KR101356845B1 - Promoter for directing embryonic procambium and radicle specific expression - Google Patents
Promoter for directing embryonic procambium and radicle specific expression Download PDFInfo
- Publication number
- KR101356845B1 KR101356845B1 KR1020130000063A KR20130000063A KR101356845B1 KR 101356845 B1 KR101356845 B1 KR 101356845B1 KR 1020130000063 A KR1020130000063 A KR 1020130000063A KR 20130000063 A KR20130000063 A KR 20130000063A KR 101356845 B1 KR101356845 B1 KR 101356845B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- promoter
- plant
- present
- procambium
- expression
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8227—Root-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이 프로모터에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 애기장대 유래 At4g31830 유전자의 프로모터인 염기서열 중 쌍자엽 식물체의 종자 내부 배 조직의 전형성층 및 유근 특이적인 발현을 유도하는 염기서열, 상기 염기서열을 포함하는 식물체 배 조직의 전형성층 및 유근 조직 특이 발현 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 쌍자엽 식물체 종자의 배 조직의 전형성층 및 유근에서 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to procambium and radicle specific promoters of embryo tissue. In more detail, the present invention is a nucleotide sequence which is a promoter of the Arabidopsis-derived At4g31830 gene, a morphotype of the internal germ tissue of a dicotyledonous plant and a base sequence for inducing root-specific expression, and a procambium of a plant embryo tissue comprising the nucleotide sequence. And root-tissue-specific expression recombinant vector and a method for producing a protein of interest by expressing a foreign gene in the formation layer and root of embryonic tissue of dicotyledonous plant seed using the vector.
작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다. 이러한 작물분자육종 기술을 이용한 유전자변형 작물의 재배면적과 재배양이 전 세계적으로 지속적으로 증가하고 있으며, 상업화된 유전자변형 신종자의 세계 시장 규모는 2002년 40억 달러에서 2010년 100억 달러(종자와 기술료 포함)로 전체 세계 종자 시장규모 300억 달러 대비 15% 수준이며 종류로는 대두, 옥수수, 면화, 유채가 주 시장을 형성하고 있다. 유전자변형 작물의 효과를 극대화하기 위해서는 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 식물의 발달 시기별, 조직별로 미세하게 조절할 수 있어야하며 이를 위해 다양한 프로모터의 개발이 이루어져야 한다.Crop molecular breeding can use all kinds of genes as a material and it is possible to control the effect of breeding infinitely by dragging the breeding technique which was possible only by the existing genome unit as a gene unit, Technology. The growing area and cultivation of GM crops using these crop molecular breeding technologies has been continuously increasing worldwide, and the global market size of commercialized GM varieties has grown from US $ 4 billion in 2002 to US $ 10 billion in 2010. It is 15% of the total global seed market size of $ 30 billion, including soybeans, corn, cotton, and rapeseed. In order to maximize the effect of genetically modified crops, the expression of exogenously inserted genes must be finely regulated by the developmental stage and tissue of the plant, and various promoters should be developed for this purpose.
이에 1980년대 초반부터 식물 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 대한 연구가 진행되어 왔다. 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)의 프로모터가 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도할 것이라고는 가능성이 제시되고(Hohn et al., 1982, Curr . Topics Microbiol . Immunol . 96: 193-236), 상기 프로모터의 염기서열이 밝혀지고(Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), 식물체내에서 강한 발현이 증명되었다(Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res . 15: 1543-58). 그 후 CaMV 35S(특허번호: JP1993192172-A1) 프로모터는 식물에서 가장 많이 쓰이는 보편적인(universal) 프로모터가 되었다.Therefore, since the early 1980s, studies on promoters that regulate expression of plant genes have been conducted. The promoter of the cauliflower mosaic virus (Cauliflower mosaic virus) would induce a strong expression in plant tissue before possibly being presented (Hohn et al., 1982, Curr. Topics Microbiol . Immunol . 96: 193-236), the nucleotide sequence of the promoter was revealed (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), and strong expression was demonstrated in plants (Sanders et al., 1987, Nucleic) Acids Res . 15: 1543-58). The CaMV 35S (patent no .: JP1993192172-A1) promoter has since become the most popular universal promoter in plants.
