KR101358183B1 - 히스톤 변형 물질을 이용한 홍국 색소 생산량을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍국균에 히스톤 변형 물질을 처리하는 단계를 포함하는 홍국 색소의 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

히스톤 변형 물질을 이용한 홍국 색소 생산량을 증가시키는 방법{Method for increasing Monascus pigment production using histone modification agent}

본 발명은 히스톤 변형 물질을 이용하여 홍국 색소의 생산에 변이를 유발하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 히스톤 변형 물질을 홍국 배양체에 처리하여 홍국 색소의 생산량을 증가시키고, 색소 성분의 조성을 변화시키는 방법에 관한 것이다.

홍국균이란 분류학상으로 반자낭균(Hemiascomycetaceaw)의 홍국균속 (Monascaceae)에 속하며 황국균에 가까운 균종으로서, 현재 약 20종, 균주로는 약 70여 균주가 분리 및 동정되어 있다. 상기 균주는 붉은 색소를 생산하기 때문에 일반적으로 홍국균이라 부르며, 홍국균을 곡물에 발효시켜 얻을 수 있는 붉은 색의 고체 배양물을 홍국이라 한다. 홍국은 예부터 식품으로서 뿐만 아니라 붉은 색을 내는 천연 착색료로도 이용되어 왔으며, 알콜 생산능력이 다른 국에 비하여 높으며 감향이 강하고 착향성이 뛰어나 천연색소 또는 보존제로서 각종 식품에 사용되어 왔다. 특히 홍국의 색소는 단백질이 풍부한 음식을 조리할 때 생성되는 돌연변이원성 헤테로사이클릭아민(heterocyclicamine)을 분해하는 항 돌연변이원 효과가 있다고 알려져 있다(Watanabe et al., 1999 Mutat. Res. 444, 75-83). 홍국은 아밀라제(amylase) 또는 프로테아제(protease)의 활성이 높아 소화촉진 효과 뿐만 아니라 혈압강화 작용이 있으며, 콜레스테롤의 생합성을 저해하는 특성을 지닌 모나콜린 K(monacolin K)를 함유하고 있다. 또한 홍국 균주에 따라서 항균 작용을 하는 모나시딘 A(Monascidin A)와 같은 시트리닌(citrinin) 유사 물질을 생산하기도 하여 식품의 항생용 첨가제로 사용하기도 한다.

최근 소득수준의 향상으로 식생활에 있어 인공 합성물질이 기피되고 건강 지향추세에 따라 천연 물질에 대한 국민적 관심이 증대되고 있는데, 특히 인공합성 색소가 안정성 등에서 인체에 미치는 문제가 매우 심각해짐에 따라 이에 대한 대책으로 천연 색소의 이용 및 생산에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 진균 유래의 식용 색소 개발 연구는 유럽을 중심으로 활성화되어 있으며, 일본의 경우는 천연색소의 사용 비율이 합성색소를 이미 넘어선 상태이다. 국내 천연색소 시장은 200억원 규모로 추정되며, 생산 업체는 일본에 대한 기술 의존도가 높거나 수입 제품을 단순 배합하는 수준이다.

종래의 진균 발효 기술은 발효 조건의 개선 및 돌연변이 균주 활용을 통하여 목표 물질의 생산성 증가를 유도한다. 돌연변이 균주의 활용은 해당 돌연변이 균주의 선발 및 특성 규명에 오랜 시간이 소요되고, 발효 조건의 개선은 다수의 발효 조건을 시도하는 방식으로 수행되므로 역시 오랜 시간과 많은 인력을 요구하는 문제점이 있다. 식물 조직 배양의 경우 유도물질 처리(elicitation) 기술을 통하여 생리활성 성분의 생산을 유도하는 기술이 널리 알려져 있다. 이에 착안하여 진균 색소 생산에 있어 발효 조건의 개선 및 돌연변이 균주 활용에 첨가하여 적용할 수 있는 유도물질 처리 기술을 개발한다면 기존의 생산 체계에 경제성을 부여할 수 있을 것으로 기대된다.

