicrobial activity against phytopathogens and pesticidal activity against crop pests could be further improved.
본 발명의 다른 실시예에서는 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호: KACC 91741P)의 배양액에서 헥산 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 에탄올 추출물 및 물 추출물을 각각 수득하고, 수득된 배양액 추출물의 식물병원균에 대한 항균활성 및 나방류 농작물 병해충에 대한 살충활성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. In another embodiment of the present invention, hexane extract, ethyl acetate extract, ethanol extract, and water extract were obtained from the culture solution of Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P). It was confirmed that the antimicrobial activity against phytopathogenic bacteria and pesticidal activity against pests of moths crops were obtained.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P) 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 살충 조성물에 관한 것이다.Therefore, in another aspect, the present invention relates to an antimicrobial composition and an insecticidal composition comprising an extract of Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104 (Accession No.:KACC 91741P) culture as an active ingredient. will be.
상기 추출물은 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P) 배양액에 용매를 가하여 추출할 수 있는데, 배양액을 원심분리하여 분리한 상등액에 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1~C4의 저급알콜의 극성 용매 또는 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 비극성 용매, 바람직하기로는 헥산, 에틸아세테이트, 에탄올 및 물을 순차적으로 첨가하고, 분획함으로써, 추출할 수 있다.The extract can be extracted by adding a solvent to the photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession Number: KACC 91741P) culture, the culture solution is centrifuged to remove the water and methanol, Polar solvents of C1-C4 lower alcohols such as ethanol, butanol, etc., or nonpolar solvents such as hexane, ethyl acetate, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), preferably hexane, ethyl acetate, ethanol and water, are added sequentially By fractionation, it can extract.
통상적으로 알려진 바와 같이, 추출물은 그대로 이용되거나, 농축된 다음 필요한 농도로 희석된 후 이용될 수 있다.
As is commonly known, the extract can be used as is, or concentrated and then diluted to the required concentration.
본 발명에 따른 항균 및 살충 활성 성분인 (a) 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P), (b) 이의 배양액 또는 (c) 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 살충 조성물을 적용할 수 있는 식물은 특별히 제한되지는 않으며, 고추, 배추, 양배추, 가지, 감, 복숭아, 오이, 결구상추(양상추), 딸기, 토마토, 파, 담배, 벼, 밤 등의 경제작물 이외에도 화훼 또는 특용작물 등의 나방류 농작물 병해충의 숙주가 될 수 있는 식물 표면이나 이들 식물이 생장하고 있는 토양, 재배하여 수송 또는 저장 중인 과실이나 채소 표면에도 처리될 수 있다.(A) Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104 (An accession number: KACC 91741P), (b) a culture thereof or (c) an extract of the antimicrobial and insecticidal active ingredient according to the present invention . Plants that can be applied to the antimicrobial composition and insecticidal composition comprising as an active ingredient are not particularly limited, pepper, cabbage, cabbage, eggplant, persimmon, peach, cucumber, cabbage lettuce (lettuce), strawberries, tomatoes, green onions, In addition to economic crops such as tobacco, rice, chestnuts, etc., they can be treated on plant surfaces that can be a host of pests of moths, such as flowers or special crops, soils on which these plants are grown, and fruit or vegetable surfaces grown, transported or stored. have.
본 발명의 항균 조성물 또는 살충 조성물은 항균 및 살충 활성 성분인 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P), 이의 배양액이나 건조분말, 또는 배양액의 추출물 이외에 계면활성제, 무기염류, 결합제, 증량제 등을 더욱 포함할 수 있다.The antimicrobial composition or insecticidal composition of the present invention is an antibacterial and insecticidal active ingredient, Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P), its culture or dry powder, or extract of the culture medium In addition, it may further include a surfactant, an inorganic salt, a binder, an extender, and the like.
상기 계면활성제는 분자 중에 친수성 분자단 및 친유성 분자단을 동시에 갖는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력이 우수한 특징을 가지므로 본 발명에 따른 항균 조성물 또는 살충 조성물중의 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P), 이의 배양액이나 건조분말, 또는 배양액의 추출물이 효과적으로 약효를 발현하도록 수화, 현탁, 분산시키는 작용을 할 수 있다.The surfactant is an amphiphilic material having both hydrophilic and lipophilic molecular groups in the molecule, and has excellent characteristics in cleaning, dispersing, emulsifying, solubilizing, wetting, sterilizing, foaming and penetrating properties according to the present invention. Hydration, so that Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P), its culture or dry powder, or extract of the culture solution in the antimicrobial or insecticidal composition effectively expresses the medicinal effect, It can act to suspend and disperse.