한편, 식물의 특정 조직 특이적으로 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터의 발현에 대한 연구가 꾸준히 진행되어서 뿌리 조직 특이 프로모터 (Elmayan and Tepfer, 1995, Transgenic Research 4: 388-396; Xu et al., 1995, Plant Molecular Biology, 27: 237-248; Nitz et al., 2001, Plant Sci . 161: 337-346; Vaughan et al., 2006, Journal of Experimental Botany 57: 3901-3910; Vijaybhaskar et al., 2008, Journal of Biosciences, 33:185-193; Jeong et al., 2010, Plant Physiology, 153:185-197; Noh et al., 2012, Transgenic Research 21: 265-278), 저장뿌리 특이 프로모터 (Herma et al., 2012, Planta, 236: 1955-1965; Noh et al., 2012, Transgenic Research 21: 265-278), 꽃 조직 특이 프로모터 (van der Meer et al., 1990, Plant Mol . Biol . 15: 95-109; Ruiz-Rivero and Prat, 1998, Plant Mol . Biol . 36: 639-648; Chiou and Y도, 2008, Plant Molecular Biology, 66: 379-388; Verdonk et al., 2008, Plant Biotechnology Journal 6: 694-701; Liu et al., 2011, Plant Cell Reports 30: 2187-2194), 약 (anther) 특이 프로모터 (van Tunen et al., 1990, Plant Cell 2: 393-401; Kato et al., 2010, Plant Molecular Biology Reports 28: 381-387), 종자 특이 프로모터 (Bustos et al., 1989, Plant Cell 1: 839-853; Kridl et al., 1991, Seed Sci Res, 1: 209-219; Washida et al., 1999, Welham and Domoney, 2000, Plant Sci . 159: 289-299; Plant Mol . Biol . 40: 1-12; Furtado et al., 2008, Plant Biotechnology Journal 6: 679-693; Chung et al., 2008, Plant Cell Reports, 27: 29-37) 등이 개발되었다. On the other hand, studies on the expression of tissue-specific promoters that induce the expression of plant-specific tissues have been steadily progressed, so that root-tissue specific promoters (Elmayan and Tepfer, 1995, Transgenic Research 4: 388-396; Xu et al., 1995, Plant Molecular Biology , 27: 237-248; Nitz et al., 2001, Plant Sci . 161: 337-346; Vaughan et al., 2006, Journal of Experimental Botany 57: 3901-3910; Vijaybhaskar et al., 2008, Journal of Biosciences , 33: 185-193; Jeong et al., 2010, Plant Physiology , 153: 185-197; Noh et al., 2012, Transgenic Research 21: 265-278), storage root specific promoter (Herma et al., 2012, Planta, 236: 1955-1965; Noh et al., 2012, Transgenic Research 21: 265-278), flower tissue specific promoter (van der Meer et al., 1990, Plant Mol . Biol . 15: 95-109; Ruiz-Rivero and Prat, 1998, Plant Mol . Biol . 36: 639-648; Chiou and Y, 2008, Plant Molecular Biology , 66: 379-388; Verdonk et al., 2008, Plant Biotechnology Journal 6: 694-701; Liu et al., 2011, Plant Cell Reports 30: 2187-2194), anther specific promoter (van Tunen et al., 1990, Plant Cell 2: 393-401; Kato et al., 2010, Plant Molecular Biology Reports 28: 381-387), seed specific promoters (Bustos et al., 1989, Plant Cell 1: 839-853; Kridl et al., 1991, Seed Sci Res , 1: 209-219; Washida et al., 1999, Welham and Domoney, 2000, Plant Sci . 159: 289-299; Plant Mol . Biol . 40: 1-12; Furtado et al., 2008, Plant Biotechnology Journal 6: 679-693; Chung et al., 2008, Plant Cell Reports , 27: 29-37).
최근에는 유전자 변형 작물 제작 시에 삽입 유전자의 발현을 한층 더 미세하게 조절하기 위해서 식물 조직 특이 발현이 한층 더 세분화되고 있는 추세이다. 이를 위하여 종자 특이 프로모터의 경우에는 종자 내부 조직 특이 프로모터들이 개발되고 있는데 배 (embryo) (Dishi et al., 2006, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 42: 432-438; Kim et al., 2011, Biochemical and Biophysical Research Communications, 408: 78-83; Jose-Extanyol and Puigdomenech, 2012, Plant Molecular Biology, 80: 325-335), 배유 (endosperm) (Hu et al., 2011, Biotechnol Lett, 33: 1465-1471; Xu et al., 2010, Plant Cell Reports, 29: 1061-1068; Vickers et al., 2006, Plant Molecular Biology, 62: 195-214; Choi et al., 2003, Plant Cell Reports, 21: 1108-1120), 종피 (seed-coat) (Wu et al., 2011, Plant Cell REports, 30: 75-80; Esfandiari et al., 2012, Plant Molecular Biology, DOI 10.1007/s11103-012-9984-0)- 조직 특이 프로모터들이 개발되었다. 현재까지 개발된 대부분의 종자 내부 조직 특이 발현을 유도하는 프로모터의 경우 벼, 밀 등의 단자엽 식물 유전자에서 유래된 단자엽용 프로모터로 개발되었다. 하지만, 이들 단자엽용 프로모터를 쌍자엽에 적용하였을 때 원래의 프로모터 활성이 나타나지 않음은 이미 알려진 사실이다 (Cornejo et al., 1993, Plant Molecular Biology, 23: 567-581; Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology, 102: 991-1000).In recent years, specific expression of plant tissue has been further subdivided in order to more finely control the expression of the inserted gene in the production of genetically modified crops. For seed-specific promoters, seed-specific promoters have been developed. Embryo (Dishi et al., 2006, In Vitro Cellular and Developmental Biology , 42: 432-438; Kim et al., 2011, B iochemical and Biophysical Research Communications , 408: 78-83; Jose-Extanyol and Puigdomenech, 2012, Plant Molecular Biology, 80:. 325-335), endosperm (endosperm) (Hu et al, 2011, Biotechnol Lett. , 33: 1465-1471; Xu et al., 2010, Plant Cell Reports , 29: 1061-1068; Vickers et al., 2006, Plant Molecular Biology , 62: 195-214; Choi et al., 2003, Plant Cell Reports , 21: 1108-1120), seed-coat (Wu et al., 2011, Plant Cell REports , 30: 75-80; Esfandiari et al., 2012, Plant Molecular Biology , DOI 10.1007 / s11103-012-9984-0) - Tissue specific promoters were developed. Most of the promoters that induce specific expression of seed internal tissues developed to date have been developed as terminal promoters derived from terminal plant genes such as rice and wheat. However, it is already known that the original promoter activity does not appear when these terminal lobe promoters are applied to the dicots (Cornejo et al., 1993, Plant Molecular Biology , 23: 567-581; Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology , 102: 991-1000).