히스톤 구조는 진핵 세포에서 유전자 발현 조절의 핵심 요소이며, 근래 히스톤 변형에 의한 진핵 세포 발달 조절 현상이 인체 및 식물 분야에서 심도 있게 연구되고 있으며, 상기 분야를 후성유전학(epigenetics)이라고 한다. 히스톤 변형은 메틸 잔기의 도입과 아세틸 잔기의 도입이 대표적이며, 이를 통하여 히스톤-핵산 구조(nucleosome)에 변화가 유발되고, 이러한 변화가 개별 유전자의 발현을 조절하게 된다. 본 발명에서 제시하는 유도물질 처리 기술은 기 수립된 배양 조건에 히스톤 변형 물질을 투여하는 방식으로 수행되므로 해당 물질의 최적 농도를 선발하기 위한 일차 실험으로 색소 생산을 개선할 수 있다는 편의성이 있다.

한편, 한국등록특허 제0113583호에는 '미생물에 의한 홍국색소의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0534372호에는 '모나스커스 적색소의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 히스톤 변형 물질을 이용한 홍국 색소 생산량 증가 방법에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 히스톤 변형 물질인 히스톤 디아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor) 또는 히스톤 디메틸라제 저해제(histone demethylase inhibitor)를 홍국균에 처리한 후 홍국 색소 생산량 변화를 확인한 결과, 처리하지 않은 배양체에 비해 처리군의 홍국 색소 생산 능력이 증가되어 홍국 색소 함량이 증가되거나 색소 성분의 조성이 현격히 변화됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 홍국균에 히스톤 변형 물질을 처리하는 단계를 포함하는 홍국 색소의 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 홍국균에 히스톤 변형 물질을 처리하여 홍국 색소 생산 능력에 변화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 발명에서 활용한 히스톤 변형 물질을 통해 진균 색소 생산 시 발효 조건 개선에 적용할 수 있다. 또한, 목적 색소의 최적 농도를 선발하기 위한 일차 실험으로 색소 생산을 개선할 수 있어 편의성이 뛰어나며, 홍국 색소를 포함한 진균 천연 색소의 상용화에 대한 생산 기술을 지원하고, 기능성 식품 개발 분야에 새로운 원천 기술을 제시하므로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 수베로하이드록삼산(suberohydroxamic acid)의 농도별 처리에 의한 감자영양 배지(potato dextrose broth, PDB)의 홍국 배양체의 색소 생산 변이(A) 및 균체 건조 중량(dried cell weight, DSW) 변화(B)를 나타낸다. (A) 에틸아세테이트 추출물은 검은색 막대로 나타내고, 50% 메탄올 추출물은 흰색 막대로 나타내었다.
도 2는 피리딘 2,4-디카복실산(pyridine 2,4-dicarboxylic acid)의 농도별 처리에 의한 감자영양 배지의 홍국 배양체의 색소 생산 변이(A) 및 균체 건조 중량 변화(B)를 나타낸다. (A) 에틸아세테이트 추출물은 검은색 막대로 나타내고, 50% 메탄올 추출물은 흰색 막대로 나타내었다.
도 3은 니알아마이드(nialamide)의 농도별 처리에 의한 감자영양 배지의 홍국 배양체의 색소 생산 촉진(A) 및 균체 건조 중량 변화(B)를 나타낸다. (A) 에틸아세테이트 추출물은 검은색 막대로 나타내고, 50% 메탄올 추출물은 흰색 막대로 나타내었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍국균에 히스톤 변형 물질을 처리하는 단계를 포함하는 홍국 색소의 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 홍국균은 모나스커스속(Monascus sp.)일 수 있으며, 바람직하게는 모나스커스 퍼프리우스(Monascus purpureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 히스톤 변형 물질은 히스톤 디아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor) 또는 히스톤 디메틸라제 저해제(histone demethylase inhibitor)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 히스톤 디아세틸라제 저해제는 수베로하이드록삼산(suberohydroxamic acid)일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 히스톤 디아세틸라제 저해제 기능이 검증된 유사물질이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 수베로하이드록삼산의 처리 농도는 0.01~100 μM일 수 있으며, 바람직하게는 1~90 μM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 2~80 μM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 히스톤 디메틸라제 저해제는 피리딘 2,4-디카복실산(pyridine 2,4-dicarboxylic acid) 또는 니알아마이드(nialamide)일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 히스톤 디메틸라제 저해제 기능이 검증된 유사물질이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 피리딘 2,4-디카복실산의 처리 농도는 0.01~100 μM일 수 있으며, 바람직하게는 0.01~80 μM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01~50 μM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 니알아미드의 처리 농도는 0.01~130 μM일 수 있으며, 바람직하게는 0.01~110 μM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01~100 μM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 히스톤 변형(histone modification)은 많은 진핵 세포의 전사 조절에 관여하는 과정으로, 주로 히스톤의 코아(core) 단백질이 아미노 말단에서 아세틸화(acetylation) 및 탈아세틸화(deacetylation) 되는 것이 알려져 있다. 이 과정에는 2가지 효소, 즉 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HATs) 및 히스톤 디아세틸라제(HDACs)가 작용하는데, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제는 히스톤을 아세틸화시켜 뉴클레오좀(nucleosome)을 느슨하게 함으로써 전사를 촉진시키고, 히스톤 디아세틸라제는 전기 HATs의 활성을 억제하여 전사를 억제하는 역할을 한다. 또한, 히스톤의 메틸화(methylation)는 히스톤 H3 및 히스톤 H4의 아르기닌(Arginine) 또는 리신(Lysine) 아미노산 잔기에 메틸기가 붙는 것으로, 히스톤 메틸화효소(HMTase)에 의해 일어나는데, 아르기닌 또는 리신의 몇 번째 잔기에 메틸화가 일어나는지에 따라서 전사 억제 또는 전사 활성이 이루어진다. 히스톤 메틸화에 의해 해당 크로마틴 부위가 후성 유전적으로 조절(epigenetic regulation)되며, 메틸화된 히스톤은 DNA에 좀 더 강하게 결합함으로써 전사를 억제시킨다. 본 발명에서 사용한 히스톤 디아세틸라제 저해제 또는 히스톤 디메틸라제 저해제를 이용하여 세포의 전사를 조절하여 균주의 대사체를 변화시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 홍국균을 배양하여 홍국 색소를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로,