상기 계면활성제로는 알킬벤젠설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트, 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트포르마린 축합물, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 나프탈렌설포석시네이트, 폴리옥시알킬렌석시네이트와 같은 석시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등의 음이온성 계면활성제, 에톡실화 알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬페닐 폴리머, 다중 알코올과 같은 비이온성 계면활성제가 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들은 모두 예시적으로 열거한 것들로서 이들 이외의 계면활성제가 사용될 수 있음은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.The surfactants include sodium salts of sulfonates such as alkylbenzenesulfonates, alkylnaphthalenesulfonates, dialkylsulfosuccinates, ligninsulfonates, alkylnaphthalenesulfonate formalin condensates, polyoxyalkylenealkylphenylsulfonates, or Sodium salts of sulfates such as calcium salts, alkyl sulfates, polyoxyalkylene alkyl sulfates, polyoxyalkylene alkylphenyl sulfates or sodium salts of succinates such as calcium salts, naphthalenesulfosuccinates, polyoxyalkylene succinates or Anionic surfactants such as calcium salts, ethoxylated alkyl ethers, polyoxyalkylene alkylphenyl polymers, and nonionic surfactants such as multiple alcohols may be used alone or in combination of two or more thereof, all of which are listed by way of example. Surfactants other than these may be used as is conventional in the art. It can be easily understood by those who have knowledge.
상기 무기염류는 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)(수탁번호:KACC 91741P), 이의 배양액이나 건조분말, 또는 배양액의 추출물과 함께 농작물 병해충의 중장에 들어가서 독소 단백질이 빠르게 활성독소의 형태로 전환되는 것을 도와주거나 중장벽에 물리적인 상처를 주어 독소의 활성을 증진시킬 뿐만 아니라, 농작물 병해충의 체내에서 생리적인 변화를 유도하여 독소의 작용효과를 높일 수 있도록 작용하는 물질로서 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 구입하여 사용할 수 있을 것이다.The inorganic salts enter the middle of the crop pests together with the photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (accession number: KACC 91741P), its culture solution or dry powder, or the extract of the culture medium. A substance that helps to quickly convert to the form of active toxins or physical damage to the middle barrier to enhance the activity of toxins, as well as to induce physiological changes in the body of crop pests to enhance the effect of toxins As can be easily purchased and used by those skilled in the art.
상기 결합제는 항균 및 살충 활성 성분과 다른 성분인 증량제 등을 서로 결합시키는 역할을 하는 것으로서, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검 또는 잔탄검 등이 단독 또는 2종 이상 혼합되어 있는 것을 사용할 수 있다.The binder acts to bind the antimicrobial and insecticidal active ingredients with other extenders, such as water-soluble starch, dextrin, carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, arabic gum or xanthan gum alone or two. What mixed more than 1 type can be used.
상기 증량제는 상기 계면활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착, 분상화하고, 계면활성제, 항균 및 살충 활성 성분과 함께 조성물의 미립자 표면을 이루는 물질로 작용하며, 전분, 대두박, 밀기울, 입상 섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.The extender is used in conjunction with the surfactant to adsorb and powder the surfactant and, together with the surfactant, antimicrobial and pesticidal active ingredients, to act as a material for forming the particulate surface of the composition, and may contain starch, soybean meal, bran, granular fibres, Yuan, diatomaceous earth, zeolite, bentonite, talc, kaolin, pyrophyllite, white carbon and the like may be used alone or in combination of two or more thereof.
본 발명에 따른 항균 조성물 또는 살충 조성물은 입제, 분제, 액상수화제, 수화제 등의 형태로 제형화 될 수 있으나, 수화제로 제형화되는 것이 바람직하다. 제형화된 살균제 또는 살충제는 사용 전에 물에 500 내지 2,000배, 바람직하게는 약 1,000배로 희석하여 사용할 수 있다. The antimicrobial composition or pesticidal composition according to the present invention may be formulated in the form of granules, powders, liquid hydrating agents, hydrating agents, etc., but is preferably formulated with a hydrating agent. Formulated fungicides or pesticides may be used diluted 500 to 2,000 times, preferably about 1,000 times, in water before use.