따라서 쌍자엽 식물과 단자엽 식물의 종자 내부 조직의 구조가 매우 상이하고 단자엽용 프로모터의 활성이 쌍자엽 식물에서 재현되지 않음을 고려할 때, 쌍자엽 식물의 종자 내부 조직을 대상으로 대사공학 및 유용 물질 생산을 가능케 할 쌍자엽 식물의 종자 내부 조직 특이 발현을 유도하는 프로모터 개발에 대한 요구가 계속적으로 있어 왔다. Therefore, considering that the internal structure of the seeds of the dicotyledonous plants and the monocotyledonous plants is very different, and the activity of the terminal promoter is not reproduced in the dicotyledonous plants, it is possible to produce metabolic engineering and useful materials There has been a continuing need for the development of promoters that induce specific expression of seed internal tissues of dicotyledonous plants.
본 발명의 배경이 되는 기술로, 대한민국 등록특허 10-0574563 (2006.04.27)에는 종자 특이적 발현을 보이는 애기장대 (Arabidopsisthaliana)의 마이크로좀 올레산 불포화제 (microsomal oleic acid desaturase) 유전자에서 유래된 식물체 고효율 발현 프로모터 및 인트론 (intron)과 이들을 함유하는 식물체 고효율 발현 벡터 그리고 이 발현벡터로 형질전환된 식물체에 대해 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 10-1996-0702810 (1996.12.09)에는 3개의 키메릭 유전자, 즉, 리신 억제에 비감수성인 디히드로디피콜린산 신타제(DHDPS)를 코딩하며 식물 엽록체 전이 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 제1유전자, 리신 풍부 단백질을 코딩하는 제2유전자 및 식물 리신 케토글루타레이트 리덕타제를 코딩하는 제3유전자로서 이들 모두 식물 종자 특이적 조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자에 관해 기재되어 있다. 그러나, 쌍자엽 식물체의 종자 내부 배 조직의 전형성층 및 유근 특이적인 발현을 유도하는 애기장대 유래 At4g31830 유전자의 프로모터에 대해 알려진 바는 없다.
As a background of the present invention, Korean Patent No. 10-0574563 (Mar. 27, 2006) discloses a plant high-efficiency microorganism derived from a microsomal oleic acid desaturase gene of Arabidopsis thaliana, Expression promoters and introns, plant high-efficiency expression vectors containing them, and plants transformed with these expression vectors have been described. In Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-1996-0702810 (Dec. 1996), three chimeric genes, A first gene encoding dihydrodipicolinic acid synthase (DHDPS) that is non-susceptible to lysine suppression and operably linked to a plant chloroplast transfer sequence, a second gene encoding a lysine rich protein, and a second gene encoding a lysine- As a third gene encoding the rutarate reductase, all of them are genes that are operably linked to plant seed specific control sequences It is described about. However, there is no known promoter of the Arabidopsis-derived At4g31830 gene, which induces typical formation and root-specific expression of seed internal embryonic tissue of dicotyledonous plants.
본 발명은 상기 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 식물체의 종자 내부 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이적 발현을 유도할 수 있는 At4g31830 프로모터 ( E mbryonic P rocambium and R adicle-specific, EPR 프로모터)을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above needs, and an object of the present invention is an At4g31830 promoter ( E) capable of inducing procambium and radicle specific expression of plant internal embryo tissue. mbryonic P rocambium and R adicle-specific (EPR promoter).
본 발명의 다른 목적은 At4g31830 프로모터를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터 및 이에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a plant transformation vector comprising the At4g31830 promoter and a transformed plant transformed thereby.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현벡터로 형질전환된 식물체를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for producing a target protein using a plant transformed with the expression vector.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 식물체의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이 프로모터를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a procambium and radicle specific promoter of embryo tissue of an isolated plant having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 형질전환용 발현벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an expression vector for transformation comprising the promoter.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 형질전환용 발현벡터를 포함하는 대장균을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides E. coli comprising the expression vector for transformation.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 식물체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a plant transformed by the expression vector.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 1) At4g31830 유전자 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및 2) 상기 형질전환된 식물체의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention comprises the steps of 1) transforming the plant with a recombinant expression vector comprising the At4g31830 gene promoter and the gene encoding the protein of interest; And 2) expressing a gene encoding the target protein in the procambium and radicle of the embryo tissue of the transformed plant to produce the target protein. to provide.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 프로모터를 증폭하기 위한 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 PCR용 프라이머를 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a PCR primer set forth in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 for amplifying the promoter.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 애기장대 TAIR/ATTED DB를 이용하여 종자 특이적 발현을 보이는 At4g31830 유전자의 프로모터 부위를 클로닝하여서 종자의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이적인 발현을 유도하는 프로모터를 제작하였으며 애기장대 형질전환체에서 동일 프로모터의 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to achieve the above object, the present inventors cloned the promoter region of the At4g31830 gene showing seed specific expression using Arabidopsis TAIR / ATTED DB to achieve the above object, and the procambium and radicle of the embryo tissue of the seed. A promoter was induced to induce specific expression and the present invention was completed by confirming the activity of the same promoter in Arabidopsis transformants.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 식물체의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이 프로모터를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a procambium and radicle specific promoter of embryo tissue of an isolated plant having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에 있어, '프로모터(promoter)'란, 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 바람직하게 본 발명에 따른 프로모터는 종자의 배 조직의 전형성층 및 유근에서 특이적으로 발현하는 애기장대의 At4g31830 유전자 프로모터이다. 따라서, 본 발명에 의한 상기 프로모터는 쌍자엽 식물 종자의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle)에서 목적 유전자의 발현을 유도시킬 수 있다. In the present invention, a 'promoter' is a gene region generally located upstream of a coding region including a point at which transcription is initiated, and is commonly used for TATA boxes, CAAT box regions, and external stimuli that regulate gene expression. It is composed of an enhancer that promotes the expression of almost all genes regardless of the site, position and direction that affect gene expression in response. In addition, among these promoters, there is a promoter that induces expression in all tissues constantly and a promoter that induces expression in a time or position-specific manner. Preferably, the promoter according to the present invention is specific in the typical layer and the root of the embryo tissue of the seed It is the At4g31830 gene promoter of the Arabidopsis of the Arabidopsis. Therefore, the promoter according to the present invention can induce the expression of the gene of interest in the procambium and radicle of the embryo tissue of the dicotyledonous plant seed.
