KR100522667B1 - Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내에서 채집된 메기디스곤충병원선충(Heterorhabditis megidis KCTC10453BP)으로부터 분리한 포토랍두스 속의 새로운 균주에 관한 것으로, 본 발명에서는 항균력과 살충력이 우수한 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2003년 3월 21일, 수탁번호: KACC 91042)이 제공된다.The present invention relates to a new strain of the genus Photorabdus isolated from Heterorhabditis megidis KCTC10453BP collected in Korea, in the present invention is excellent in the antibacterial and insecticidal photolapus temperata temperata ANU101 ( P. temperata . subsp temperata ANU101, depository: agricultural biotechnology Research Institute, commissioned: March 21, 2003, accession number: KACC 91042) is provided.

Description

포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 {Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101}Photorapduus temperata Temperata AN # 101 {Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101}
본 발명은 곤충병원선충으로부터 분리한 포토랍두스 속의 새로운 세균에 관한 것으로, 특히 국내 토양미생물 자원으로부터 탐색한 메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis)으로부터 분리한 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101, 기탁기관: 농업생명공학연구원,수탁일: 2003년 3월 21일, 수탁번호: KACC 91042)에 관한 것이다.The present invention relates to a new bacterium of the genus Photorapdus isolated from an insect pathogenic nematode, and in particular, photorapid temperata temperata ANU101 ( P. sp. Isolated from Heterorhabditis megidis detected from domestic soil microbial resources . temperata subsp.temperata ANU101, Depositary Organization: Institute of Agricultural Biotechnology, Deposit Date: March 21, 2003, Accession No .: KACC 91042).
농작물에 심각한 경제적 피해를 주는 곤충류를 해충이라 하며 이러한 해충을 방제할 목적으로 사용하는 것이 농약중 살충제이다. 현재의 살충제는 대부분 유기 합성된 화학농약으로 지난 50년간 해충 방제에 중요 방제자로서 역할을 담당하였다. 그러나 이러한 화학 살충제의 과다 사용과 연용으로 현재 크게 3가지 문제에 봉착하게 되었다. 우선 대상 해충의 약제에 대한 저항성(resistance)의 발현이다. 약제에 대한 저항성 발현은 약제의 효과를 저하시켰으므로 사용자인 농민은 더욱 자주 살포하거나 또는 살포량을 늘려야 했고, 이는 경제적 수지면에서 농자재 및 인건비의 증가로 생산비 가중을 일으겼다. 또한, 화학농약은 기존의 생물들의 먹이사슬에 의한 평형 상태를 깨뜨려 천적의 감퇴를 초래하므로 기존의 제2차 해충이 이제는 주요 해충화되는 격발(resurgence) 현상을 일으켜 더욱 다양한 해충상을 낳게 되었다. 그리고 이러한 이유들은 화학농약의 사용을 더욱 가속화시켰으며 이를 통해 심각한 환경오염 (environmental pollution)을 초래하게 되었다.Insects that cause serious economic damage to crops are called pests, and pesticides are used to control these pests. Current pesticides are mostly organically synthesized chemical pesticides that have played an important role in controlling pests over the last 50 years. However, the overuse and use of such chemical insecticides has led to three major problems. First is the expression of resistance of the pest to the drug. Resistant resistance to the drug lowered the drug's effectiveness, so farmers who were users had to spray more often or increase the amount of spray, which increased production costs due to the increase of agricultural materials and labor costs on the economic surface. In addition, chemical pesticides break the equilibrium caused by the food chain of existing organisms and cause natural degradation, resulting in a variety of insect pests by causing a secondary pest infestation. These reasons further accelerated the use of chemical pesticides, which resulted in serious environmental pollution.
이러한 화학농약의 폐단을 보완하고자 생물농약 (biopesticide)의 개발이 진행되어 왔다. 이중 곤충에 선택적으로 살충력을 보유하며 환경조건에서 비교적 안정한 비티(Bacillus thuringinesis: Bt) 등이 효과적인 살충제로 인정받아 현재 나비목 곤충을 대상으로 상용화되어 있다.In order to complement the chemical pesticides, the development of biopesticides has been in progress. Among them, insects that selectively retain insecticides and are relatively stable under environmental conditions, such as Bacillus thuringinesis (Bt), are recognized as effective insecticides and are currently commercialized for lepidoptera insects.
그러나 지금까지의 생물농약은 선택성 때문에 대상 해충의 종류가 제약적이고, 화학농약과 비교하여 살충효과면에서 문제점들이 지적되고 있다. 살충제로서의 유효성이 인정된 비티 살충제의 경우도 최근에는 야외에서의 저항성이 보고 되고 있으며, 특히 파밤나방과 같이 다양한 약제에 대해 저항성을 보유하는 해충들에 대해서는 매우 낮은 감수성을 보이고 있다.However, until now, biopesticides have limited selectable pests due to their selectivity, and problems have been pointed out in terms of pesticidal effects compared to chemical pesticides. In the case of the bitty pesticides that have been recognized as effective insecticides, the resistance to the outdoors has recently been reported, and in particular, they show very low susceptibility to pests having resistance to various drugs such as pabam moths.
메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis)은 나비목 해충 등의 경제성 해충에 대해 살충력을 나타내는 생물적방제인자로, 이 선충의 살충효과는 이 선충의 장내에 공생하는 공생세균에 기인하는 것으로 알려져 있다. 공생선충의 도움으로 대상 해충의 혈강 내에 들어간 공생세균은 LPS(Lipopolysaccharide) 또는 특이 독소 물질을 분비하여 기주의 면역반응을 빠르게 무력화시키고, 자신의 생장에 유리한 환경으로 전환시킨다. 이후 이들 세균의 성장에 따라 곤충은 혈액의 패혈증이 진행되어 치사에 이르게 된다. Heterorhabditis megidis is a biological control factor that shows insecticidal properties against economic pests such as lepidopteran pests. The insecticidal effect of this nematode is known to be due to symbiotic bacteria in the intestine. With the help of symbiotic nematodes, symbiotic bacteria that enter the bloodstream of a target pest secrete LPS (Lipopolysaccharide) or specific toxins, which quickly neutralize the host's immune response and convert it into an environment favorable for its growth. Then, as the bacteria grow, insects progress to sepsis in the blood, leading to death.