본 발명에 따른 항균 조성물 또는 살충 조성물이 농업용으로 사용될 경우, 이들의 적용량은 통상 10 에이커 당, 0.1 내지 100g일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 물로 희석한 후 사용되는 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 및 기타 유사 제형물들의 경우, 그 적용 농도는 통상 1 내지 100,000ppm의 범위이다. 이러한 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 농작물 병해충 또는 식물 병원균의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 다를 수 있으므로, 상기 범위에 한정되지 않고, 증감 가능하다.When the antimicrobial composition or the pesticidal composition according to the present invention is used for agriculture, the application amount thereof may be usually 0.1 to 100 g per 10 acres, but is not limited thereto. For emulsifiable concentrates, wettable powders, flows and other similar formulations used after dilution with water, their application concentrations are usually in the range of 1 to 100,000 ppm. The amount and concentration of such application may vary depending on the type of formulation, time of application, location and method, type of crop pest or plant pathogen, degree of damage and other factors, and are not limited to the above range and may be increased or decreased.
또한, 본 발명의 항균 조성물 또는 살충 조성물은 다른 살곤충제, 살선충제, 살진드기제, 살세균제, 살진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료, 토양 컨디셔너 등과 함께, 혹은 그것들과 별도로 하되 동시에 사용될 수 있다.
In addition, the antimicrobial composition or insecticidal composition of the present invention may be used together with or with other insecticides, nematicides, acaricides, fungicides, fungicides, herbicides, plant growth regulators, synergists, fertilizers, soil conditioners, and the like. Separate but can be used simultaneously.
[실시예][Example]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for illustrating the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예 1: 포투랍두스 템프라타 선별EXAMPLES Example 1: Selection of Porutabudus templata
1-1: 곤충병원성 선충의 분리1-1: Isolation of Insect Pathogenic Nematodes
토양시료(경기도 포천)의 채취는 표면의 건조한 부위를 제거하고, 깊이 10㎝ 이내의 수분을 함유하는 토양을 0.5~1㎏ 정도 채취하여 밀봉하는 방법으로 실시하였으며, 채취한 토양시료는 4℃에 보관하였다. 분리한 토양시료로부터 치사시키는 곤충병원성 선충의 분리는 insect baiting 법(Bedding, 1975)을 사용하였으며, 그 방법은 다음과 같다.The soil samples (Pocheon, Gyeonggi-do) were collected by removing the dry part of the surface and collecting 0.5 ~ 1 kg of soil containing 10 ㎝ depth of water. Respectively. The insect baiting method (Bedding, 1975) was used to isolate insect pathogenic nematodes from the soil samples.
먼저, 토양시료 200g을 플라스틱 상자에 넣고, 증류수를 분무해 고루 섞은 후 선충 탐색용 trap을 넣었으며, 이때 여과지를 1장 덮어서 trap의 치사 곤충을 거둬갈 때 비병원성 선충의 오염을 방지토록 하였다. 그 다음, 멸균 증류수를 분무하여 충분히 적신 여과지 위에 꿀벌부채명나방 유충을 100마리씩 올려놓고 습도와 온도가 각각 50%, 20℃로 유지되는 배양기에서 24시간 간격으로 유충의 살충 효과를 관찰하였다. First, 200 g of soil sample was placed in a plastic box, distilled water was sprayed on it, and a trap for searching nematodes was inserted. At this time, one filter paper was covered to prevent contamination of non-pathogenic nematodes when lethal insects were trapped. Then, 100 larvae of honey bee moth larvae were placed on filter paper which was sprayed with sterilized distilled water, and insecticidal effects of larvae were observed at intervals of 24 hours in an incubator where humidity and temperature were kept at 50% and 20 ° C, respectively.
감염태 유충은 시험접시로 하나씩 분리하여 옮기고, 2~3일 경과한 감염태 유충으로 부터 유리되어 나오는 선충을 분리하였다. 분리한 선충은 상기와 같은 방법으로 꿀벌부채명나방 유충에 재접종 한 후, 20℃에서 약 24~72시간 유지하였다.
The infected larvae were separated and transferred into test dishes one by one, and the nematodes released from the infected larvae were separated after 2 to 3 days. The separated nematodes were re-inoculated into the larvae of the honeybee larvae and maintained at 20 DEG C for about 24 to 72 hours in the same manner as above.
1-2: 곤충병원성 선충으로부터의 공생세균 분리1-2: Isolation of Symbiotic Bacteria from Insect Pathogenic Nematodes
다음의 2가지 방법을 이용하여 곤충병원성 선충으로부터 공생세균을 분리하였다. Symbiotic bacteria were isolated from entomopathogenic nematodes using the following two methods.