상기 프로모터의 DNA 염기서열은 애기장대 At4g31830 유전자의 코딩 시퀀스의 번역개시 부위로부터 -43 내지 -534 염기쌍에서 유래된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 종자의 배 조직의 전형성층 및 유근 특이 프로모터는 상기 서열번호 1의 염기서열뿐만 아니라 상기 서열번호 1의 염기서열의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서 배 조직의 전형성층 및 유근 특이 프로모터 활성을 나타내는 염기서열을 포함한다.
The DNA sequence of the promoter is characterized in that derived from -43 to -534 base pairs from the translation start site of the coding sequence of Arabidopsis At4g31830 gene. The typical layer and the root-specific promoter of the embryonic tissue of the seed of the present invention is a modified sequence in which not only the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 but also some bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added. Nucleotide sequences exhibiting root-specific promoter activity are included.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 형질전환용 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게 본 발명은 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 식물체의 배(embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이 재조합 발현 벡터를 제공한다.The present invention also provides an expression vector for transformation comprising the promoter. Preferably, the present invention provides a procambium and radicle specific recombinant expression vector of embryo tissue of a plant prepared by operably linking a gene encoding a target protein downstream of the promoter. to provide.
본 발명에 있어, '발현 벡터'란 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 배 조직의 전형성층 및 유근 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. In the present invention, an 'expression vector' refers to a plasmid, virus or other medium known in the art, into which a promoter of the present invention and a gene sequence encoding a target protein operably linked to the promoter can be inserted or introduced. it means. The typical layer of the embryonic tissues of the plant according to the present invention and the root-specific expression promoter and the gene sequence encoding the target protein operably linked with the promoter may be operably linked to the expression control sequence, the operably linked Gene sequences and expression control sequences may be included in one expression vector that includes a selection marker and a replication origin.
본 발명에 있어, '작동 가능하게 연결(operably linked)' 된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. For purposes of the present invention, "operably linked" means that the appropriate molecule is linked in such a way as to enable gene expression when bound to an expression control sequence. In addition, "expression control sequence" refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for carrying out transcription, any operator sequence for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.
상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 At4g31830 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 pBI101 벡터를 이용하여 EPR-promoter::GUS 발현벡터를 제조하였다. The expression vector according to the present invention may be prepared by inserting the At4g31830 promoter of the present invention using a conventional vector used for protein expression as a base skeleton and inserting a base sequence encoding a target protein downstream of the promoter. Can be. Therefore, E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110 and pTP5), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50) having various cloning sites as vectors that can be used in the present invention. And plasmids such as Ti plasmids, plant viral vectors, and binary vectors such as pCHF3, pPZP, pGA, and pCAMBIA families can be used. However, those skilled in the art can use any vector as long as it is a vector capable of introducing the promoter of the present invention and the base sequence encoding the target protein operably linked to the promoter into the host cell. In the embodiment of the present invention, the EPR-promoter :: GUS expression vector was prepared using pBI101 vector.
본 발명에 있어서, '목적 단백질'이란 본 발명의 프로모터에 의해 식물체의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle)에서 특이적으로 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질을 말하며, 바람직하게는 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 GUS가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBI101 벡터에 본 발명의 애기장대 EPR 프로모터를 GUS 유전자의 상류부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터 EPR-promoter::GUS를 제조하였다. 상기 외래 유전자는 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다.In the present invention, 'target protein' refers to any target protein of external origin that is specifically expressed in the procambium and radicle of the embryo tissue of the plant by the promoter of the present invention, Preferably it may be an exogenous protein or an endogenous protein and a reporter protein. The exogenous protein refers to a protein that does not naturally exist in a specific tissue or cell, and the endogenous protein refers to a protein expressed by a gene naturally present in a specific tissue or cell. In addition, the reporter protein is a protein expressed by the reporter gene and refers to a labeling protein that indicates its activity in the cell by its presence. In one embodiment of the present invention, a recombinant expression vector EPR-promoter, in which a Arabidopsis EPR promoter of the present invention is operably linked to an upstream portion of the GUS gene, to a pBI101 vector having a reporter system linked to a blue color gene, GUS. :: GUS was prepared. The foreign gene may be expressed by fusion with a reporter gene as necessary.
본 발명의 배(embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이 프로모터의 전사활성에 의하여 발현되는 목적 단백질 유전자의 예로는, 형질전환 대상 식물체가 유채, 들깨 및 참깨 등의 유지작물인 경우 지방산 생합성 및 조절 관련 유전자 등을 들 수 있고, 단백질의 생성 및 축적량이 다른 식물에 비해 상대적으로 높은 콩 및 알팔파 등의 두과식물인 경우 경제적으로 부가가치가 높은 항체 유전자 등을 들 수 있고 사료작물로 대표적인 옥수수의 경우 돼지 설사병, 구제역 바이러스 등의 경구 백신(edible vaccine) 유전자 등을 들 수 있고, 종자로 장기간 보관, 유통되는 대부분의 작물의 경우 수확 후 저장성을 높이도록 각종 병 저항성에 관련된 유전자 등을 들 수 있으며, 그 외에도 토코페롤, 베타카로틴 등과 같이 특정 영양 성분을 작물의 종자에서 강화하려는 경우에는 관련 물질대사경로의 생합성 유전자 등을 들 수 있으나, 여기에 한정되지 않고, 본 발명의 배 조직의 전형성층 및 유근 특이 프로모터를 사용하여 조절될 수 있는 각종 목적 단백질을 코딩하는 유전자들이 포함될 수 있다.Examples of the protein of interest expressed by the transcriptional activity of the procambium and radicle specific promoters of embryonic tissues of the present invention include transformed plants which are oily crops such as rapeseed, perilla and sesame. Fatty acid biosynthesis and regulation related genes, and soybean plants such as soybeans and alfalfa, whose production and accumulation of proteins are relatively higher than those of other plants, are economically valuable antibody genes. In the case of representative corn, oral vaccine genes such as swine diarrheal disease and foot-and-mouth disease virus, etc. may be mentioned. For most crops which are stored and distributed as seeds for a long time, genes related to various disease resistances may be increased to improve storage resistance after harvesting. In addition, certain nutrients such as tocopherol, beta-carotene, etc. In this case, biosynthetic genes of related metabolic pathways may be used, but the present invention is not limited thereto. May be included.