참고문헌 :references :
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, 2 nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Weisburg, G. W., Barns, S. M., Pelletier, D. A., and Lane, D. J. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173:697-703. Weisburg, G. W., Barns, S. M., Pelletier, D. A., and Lane, D. J. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173: 697-703.
본 발명자들은 새로운 생물농약의 개발을 목표로 국내 토양미생물 자원으로부터 신규 미생물을 탐색한 결과, 국내 최초로 메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis KCTC10453BP)을 채집하고 이로부터 항균력과 뛰어난 살충력이 있는 포토랍두스 속의 새로운 균주를 분리, 동정하게 되었다.The present inventors searched for new microorganisms from domestic soil microbial resources with the aim of developing new biopesticides. As a result, we collected Heterorhabditis megidis KCTC10453BP for the first time in Korea, and from the genus Photorapdus with antibacterial and excellent insecticidal properties. New strains were isolated and identified.
본 발명은 메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis)의 공생세균인 포토랍두스 속의 새로운 균주에 관한 것으로, 본 발명에서는 그 동안 외국에서 보고된 포토랍두스(Photorhabdus) 속 균주와 다른 균주특성을 보이는 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2003년 3월 21일, 수탁번호: KACC 91042)을 제공한다.The present invention relates to a new strain of the genus Photorapdus , a symbiotic bacterium of Heterorhabditis megidis , and in the present invention, photorhabdus ( Photorhabdus ) strains that have been reported in foreign countries have shown different strain characteristics Rapdus temperata temperata ANU101 ( P. temperata subsp.temperata ANU101, Depositary: Institute of Agricultural Biotechnology, Deposited: March 21, 2003, Accession No .: KACC 91042).
본 발명에서는 국내 토양미생물 자원으로부터 탐색한 메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis KCTC10453BP)으로부터 포토랍두스 템페라타 템페라타(P. temperata subsp. temperata)의 새로운 균주를 분리하고, 동정하였다.In the present invention, a new strain of P. temperata subsp. Temperata was isolated and identified from Heterorhabditis megidis KCTC10453BP, which was searched from domestic soil microbial resources.
경북 안동시 송천동 안동대학교 뒷산 밤나무 아래 토양을 채집하여 꿀벌부채명나방과 파밤나방에 접종하여 메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis KCTC10453BP; 기탁기관: 생명공학연구원 유전자은행, 수탁일: 2003.3.26. 수탁번호: KCTC10453BP; 대한민국 특허출원 제10-2003-30070호)을 분리한 후 이 선충 감염태로부터 세균을 분리하였다. Heterorhabditis megidis KCTC10453BP; Deposited: Genetic Bank of Biotechnology Research Institute, Date of deposit: March 26, 2003 : KCTC10453BP; Korean Patent Application No. 10-2003-30070) were isolated and bacteria were isolated from the nematode infection.
분리된 세균(이하 "본 발명 분리균주"라 함)을 동정하기 위하여 먼저 생리 및 생화학적 반응을 조사하였다. 그람염색, 산소요구성, 인돌생산, 형태, 세포길이, 편모타입, 운동성 등의 기본적인 생리·생화학적 반응을 통해 본 발명 분리균주를 포토랍두스 속으로 분류하였으며, 결과는 실시예 2의 표 6과 같다. 다시 종 동정을 위해 탄소이용원 조사를 하였으며, 조사결과를 포토랍두스 속의 공지균주와 비교하였다. 비교결과는 실시예 2의 표 7과 같고, 이러한 결과에 따라 본 발명 분리균주를 포토두스 템페라타 템페라타 (P. temperata subsp. temperata)로 분류하였다. 이밖에도 본 발명 분리균주에 대해 다른 탄소원이용원 조사, 지방산 분석, 생육온도 실험 등을 실시하여 균주 특성을 알아보았다. The physiological and biochemical reactions were first examined to identify isolated bacteria (hereinafter referred to as "strain isolates"). The isolated strains of the present invention were classified into photolapdus through basic physiological and biochemical reactions such as gram staining, oxygen urine composition, indole production, morphology, cell length, flagella type, and motility. Same as Again, carbon source survey was conducted to identify species, and the results were compared with known strains in the genus Photorapdus. The comparative results are shown in Table 7 of Example 2, and according to the results, the isolated strains of the present invention were classified into P. temperata subsp. Temperata. In addition, the strain characteristics of the isolated strains of the present invention were examined by performing other carbon source investigation, fatty acid analysis, growth temperature test, and the like.
또한, 본 발명 분리균주에 대해 16S rDNA의 서열분석을 실시하고, 그 결과를 포토랍두스 속의 공지균주와 비교하였다. 서열분석(Sequencing)한 결과는 서열목록 1 및 도 4a, 4b와 같다. 본 발명 분리균주는 16S rDNA의 전체 염기수가 1539개로 확인되었으며, 기존에 보고된 템페라타 템페라타 러시아균주 (P. temperata subsp. temperata NCBI AJ007405)와 1526 염기서열 중에서 1516개의 염기가 동일하여 99.5 %의 상동성을 갖는 것으로 나타났고, 반면 4개의 염기 전위 (Transition), 2개의 염기 전환 (Transversion), 그리고 3개의 Gap이 형성되어 있어 계통간 차이점 또한 있는 것으로 확인되었다. 도 4b는 본 균주의 16S rDNA 염기서열(A)을 NCBI에 등록된 포토랍두스 속의 공지균주(B∼G)와 비교하여 계통발생학적 모식도로 나타낸 것이며, 공지균주와 본 발명 분리균주의 16S rDNA 염기서열을 비교분석한 결과는 표 9와 같다.In addition, the isolated strain of the present invention was subjected to sequencing of 16S rDNA, and the results were compared with the known strains of the genus Photorapdus. Sequencing results are shown in SEQ ID NO: 1 and FIGS. 4A and 4B. The isolated strain of the present invention was confirmed that the total number of bases of the 16S rDNA is 1539, and 159.5 bases among the previously reported Temperata temperata Russian strain ( P. temperata subsp. Temperata NCBI AJ007405) and 1526 nucleotide sequences are 99.5% It was shown to have homology, while four base transitions, two transitions, and three Gaps were formed, confirming the differences between the lines. Figure 4b shows a 16S rDNA nucleotide sequence (A) of the strain compared to the known strain (B-G) of the genus Photolabdus registered in NCBI, showing a phylogenetic schematic diagram, 16S rDNA of the known strain and the isolated strain of the present invention Comparative results of the nucleotide sequences are shown in Table 9.