첫 번째는 감염태 곤충병원성 선충으로부터 분리하는 방법으로, 0.1% 차아염소산나트륨(NaClO) 용액에 감염태 선충을 담가 선충을 표면 살균한 다음, 멸균된 TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에 넣은 후 갈아 부수거나 분쇄하여 증균하는 방법이며. 두 번째는 곤충병원성 선충을 감염시킨 꿀벌부채명나방 유충으로부터 분리하는 방법으로, 꿀벌부채명나방 유충 당 약 10마리의 선충을 접종하여 25℃에서 12∼48시간 동안 배양한 다음, 선충에 감염되어 죽은 유충을 95% 에탄올로 표면 살균한 후 3~4회 멸균 증류수로 씻은 유충을 해부하여 혈림프(hemolymph)를 TSB 액체 배지에서 배양하여 증균하는 방법이다. The first method is to separate from infectious insect pathogenic nematodes, soak the infectious nematodes in 0.1% sodium hypochlorite (NaClO) solution, surface sterilize the nematodes, and then grind them in sterile Tryptic Soy Broth (TSB) liquid medium. It is a method of crushing or crushing and enriching. The second method is to separate from the honeybee moth larvae infected with the insect pathogenic nematode, inoculate about 10 nematodes per beeworm moth larva and incubate for 12 to 48 hours at 25 ° C. After disinfecting the dead larvae with 95% ethanol, the larvae washed three to four times with sterile distilled water are dissected to cultivate hemolymph (hemolymph) in TSB liquid medium and enrich.
위의 2가지 방법으로 28℃에서 24~48시간 동안 증균시킨 배양액을 멸균된 TSB 배지에 희석시킨 후, 맥콘키(MacConkey) 고체배지에 도말하고, 28℃ 배양기에서 3∼5일 동안 배양하였다. The culture medium enriched for 24 to 48 hours at 28 ° C by the above two methods was diluted in sterile TSB medium, then plated in MacConkey solid medium, and incubated in 28 ° C incubator for 3-5 days.
맥콘키(MacConkey) 고체배지에 형성된 콜로니 중에서 밝은 분홍빛 또는 붉은빛을 나타내는 콜로니를 선별하고, 선발된 콜로니는 NBTA 고체배지로 옮겼으며, NBTA 배지에서 브롬티몰 블루(bromothymol blue)를 흡착하고, 테트라졸리움 클로라이드(tetrazolium chloride)를 환원하여 콜로니의 색깔이 진한 노란색 또는 녹색을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 참고로, 실시예에서 사용된 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.From the colonies formed on MacConkey solid medium, bright pink or red colonies were selected, and the selected colonies were transferred to NBTA solid medium, bromothymol blue was adsorbed on NBTA medium, and tetrazolium was added. Reducing the chloride (tetrazolium chloride) was selected colonies showing a dark yellow or green color of the colonies. For reference, the composition of the medium used in the examples is shown in Table 1 below.
1-3: 곤충병원성 1-3: Insect Pathogenicity 선충eelworm 공생세균의 형태생리학적 특징 확인 Confirmation of Morphological Characteristics of Symbiotic Bacteria
1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균을 동정하기 위하여 광학현미경을 통하여 형태학적 특성을 관찰한 결과, 간상의 모양을 보이며, 편모를 지녔음을 확인하였다.In order to identify the entomopathogenic nematode symbiosis bacteria isolated in 1-2, the morphological characteristics were observed through optical microscopy.