그러므로 본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 종자 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 종자에서 발현시킴으로써 종자와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다. 또는, 식물체 내에서 생산된 목적 단백질을 당업계에 알려진 적절한 방법에 따라 추출하여 사용할 수도 있다.
Therefore, when the promoter of the present invention is used, in the case of a crop which consumes seeds of plants and the like, it is possible to develop a crop capable of ingesting a target protein together with seeds by expressing a useful protein of interest in a seed of a plant. Alternatively, the target protein produced in the plant may be extracted and used according to a suitable method known in the art.
또한, 본 발명은 상기 배 조직의 전형성층 및 유근 특이적 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물세포 및 식물체를 제공한다. 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 식물 세포내로 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 식물 세포내로 도입하는 방법으로는, 제한 없이 당해 공지된 방법이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particgunbombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등과 같은 방법들이 있다.The present invention also provides plant cells and plants transformed with the procambium of the embryonic tissue and the root specific recombinant expression vector. A recombinant expression vector comprising a promoter of the present invention and a base sequence encoding a protein of interest linked to the promoter can be introduced into plant cells using methods known in the art. As the method for introducing the recombinant expression vector according to the present invention into a plant cell, a known method can be used without limitation, for example, calcium chloride (CaCl 2 ) and heat shock (heat shock) method, particle total impact Methods such as particgunbombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporation, and precipitation by polyethylenglycol (PEG).
또한, 본 발명은 EPR 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 종자에 특이적으로 발현시키는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for producing a transgenic plant that specifically expresses a target protein in a seed, the method comprising transforming the plant with a recombinant plant expression vector comprising an EPR promoter and a gene encoding a protein of interest. do.
본 발명은 또한, 1) At4g31830 유전자 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및 2) 상기 형질전환된 식물체의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a plant, comprising the steps of: 1) transforming a plant with a recombinant expression vector comprising an At4g31830 gene promoter and a gene encoding a protein of interest; And 2) expressing a gene encoding the target protein in the procambium and radicle of the embryo tissue of the transformed plant to produce the target protein. to provide.
본 발명에서 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이고, 상기 쌍자엽 식물은 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리 및 유채일 수 있고, 상기 단자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 벼,보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파일 수 있다.
In the present invention, the plant may be a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant. Preferably, the plant is a dicotyledonous plant. The dicotyledonous plant may be a plant such as Arabidopsis, soybean, tobacco, eggplant, pepper, potato, Rice, barley, wheat, rye, corn, sorghum, oats, and oats, which may be used in the present invention. And can be both files.
본 발명은 또한 애기장대 At4g31830 유전자 프로모터를 클로닝하기 위한 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 PCR용 프라이머를 제공한다. 상기 프라이머를 이용하여 클로닝 효율을 높일 수 있다.
The present invention also provides a primer for PCR represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 for cloning the Arabidopsis At4g31830 gene promoter. Cloning efficiency can be increased by using the primer.
상술한 바와 같이 본 발명은 애기장대 At4g31830 유전자의 프로모터(EPR 프로모터) 부위에 관한 것으로써 이는 쌍자엽 식물의 종자 내부의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 특이적인 발현을 유도한다. 쌍자엽 식물의 성숙된 종자에서는 배 조직의 전형성층 및 유근에서 유전자의 발현을 유도할 때 효과적으로 이용될 수 있다. 한편, 배 조직의 전형성층과 유근 부분은 종자 발아 이후 유식물의 하배축 및 뿌리의 분열 조직에 해당하는 부분으로서 EPR 프로모터는 동일 조직에서 유용유전자의 발현을 유도함으로써 종자 및 유식물의 발달 촉진, 병 저항성 향상 혹은 재해 내성이 강화된 형질전환체 제작에 효과적으로 이용될 수 있다.
As described above, the present invention relates to a promoter (EPR promoter) region of the Arabidopsis At4g31830 gene, which induces procambium-specific and radicle-specific expression of embryo tissue inside seeds of a dicotyledonous plant. do. In mature seeds of dicotyledonous plants can be effectively used to induce the expression of genes in the procambium and root of embryonic tissue. On the other hand, the typical layer and root portion of the embryonic tissues correspond to the hypocotyls and seedlings of the seedlings after seed germination.The EPR promoter promotes the development of seeds and seedlings by inducing the expression of useful genes in the same tissue. It can be effectively used for the production of transformants having improved resistance or enhanced disaster resistance.
도 1은 본 발명의 프로모터에 의해 발현이 조절될 것으로 예상되는 At4g31830 유전자의 RT-PCR을 통한 조직별 발현 양상을 나타내는 도면.
도 2는 본 발명을 위한 프로모터 클로닝을 위한 PCR 결과와 완성된 클론을 확인하는 과정을 나타내는 도면.