상기와 같은 분석결과에 따라 메기디스 곤충병원선충 ((Heterorhabditis megidis KCTC10453BP)으로부터 분리한 본 발명 분리균주를 포토랍두스 템페라타 템페라타의 새로운 균주로 동정하고 균주명을 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101)로 명명하였으며, 2003년 3월 21일자로, 농업생명공학연구원에 수탁번호 KACC91042로 기탁하였다.According to the above analysis results, the isolated strain of the present invention isolated from Heterorhabditis megidis KCTC10453BP was identified as a new strain of photolabdus temperata temperata, and the strain name was identified as photorapdus temperata temperata ANU101 ( P. temperata subsp.temperata ANU101), dated March 21, 2003, was deposited with KACC91042 by the Institute of Agricultural Biotechnology.
본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101은 배양액에 부탄올을 가하여 추출한 부탄올분획구에서 식물병원세균에 대해 항균력을 나타내는 것으로 실험을 통해 확인되었다. 실험결과, 본 균주의 부탄올 추출물은 펙토박테리움 카로보룸 아트로셉티움(Pectobacterium carovorum subsp. atroseptium), 펙토박테리움 카로보룸 카로토보룸(Pectobacterium carovorum subsp. carotovorum), 마이크로코커스 렌텔리스(Micrococcus lentelis)에 대해 항균력을 갖는 것으로 나타났다. 본 균주는 성장시기면에서는 최대 증식기에서 최대로 항균능력을 발휘하는 것으로 확인되었다 (도 5).Photolabduus temperata temperata ANU101 of the present invention was confirmed through experiments to show the antimicrobial activity against phytopathogenic bacteria in the butanol fraction extracted by adding butanol to the culture. Result, the butanol extract of the strain Peck tobak Te Solarium car Robo Room art forceps tium (Pectobacterium carovorum subsp. Atroseptium) to peck tobak Te Solarium car Robo room Caro sat borum (Pectobacterium carovorum subsp. Carotovorum), micro Lactococcus rentel lease ( Micrococcus lentelis ) has been shown to have an antimicrobial activity. This strain was confirmed to exhibit the maximum antimicrobial capacity in the growth phase in terms of growth (Fig. 5).
또한, 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101은 살충력 시험에서 대상 해충으로 사용한 나비목의 누에 (Bombyx mori), 파밤나방 (Spodoptera exigua), 화랑곡나방 (Plodia interpunctella), 미국흰불나방 (Hyphanria cunca)의 4종 모두에 대해 20 시간 이내에 높은 살충력을 나타내는 것으로 확인되었으며, 특히 적절한 농도로 사용할 경우 파밤나방, 화랑곡나방, 미국흰불나방에 대해 100%에 가까운 살충력을 보였다 (도 6).In addition, Photorabdus temperata temperata ANU101 is a four species of lepidoptera ( Bombyx mori ), moth ( Spodoptera exigua ), Plodia interpunctella , and American White Moth ( Hyphanria cunca ) It was found to exhibit high insecticidal activity within 20 hours for all, particularly close to 100% insecticide against Pabamoth, Hwagok-moth, American White Bull Moth when used at an appropriate concentration (Fig. 6).
실험을 통해 확인된 바와 같이, 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101은 다양한 식물병원세균을 방제하는 방제제로 사용될 수 있으며, 동시에 나비목 해충에 대한 효과적인 방제제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 실험한 식물병원세균이나 나비목 해충 이외에도 본 균주가 살균 및 살충력을 나타내는 모든 세균과 해충에 대해 방제제로 사용될 수 있다. 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101은 식물병원세균의 방제나 해충방제 목적으로 단독으로 사용되거나, 또는 다른 생물농약이나 화학농약과 함께 사용될 수 있다. 다른 농약과 함께 사용하는 방법은, 본 균주와 다른 농약을 혼합하여 조성물 형태로 사용하거나, 또는 본 균주와 다른 농약 제제를 분리하여 각각 사용하되, 예를 들어 순차적으로 살포하는 것과 같이 방법상 혼용하여 사용할 수도 있다. As confirmed through the experiments, photolabduus temperata temperata ANU101 of the present invention can be used as a control agent for controlling various phytopathogenic bacteria, and at the same time can be used as an effective control agent for lepidopteran pests. In addition, in addition to the phytopathogenic bacteria or lepidopteran pests tested in the present invention, this strain can be used as a control against all bacteria and pests exhibiting sterilization and insecticidal properties. Photolapus temperata temperata ANU101 of the present invention may be used alone or for the control of phytopathogenic bacteria or pest control, or may be used together with other biopesticides or chemical pesticides. For use with other pesticides, the present strains and other pesticides may be mixed in the form of a composition, or the present strains and other pesticide preparations may be separately used, for example, mixed in a method such as spraying sequentially. Can also be used.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 다음의 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1Example 1
ANU101의 분리Isolation of ANU101
경북 안동시 송천동 안동대학교 뒷산 밤나무 아래 토양을 채집하여 꿀벌부채명나방과 파밤나방 5령충에 접종하여 메기디스곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis KCTC10453BP)을 분리하였다. 이 선충 감염태(400마리)를 250ppm 스트렙토마이신이 포함된 0.06% NaOCl 용액에서 30분간 표면소독한 후 균질기로 선충 전체를 마쇄하였다. 이 추출물을 다음의 표 1의 배지(MacConkey agar™배지)를 사용하여 형광을 발하는 밝은 핑크색의 세균을 분리하였다. 이들 세균을 표 2의 NBTA 배지에 올려 놓은 후 콜로니를 둘러싸는 흰색띠를 형성하는 녹색 콜로니를 다시 분리하였다. 또한 동일한 분리 방법으로 선충에 감염된 꿀벌부채명나방과 파밤나방의 혈액으로부터도 유사 균주를 분리하였다. Soterorhabditis megidis KCTC10453BP was isolated by collecting the soil under the chestnut trees of Andong National University, Andong-si, Andong-si, Gyeongbuk. The nematode infection (400 animals) was surface sterilized in a 0.06% NaOCl solution containing 250 ppm streptomycin for 30 minutes, and then the whole nematode was crushed with a homogenizer. This extract was used to isolate the bright pink bacteria that fluoresce using the media in Table 1 (MacConkey agar ™ medium). After placing these bacteria on the NBTA medium of Table 2, green colonies forming white bands surrounding the colonies were isolated again. Similar strains were also isolated from the nematode beeworm moth and pabam moth blood.