(a) 본 발명의 시약 처리 후 홍국균을 배양하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 홍국균 배양액에 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가한 후 원심분리하여 상층액인 홍국 색소 에틸아세테이트 추출물을 분리하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계의 잔존하는 수용액에 동량의 메탄올을 첨가한 후 원심분리하여 상층액인 홍국 색소 메탄올 추출물을 분리하는 단계를 포함한다.

상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 미생물 또는 미생물 배양액으로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다.

상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출액을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

모나스커스 퍼프리우스 ( Monascus purpureus ) 균주 배양

홍국 색소 생산을 위해 모나스커스 퍼프리우스(Monascus purpureus) KACC 42430 균주를 사용하였다. 해당 균주를 감자한천 배지(potato dextrose agar, PDA)에 고체 배양한 후 분생포자(conidiospore)를 채취하여 20% 글리세롤 상태로 -80℃ 에 저장하여 실험에 활용하였다. 해당 분생포자의 농도를 ~2×10⁷/㎖로 조절하여 사용하였다. 해당 분생포자 현탁액 50 ㎕를 지름 90 mm의 감자한천 배지에 도말하고, 28℃에서 7일간 배양하였다. 해당 배양체에서 지름 9 mm의 한천 조각 5개를 50 ㎖ 감자영양 배지(potato dextrose broth, PDB)에 접종한 후, 28℃에서 250 rpm으로 7일간 진탕 배양하였다.