또한, 생화학적 특성을 조사하기 위하여, TSA(Tryptic Soy Agar) 사면배지에서 28℃로 24시간 배양한 후, 3% KOH 용액을 이용하여 그람염색반응을 식별하였고, 브롬티몰블루와 글루코오스가 함유된 배지에 균주를 접종한 후, 액체파라핀을 덮어 30℃에서 2일간 배양한 후 발색을 통하여 산소 요구성을 확인하였다. 인돌생성은 균주를 1% TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에 접종하고, 27℃에서 2일간 배양한 후 코백스 시약(Kovacs' reagent)을 10방울 떨어뜨려 변화를 관찰하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.In addition, in order to investigate the biochemical properties, after 24 hours incubation at 28 ℃ in TSA (Tryptic Soy Agar) slope medium, the Gram staining reaction was identified using 3% KOH solution, bromine thiblue and glucose containing After inoculating the strain into the medium, and incubated for 2 days at 30 ℃ covered with liquid paraffin and confirmed the oxygen demand through color development. Indole production was inoculated with 1% TSB (Tryptic Soy Broth) liquid medium, incubated for 2 days at 27 ° C, and 10 drops of Kovacs' reagent were observed to observe the change. Shown in
(Characters)characteristic
(Characters)
(Host)Host
(Host)
(Gram staining)Gram stain
(Gram staining)
(Oxygen requirements)Oxygen composition
(Oxygen requirements)
(Indol production)Indole production
(Indol production)
(shape)shape
(shape)
(Cell length)Cell length
(Cell length)
(Cell width)Cell width
(Cell width)
(Filagella type)Flat hair type
(Filagella type)
(Mortility)motility
(Mortility)
(Bioluminescence)Bioluminescence
(Bioluminescence)
1) +: (Positive reaction), -: (Negative reaction), d: (weak reaction)
1) +: (Positive reaction), - (Negative reaction), d: (weak reaction)
버기스 매뉴얼(Bergy's manual)에 기재된 사항과 비교한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균은 포토랍두스 속의 균주임을 확인할 수 있었다.
As shown in Table 2, it was confirmed that the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria isolated in 1-2 were strains of the genus Photorapdus as compared with the items described in the Bugis manual.
1-4: 종 동정1-4: Identification
1-4-1: 탄소 이용원 조사1-4-1: Carbon Source Survey
1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균이 포토랍두스 속에 속하는 세균임을 확인한 후, 이의 종을 동정하기 위하여 탄소 이용원 조사를 실시하였다. 미국의 바이오로그(Biolog) 사의 마이크로플레이트를 이용하여 세균을 접종, 배양한 후 탄소원의 이용 여부를 조사하였다. 조사된 결과를 포토랍두스 속의 공지 균주와 비교하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. After confirming that the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria isolated at 1-2 were bacteria belonging to the genus Photorapdus, a carbon utilization survey was conducted to identify the species. Bacteria were inoculated and cultured using a microplate of Biolog, USA, and the use of carbon sources was examined. The examined results were compared with known strains of the genus Photorapdus, and the results are shown in Table 3.
(탄소이용원)Characteristic
(Carbon source)
+: 90% 이상, [+] : 76~89%, d : 26~75%, [-]: 11~25%, - : 0~10%
+: 90% or more, [+]: 76 to 89%, d: 26 to 75%, [-]: 11 to 25%
표 3의 결과로부터, 분리균주는 포토랍두스속의 템페라타 템프라타(P.temperata subsp. temperata)인 것을 확인할 수 있었다.
From the results of Table 3, it was confirmed that the isolated strain is P. temperata subsp. Temperata of the photolapdus genus.
1-4-2: 16S rDNA의 서열분석1-4-2: Sequencing of 16S rDNA
분리균주의 종에 대한 동정을 더욱 확실하게 확인하기 위하여 16S rDNA의 서열분석을 수행하였다.Sequencing of 16S rDNA was performed to more clearly identify the species for the isolate strain.
먼저, genomic DNA extraction kit를 이용하여 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균으로부터 genomic DNA를 추출하였다. First, genomic DNA was extracted from the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria isolated in 1-2 using genomic DNA extraction kit.
즉, 튜브에 공생세균 및 DNA 추출용액을 첨가하고, 60℃ 배양기(JSR cat.no JSON-150)에서 30분간 배양한 다음, 100℃에서 10분간 가열하고 3분간 냉각하는 과정을 5~6회 반복하였다. 다음으로, 13,200rpm에서 10분간 원심분리 후, 1% 아가로즈 겔에 침전물을 로딩함으로써, 곤충병원성 선충 공생세균의 genomic DNA를 추출하였다.In other words, add the symbiotic bacteria and DNA extract solution to the tube, incubate for 30 minutes in a 60 ℃ incubator (JSR cat.no JSON-150), then heated at 100 ℃ for 10 minutes and cooled for 3 minutes 5-6 times Repeated. Next, after centrifugation for 10 minutes at 13,200rpm, by loading the precipitate in 1% agarose gel, genomic DNA of the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria was extracted.
추출된 genomic DNA를 주형으로 사용하여 PCR(polymerase chain reaction) 방법에 의하여 16S rDNA를 증폭하였다. 16S rDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using extracted genomic DNA as a template.