실시예 2Example 2
ANU101의 동정 : 생리 및 생화학적 반응 Identification of ANU101: Physiological and Biochemical Responses
(1) 속 동정(1) in sympathy
실시예 1에서 분리된 균주(이하 "분리균주"라 함)의 세균 속(genus)을 생리 및 생화학적 반응을 통해 동정하였다. The bacterial genus of the strain isolated in Example 1 (hereinafter referred to as "isolation strain") was identified through physiological and biochemical reactions.
본 발명의 분리균주를 표 3의 TSA 사면배지에서 28℃로 24시간 배양한 후 3% KOH 용액을 이용하여 그람염색반응을 식별하였다. 산소 요구성은 브롬티몰블루와 글루코오스가 함유된 배지에 세균을 접종한 후 액체파라핀을 덮어 30℃에서 2일간 배양한 후 발색을 확인하였다. MR시험은 세균을 표 4의 MR-VP 배지에 접종하여 30℃에서 5일간 배양한 후 배지에 MR시약을 떨어뜨려 배지의 색을 식별하였다. 인돌생성은 세균을 표 5의 트립톤 액체배지에 접종한 후 27℃에서 2일간 배양한 후 코백스 시약(Kovacs' reagent)을 10방울 떨어뜨려 변화를 관찰하였다. 분리균주의 생리 및 생화학적 반응결과는 다음의 표 6과 같다.The isolated strain of the present invention was incubated at 28 ° C. for 24 hours in TSA slope medium of Table 3, and then Gram staining reaction was identified using 3% KOH solution. Oxygen demand was confirmed by the inoculation of bacteria in the bromine thymol blue and glucose-containing medium and then incubated for 2 days at 30 ℃ covered with liquid paraffin. In the MR test, bacteria were inoculated in the MR-VP medium of Table 4, incubated at 30 ° C. for 5 days, and the MR reagent was dropped on the medium to identify the color of the medium. Indole production was observed by injecting bacteria into tryptone liquid medium of Table 5, incubating at 27 ° C. for 2 days, and dropping 10 drops of Kovacs' reagent. Physiological and biochemical reaction results of the isolates are shown in Table 6 below.
1. 포토랍두스 : 버기스 매뉴얼에 기재된 자료에 의함.1. Photorapdus: Based on materials described in Burgis manual.
2. TSA 배지에서 24시간 인큐베이션 후 3% KOH를 사용.2. Use 3% KOH after 24 hours incubation in TSA medium.
3. TSA 배지에서 48시간 인큐베이션 후 1% 디메틸-p-페닐렌디아민 하이드로클로라이드를 사용.3. Use 1% dimethyl-p-phenylenediamine hydrochloride after 48 hours incubation in TSA medium.
4. TSA 배지에서 48시간 인큐베이션 후 시험.4. Test after 48 hours incubation in TSA medium.
5. + : 양성반응 - : 음성반응5. +: Positive reaction-: Negative reaction
상기와 같은 생리 및 생화학적 반응결과에 따라 본 발명의 분리균주가 포토랍두스(Photorhabdus) 속에 속하는 것으로 확인하였다.According to the physiological and biochemical reaction results as described above, it was confirmed that the isolated strain of the present invention belongs to Photorhabdus .
(2) 종 동정(2) species identification
1) 탄소이용원1) Carbon Source
상기와 같이 본 발명의 분리균주를 포토랍두스(Photorhabdus) 속에 속하는 세균으로 확인한 후 이를 다시 종(species) 동정을 하기 위하여 보다 세부적인 특성조사로 탄소이용원 조사를 실시하였다. 미국의 바이오로그(Biolog) 사의 마이크로플레이트를 이용하여 세균을 접종, 배양한 후 탄소원의 이용 여부를 조사하였다. 조사된 결과를 포토랍두스(Photorhabdus) 속의 공지된 균주와 비교하였으며, 비교결과는 다음의 표 7과 같다.As described above, the isolated strain of the present invention was identified as a bacterium belonging to the genus Photorhabdus , and then the carbon use was investigated as a detailed characteristic investigation to identify the species again. After inoculation and incubation of bacteria using a microplate of Biolog, USA, the use of a carbon source was investigated. The investigated results were compared with known strains of the genus Photorhabdus , and the comparison results are shown in Table 7 below.
+ : 90∼100%+: 90-100%
[+] : 76∼89%[+]: 76-89%
d : 26∼75%d: 26 to 75%
[-] : 11∼25%[-]: 11-25%
- : 0∼10%-0 to 10%
표 7의 결과로 볼 때 본 발명의 분리균주는 포토랍두스 속의 템페라타 탐페라타(P. temperata subsp. temperata)인 것으로 확인할 수 있었다.As a result of Table 7, the isolated strain of the present invention was confirmed to be temperata tamperata of P. temperata subsp .