도 3은 본 발명에 의한 프로모터 클로닝에 이용한 pBI101 벡터 모식도.
도 4a는 본 발명에 의한 At4g31830 유전자 프로모터의 조절로 GUS의 조직별 발현양상을 분석한 결과를 나타내는 도면.
도 4b는 종자 내 자세한 구조에 관한 도면으로 도 4a의 도면 해석에 참고할 수 있는 도면.1 shows tissue-specific expression patterns through RT-PCR of the At4g31830 gene, whose expression is expected to be regulated by the promoter of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a PCR result for promoter cloning and a process for confirming a completed clone for the present invention. FIG.
3 is a schematic diagram of a pBI101 vector used for promoter cloning according to the present invention.
Figure 4a is a view showing the results of analyzing the expression pattern of the tissue by the control of the At4g31830 gene promoter according to the present invention.
Figure 4b is a view of the detailed structure in the seed can be referred to the drawing interpretation of Figure 4a.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, the following examples illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example 1. 종자에서 특이적으로 발현하는 유전자(At4g31830) 선발 및 확인 1. Selection and identification of gene (At4g31830) specifically expressed in seeds
종자에서 특이적으로 발현하는 유전자를 확보하기 위해, TAIR/ATTED DB에 공개된 affymetrix 25k(ATHI) array 결과를 토대로 종자에서만 발현하는 유전자들을 선발한 후, 기존에 발표된 논문에서 종자에 특이적으로 발현하는 패턴을 확인할 수가 없는 유전자들을 선발하였다. 그 중 At4g31830에 위치한 유전자를 선발하였다.In order to obtain a gene specifically expressed in seeds, genes selected only in seeds based on the results of affymetrix 25k (ATHI) array disclosed in TAIR / ATTED DB were selected, Genes that were unable to identify the expression pattern were selected. Among them, a gene located at At4g31830 was selected.
종자 특이적으로 발현할 것으로 추정되는 At4g31830의 발현이 실제로 종자에서만 발현이 되는지 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다.RT-PCR was performed to determine whether the expression of At4g31830, which is expected to be specific for seed, is actually expressed only in seeds.
RT-PCR에 이용할 표준 cDNA를 함성하기 위해 TRI REAGENT®(TRI REAGENT® - RNA/DNA/PROTEIN ISOLATION REAGENT, MOLECULAR RESEARCH CENTER, INC.)을 이용하여, 5주 된 애기장대(Arabidopsis thalina ecotype Columbia)의 각 조직, 즉 꽃(flower), 줄기(inflorescence), 잎(leaf), 뿌리(root), 미성숙 종자(immature seed)와 7주 된 애기장대의 성숙 종자(mature seed)의 전체 RNA(total RNA)를 추출하였다.A 5-week-old Arabidopsis thaliana ecotype Columbia strain was transfected with TRI REAGENT ® (TRI REAGENT ® - RNA / DNA / PROTEIN ISOLATION REAGENT, MOLECULAR RESEARCH CENTER, INC. Total RNA of each tissue, flower, inflorescence, leaf, root, immature seed and mature seed of 7 weeks old Arabidopsis thaliana, Respectively.
정량한 전체 RNA(total RNA) 5 μg과 2.5 μM anchored-oligo(dT)18 primer, 1x (8 mM MgCl2) transcriptor reverse transcriptase reaction buffer, 20U protector RNase inhibitor, 1mM deoxynucleotide mix, 10U transcriptor reverse transcriptase를 전체 20 μl가 되도록 잘 섞은 다음 55℃에서 70분간 처리하였다. 이후 transcriptor reverse transcriptase의 불활성화를 위해서 85℃에서 5분간 처리하였다. 위와 같은 방법으로 조직별 cDNA pool을 만들었으며, 이 cDNA pool을 RT-PCR의 주형 (template)으로 사용하였다.(5 μg total RNA), 2.5 μM anchored-oligo (dT) 18 primer, 1 × (8 mM MgCl 2 ) transcriptor reverse transcriptase reaction buffer, 20 U protector RNase inhibitor, 1 mM deoxynucleotide mix and 10 U transcriptor reverse transcriptase 20 μl, and then treated at 55 ° C for 70 minutes. And then treated at 85 ° C for 5 minutes to inactivate the transcriptor reverse transcriptase. A cDNA pool for each tissue was constructed as described above, and this cDNA pool was used as a template for RT-PCR.
Tair site의 염기서열을 바탕으로 protein coding region에서 프라이머 1, 2(표 1의 서열번호 2, 3)를 합성하였고, Gene AmpPCR System 2700 (Perkin Elmer, USA)을 사용하여, 95℃에서 5분간 초기 변성 후, 95℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 30초를 30회 실시하였다.
내적대조군(internal control)으로는 EF1a를 사용하였으며, 조직별 cDNA pool에서 EF1a의 전사 양이 거의 동일함을 확인하였다. 상기 At4g31830 유전자 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과는 도 1과 같다. 도 1에 나타난 바와 같이 At4g31830 유전자가 꽃, 잎, 줄기, 뿌리에서는 발현하지 않고, 미성숙 종자에서 강하게, 성숙 종자에서는 약하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
EF1a was used as an internal control and the transcription amount of EF1a in the tissue pool was almost the same. The results of RT-PCR using the At4g31830 gene specific primer are shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, the At4g31830 gene was not expressed in flowers, leaves, stems, and roots, but was strongly expressed in immature seeds and weakly expressed in mature seeds.
실시예Example 2: 애기장대 2: Arabidopsis thaliana At4g31830At4g31830 유전자의 프로모터( Promoter of gene ( EPREPR 프로모터) Promoter) 클로닝Cloning
상기 유전자의 프로모터로 추정되는 부위는 492 염기쌍(base pair)으로 추정하였다. 먼저 야생 애기장대의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하고, 5' 말단에는 HindIII을 3' 말단에는 Xba1을 포함하고 있는 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머를 합성하였다(표 2 참조).