히스톤 변형 물질 처리

모나스커스 퍼프리우스 균주 배양체 5 ㎖을 50 ㎖ 감자영양 배지(250 ㎖ 주름 플라스크)에 접종하였고, 접종 시 히스톤 변형 시약을 농도별로 처리하였다. 사용한 히스톤 변형 시약은 히스톤 디아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor)로 수베로하이드록삼산(suberohydroxamic acid, CAS Number 38937-66-5, Sigma-Aldrich, 미국)을 사용하였다. 또한, 히스톤 디메틸라제 저해제(histone demethylase inhibitor)로는 피리딘 2,4-디카복실산(pyridine 2,4-dicarboxylic acid, CAS Number 207671-42-9, Sigma-Aldrich, 미국) 및 니알아마이드(nialamide, CAS Number 51-12-7, Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 수베로하이드록삼산은 메탄올을 용매로 사용하였으며, 피리딘 2,4-디카복실산 및 니알아마이드는 각각 물 및 에탄올을 용매로 사용하였다. 대조군에는 각각 해당 용매만 처리하였다. 각 용액은 배양체 내 최종 농도의 500배 농도로 제조하고, 50 ㎖ 배양체에 100 ㎕씩 투여하였다.

홍국 색소 용매 추출물 제조

모나스커스 퍼프리우스 KACC 42430 균주 배양체에 에틸아세테이트 및 메탄올을 첨가하여 용매 추출물을 제조하였다. 균주 배양체에 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가한 후 원심분리하였다. 상기 원심분리한 상층액인 홍국 색소 에틸아세테이트 추출물을 분리하는 단계를 2회 반복 수행하여 홍국 색소 에틸아세테이트 추출물을 제조하였다. 이후 잔존하는 수용액에 동량의 메탄올(methanol)을 첨가한 후, 원심분리하고 상층액을 분리하여 홍국 색소 50% 메탄올 추출물을 제조하였다. 해당 추출물을 적당 수준 희석한 후, 주사 자외선-가시광선 흡광도기(scanning UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 최대 흡광도를 보이는 파장의 흡광도를 기록하여 색소 함량을 추론하였다. 통상적으로 에틸아세테이트 추출물은 460 nm에서 최대 흡광도를 보였으며, 50% 메탄올 추출물은 500 nm에서 최대 흡광도를 나타내었다. 균체 생장량의 측정은 1 ㎖ 배양체를 원심분리하여 균사체를 확보한 후, 70℃에서 건조하여 건조 중량(dried cell weight, DSW)을 측정하는 방법으로 수행하였다.

실시예 1. 수베로하이드록삼산 처리를 통한 홍국 색소 생산 촉진

모나스커스 퍼프리우스(Monascus purpureus) KACC 42430 균주에 히스톤 디아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor)인 수베로하이드록삼산(suberohydroxamic acid)을 처리한 후, 에틸아세테이트 및 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 주사 자외선-가시광선 흡광도기(scanning UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 에틸아세테이트 추출물은 460 nm, 메탄올 추출물은 500 nm에서 흡광도를 측정하여 홍국 색소 생산량을 확인하였다. 균체 생장량은 배양된 균사체를 건조하여 건조 중량(dried cell weight, DCW)을 측정하여 확인하였다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, 10 μM 수베로하이드록삼산을 처리한 경우 에틸아세테이트 추출물의 홍국 색소 함량이 비처리군에 비해 현격히 증가(100% 증가)된 것을 확인할 수 있었다. 반면 해당 농도에서 50% 메탄올 추출물의 홍국 색소 함량은 비처리군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 또한, 100 μM의 고농도 수베로하이드록삼산을 처리한 경우에는 에틸아세테이트 추출물 및 50% 메탄올 추출물의 홍국 색소 함량이 현저히 감소되는 경향을 확인하였다. 상기 결과는 모나스커스 퍼프리우스 균주 배양체의 축적된 홍국 색소 성분 함량에 변이가 생겼음을 나타내는 결과이다. 특이한 점은 0.01 μM의 저농도 수베로하이드록삼산을 처리한 경우 홍국 색소 생산 능력이 현격히 감소된 점이며, 상기 결과는 수베로하이드록삼산 처리가 균체 내의 유전자 발현에 조절 효과를 발휘함을 나타낸다.

