KR101359865B1

KR101359865B1 - 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양 접시 표면을 이용한 심장줄기세포의 체외 배양 방법

Info

Publication number: KR101359865B1
Application number: KR1020120024887A
Authority: KR
Inventors: 백상홍; 최승현; 정석윤; 권상모
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2014-02-11
Also published as: WO2013137532A1; KR20130103889A

Abstract

본 발명은 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 표면을 이용한 심장줄기세포의 체외배양 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 표면을 제조하는 단계, 및 상기 표면 위에 심장줄기세포를 1시간 내지 60일 동안 배양하는 단계를 포함하는 심장줄기세포의 체외 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 심장줄기세포의 체외 배양 방법은 심장조직 재생능력이 탁월한 c-kit 양성 심장줄기세포를 심장조직으로부터 추출하여 체외에서 장기간 효과적으로 증식 및 배양을 가능하게 함으로써 줄기세포 치료제 및 줄기세포 연구에 필요한 줄기세포의 대량 생산을 가능하게 한다.

Description

아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양 접시 표면을 이용한 심장줄기세포의 체외 배양 방법{In vitro cultivation method of cardiac stem cell using culture vessel surface coated amine or carboxyl residue}

본 발명은 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 표면을 이용하여 심장줄기세포를 체외배양하는 방법에 관한 것이다.

심근경색, 심부전증 등을 포함하는 심장질환은 심장을 구성하는 심근세포의 손실 및 괴사를 초래하는 질병으로, 사망까지 이어지는 심혈관계 주요 질병 중의 하나이다. 특히 최근 고령화 사회로의 급진적 변화로 인해 의료경제학적인 면에서 그 심각성이 급부상되고 있는 실정이다. 현재 심장질환의 치료 방법으로는 약물치료를 통한 내과적 치료 방법, 혈관성형술, 심장이식 등을 통한 외과적 치료 방법 등이 주로 이용되고 있으나 한계를 가지고 있으며, 아직 심장질환을 효과적으로 치료할 만한 방법은 부족한 실정이다.

최근에는 이런 한계점을 극복하고자 줄기세포(stem cell)를 이용하여 심장 및 심근의 재생을 가능하게 하는 세포치료(cell therapy)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 줄기세포는 생물 조직을 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화(differentiation)될 수 있는 미분화 세포들을 의미한다. 배아줄기세포를 비롯하여, 성체줄기세포에서는 중배엽줄기세포, 혈관내피전구세포, 및 역분화줄기세포 등과 같은 다양한 줄기세포들이 심근세포를 포함한 다양한 조직으로 분화가 가능하기 때문에, 상기 줄기세포들을 모두 심장조직재생에 사용가능하다고 보고되었으나, 상기 줄기세포는 체내 이식 후에 심장조직으로의 분화율이 현저히 낮으며, 부정맥 등 다양한 부작용의 위험성을 가지고 있어 실질적으로는 세포치료에 이용되지 못하고 있는 실정이다. 그러나 최근에 다양한 줄기세포 중 동물 및 인간의 심장에는 심장줄기세포(resident cardiac stem cell)가 존재하며, 상기 심장줄기세포는 심근세포의 손상 후 심장조직을 재생(regeneration)하는데 중요한 역할을 담당하고 있다는 것이 발견되어, 심장줄기세포를 이용한 세포치료에 대한 연구가 주목받고 있다.

상기 심장줄기세포를 효과적인 세포치료에 이용하기 위해서는 심장줄기세포의 수적 확보 및 연구의 용이성을 위한 손쉬운 체외 배양 방법의 개발이 요구된다. 따라서 최근에는 사이토카인을 배양액에 투여하는 방법, 정전기적 전하를 띠는 물질을 표면에 부착시키는 방법, 3차원으로 세포를 배양하는 방법 등 다양한 방법들이 개발되고 있으나, 기존의 체외 배양 방법들은 배양의 어려움, 심장줄기세포의 증식 억제, 장기간 배양시 줄기세포 특유의 다분화능 소실 등의 한계점으로 인하여 배양이 용이하지 않은 실정이다.