The region estimated to be the promoter of the gene was estimated to be 492 base pairs. First, the genome DNA (gDNA) of wild Arabidopsis was extracted, and primers represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 containing HindIII at the 5 'end and Xba1 at the 3' end were synthesized (see Table 2).
프라이머For promoter cloning
primer
상기 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 4, 5 프라이머와 교정(proofreading) 기능을 갖는 DNA 중합효소인 PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(PrimeSTARTMHS DNA Polymerase, TAKARA BIO INC.)를 이용하여 프로모터 부위를 증폭하였다. 그리고 이때 PCR 반응은 Gene Amp®PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA)을 사용하여, 95℃에서 5분간 초기 변성 후, 터치-다운(touch-down) PCR 방법으로, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초 72℃에서 1분 20초로 2℃씩 낮춰서 3회 실시하고, 95℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 1분 20초로 27회 실시하여 전체 30회 PCR을 수행하였다. Using the PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase (PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase, TAKARA BIO INC.) DNA polymerase having the SEQ ID NO: 4, 5 primer and correction (proofreading) function to the gDNA as a template was amplified promoter region. At this time, the PCR reaction was initial denaturation at 95 ° C for 5 minutes using a Gene Amp ® PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA), followed by touch-down PCR at 95 ° C for 30 seconds, 57 ° C For 30 seconds at 72 ° C for 1 minute and 20 seconds at 3 ° C for 30 cycles. The PCR was performed 30 times at 95 ° C for 30 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute and 20 seconds.
PCR로 얻은 산물이 약 492 염기쌍인지를 아가로스 젤 상에서 확인하고(도 2 참조), 이 PCR 산물을 HindIII과 Xba1 제한효소로 말단을 자른 다음 GUS 리포터 유전자를 가지고 있는 pBI101 벡터(vector)의 HindIII과 XbaI 사이트에 클로닝하였다. 이후 16개의 대장균(E.coli) 콜로니로 colony-PCR을 수행하여 16개 모두 PCR 산물이 삽입된 것을 확인하고(도 2 참조), 그 중 하나의 클론을 시퀀싱(sequencing)한 결과 정확한 염기서열이 클로닝되었음을 확인하였다(서열번호 1 참조).
Confirm that the product obtained by PCR was about 492 base pairs on the agarose gel (see FIG. 2), and the PCR product was truncated with HindIII and Xba1 restriction enzymes, followed by HindIII of pBI101 vector containing GUS reporter gene. Cloned to XbaI site. Thereafter, colony-PCR was performed with 16 E. coli colonies to confirm that all 16 PCR products were inserted (see FIG. 2), and the sequencing of one of the clones resulted in correct sequencing. Confirmed cloning (see SEQ ID NO: 1).
실시예Example 3: 3: EPREPR 프로모터의 애기장대 형질전환 Promoter's Arabidopsis transformation
EPR 프로모터 클로닝에 이용한 pBI101 벡터는 레프트 보드(left board)와 라이트 보드(right board) 사이에 GUS(β-glucuronidase) 리포터 유전자를 가지고 있으며 식물에 형질전환시킬 수 있는 바이너리 벡터(binary vector)이다(도 3 참조).The pBI101 vector used for EPR promoter cloning has a GUS (β-glucuronidase) reporter gene between the left and right boards and is a binary vector that can be transformed into plants (Fig. 3).
이 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium, GV3101)에 형질전환을 한 후 꽃침지(flower dipping, Clough er al., Plant J., 16(6): 735 743, 1998) 방법으로 애기장대에 형질전환을 하였다. 형질전환 애기장대를 항생제 카나마이신이 함유된 배지에서 선별하였다.
This vector was transformed into Agrobacterium (GV3101) and transformed into Arabidopsis by the method of flower dipping (Clougher et al., Plant J., 16 (6): 735 743, 1998) Respectively. Transgenic Arabidopsis thaliana was selected on a medium containing the antibiotic kanamycin.
실시예Example 4: 형질전환된 애기장대의 조직 화학적 염색 분석 4: Histochemical staining analysis of transformed Arabidopsis thaliana
선별된 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하여 조사하였다. 종자를 제외한 식물체의 각 조직은 1 mM X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-glucuronidase), 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담가 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 70% 에탄올을 첨가하여 2시간 동안 클로로필을 제거하는 과정을 3회 반복한 후, 100% 에탄올에 보관하면서 관찰하였다. 그 결과, 도 4a와 같이 종자를 제외한 전 조직-뿌리, 줄기, 잎, 꽃에서 GUS 염색이 관찰되지 않았다. 이 결과는 EPR 프로모터가 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등의 조직에서는 프로모터 활성이 없음을 나타낸다. GUS activity from each tissue of selected transgenic plants was examined by histochemical staining. Each tissue except for the seeds contained 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-glucuronidase), 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, and 0.1% Triton X-100 at 37 ° C. for 24 hours. Then, the solution was removed, and 70% ethanol was added thereto to remove chlorophyll for 2 hours. This procedure was repeated three times , Followed by storage in 100% ethanol. As a result, GUS staining was not observed in all tissues-roots, stems, leaves, and flowers except seeds as shown in FIG. 4A. This result indicates that the EPR promoter has no promoter activity in tissues such as roots, stems, leaves and flowers.