2) 기타 탄소이용원2) Other carbon sources
다음의 표 8의 탄소원에 대해서도 분리균주의 이용 여부를 조사하였다. 그러나 이들 탄소원에 대해서는 포토랍두스 속의 공지균주의 자료가 없어 직접적인 비교는 하지 못했다. The following table 8 also examined the use of the isolate strain. However, these carbon sources do not have direct comparisons because there are no known strains in the photolobus.
3) 형태3) form
분리된 균주의 미세구조를 확인하기 위하여 투과전자현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 도 1에 도시된 막대는 1 ㎛ 를 나타낸다. ·In order to confirm the microstructure of the isolated strain was observed by transmission electron microscope, the results are shown in FIG. The bar shown in FIG. 1 represents 1 μm. ·
4) 지방산 분석4) Fatty Acid Analysis
가스크로마토그래피-지방산 분석(GC-fatty acid 분석; 미국 MIDI사)을 이용하여 분리균주의 세포막 및 세포벽에 함유된 지방산을 추출, 분석하고, 이를 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens)의 지방산 분석결과와 비교하여 도 2에 나타내었다. 비교결과, 본 발명의 균주와 포토랍두스 루미네센스는 전체적으로는 유사한 지방산 조성을 보이고 있으나, 일부 지방산에 있어서는 두 종간 특이성을 보이고 있다 (예: 15:1 ISO F, 15:0 ISO 3OH). 그러나 포토랍두스 템페라타 탐페라타(P. temperata subsp. temperata)의 공지균주에 대해서는 이러한 자료가 없는 관계로 직접적인 비교를 하지 못했다.Extraction and analysis of fatty acids contained in the cell membrane and cell wall of the isolated strain using gas chromatography-fatty acid analysis (GC-fatty acid analysis; MIDI Corporation, USA) and fatty acid analysis of Photorhabdus luminescens It is shown in FIG. 2 in comparison with the result. As a result of the comparison, the strain of the present invention and photolapux luminescence showed similar fatty acid composition as a whole, but some fatty acids showed specificity between two species (eg, 15: 1 ISO F, 15: 0 ISO 3OH). However, the known strains of P. temperata subsp. Temperata did not have direct comparisons due to the absence of such data.
5) 생육온도5) Growth temperature
본 발명의 분리균주의 적절한 생육온도를 실험을 통해 확인하였다. 도 3은 590nm에서의 세균개체수 분포를 온도별로 나타낸 것이다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 분리균주는 TSB 배지에서 34℃ 이상의 온도에서는 생육이 어려운 것으로 나타났다. 본 균주의 이러한 온도 민감도는 유사 균주인 포토랍두스 템페라타와는 차이가 있는 것이다. Appropriate growth temperature of the isolate strain of the present invention was confirmed through experiments. Figure 3 shows the bacterial individual number distribution at 590nm by temperature. As can be seen from Figure 3, the isolated strain of the present invention was found to be difficult to grow at a temperature above 34 ℃ in TSB medium. This temperature sensitivity of this strain is different from the similar strain Photorabdus temperata.
실시예 3Example 3
ANU101의 동정 : 16S rDNA의 서열분석Identification of ANU101: Sequencing of 16S rDNA
(1) 지노믹 DNA 추출 및 PCR 증폭(1) Genomic DNA Extraction and PCR Amplification
맥콘키 아가 배지(MacConkey agar 배지)에서 붉고 형광이 나는 콜로니를 선발하여, TSB(Tryptic soy broth) 배지상에서 12시간 (30℃) 배양한 후, 전체 지노믹(genomic) DNA를 추출하였다 (참고: Sambrook et al., 1989). PCR 프라이머는 웨이스버그(Weisburg, 1991) 등이 고안한 것을 사용하여, 16S rDNA 영역을 증폭하였다. 포워드 프라이머(Forward primer) 와 리버스 프라이머(reverse 프라이머)는 각각 5'-GAA GAG TTT GAT CAT GGC TC-3' 와 5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3' 을 사용하였다. PCR 증폭을 위한 샘플링은 10 ×PCR 완충액(buffer) 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, 25 pmol 포워드 프라이머 2 ㎕, 25 pmol 리버스 프라이머 2 ㎕, 5U/㎕ 택 폴리머라제(Taq polymerase) 1㎕, 주형 DNA(template DNA) 2 ㎕, 증류수 34 ㎕, 그리고 미네랄 오일 20 ㎕ 를 각 튜브에 혼합하였다. PCR (PTC-100 MJ Research, Minnesota, USA) 조건은 94℃에서 1 분, 68℃에서 1 분, 그리고 72℃에서 1 분씩 35회 반복하였다. Red and fluorescent colonies were selected from MacConkey agar medium, incubated for 12 hours (30 ° C.) on Tryptic soy broth (TSB) medium, and the entire genomic DNA was extracted. Sambrook et al., 1989). PCR primers were amplified by the 16S rDNA region using the one designed by Wesburg, 1991. Forward primer and reverse primer were used as 5'-GAA GAG TTT GAT CAT GGC TC-3 'and 5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3', respectively. Sampling for PCR amplification: 5 μl 10 × PCR buffer, 4 μl 2.5 mM dNTP, 2 μl 25 pmol forward primer, 2 μl 25 pmol reverse primer, 1 μl 5U / μl Taq polymerase, template 2 μl of DNA (template DNA), 34 μl of distilled water, and 20 μl of mineral oil were mixed in each tube. PCR (PTC-100 MJ Research, Minnesota, USA) conditions were repeated 35 times for 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 68 ° C, and 1 minute at 72 ° C.