PCR을 위한 반응액은 10 × EF-Taq 완충액(buffer) 2.5 ㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, 10 pmol 포워드 프라이머(서열번호 1) 1 ㎕, 10 pmol 리버스 프라이머(서열번호 2) 1 ㎕, 2.5U/㎕ EP Taq 1㎕, 주형 DNA(template DNA-50~100ng) 1 ㎕, 증류수 25㎕을 각 튜브에 혼합하였다. The reaction solution for PCR was 2.5 μl 10 × EF-Taq buffer, 0.5 μl 10 mM dNTP, 1 μl 10 pmol forward primer (SEQ ID NO: 1), 1 μl 10 pmol reverse primer (SEQ ID NO: 2), 2.5
[서열번호 1] : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'[SEQ ID NO 1]: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[서열번호 2] : 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[SEQ ID NO 2]: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 '
16S rDNA의 증폭은 PCR 장치(PTC-100 MJ Research, Minnesota, USA)를 이용하여 반응액을 95℃에서 15분간 반응시킨 후, 95℃에서 20초간, 60℃에서 40초간, 72℃에서 1분 30초간 각각 반응시키는 것을 30회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시키는 과정으로 수행하였다.Amplification of 16S rDNA was performed by using a PCR apparatus (PTC-100 MJ Research, Minnesota, USA) for 15 minutes at 95 ° C, followed by 20 seconds at 95 ° C, 40 seconds at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C. Each reaction was repeated 30 times for 30 seconds, and finally, the reaction was performed at 72 ° C. for 5 minutes.
다음으로, Sequencer(ABI 3730XL DNA Analyzer)를 이용하여 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석하였다. 시퀀싱을 위하여 BigDyeⓡ Therminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Scoresby, VIC, Australia)를 이용하였다. Next, the sequence of the PCR amplification product was analyzed using a Sequencer (ABI 3730XL DNA Analyzer). BigDye® Therminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Scoresby, VIC, Australia) was used for sequencing.
시퀀싱 결과, 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균의 16S rDNA의 전체 염기(서열번호 3)의 수는 1509개인 것으로 확인되었다.
Sequencing confirmed that the total number of bases (SEQ ID NO: 3) of 16S rDNA of the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria isolated at 1-2 was 1509.
먼저, 포토랍두스 타입 종(Photorhabdus type strain)과의 16S rDNA 서열 비교를 통한 neighborjoining methods을 사용하여 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)를 작성하고, 도 1에 나타내었다. 도 1에서 붉은 색으로 표시된 바와 같이, 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균은 포토랍두스속의 템페라타 템프라타(P.temperata subsp. temperata) 계통이라는 것을 확인할 수 있었다.First, a phylogenetic tree was prepared by using neighborjoining methods by comparing 16S rDNA sequences with Photorhabdus type strain, and shown in FIG. 1. As shown in red in Figure 1, it was confirmed that the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria isolated from 1-2 is a P.temperata subsp. Temperata strain of the genus photorapdus .
다음으로, NCBI에 등록된 포토랍두스 속 균주의 16S rDNA 염기서열과 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균의 16S rDNA 염기서열의 상동성을 NCBI의 Blastn을 이용하여 조사하였으며(도 2 참조), 상동성이 높게 나타난 공지 균주인 P. temperata subsp. temperata BE09 NCBI EU930337의 염기서열을 비교하고, 도 3에 나타내었다. Next, the homology between the 16S rDNA sequences of the photolobus genus strains registered in NCBI and the 16S rDNA sequences of the insect pathogenic nematode symbiosis bacteria isolated from 1-2 was investigated using Blastn of NCBI (see FIG. 2). ), P. temperata subsp. The base sequences of temperata BE09 NCBI EU930337 were compared and shown in FIG. 3.
도 3에 도시된 바와 같이, 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균의 16S rDNA는 공지 균주인 P. temperata subsp. temperata BE09 NCBI EU930337의 16S rDNA와 99.2 %의 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 밑줄로 표시되어 있는 바와 같이, 서열이 완전히 동일하지 않으므로, 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균은 상기 종에 속하는 신규 균주임을 최종적으로 확인할 수 있었다.
As shown in Figure 3, 16S rDNA of the insect pathogenic nematode symbiotic bacteria isolated from 1-2 is known strain P. temperata subsp. temperata BE09 NCBI EU930337 was found to have 99.2% homology with 16S rDNA. However, as indicated by the underline, since the sequences are not completely identical, the insect pathogenic nematode symbiosis isolated at 1-2 was finally confirmed to be a new strain belonging to the species.