또한 균체 생장량을 조사한 결과, 10 μM 수베로하이드록삼산 처리에서 균체의 건조 중량은 다소 증가하는 경향을 나타내었다(도 1B).

실시예 2. 피리딘 2,4- 디카복실산 처리를 통한 홍국 색소 생산 변이

모나스커스 퍼프리우스 KACC 42430 균주에 히스톤 디메틸라제 저해제(histone demethylase inhibitor)인 피리딘 2,4-디카복실산(pyridine 2,4-dicarboxylic acid)을 처리한 후, 에틸아세테이트 및 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 주사 자외선-가시광선 흡광도기를 이용하여 에틸아세테이트 추출물은 460 nm, 메탄올 추출물은 500 nm에서 흡광도를 측정하여 홍국 색소 생산량을 확인하였다. 균체 생장량은 배양된 균사체를 건조하여 건조 중량(dried cell weight, DCW)을 측정하여 확인하였다.

그 결과, 피리딘 2,4-디카복실산 처리 후 에틸아세테이트로 추출한 경우 홍국 색소 함량이 거의 소실된 현상을 확인할 수 있었다. 반면, 50% 메탄올 추출물의 홍국 색소 함량은 비처리군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다(도 2A).

또한, 균체 생장량을 조사한 결과, 피리딘 2,4-디카복실산 처리에 의해 균체의 건조 중량이 비처리군에 비해 현저하게 감소되는 것으로 나타나, 균체의 생장이 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 2B). 특이하게, 고농도(100 μM)의 피리딘 2,4-디카복실산 처리군에서는 홍국 색소 함량 및 균체 건조 중량에 있어 특이한 변화가 나타나지 않았다. 상기 결과로, 피리딘 2,4-디카복실산 처리 조건의 조절에 의해 색소 성분 간의 비율 조정이 가능할 것으로 판단된다.

실시예 3. 니알아마이드를 통한 홍국 색소 생산 촉진

모나스커스 퍼프리우스 KACC 42430 균주에 히스톤 디메틸라제 저해제(histone demethylase inhibitor)인 니알아마이드(nialamide)를 처리한 후, 에틸아세테이트 및 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 주사 자외선-가시광선 흡광도기를 이용하여 에틸아세테이트 추출물은 460 nm, 메탄올 추출물은 500 nm에서 흡광도를 측정하여 홍국 색소 생산량을 확인하였다. 균체 생장량은 배양된 균사체를 건조하여 건조 중량(dried cell weight, DCW)을 측정하여 확인하였다.

니알아마이드를 농도별로 처리한 경우 에틸아세테이트 추출물에서 비처리군에 비해 유의성 있는 홍국 색소 생산 함량 증가를 관찰할 수 있었으며, 0.1 μM 처리에서 약 35%의 홍국 색소 생산이 촉진된 것을 확인하였다(도 3A). 메탄올 추출물의 경우에도 비처리군에 비해 증가된 홍국 색소 함량 변화를 나타냈다. 그러나 균체 생장량을 조사한 결과, 균체 건조 중량에는 큰 변화가 없는 것으로 나타났고, 따라서 니알아마이드 처리에 의한 균체의 생장은 거의 변화가 없는 것을 확인하였다(도 3B).

Claims (8)

1. 홍국균에 10 μM 수베로하이드록삼산(suberohydroxamic acid), 0.01~10 μM 피리딘 2,4-디카복실산(pyridine 2,4-dicarboxylic acid) 또는 0.01~100 μM 니알아마이드(nialamide)를 처리하는 단계를 포함하는 홍국 색소의 생산량을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 홍국균은 모나스커스(Monascus) 속인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 홍국균은 모나스커스 퍼프리우스(Monascus purpureus)인 것을 특징으로 하는 방법.
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