반면에 형질전환 식물체의 종자를 GUS 유전자의 기질인 X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-glucuronidase)가 들어있는 수용액에서 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 에탄올과 아세틱에시드를 9:1의 비율로 섞은 용액으로 25℃에서 24시간 동안 1차로 색소를 제거한 후, 90% 에탄올에서 30분 동안 세척하는 과정을 2회 반복했다. 그리고 1 ml의 30% glycerol에 2.5 g의 Chloral hydrate을 첨가한 용액으로 25℃에서 24시간 동안 2차로 색소를 제거한 후에 Nomarski 렌즈를 이용하여 광학현미경(Olympus model BX-51) 하에서 GUS의 활성을 관찰하였다. 이러한 관찰 결과 종자 내부의 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 조직에서 특이적으로 GUS 염색을 확인할 수 있었다(도 4a 및 도 4b 참조). 전형성층(procambium) 조직보다는 유근(radicle) 조직의 GUS 염색이 상대적으로 매우 강함을 확인하였다. 이러한 결과는 EPR 프로모터가 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium)과 유근(radicle) 특이적으로 강한 프로모터 활성을 나타낸다.On the other hand, seeds of transgenic plants were reacted in an aqueous solution containing X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-glucuronidase) as a substrate of the GUS gene for 24 hours at 37 ° C., After removing the dye, the dye was firstly removed at 25 ° C for 24 hours in a solution of ethanol and acetic acid in a ratio of 9: 1, and then washed in 90% ethanol for 30 minutes. After removing the dye for 24 h at 25 ° C with 1 ml of 30% glycerol and 2.5 g of chloral hydrate, the activity of GUS was observed under an optical microscope (Olympus model BX-51) using a Nomarski lens Respectively. These observations confirmed specific GUS staining in the procambium and radicle tissues of the embryo tissue inside the seed (see FIGS. 4A and 4B). It was confirmed that GUS staining of radicle tissue was relatively stronger than procambium tissue. These results indicate that the EPR promoter has strong promoter activity specifically in the procambium and radicle of embryo tissue.
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (7)
2) 상기 형질전환된 식물체 배 (embryo) 조직의 전형성층(procambium) 및 유근(radicle) 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법.1) transforming a plant with a recombinant expression vector comprising the promoter of claim 1 and a gene encoding a protein of interest; And
2) A method for producing a target protein comprising expressing a gene encoding the target protein in the procambium and radicle of the transformed plant embryo tissue to produce the target protein.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130000063A KR101356845B1 (en) | 2013-01-02 | 2013-01-02 | Promoter for directing embryonic procambium and radicle specific expression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130000063A KR101356845B1 (en) | 2013-01-02 | 2013-01-02 | Promoter for directing embryonic procambium and radicle specific expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101356845B1 true KR101356845B1 (en) | 2014-02-07 |
Family
ID=50269534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130000063A KR101356845B1 (en) | 2013-01-02 | 2013-01-02 | Promoter for directing embryonic procambium and radicle specific expression |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101356845B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050064256A (en) * | 2003-12-23 | 2005-06-29 | 한국생명공학연구원 | Bip-l promoter dna sequence showing specific response on er stress in arabidopsis thaliana |
| KR100685520B1 (en) | 2006-01-04 | 2007-03-09 | 대한민국 | A seed specific promoter primers for amplification thereof an expression vector comprising the same and a transformant cell |
-
2013
- 2013-01-02 KR KR1020130000063A patent/KR101356845B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050064256A (en) * | 2003-12-23 | 2005-06-29 | 한국생명공학연구원 | Bip-l promoter dna sequence showing specific response on er stress in arabidopsis thaliana |
| KR100685520B1 (en) | 2006-01-04 | 2007-03-09 | 대한민국 | A seed specific promoter primers for amplification thereof an expression vector comprising the same and a transformant cell |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2001502551A (en) | Leaf-specific expression of genes in transgenic plants | |
| DE10224889A1 (en) | Process for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants | |
| CN87106120A (en) | Seed specific transcriptional is regulated | |
| KR100719629B1 (en) | Flax seed specific promoters | |
| US7642346B2 (en) | Flax seed specific promoters | |
| CN102465128B (en) | Anther specific expression promoter and application thereof | |
| US9803212B2 (en) | Regulation of translation of heterologously expressed genes | |
| KR101369526B1 (en) | Promoter for directing embryo and seed inner integument specific expression | |
| CN103540592B (en) | A kind of rice endosperm specific expresses promotor and application thereof | |
| JP3791059B2 (en) | Plant promoters and their use | |
| KR101428631B1 (en) | Promoter for directing endosperm-specific expression | |
| KR101356845B1 (en) | Promoter for directing embryonic procambium and radicle specific expression | |
| Bang et al. | The activities of four constitutively expressed promoters in single-copy transgenic rice plants for two homozygous generations | |
| KR101428629B1 (en) | Promoter for directing matured embryo-specific expression | |
| KR101433893B1 (en) | Promoter for directing embryo-specific expression | |
| CN109706150B (en) | Peanut seed specific expression promoter AHSSP29 and application thereof | |
| KR101494191B1 (en) | Promoter for directing the guard-cell specific expression | |
| Yang et al. | Isolation and functional analysis of a strong specific promoter in photosynthetic tissues | |
| KR101677067B1 (en) | Seedspecific promoter derived from Oryza sativa and use thereof | |
| KR100862599B1 (en) | Promoter for the high level expression in plant-cell culture and vector using the same | |
| KR101642797B1 (en) | Endosperm-specific expression promoter derived from oryza sativa and use thereof | |
| KR101636317B1 (en) | funiculus specific expression promoter | |
| KR101825960B1 (en) | Root―specific promoter derived from Oryza sativa and use thereof | |
| EP3057980A1 (en) | Tissue specific plant promoter and uses thereof | |
| CN110734910A (en) | Ovule specific promoter PMEI _ d and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170109 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180108 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190114 Year of fee payment: 6 |