(2) 서열분석(2) sequencing
상기 PCR 생성물들을 TA 벡터 (pGEM™, Promega, Madison, USA)에 삽입시키고, Top 10, E. coli 에 형질전환 시켰다. X-Gal + IPTG / LB + Amp 배지에 도말 한 후, 푸른색 콜로니를 miniprep을 실시하였다.The PCR products were inserted into TA vectors (pGEM ™, Promega, Madison, USA) and transformed into Top 10, E. coli . After smearing on X-Gal + IPTG / LB + Amp medium, blue colonies were subjected to miniprep.
이렇게 분리된 rDNA에 대해 서열분석(Sequencing)을 실시하였으며, 그 결과는 서열목록 1 및 도 4a, 4b와 같다. (DNA star program, Version 5.01, Dnastar Inc, Madison, USA) Sequencing was performed on the separated rDNA, and the results are shown in SEQ ID NO: 1 and FIGS. 4A and 4B. (DNA star program, Version 5.01, Dnastar Inc, Madison, USA)
서열목록 1 및 도 4a는 본 발명의 분리균주의 16S rDNA의 전체 염기서열을 나타낸 것이다. 도 4a에서 박스로 표현된 203∼208 염기는 포토랍두스 속의 전형적인 16S rDNA의 염기서열을 보여주고 있으며, 밑줄친 부분은 본 실험에 사용된 프라이머이다. SEQ ID NO: 1 and Figure 4a shows the entire nucleotide sequence of 16S rDNA of the isolate strain of the present invention. 203 to 208 bases represented by boxes in FIG. 4A show the nucleotide sequences of a typical 16S rDNA genus in photolapidus, and the underlined portions are primers used in this experiment.
도 4b는 본 분리균주의 16S rDNA 염기서열(A)을 NCBI에 등록된 포토랍두스 속의 공지균주(B∼G)와 비교하여 계통발생학적 모식도로 나타낸 것이다. 도 4b에서 A는 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 균주 (P. temperata subsp. temperata ANU101), B는 P. 템페라타 템페라타 러시아균주 (P. temperata subsp. temperata NCBI AJ007405), C는 P. 템페라타(P. temperata NCBI Z76750), D는 P. 아심비오티카 (P. asymbiotica NCBI Z76753), E는 P. 루미네센스 (P. luminescens subsp. luminescens NCBI X82248), F는 P. 루미네센스 아커스티이 (P. luminescens subsp. akhurstii NCBI AJ007359), G는 P. 루미네센스 라우몬디이 (P. luminescens subsp. laumondii NCBI 등록번호 Z76743) 이다.Figure 4b is a phylogenetic schematic diagram comparing the 16S rDNA nucleotide sequence (A) of this isolate with known strains (B-G) of the genus Photorapdus registered in NCBI. In Figure 4b, A is a photolabduus temperata temperata ANU101 strain of the present invention ( P. temperata subsp. Temperata ANU101), B is P. temperata temperata Russian strain ( P. temperata subsp. Temperata NCBI AJ007405), C is P. temperata NCBI Z76750, D is P. asymbiotica NCBI Z76753), E is P. Luminescence (P. luminescens subsp. Luminescens NCBI X82248 ), F is P. luminous Oh keoseutiyi (P. luminescens subsp. Akhurstii NCBI AJ007359 ), G is P. luminous Lau Mondy ( P. luminescens subsp.laumondii NCBI Accession No. Z76743).
(3) 분석결과(3) Analysis result
분석결과, 본 발명 분리균주 (P. temperata subsp. temperata strain ANU101)의 16S ribosomal DNA의 전체 염기수는 1539개로 확인되었다. 본 균주는 기존에 보고된 템페라타 템페라타 러시아균주 (P. temperata subsp. temperata NCBI AJ007405)와 1526 염기서열 중 1516개의 염기가 동일하여 99.5 %의 상동성을 갖는 것으로 나타났으며, 반면 4개의 염기 전위 (Transition), 2개의 염기 전환 (Transversion), 그리고 3개의 Gap이 형성되어 있어 계통간 차이점 또한 있는 것으로 확인되었다. NCBI에 등록된 공지균주의 16S rDNA 염기서열과 본 발명의 분리균주의 16S rDNA 염기서열을 비교분석한 결과를 다음의 표 9에 정리하였다. 표 9의 상동성은 본 발명의 분리균주와 공지균주들간의 염기서열이 일치하는 퍼센트를 나타낸 것이다.As a result, the total base number of 16S ribosomal DNA of the isolated strain ( P. temperata subsp. Temperata strain ANU101) of the present invention was confirmed to be 1539. This strain was appeared to have a tempera other tempera other Russian strains (P. temperata subsp. Temperata NCBI AJ007405 ) and a homology of 99.5% to the same 1516 bases of the 1526 nucleotide sequence reported previously, while four bases Transitions, two base transitions, and three gaps were formed, confirming the differences between the lines. 16S rDNA nucleotide sequence of the known strain registered in NCBI and 16S rDNA nucleotide sequence of the isolated strain of the present invention are summarized in Table 9 below. The homology of Table 9 shows the percent nucleotide sequence of the isolate and known strains of the present invention.
상기와 같은 분석결과에 따라 본 발명 분리균주를 포토랍두스 템페라타 템페라타 (P. temperata subsp. temperata)의 새로운 균주로 동정하였다.The isolated strain of the present invention was identified as a new strain of P. temperata subsp. Temperata according to the above analysis results.
a : NCBI 등록번호 AJ007405 a: NCBI registration number AJ007405
b : NCBI 등록번호 Z76750b: NCBI registration number Z76750
c : NCBI 등록번호 Z76753c: NCBI registration number Z76753
d : NCBI 등록번호 X82248d: NCBI registration number X82248
e : NCBI 등록번호 AJ007359e: NCBI registration number AJ007359
f : NCBI 등록번호 Z76743f: NCBI registration number Z76743
이상 실시예 2∼3의 결과를 토대로, 메기디스 곤충병원선충 (Heterorhabditis megidis) 으로부터 분리한 본 발명의 신균주를 포토랍두스 템페라타 템페라타로 분류하고, 균주명을 ANU101로 명명하였다 (P. temperata subsp. temperata ANU101, 기탁기관: 농업생명공학연구원,수탁일: 2003년 3월 21일, 수탁번호: KACC 91042).Based on the results of Examples 2 to 3 above, the new strain of the present invention isolated from Heterorhabditis megidis was classified as Photorabdu temperata temperata , and the strain name was ANU101 ( P. temperata). . subsp temperata ANU101, depository: agricultural biotechnology Research Institute, commissioned: March 21, 2003, accession number: KACC 91042).