이와 같이, 심장줄기세포를 효과적으로 세포치료에 이용하기 위해서는 손쉽고 저렴한 체외 배양 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 심장줄기세포의 다분화능을 장기간동안 유지할 뿐만 아니라 증식능을 증가시킬 수 있는 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 표면을 이용한 심장줄기세포의 체외 배양 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 또한 상기 체외 배양 방법을 이용하여 배양한 심장줄기세포 및, 이를 유효성분으로 함유하는 심장 및 혈관질환 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 심장줄기세포의 체외 배양 방법으로, 아민기(amine residue) 또는 카르복실기(carboxyl residue)가 코팅된 표면 위에서 심장줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 체외 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 아민기가 코팅된 표면은 아민 중합체(amine polymer) 또는 아민기를 포함하는 액화 세포비독성 화합물을 표면 위에 도말한 후에 건조시키는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 카르복실기가 코팅된 표면은 카르복실 중합체(carboxyl polymer) 또는 카르복실기를 포함하는 액화 세포비독성 화합물을 표면 위에 도말한 후에 건조시키는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 심장줄기세포는 c-kit 양성인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배양 방법은 심장줄기세포의 미분화 상태를 1시간 내지 60일 동안 유지하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 표면에서 배양된 심장줄기세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 심장줄기세포를 유효성분으로 함유하는 심장 또는 혈관질환 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 심장줄기세포의 체외 배양 방법은 심장조직 재생능력이 탁월한 c-kit 양성 심장줄기세포를 심장조직으로부터 추출하여 체외에서 장기간 효과적으로 증식 및 배양을 가능하게 함으로써 줄기세포 치료제 및 줄기세포 연구에 필요한 줄기세포의 대량 생산을 가능하게 한다. 또한 c-kit 양성 심장줄기세포를 조직에서 추출한 후 체외배양을 할 경우, 줄기세포의 증식에 관한 스트레스 반응을 억제할 수 있기 때문에 이를 통해 양질의 줄기세포를 배양할 수 있다. 따라서 세포 치료 및 연구에 필요한 심장줄기세포를 손쉽고 저렴하게 대량 확보할 수 있어 줄기세포를 이용한 세포 치료제 개발 분야에 긍정적인 효과를 야기할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 심장줄기세포 이외의 다른 줄기세포를 배양하여 다양한 줄기세포의 대량 생산을 가능하게 할 수 있는 원천기술로 기대된다.

도 1 은 본 발명의 실험 방법을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2 는 배양접시의 표면에 따른 심장줄기세포의 부착능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 배양접시의 표면에 따른 심장줄기세포의 줄기세포 표지자 발현 유지능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 배양접시의 표면에 따른 심장줄기세포의 증식능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 배양접시의 표면에 따른 심장줄기세포의 단백질 발현능 및 인산화능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 배양접시의 표면에 따른 심장줄기세포의 단백질 발현능 및 인산화능을 정량한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명자들은 심장줄기세포를 효과적으로 세포치료에 사용하기 위하여, 손쉽게 심장줄기세포의 다분화능을 장기간 동안 유지시킬 수 있는 체외 배양 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명은 완성하게 되었다.

본 발명은 심장줄기세포의 체외 배양 방법으로, 아민기(amine residue) 또는 카르복실기(carboxyl residue)가 코팅된 표면 위에서 심장줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 심장줄기세포의 체외 배양 방법을 제공한다.