16S rDNA를 이용한 상동성 조사 결과에 따라 1-2에서 분리된 곤충병원성 선충 공생세균은 포토랍두스속의 템페라타 템프라타(P.temperata subsp. temperata)인 것을 확인할 수 있었고, 이를 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104(Photorhabdus temperata subsp. temperata ECOWIN_104)로 명명하고, 2012년 9월 13일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁(수탁번호: KACC 91741P)하였다.
According to the results of homology using 16S rDNA, the insect pathogenic nematode symbiosis isolated from 1-2 was confirmed to be P.temperata subsp.temperata of the genus Photorapdus. It was named Tatempprata ECOWIN_104 (Photorhabdus temperata subsp. Temperata ECOWIN_104) and deposited on September 13, 2012 at the National Institute of Agricultural Science, Agricultural Genetic Resource Center (Accession Number: KACC 91741P).
실시예 2: 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104의 항균력 확인Example 2: Confirmation of the antimicrobial activity of photolapdus temperata tempprata ECOWIN_104
포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 배양액을 5,000rpm에서 20분간 원심분리 후, 상등액에 헥산, 에틸아세테이트, 에탄올 및 물을 순차적으로 첨가하고, 분획하면서, 헥산 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 에탄올 추출물 및 물 추출물을 각각 획득하였다.Centrifugation of the Photolapus temperata temprata ECOWIN_104 culture medium at 5,000 rpm for 20 minutes, and then hexane, ethyl acetate, ethanol and water were added sequentially to the supernatant, and fractionated. Extracts were obtained respectively.
각각의 추출물을 500ppm으로 희석하여 평판배지에 도말한 후, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)(KACC 40573), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)(입수처: 계명대학교 미생물학과), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare)(입수처: 계명대학교 미생물학과), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)(입수처: 계명대학교 미생물학과), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(입수처: 계명대학교 미생물학과) 및 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)(입수처: 계명대학교 미생물학과)을 각각 접종한 다음, 12시간 이후 활성을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.Each extract was diluted to 500 ppm and plated on a plate medium, followed by Botrytis cinerea (KACC 40573), Phytophthora capsici (obtained from Keimyung University) , Colletotrichum orbiculare (obtained from Keimyung University) , Fusarium oxysporum (Department of Microbiology, Keimyung University), Rhizoctonia solani (Department of Microbiology, Keimyung University) and After inoculating Rhizoctonia cerealis (obtained: Department of Microbiology, Keimyung University), the activity was measured after 12 hours, and the results are shown in Table 4.
본 실험에 이용된 식물병원균들은 모두 일반적인 감자한천배지(Potato dextrose agar medium : PDA)에서 잘 자라는 것들이었으므로 이들을 PDA에 키우며 식물체 추출물의 항균활성을 검정하였다. 우선 공생균 추출물들을 각각 500ppm이 되도록 첨가하여 PDA를 조제하고 그 위에 지름 5mm cork borer로 채취한 각 병원균 균사 절편을 올려 놓고 25℃ 항온기에서 배양하며 균총의 형성과 크기를 조사하였다. The phytopathogens used in this experiment were all grown well in the common potato agar medium (Potato dextrose agar medium: PDA), so they were grown on PDA and tested for the antimicrobial activity of plant extracts. First, PDA was prepared by adding 500 ppm of symbiotic extract, and each pathogen mycelial section taken with a 5mm diameter cork borer was placed on it, and cultured in a 25 ℃ thermostat.
추출물의 항균효과는 추출물 처리 4일 후 대조군(무처리구)과 추출물 처리구의 병원균의 균사 생장 크기를 비교 분석하였으며, 대조군으로는 추출물 처리 없이 순수 물을 이용한 PDA 배지를 사용하였다.
The antimicrobial effect of the extract was analyzed by comparing the mycelial growth of pathogens of the control group (untreated) and the extract treated 4 days after the extract treatment. As a control, PDA medium using pure water was used without extract treatment.
oxysporumoxysporum
solanisolani
cerealiscerealis
표 4에 나타난 바와 같이, 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 배양액의 용매 추출물은 모두 식물 병원균인 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 애쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 대한 항균활성을 가지고 있으며, 특히 에틸아세테이트 추출물 및 에탄올 추출물의 항균활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
As shown in Table 4, the solvent extracts of the cultured photolapus temperata temprata ECOWIN_104 were all plant pathogens, Botrytis cinerea, Phytophthora capsici , and choletotricum . Colletotrichum acutatum , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani and It has an antimicrobial activity against Rhizoctonia cerealis ( Rhizoctonia cerealis ), in particular, it was confirmed that the antibacterial activity of the ethyl acetate extract and ethanol extract.