실시예 4Example 4
항균력 시험Antibacterial test
(1) 항생물질의 분리(1) Isolation of antibiotics
본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101)을 TSA 배지에서 28℃로 48시간 동안 배양하였다. 배양액(50L)에 동량의 부탄올을 가하여 48시간 추출한 후 이 추출액을 분액깔대기를 이용하여 다시 부탄올층과 수층으로 분획(1:1)하였다. 이 중 부탄올에 추출된 용매분획물을 농축하여 부탄올 분획구를 얻고, 나머지는 수층 추출물로 하여 다양한 식물병원세균에 대한 항균력을 조사하였다.Photolapus temperata temperata ANU101 of the present invention ( P. temperata subsp. Temperata ANU101) was incubated for 48 hours at 28 ℃ in TSA medium. The same amount of butanol was added to the culture solution (50L), followed by extraction for 48 hours, and the extract was partitioned (1: 1) into a butanol layer and an aqueous layer using a separatory funnel. Among them, the solvent fractions extracted in butanol were concentrated to obtain butanol fractions, and the remainder was used as an aqueous extract to investigate the antibacterial activity against various phytopathogenic bacteria.
(2) 항균력 조사(2) antibacterial activity
다양한 식물병원세균에 대해 상기에서 분리한 항생물질이 항균효과를 나타내는지 여부를 실험하였다. 실험은 3회 반복으로 수행되었다. 실험에 사용된 식물병원세균의 현탁액은 30℃에서 2일간 배양한 세균에 살균수 10㎖를 넣어 만들었다. NA 배지에 세균 현탁액을 500㎕ 도포한 후 상기에서 추출한 항생물질 10,000 ppm 을 적신 6㎜ 여과지를 올려놓아 억제효과를 관찰하였다. 결과는 다음의 표 10과 같다. For various phytopathogens, it was tested whether antibiotics isolated above showed antimicrobial effect. The experiment was performed in three iterations. The suspension of the phytopathogenic bacteria used in the experiment was made by adding 10 ml of sterilized water to bacteria cultured at 30 ° C. for 2 days. 500 μl of bacterial suspension was applied to NA medium, and the inhibitory effect was observed by placing a 6 mm filter paper moistened with 10,000 ppm of the extracted antibiotics. The results are shown in Table 10 below.
한편, ANU101의 항균능력을 세균성장 시기면에서 살펴보았다. 그 결과를 도 5에 나타내었으며, ANU101은 최대 증식기에서 최대로 항균능력을 발휘하는 것으로 나타났다. Meanwhile, the antimicrobial ability of ANU101 was examined in terms of bacterial growth. The results are shown in Figure 5, ANU101 was shown to exhibit the maximum antimicrobial capacity in the maximum growth phase.
실시예 5Example 5
해충에 대한 살충력 시험Insecticidal test for pests
본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101)의 다양한 해충에 대한 살충력을 조사하였다.Insecticidal activity against various pests of the photolaptus temperata temperata ANU101 ( P. temperata subsp.temperata ANU101) of the present invention was investigated.
희석평판법을 이용하여 ANU101의 세균수를 결정하였으며, 결정된 세균을 해충의 뒷다리 부분에 2㎕ 주사하여 살충력을 조사하였다. 실험에는 누에 (Bombyx mori), 파밤나방 (Spodoptera exigua), 화랑곡나방 (Plodia interpunctella), 미국흰불나방 (Hyphanria cunca)을 사용하였으며, 결과는 도 6과 같다. 도 6에 나타난 바와 같이, ANU101은 실험에 사용된 모든 해충에 대해 20시간 내에 높은 살충력을 보였다.The number of bacteria of ANU101 was determined by dilution plate method, and the insecticide was examined by injecting 2 µl of the determined bacteria into the hind leg of the pest. In the experiment, a silkworm ( Bombyx mori ), a night beetle ( Spodoptera exigua ), a hedgehog moth ( Plodia interpunctella ), the American white moth ( Hyphanria cunca ) was used, and the results are shown in FIG. 6. As shown in FIG. 6, ANU101 showed high insecticidal activity within 20 hours for all pests used in the experiment.
상기 실시예 등으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101, KACC 91042)은 종래 외국에서 보고된 포토랍두스 속의 공지균주와 16S rDNA 염기서열 및 항균·살충 특성에서 차이를 보이는 신균주로, 특히 실험을 통해 확인된 바와 같이, 펙토박테리움 카로보룸 아트로셉티움, 펙토박테리움 카로보룸 카로토보룸 및 마이크로코커스 렌텔리스에 대해 항균력을 나타내며, 실험에 사용된 나비목 해충 4종 모두에 대해 20 시간 이내에 높은 살충력을 나타내었다. 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101은 해충 방제 및 식물병원세균의 방제를 위한 효과적인 생물농약으로 사용될 수 있다.As can be seen from the above examples, the photolobus temperata temperata ANU101 of the present invention ( P. temperata subsp.temperata ANU101, KACC 91042) is known from the known foreign strains of the genus photolapus and 16S rDNA base New strains with differences in sequence and antibacterial and insecticidal properties, especially as confirmed by experiments, such as Pectobacterium carborum atheroceptium, Pectobacterium carborum caroteborum and microcacus lentellis It showed antimicrobial activity against and showed high insecticidal activity within 20 hours for all four Lepidoptera pests used in the experiment. Photolapus temperata temperata ANU101 of the present invention can be used as an effective biopesticide for pest control and control of phytopathogenic bacteria.