본 발명자들은 공지되어 있는 방법으로 일반적으로 쉽게 구매할 수 있는 배양접시(culture vessel) 표면을 아민기 또는 카르복실기로 코팅한 후에 심장줄기세포 표지자인 c-kit을 발현하는 c-kit 양성 심장줄기세포를 배양하였다. 표면을 코팅하는 방법은 표면에 세포의 증식 및 생존에 관련된 인테그린(integrin)의 활성화를 촉진하여, 세포의 증식을 개선시키고, 세포의 부착을 증진시켜 세포가 성장할 수 있는 환경에서의 스트레스를 감소시킬 수 있는 아민기 또는 카르복실기가 다수 존재하도록 할 수 있는 방법이라면 제한이 없다. 바람직하게는 아민기를 코팅하는 방법은 아민 중합체(amine polymer), 아민기를 포함하는 액화 세포비독성 합성물, 또는 휘발성의 특징을 갖는 알릴아민(allylamine), 헥실아민(hexyl amine), 헵틸아민(hetylamine) 등과 같은 아민 작용기를 갖는 유기분자 등을 표면 위에 첨가하거나, 마이크로(micro) 또는 나노(nano) 스프레이를 이용하거나 플라즈마를 이용하여 도말한 후에 건조시킬 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 카르복실기를 코팅하는 방법은 카르복실 중합체(carboxyl polymer), 카르복실기를 포함하는 액화 세포비독성 합성물, 또는 휘발성의 특징을 갖는 카르복실 작용기를 갖는 유기분자 등을 표면 위에 첨가하거나, 마이크로(micro) 또는 나노(nano) 스프레이를 이용하거나 플라즈마를 이용하여 도말한 후에 건조시킬 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 표면의 재질은 세포를 배양할 수 있는 종류라면 제한이 없다. 예를 들어 유리, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 아민기 또는 카르복실기가 상기 방법으로 코팅된 배양접시에서 배양한 심장줄기세포는 focal adhesion kinase (FAK)의 인산화가 촉진되어 세포의 부착능이 증가되었으며, 스트레스 관련 단백질인 c-Jun N-terminal kinases (JNK)의 인산화가 억제되는 동시에, c-Src 및 extracellular signal-regulated kinase (Erk)의 인산화가 증가되어 최종적으로 세포 주기 조절 단백질인 Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)의 발현이 증가되어 세포의 증식능이 증가하였을 뿐만 아니라, 장기간동안 배양하여도 줄기세포 표지자인 c-kit의 발현이 높은 비율로 유지된다는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

상기 결과로부터, 본 발명의 체외 배양 방법을 이용하여 배양된 심장줄기세포는 줄기세포의 특성인 다분화능을 장기간(1시간 내지 60일) 유지하기 때문에, 상기 심장줄기세포를 심장질환의 치료를 위한 심장조직재생용 세포 치료제에 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 발명은 본 발명의 체외 배양 방법을 이용하여 배양된 심장줄기세포, 및 상기 체외 배양된 심장줄기세포를 유효성분으로 함유하는 심장조직재생용 및/또는 심장질환치료용 세포 치료제를 제공한다. 상기 체외 배양된 심장줄기세포를 배양하는 기간에는 제한이 없으나, 바람직하게는 다분화능이 유지되는 1시간 내지 60일 동안 배양할 수 있다. 세포 부착능을 이용한 세포의 배양인 경우는 1시간 이상, 시술 및 연구를 위한 세포인 경우 15일 이상 장기간 동안 배양할 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 심장줄기세포를 세포 치료제로 사용하기 위해서는, 상기 심장줄기세포를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. c- kit 양성 심장줄기세포의 체외 배양

아민기(amine residue) 또는 카르복실기(carboxyl residue)가 코팅된 6 well 배양접시에 c-kit 양성 심장줄기세포를 10,000 cells/well이 되도록 분주한 후, 2mL의 심장줄기세포 배양액(Ham F12 영양배지, 10% 우혈청(fetal bovine serum), 0.1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor), 에리쓰로포에틴(erythropoietin), L-글루타티온(L-glutathione))을 첨가하였다. 그리고 24시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양한 후에 표면에 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 배양액을 제거한 후, 새로운 심장줄기세포 배양액 2mL로 교체하였다. 그리고 2일 마다 새로운 심장줄기세포 배양액으로 교체하면서 세포를 배양하였다. 대조군으로는 코팅이 되지 않은 6 well 배양접시에 c-kit 양성 심장줄기세포를 상기와 동일한 방법으로 배양하였다.

실시예 2. 심장줄기세포의 특성 분석

2-1. 세포의 부착능 측정

아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용한 체외 배양 방법이 심장줄기세포의 부착능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 c-kit 양성 심장줄기세포를 18시간 동안 배양한 후에 배양접시의 표면에 부착된 세포의 수를 계수하여 세포의 부착능을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 코팅이 되지 않은 배양접시에 비하여 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시에서 심장줄기세포의 부착능이 약 2배 정도 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 배양접시 표면의 아민기 또는 카르복실기가 세포의 부착능을 향상시킨다는 것을 확인하였다.