실시예 3: 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104의 살충력 확인Example 3: Confirmation of the insecticidal power of photolapdus temperata tempprata ECOWIN_104
실시예 2에서 획득된 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 배양액의 용매 추출물을 DMSO로 희석하여 500배로 제조하였으며, 배추 잎의 디스크를 10×10Cm로 만들어 각각의 제형화된 제제 500배 액에 30초간 침지한 후 꺼내어 30분 이상 충분히 음건한 다음, 상부에 공기가 통할 수 있는 페트리디쉬(직경: 10Cm, 높이: 4Cm)에 배추좀나방(Spodoptora exigua)과 담배거세미나방(Spodoptora litura) 3~4령 유충(경북바이오산업연구원 313호 생물이용연구소에서 분양받음)을 각각 5마리씩 올려놓았다. 이때 사육실의 온도는 25±3℃, 습도는 40~60%를 유지시켰다. 그리고, 무처리에는 물을 살포하였다.The solvent extracts of the Photolapdus temperata tempprata ECOWIN_104 culture broth obtained in Example 2 were prepared by diluting with
처리 후 24시간 간격으로 3일간 작은 붓으로 유충의 몸을 건드려 움직이지 않으면 죽은 것으로 판단하며 관찰하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
After the treatment, the larvae were touched with a small brush for 3 days at 24 hours intervals, and the body was observed to be dead. The results are shown in Table 5.
표 5에 나타난 바와 같이, 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 배양액의 용매 추출물은 모두 배추좀나방 및 담배거세미나방 유충에 대한 살충활성을 가지고 있으며, 특히 에틸아세테이트 추출물 및 에탄올 추출물의 살충활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
As shown in Table 5, the solvent extracts of the Photolapdus temperata tempprata ECOWIN_104 culture medium have insecticidal activity against the larvae of Chinese cabbage moth and tobacco germweed moth, and especially the pesticidal activity of ethyl acetate extract and ethanol extract. It was confirmed that it was excellent.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereto will be. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
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Claims (13)
Botrytis cinerea, Phytophthora capsici , Colletotrichum acutatum , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani ) And Antimicrobial activity against one or more plant pathogens selected from the group consisting of Rhizoctonia cerealis and one or more crop pests selected from the group consisting of Plutella xylostella and Spodoptera litura Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 (accession number: KACC 91741P) having simultaneously insecticidal activity against.
Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P) or its culture medium as an active ingredient, Botrytis cinerea, Phytophthora capsaici ( Phytophthora capsici ), Colletotrichum acutatum , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani and Antimicrobial composition, characterized in that it has an antimicrobial activity against at least one plant pathogen selected from the group consisting of Rhizoctonia cerealis ( Rhizoctonia cerealis ).
Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P) or its culture medium as an active ingredient, Plutella xylostella and Tobacco moth moth ( Spodoptera litura ) Insecticidal composition, characterized in that it has insecticidal activity against at least one crop pest selected from the group consisting of.
Photorhabdus temperata tempprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P) Contains an extract of the culture medium as an active ingredient, Botrytis cinerea, phytophthora capsaici ( Phytophthora capsici ), Colletotrichum acutatum , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani and Antimicrobial composition, characterized in that it has an antimicrobial activity against at least one plant pathogen selected from the group consisting of Rhizoctonia cerealis ( Rhizoctonia cerealis ).
The antimicrobial composition of claim 8, wherein the extract is extracted by adding a solvent selected from the group consisting of hexane, ethyl acetate, ethanol, and water to the strain culture medium of claim 1.
Photorhabdus temperata temprata ECOWIN_104 ( Photorhabdus temperata subsp.temperata ECOWIN_104) (Accession No .: KACC 91741P) Contains the extract as an active ingredient, Chinese cabbage moth ( Plutella xylostella ) and tobacco moth ( Spodoptera litura ) Insecticidal composition, characterized in that it has insecticidal activity against at least one crop pest selected from the group consisting of.
The insecticidal composition according to claim 11, wherein the extract is extracted by adding a solvent selected from the group consisting of hexane, ethyl acetate, ethanol and water to the strain culture medium of claim 1.
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