도 1은 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (KACC 91042)의 투과전자현미경 사진이다. FIG. 1 is a transmission electron microscope photograph of photolapdus temperata temperata ANU101 (KACC 91042).
도 2는 본 발명 균주의 지방산 분석결과를 공지균주와 비교하여 나타낸 것이다. Figure 2 shows the fatty acid analysis of the strain of the present invention compared to the known strain.
도 3은 본 발명 균주의 생육온도 실험결과로 온도별 세균개체수 분포를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the distribution of bacterial individual by temperature as a result of the growth temperature test of the strain of the present invention.
도 4a는 본 발명 균주의 16S rDNA의 서열분석 결과이다. 4a shows sequencing results of 16S rDNA of the strain of the present invention.
도 4b는 본 발명 균주의 16S rDNA 염기서열(A)을 공지균주(B∼G)와 비교하여 계통발생학적 모식도로 나타낸 것이다. Figure 4b shows a 16S rDNA nucleotide sequence (A) of the strain of the present invention compared to known strains (B to G) is shown in a phylogenetic schematic.
도 5는 본 발명 균주의 배양시간 별 항균능력을 나타낸 것이다. Figure 5 shows the antimicrobial capacity of each strain incubation time of the present invention.
도 6은 본 발명 균주의 나비목 해충에 대한 살충력 실험결과를 나타낸 것이다. Figure 6 shows the insecticidal test results for the lepidopteran pest of the strain of the present invention.
<110> KIM, Yong Gyun BIG Co.,Ltd. <120> Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1539 <212> DNA <213> Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101 <400> 1 gaagagtttg atcatggctc agattgaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga 60 gcggtaacag gaaagtgctt gcacttttgc tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgtct 120 ggggatctgc ccgagggcgg aggataacca ctggaaacgg tggctaatac cgcataatgt 180 cgcaagacca aagtggggga cctgaaaggg cctcacgccc gcggatgaac ccaggtggga 240 ttagctagtc ggtagggtaa tggcctaccg aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga 300 tgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 360 atattgcaca atgagcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg 420 ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag ggtttagcct gaacagggtt gaattttgac 480 gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt 540 gcaagcgtta atcggaatga ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtcaat taagttagat 600 gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaacgg catctaagac tggttggcta gagtctcgta 660 gaggggggta gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccggt 720 ggcgaaggcg gccccctgga cgaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaacc 780 aggattagat accctagtag tccacgcggt aaacgatgtc gatttggagg ttgttcccta 840 gaggagtggc ttccggagct aacgcgttaa atcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 900 ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960 atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg acatccagag aagaccacag agatgtggtt 1020 gtgccttcgg gagctctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat 1080 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg cgtgatggcg 1140 ggaactcaaa ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1200 catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg cggatacaaa gtgaagcgac 1260 ctcgcgagag caagcggaac acataaagtc tgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc 1320 gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga atgctacggt gaatacgttc 1380 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaaaag aagtcggtag 1440 cttaacctgt aggagggcgc tgaccacttt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca 1500 aggtaaccgt aggggaacct gcggctggat cacctcctt 1539<110> KIM, Yong Gyun BIG Co., Ltd. <120> Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1539 <212> DNA <213> Photorhabdus temperata subsp. temperata ANU101 <400> 1 gaagagtttg atcatggctc agattgaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga 60 gcggtaacag gaaagtgctt gcacttttgc tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgtct 120 ggggatctgc ccgagggcgg aggataacca ctggaaacgg tggctaatac cgcataatgt 180 cgcaagacca aagtggggga cctgaaaggg cctcacgccc gcggatgaac ccaggtggga 240 ttagctagtc ggtagggtaa tggcctaccg aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga 300 tgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 360 atattgcaca atgagcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg 420 ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag ggtttagcct gaacagggtt gaattttgac 480 gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt 540 gcaagcgtta atcggaatga ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtcaat taagttagat 600 gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaacgg catctaagac tggttggcta gagtctcgta 660 gaggggggta gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccggt 720 ggcgaaggcg gccccctgga cgaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaacc 780 aggattagat accctagtag tccacgcggt aaacgatgtc gatttggagg ttgttcccta 840 gaggagtggc ttccggagct aacgcgttaa atcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 900 ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960 atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg acatccagag aagaccacag agatgtggtt 1020 gtgccttcgg gagctctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat 1080 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg cgtgatggcg 1140 ggaactcaaa ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1200 catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg cggatacaaa gtgaagcgac 1260 ctcgcgagag caagcggaac acataaagtc tgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc 1320 gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga atgctacggt gaatacgttc 1380 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaaaag aagtcggtag 1440 cttaacctgt aggagggcgc tgaccacttt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca 1500 aggtaaccgt aggggaacct gcggctggat cacctcctt 1539

Claims (5)

  1. 헤테로랍디티스 메기디스 (Heterorhabditis megidis KCTC10453BP)로부터 분리된 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (P. temperata subsp. temperata ANU101, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2003년 3월 21일, 수탁번호: KACC 91042).Photorabdus temperata temperata ANU101 ( P. temperata subsp. Temperata ANU101, isolated from Heterorhabditis megidis KCTC10453BP), Depositary: Institute of Agricultural and Biotechnology, Deposited: March 21, 2003 KACC 91042).
  2. 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (KACC 91042)을 포함하는 해충 방제제.A pest control agent comprising photolapus temperata temperata ANU101 (KACC 91042).
  3. 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (KACC 91042)을 포함하는 식물병원균 방제제.A phytopathogen control agent comprising photolapus temperata temperata ANU101 (KACC 91042).
  4. 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (KACC 91042)을 사용하는 해충 방제방법.Pest control method using photolapus temperata temperata ANU101 (KACC 91042).
  5. 포토랍두스 템페라타 템페라타 ANU101 (KACC 91042)을 사용하는 식물병원균 방제방법.A method for controlling phytopathogens using photolapux temperata temperata ANU101 (KACC 91042).
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