2-2. 세포의 줄기세포 표지자 발현 유지능 확인

아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용한 체외 배양 방법이 심장줄기세포의 줄기세포 표지자(c-kit) 발현을 유지하는데 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 c-kit 양성 심장줄기세포를 14일 동안 배양한 후에 c-kit 표지자를 유세포분석기(FACS; Fluorescence activated cell sorter)로 측정하였다. 측정하는 방법은 c-kit 표지자를 분석하기 위해 형광을 붙인 시료와 붙이지 않은 시료로 구분하여, FACS상에 형광을 표지 하지 않은 시료로 세포의 모양을 확인하여 1차 범위를 설정하고, 형광이 표지된 시료를 이용하여 형광이 발현되는 세포의 범위를 2차 설정하여, 모양이 비슷하고, 형광의 발현이 강한 세포를 분리 추출하는 방법으로 수행하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시에서 배양한 세포의 경우 14일이 경과한 후에도 줄기세포 표지자의 발현이 대조군에 비하여 약 2배 정도 높게 유지되고 있는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용하여 심장줄기세포를 배양하는 경우, 장기간동안 줄기세포로의 특성을 유지시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

2-3. 세포의 증식능 측정

아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용한 체외 배양 방법이 심장줄기세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 c-kit 양성 심장줄기세포를 8일 동안 배양하며 트리판블루(trypan blue)로 염색되지 않은 살아있는 세포의 수를 계수하여 세포의 증식능을 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용한 경우, 세포의 증식능이 코팅되지 않은 배양 접시를 이용하여 배양한 경우와 유사하였다. 그러나 아민기가 코팅된 배양 접시를 이용한 경우에는 세포의 증식능이 약 2배 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 아민기가 코팅된 배양접시를 이용하는 경우 c-kit 양성 심장줄기세포의 증식능을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

2-4. 세포의 단백질 발현능 및 인산화능 측정

아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용한 체외 배양 방법이 심장줄기세포의 focal adhesion kinase(FAK), 세포질 사르코마(c-Src, cytosolic sarcoma), CDK2(Cyclin Dependent Kinase 2), ERK(Extracellular signal-regulated kinases), 및 JNK(c-Jun N-terminal Kinases)의 발현 또는 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 c-kit 양성 심장줄기세포를 14일 동안 배양한 후에 상기 단백질의 발현량 또는 인산화를 웨스턴블롯팅(western blotting)으로 확인하였다. 그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시에서 배양한 세포의 경우에는 FAK, c-Src, 및 Erk의 인산화가 증가된 것을 확인하였다. 또한 CDK2의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 이와 반대로, 아민기가 코팅된 배양접시에서 배양된 세포의 경우에는 JNK 단백질의 인산화가 억제된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 아민기 또는 카르복실기가 코팅된 배양접시를 이용하는 경우 FAK의 인산화가 증가되어 세포의 부착능이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 스트레스 관련 단백질인 JNK의 인산화를 억제하는 동시에, c-Src 및 Erk의 인산화를 증가시켜 최종적으로 세포 주기 조절 단백질인 CDK2의 발현을 증가시켜 세포의 증식능을 향상시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

심장줄기세포의 체외 배양 방법으로, 아민기(amine residue) 또는 카르복실기(carboxyl residue)가 코팅된 표면 위에서 심장줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 심장줄기세포의 체외 배양 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 아민기가 코팅된 표면은 아민 중합체(amine polymer) 또는 아민기를 포함하는 액화 세포비독성 화합물을 표면 위에 도말한 후에 건조시키는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 카르복실기가 코팅된 표면은 카르복실 중합체(carboxyl polymer) 또는 카르복실기를 포함하는 액화 세포비독성 화합물을 표면 위에 도말한 후에 건조시키는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 심장줄기세포는 c-kit 양성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 배양 방법은 심장줄기세포의 미분화 상태를 1시간 내지 60일 동안 유지하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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